Oncologie

Pêchés au filet, anesthésiés trois à cinq minutes, mesurés et pesés hors de l'eau, 2 000 poissons reçoivent une puce électronique implantée dans l'abdomen par une incision de trois à cinq millimètres. Onze espèces sont concernées, dont cent salmonidés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont ensuite remis à l'eau, l'objet du projet étant de vérifier si une passe aménagée dans un grand fleuve laisse effectivement passer les migrateurs. Le porteur reconnaît qu'aucune analyse statistique n'est prévue et justifie l'effectif par les puces perdues en cours de route, certaines femelles les expulsant lors de la reproduction.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves ou de cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 2000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (50%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

11 espèces de poissons sont ciblées et sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, truite commune - Poissons d’eau calme : brème, gardon, rotengle, lote - Carnassiers : Brochet, silure, perche 1 stade de développement est retenu : subadultes-adultes.

1 214 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 24 injections dans l'abdomen et 40 gavages sur deux mois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent deux instillations dans la gorge sous anesthésie, un prélèvement sanguin, une séance d'imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements. Le porteur indique que le modèle peut provoquer des atteintes cutanées à partir de quatorze semaines, puis une perte de poids et une mobilité réduite, pour étudier une sclérodermie déclenchée par la silice. Toutes sont tuées afin de prélever sang, poumon, rate et peau, une partie l'étant simplement faute de porter le génotype recherché.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques. Une partie des animaux seront euthanasiés car sans génotype d'intérêt.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.

Les 1 800 souris reçoivent toutes une injection de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie gazeuse, puis 900 sont gavées une à deux fois par jour pendant 28 jours et 900 autres portent une pompe osmotique implantée dans le dos, agrafes retirées une semaine plus tard. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, toutes les souris étant tuées à la fin pour l'analyse moléculaire de leurs tumeurs, et la croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur écrit veiller à ce que les molécules testées ne portent pas atteinte aux "libertés individuelles de l'animal", définies comme l'absence de douleur, de lésion, de maladie, de peur et de détresse, dans un protocole qui commence par greffer une tumeur. Il ne décrit par ailleurs que des lots de cinq animaux en phase exploratoire puis quarante pour la démonstration d'efficacité, sans expliquer comment l'effectif atteint 1 800.

Objectifs

Les mutations non sens sont responsables d’environ 10% des maladies génétiques. La conséquence d’une mutation non sens est la dégradation rapide de l’ARNm porteur de la mutation par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD (pour nonsense-mediated mRNA decay). Certaines molécules sont capables de restaurer l’expression d’un gène porteur d’une mutation non sens. Ce type de molécules représente des candidats médicaments pour le traitement de certains patients atteints de maladie génétique. Nous recherchons au laboratoire des molécules capables de corriger les mutations non sens. Pour cela nous criblons des chimiothèques puis validons les molécules sur des lignées cellulaires. Une étude est ensuite entreprise pour déterminer la toxicité des molécules sélectionnées et leur mode d’action. L’étude préclinique est achevée après avoir démontré que les molécules sont capables de corriger les mutations non sens in vivo au sein d’un organisme complexe tel qu’une souris. L’étude in vivo consistera à déterminer la voie d’exposition, la concentration la plus efficace et la cinétique d’action de la molécule. Pour cela, les voies d’exposition qui seront testées sont la voie orale en gavant la souris avec différentes quantités de molécules et la diffusion sous-cutanée au moyen d’une pompe osmotique. Pour évaluer l’efficacité des molécules, nous effectuerons des mesures de croissance tumorale puis une analyse moléculaire sur les tumeurs après mise à mort des animaux.

Bénéfices attendus

La validation de l’efficacité de molécules permettant de corriger des mutations non-sens (entraînant la production de protéines généralement non-fonctionnelles) dans un organisme complexe comme la souris permettra à terme le développement de futurs médicaments pour traiter l’Homme souffrant de maladies génétiques telle que le cancer.

