Oncologie

Relever la température hivernale des bassins piscicoles pour réduire la facture de refroidissement, voilà le débouché annoncé à court terme. 225 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 d'entre elles étant ensuite réutilisées dans une autre expérience ou versées comme géniteurs dans une pisciculture, les autres tuées pour le prélèvement des ovaires. Chaque poisson est sorti de l'eau, anesthésié, sexé par échographie et pucé sous la peau, et 90 femelles subissent en plus l'introduction d'une canule dans l'orifice génital. La récupération des pontes et du sperme, elle, se fait sans anesthésie, par pression sur l'abdomen, pour ne pas altérer la qualité des gamètes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux entiers, les cultures de gonades ne permettant pas le développement complet des cellules reproductrices.

Objectifs

Les poissons des régions tempérées sont souvent sensibles aux variations de stimuli environnementaux présentant une saisonnalité. Tout écart important de ces stimuli par rapport à une situation normale, à laquelle est adaptée l’espèce cible, pourrait compromettre leur reproduction. Ainsi, le succès de reproduction d’une espèce dépend de sa capacité de résilience face aux écarts de ces stimuli par rapport à une référence. Le contrôle des étapes de production des cellules reproductrices femelles (l’ovogenèse) dépend notamment de variations de température chez la perche commune (Perca fluviatilis). Cette espèce, d’intérêt aquacole, peut être élevée avec succès dans des conditions captives dans lesquelles les variations thermiques saisonnières sont mimées. Il a été montré, dans ces conditions, qu’une exposition prolongée à une température de 6°C (vernalisation) durant l’ovogenèse garantissait l’obtention d’ovules de bonne qualité (avec cependant une très grande variation). En revanche, si la température de vernalisation ne descendait qu’à 14°C, l’ovogenèse s’arrêtait. Nous n’avons aucune donnée pour des températures intermédiaires. Or, dans les conditions environnementales actuelles, des écarts de cette température de vernalisation pourraient apparaitre plus fréquemment. Dans la cascade d’évènements qui lient la température au contrôle de la reproduction, on cite des modifications moléculaires sur l’ADN qui n’induisent pas de mutation. Toutefois