Procédures

L'ensemble des animaux (1800) seront anesthésiés par voie gazeuse afin de procéder à l'injection des cellules tumorales au niveau de leur flanc (durée de l'anesthésie : 10 minutes). L’ensemble des souris seront pesées 1 fois par semaine (1 minute) et la croissance des tumeurs sera mesurée 3 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (2 minutes). Deux voies d'administration de traitement seront ensuite évaluées. - Traitement par voie orale : une partie des animaux (900) recevront une à deux fois par jour un traitement ou son placebo par voie orale (30 secondes). Le traitement durera au maximum 28 jours. - Traitement par voie sous-cutanée : une partie des animaux (900) auront une implantation au niveau du dos d’un système permettant la délivrance en continu du traitement ou de son placebo (Chirurgie pour implanter une pompe osmotique : 10 minutes). Une semaine après l’intervention, les agrafes sont retirées sous anesthésie gazeuse (1 minute). Le traitement durera au maximum 28 jours.

Impact sur les animaux

Ce projet a pour but de valider l’utilisation de nouvelles molécules comme éventuel candidat médicament. Bien que des tests de toxicité auront été effectués au préalable sur culture cellulaire, l’effet de ces molécules sur un organisme entier doit être évalué. Pour cela, nous veillerons à ce que ces molécules ne portent pas atteinte aux libertés individuelles de l’animal définies comme étant l’absence de faim, de soif et de malnutrition, l’absence de peur et de détresse, l’absence de stress physique et/ou thermique, l’absence de douleur, de lésions et de maladie ainsi que la liberté d'expression d'un comportement normal de son espèce. Cette observation servira à détecter une nuisance sur du long terme d'exposition à la molécule étudiée. Au cours des procédures, les animaux seront soumis à un stress léger de courte durée lors des anesthésies (par voie gazeuse ou par injection). De même, le traitement par voie orale, bien accepté par l'animal, pourra générer un stress léger et de courte durée lors de la contention. L'implantation de la pompe, réalisée sous anesthésie, ne devrait pas générer de gêne au mouvement de l'animal (placée sous la peau dans le dos) mais pourrait conduire à une douleur post-opératoire qui sera gérée par analgésiques. L'injection des cellules tumorales sera réalisée de manière à ne pas entraver les mouvements de l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience afin de pouvoir procéder à l’analyse moléculaire des tumeurs et d’autres tissus.

Remplacement

Dans la première partie du projet, nous disposons d’un programme de caractérisation des nouvelles molécules que nous identifions et sélectionnons basé sur le criblage cellulaire. Cette étape in vitro préalable est essentielle afin de déterminer la dose efficace en culture cellulaire (ce qui nous permet d'extrapoler pour définir une fenêtre de doses qui seront utilisées chez la souris), la toxicité cellulaire et le mode d'action. Cette étape permettra de remplacer l'animal dans la phase de sélection des molécules et d'évaluation des conditions optimales d'utilisation. Cependant, bien qu’une grande partie de l’étude se réalise in vitro remplaçant ainsi le modèle animal, l’expérimentation in vivo demeure nécessaire afin de pouvoir étudier l’effet de ces molécules sélectionnées avec soin dans un modèle physiologique pertinent reflétant la mutation étudiée à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Le projet est conforme aux exigences de réduction puisqu'une phase exploratoire avec un nombre réduit d'animaux par lot (lot de 5) sera effectuée afin d'identifier la voie d'exposition, la concentration et la cinétique d'action de la molécule étudiée et ce afin d'abaisser au minimum le nombre d'animaux qui seront ensuite utilisés pour la démonstration de l'efficacité d'action de la molécule in vivo. Ce nombre sera de 40 ce qui correspondra à deux séries d'expériences avec 10 animaux par condition (avec et sans la molécule). La répétition de l'expérience est nécessaire pour s'affranchir d'un éventuel effet biaisé lié à la préparation de la molécule, au lot d'animaux ou à un stress survenu pendant l'expérience. Le nombre de 10 animaux par condition et par série afin de pouvoir réaliser ensuite un "student test" qui est le test statistique utilisé dans les expériences permettant d'évaluer l'efficacité d'un traitement.

Raffinement

Enfin, concernant le raffinement, l'expérience sera toujours menée de façon à prévenir ou à réduire au maximum toute souffrance. Ainsi, la voie d'exposition efficace la moins invasive sera privilégiée (la voie orale plutôt que sous-cutanée) et une anesthésie sera effectuée lorsque cela est compatible avec l'expérience. Des analgésiques seront utilisés pour pallier toute douleur pouvant survenir à la suite de l'implantation du système de diffusion sous-cutané. Les conditions d'hébergement seront telles que les animaux pourront bénéficier d'un enrichissement de leur environnement permettant une réduction de leur stress.

Choix des espèces

La souris présente l'avantage d'avoir un mécanisme de reconnaissance des codons stop prématurés étudié dans notre projet semblable à celui de l'Homme. De plus, la souris a un cycle de vie compatible avec le test in vivo sur plusieurs semaines de molécules à visées thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à partir de la quatrième semaine après la naissance et jusqu'à 6 mois maximum après la naissance. La limite inférieure correspond à l'âge de maturité du système immunitaire chez la souris et la limite supérieure a été fixée à 6 mois car après, nous les considérons comme trop âgées ce qui pourrait compliquer l'interprétation des résultats.

Une biopsie de l'endomètre et du placenta réalisée sur animal vigile, sans sédation ni anesthésie, en profitant de l'ouverture du col juste après la mise bas : vingt des soixante brebis gestantes du projet subissent ce prélèvement. 120 ovins au total, brebis et agneaux, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois prises de sang pour les mères et cinq pour les descendants. Les brebis sont placées en conditions de vague de chaleur durant le dernier mois de gestation, ce qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés de thermorégulation et un risque d'avortement ou de mise bas précoce, l'enjeu déclaré étant de mesurer l'effet du dérèglement climatique sur la fertilité des descendants. 90 animaux, les mères et leurs filles, rejoindront le troupeau pour le renouvellement des générations, et les 30 descendants mâles seront abattus pour prélever leurs testicules et leur prostate, leur "reproduction" étant déclarée "compromise".

Objectifs

Le déreglement climatique et plus particulièrement l’intensification des vagues de chaleurs imposent une adaptation pour toutes les filières animales. Chez les ruminants, déjà peu adaptés à la chaleur du fait des fermentations du rumen, l’aptitude à produire est corrélée négativement à la résistance à la chaleur. Des effets délétères d’un index combinant la température et le taux d’humidité (THI), ont ainsi été démontrés sur la santé, la production ou la fertilité des individus touchés. Si l'effet de la température et de l'humidité peut être direct sur les animaux en croissance ou adultes, il pourrait également s'appliquer durant le développement fœtal, perturbant l’organogenèse et la fonction placentaire. Le stress thermique, réduit en effet la croissance d'organes spécifiques chez les veaux mâles et femelles et en particulier la taille des ovaires. Mais à l'heure actuelle, l'impact sur la construction du phénotype de fertilité des descendants et sur leurs performances de reproducteur à l’âge adulte reste inexploré. De tels impacts, s’ils étaient avérés, pourraient fortement limiter la diffusion du progres génétique des troupeaux et réduire les performances globales de l’élevage. Des perturbations épigénétiques pourraient être le socle soutenant toutes les modifications phénotypiques observées après un stress thermique. Le projet vise à étudier les effets d’un stress thermique en environnement contrôlé, appliqué durant le dernier mois de gestation chez la brebis, sur la construction du phénotype chez les descandants et leur performance à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier les effets du déreglement climatique (et plus particulièrement l’intensification des phases de pics de chaleurs) sur la construction du phénotype de la descendance et sur leurs performances de reproduction à l’âge adulte. Les bénéfices attendus à court termes porteront sur la caractérisation des effets physiologiques et moléculaires d’un choc thermique subi in utero sur le devenir des animaux afin d’améliorer nos connaissances scientifiques sur les mécanismes épigénétiques qui soutendent la construction des phénotypes. A long terme, ce projet devrait fournir des bases de compréhension sur les mécanismes d’adaptation des animaux aux changements environnementaux, ce qui permettrait de développer des leviers positifs attenuant les effets déletères d’un stress thermique.

Procédures

3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). Pour un sous groupe de 20 brebis une biopsie de l’endomètre et du placenta sur animal vigile sera réalisée. Nous profiterons juste apres la mise-bas de l’ouverture du col pour réaliser ce prélèvement. A ce stade physiologique, les voies femelles étant dilatées afin de permettre le passage du nouveau-né, le prélèvement pourra se faire sur animal vigile sans sédation ou anesthésie locomotrice. Concernant les descandants, 5 prises de sang seront effectuées (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois). Tous ces actes ont une durée limitée à de quelques secondes (prise de sang) à quelques minutes (biopsie).

Impact sur les animaux

Une hyperthermie sur les brebis mis en condition de vague de chaleur pourrait survenir, avec des difficultés de régulation de température corporel et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Les femelles biopsée pourraient ressentir une douleur liée au prélèvement. Enfin, le stress generé par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuissance supplémentaire.

Devenir

Les mères ainsi que leurs filles pourront rejoindre leur troupeau d’origine afin de contribuer au renouvellement des générations. Seuls les déscandants mâles seront abatus à la fin de l’expériementation afin de collecter les organes necessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du déreglement climatique. L’etude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’y a pas de remplacement possible puisque l’objectif du projet est d’étudier les impacts d’un stress thermique subit in utero sur le développement embryonnaire, la construction du phénotype et les performances de reproduction à l’âge adulte. Aucune étude ne permet d’ores et déjà de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. Nous n’avons donc pas de données fiables pour remplacer tout ou partie des animaux necessaires. De plus les développements récents d’organoïdes ou de cultures cellulaires 2D ne permettent pas de prendre en compte toute la compléxité d’un organisme biologique [placenta – fœtus – organes spécifiques] ayant subit un stress thermique.

Réduction

Aucune étude ne permet de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. En revanche, concernant le contenu spermatique en petits ARN non codants, des études chez le bovin soulignent une variabilité individuelle sans condition de stress appliquée. C’est pourquoi le nombre d’individus souhaités par groupe de stress permettant de tenir compte de la variabilité individuelle et de visualiser un effet potentiel du stress envisagé est compris entre 12 et 15 pour les deux sexes. Afin de les obtenir, 60 brebis gestantes seront utilisées dans le projet (30 pour le groupe « contrôle » et 30 pour le groupe « stress thermique »). Ces Brebis, porteuses de singleton, donneront naissance au mieux à 60 descendants en sexe-ratio équilibré, soit 15 males et 15 femelles par groupe. Ce nombre permettra de tenir compte de certains aléas de mortalité et d’entrainement à la récolte de semence. Nous choisirons les méthodes d'analyse statistique adaptés pour obtenir des résultats fiables et interprétables.

Raffinement

Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Un enrichissement adapté sera proposé dans chaque cellule (pour tous les lots) : des miroirs, cônes et un filet de foin suspendu. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Les prises de sang pourraient être alternativement faites à la veine jugulaire droite et gauche pour limiter le risque de phlébite. Un baume décongestionnant pourrait être appliqué en cas de lésions ou de thrombose. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera assurée. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisi en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et proportion des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Les premiers animaux utilisés seront les brebis Ile-de-France gestantes. Le second lot d’animaux sera constitué des agneaux (mâles et femelles) obtenus après la mise-bas. Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Les souris utilisées sont des NOD Scid, dépourvues de système immunitaire fonctionnel, condition posée par le porteur pour que des cellules tumorales prostatiques humaines s'implantent et se disséminent. 75 souris sont ainsi exploitées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour collecte des tissus. Chacune reçoit une greffe de cellules PC3-GFP par ouverture de la cavité péritonéale sur cinq à six millimètres, puis un traitement de 120 secondes par torche à plasma froid par la même voie d'entrée. Le porteur écrit que les lots déjà traités n'ont présenté "aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables", tout en reconnaissant que l'implantation de cellules tumorales peut être associée à des douleurs et altérer l'état sanitaire de l'animal.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans l’étude de l’évaluation du potentiel thérapeutique quant à l’utilisation d’une torche à plasma pour le traitement des marges chirurgicales au cours d’une chirurgie de prostatectomie radicale. Afin d’évaluer in vivo la pertinence de l’utilisation d’un tel dispositif, nous proposons de réaliser un traitement par torche à plasma sur des greffons de cellules PC3-GFP réaliser par implantation orthotopique intraprostatique.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate peut, selon les options thérapeutiques retenues, conduite à une prostatectomie dans le but de supprimer le foyer tumoral primaire. Bien que les techniques actuelles soient aujourd’hui excellentes, notamment par le développement de procédure assistée par robotique, le risque de récidive par la présence de marges positives lors de la chirurgie reste un enjeu clinique de premier ordre. Ainsi, le développement de techniques permettant le traitement préventif du lit tumoral constitue un axe de recherche prioritaire. Les bénéfices attendus sont donc la validation par l'utilisation d'un modèle pré-clinique de l'efficacité du plasma froid pour le traitement des marges positives sur une chirurgie d'exérèse de tumeurs de la prostate et l'évaluation des risques de récidives avec ou sans traitemennt par plasma froid.

Procédures

Procédures chirurgicales : - 1 implantation intraprostatique par voie ventrale, ouverture sagitale de 5-6mm de la cavité peritonéale (6 minutes) - 1 traitement par plasma froid de 120 secondes, voie d'entrée identique à la première procédure (8 minutes)

Impact sur les animaux

La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3-GFP est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal. Toutefois, le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque d'une durée n'exédant pas 4 semaines. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de potentielle souffrance de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues. Concernant la réponse du traitement par la torche à plasma froid sur le site d'implantation, cette DAP correspondant à une extension d'une expérimentation précedemment autorisée, les lots d'animaux déjà traités n'ont présenté aucun signe d'inflammation ni aucun effets indésirables.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour collecte des tissus.

Remplacement

Cette étude in vivo a été précéder par une caractérisation des paramètres physiques de la torche à plasma et des effets biologiques obtenus sur lignées cellulaires. Ainsi, nous avons pu définir les paramètres optimales d’utilisation de la torche pour une utilisation sur l’animal. Ainsi tout la phase de mise au point a été réalisé sur des systèmes de substitution in cellulo. En parallèle, les processus de dissémination métastatique sont très complexes et, même si certains paramètres peuvent être étudiés en culture de cellule, nécessitent d'être analysés sur un organisme mammifère proche de l'humain. Dans le cas présent, le modèle utilisé est le modèle préclinique incontournable pour valider l'utilisation du plasma froid en chirurgie et analyser son potentiel sur le risque de récidive.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, ainsi 45 animaux seront utilisés au total sur des lots de 15. Les tests utilisés seront les suivants: Mann & Whitney, Wilcoxon, Kruskal & Wallis et/ou Friedman en fonction des comparaison de groupe effectué. MODIFICATION 75 ANIMAUX AU TOTAL

Raffinement

En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Concernant la chirurgie, l'ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie et des traitements post-opératoires sont mis en place pour optimiser le bien-être de l'animal. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque et sont décrits dans la présente demande. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle murin correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Il est important de noter que l’utilisation de la torche à plasma in vivo, est consécutive à la validation des effets biologiques d’intérêts sur lignées cellulaires en culture. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.

2 184 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant enchaîner sept prises de sang sur animal éveillé, des injections dans l'orbite de l'œil et soixante-douze heures seule dans une cage métabolique de 500 cm2. Elles reçoivent des régimes hypercaloriques ou privés de méthionine et de choline, et sont mises à jeun huit à seize heures avant les tests de tolérance. Le porteur qualifie les perturbations du métabolisme hépatique ainsi provoquées de "non dommageable pour la souris", alors que le projet vise justement à installer une maladie hépatique métabolique. Une partie des souris est tuée trente minutes après une injection, le sang étant chassé de leurs vaisseaux par une perfusion dans le cœur, pour mesurer la perméabilité de ces vaisseaux.

Objectifs

Les maladies hépatiques métaboliques sont des conséquences hépatiques du syndrome métabolique. Elles peuvent rester asymptomatiques mais aussi évoluer vers une cirrhose et un cancer du foie avec un taux de survie de 10% sur 5 ans.Les maladies hépatiques métaboliques représentent un problème majeur de santé publique à l’échelon mondial. L'organisation mondiale de la santé les catégorise actuellement comme la cause numéro une des maladies hépatiques dans les pays occidentaux. Même si les maladies métaboliques hépatiques sont étroitement liées à l’obésité et au syndrome métabolique, les causes des maladies métaboliques hépatiques ne sont pas les mêmes chez tous les patients et demeurent actuellement en grande partie non élucidée, ce qui complique la prévention et la prise en charge de ces maladies. Comment les plaquettes sanguines et leur vésicules extra-cellulaires, acteurs clés du maintien de l’intégrité vasculaire, peuvent réguler l’installation des maladies métaboliques hépatiques est une question très intéressante et novatrice et aborde un problème médical important sous un angle à la fois moléculaire et de physiopathologie intégrée. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des plaquettes dans les maladies métaboliques hépatiques et ses conséquences. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie hépatique et aideront à évaluer l’intérêt thérapeutique de cibler les plaquettes pour prévenir les maladies métaboliques du foie.

Procédures

La souris sera soumise à différents régimes alimentaires (hypercalorique et/ou déficients en méthionine ou/et choline) (réalisé dans l'Etablissement Utilisateur (EU) 1/2). La souris sera mise à jeun (8h ou 16h) pour les tests de tolérance (réalisé dans EU 1/2). La souris sera soumise à des procédures avec des injections sur souris vigiles ou anesthésiées (plusieurs injections successives par souris de quelques secondes) (réalisé dans EU 1/2). Sept prélèvements sanguins de 30 secondes sur souris vigile (réalisé dans EU1/2) et une prise de sang terminale sur la souris anesthésiée (d’une durée environ de 2 min) seront réalisées (réalisé dans EU1/2 ou 2/2 en fonction de l’expérimentation réalisée avec le sang et les organes prélevés). Pour l'évaluation du métabolisme in vivo, la souris sera isolée individuellement en cage métabolique d’une surface de 500cm2 sur une durée de 72h (réalisé dans EU 1/2). Pour l'évaluation de la structure et perméabilité des vaisseaux sanguin : une seule injection (injection d'une durée de quelques secondes) sera réalisée sur la souris anesthésiée suivie de la mise à mort de la souris 30 minutes après suite à une anesthésie générale et antalgie locale et une perfusion intra-cardiaque (EU 2/2).

Impact sur les animaux

La mise en régime hyperlipidique de la souris induit : une prise de poids pour la souris et des perturbations du métabolisme hépatique non dommageable pour la souris. Les actions suivantes vont induire un stress modéré et un inconfort des animaux : injections intra-orbitaire et intra-péritonéale (durée : 30 sec), mise en isolation de 72h pour les mesures de calorimétrie indirecte, test de tolérance (induction d’hyerglécemie et d’hypoglycémie et prise de sang) (durée 2h).

Devenir

La souris sera euthanasiée suite à un prélèvement sanguin terminal à la veine cave ou suite à l’isolement dans les cages métaboliques de 72h qui ne permettra pas de réaliser en suivant d’autres mesures métaboliques.

Remplacement

Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose et de maladies métaboliques hépatiques font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré.

Réduction

Plusieurs résultats seront obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. Nous utiliserons 6 à 8 animaux par groupe en fonction de la procédure (nombre minimum nécessaire déjà défini par des expériences déjà réalisées au laboratoire). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés. Les paramètres évalués seront analysés par une analyse de variance.

Raffinement

Le suivi des souris sera réalisé 2 fois par jour par les zootechniciens et l’expérimentateur et un calcul de score général sera réalisé. En fonction du score général, une surveillance accrue est nécessaire. De l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Des soins/désinfections seront prodigués à la souris. La souris peut être aussi momentanément séparée de ces congénères. Si l'animal atteint le point limite : mise à mort par l’expérimentateur ou par le service de zootechnie. Toutes les procédures invasives utilisent des analgésiques généraux ou locaux. Certains animaux seront transportés à pied selon un tracé bien défini de 5 minutes dans leur cage d’origine placée dans des sacs isotherme de transports à raison de 2 cages par sac de transport. Ceci permet de réduire le stress des animaux car dans l’obscurité et à une température contrôlée. Tout animal faible ou malade ne sera pas transporté et mis à mort avant transport par dislocation cervicale. Les animaux sont ensuite placés dans la salle d’expérimentaion pour une acclimation de 2 h avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Nous utilisons des modèles murins car nous disposons de modèles de souris génétiquement modifiées ainsi que d'outils pharmacologiques commercialement disponibles et couramment utilisés pour modifier le compte plaquettaire chez la souris. Les modèles de drosophiles ou de poissons zèbres ne sont pas utilisables dans le contexte de ce projet de recherche car les plaquettes sanguines sont phénotypiquement et mecanistiquement très différentes de celles de l'Homme, ce qui n'est pas le cas chez les rongeurs. Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte, système cardiovasculaire et métabolique mature).

5 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de trois vecteurs qui déclenche un cancer des voies biliaires, puis jusqu'à seize échographies sous anesthésie et trente-deux passages en résonance magnétique sur animal éveillé, auxquels s'ajoutent des vaccins viraux et jusqu'à six traitements de chimiothérapie ou d'immunothérapie. Le porteur annonce une cachexie, une fièvre passagère et un risque de péritonite lié aux injections répétées, et précise qu'aucun médicament de confort ne sera donné pendant les expériences pour ne pas brouiller les résultats immunitaires. Il conclut à l'impossibilité de mener cette étude autrement qu'in vivo, faute d'autre modèle permettant d'évaluer une vaccination et ses mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vaccins viraux comme nouvelle approche à la fois prophylactique et thérapeutique du cholangiocarcinome, un cancer agressif et encore mal pris en charge qui affecte les voies biliaires. L’objectif est de stimuler le système immunitaire afin, non seulement, de prévenir l’apparition de la tumeur, mais aussi de limiter sa progression et d’améliorer la réponse aux traitements existants.

Bénéfices attendus

Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5 sur 100.000 habitants en Occident. Il présente l’un des pronostics les plus sombres, avec moins d’un patient sur cinq encore en vie après cinq ans, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cholangiocarcinome.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection de 3 vecteurs pour l’induction tumorale (1 minute par souris vigile, 1 fois). Toutes les souris seront soumises à des examens par: échographie sous anesthésie (10 minutes par animal, 1 fois par semaine, 16 fois maximum) et résonance magnétique nucléaire sur animal vigile (2 minutes par animal, 2 fois par semaine, 32 fois maximum). Toutes les souris seront soumises à des injections pour la vaccination virale (pour un maximum de 2 au total, une minute par souris par jour, la moitié sous anesthésie). Une partie des souris sera soumise à des traitements de chimiothérapie et/ou immunothérapie (pour un maximum de 6 au total, moins d’une minute par souris vigile).

Impact sur les animaux

L’induction tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie) et peut induire une gêne chez l’animal. L’anesthésie peut induire de l’hypothermie et de la détresse respiratoire. L’administration de virus pourrait induire une fièvre transitoire. Les traitements de chimiothérapie et immunothérapie peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et un risque de péritonite associé aux administrations fréquentes. Les sites d’injections peuvent s’infecter. La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront euthanasiés selon une méthode réglementaire. La procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Cette étude consiste à évaluer l’efficacité prophylactique et/ou thérapeutique de vaccins viraux dans un modèle de cholangiocarcinome orthotopique. Ces vaccins viraux ont été développés, in vitro, par clonage de 13 antigènes identifiés (ex vivo) par des analyses immunopeptidomiques et immunologiques complémentaires. Cette étude peut être conduite seulement in vivo car il n’y a pas d’autres modèles pour pouvoir étudier l’efficacité de la vaccination virale et ses mécanismes, notamment immuno-dépendants, vu sa complexité.é.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 5296 souris. Pour sa réalisation, des groupes de 16 souris (8 femelles et 8 mâles) seront utilisés afin de garantir une évaluation statistique robuste des effets analysés. Nous appliquerons des tests statistiques appropriés pour comparer l’effet étudié entre les groupes, les croissances tumorales et la survie des animaux. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lorsque cela est possible. Le nombre d’animaux pourra être réduit à la baisse si les hypothèses sont validées au cours des premières expériences. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront soumis à 7 jours d’acclimatation dès leur arrivée dans la structure. Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger et tunnels en cartons). Les souris seront soumises à un suivi quotidien afin d’évaluer leur niveau de stress et leur poids sera mesuré une fois par semaine tout au long de l’expérience de croissance tumorale. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées à la fin de l’étude ou en cas d’atteinte de ces points limites préétablis. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Toutes les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie, tapis chauffants, ...). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - Notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire efficient.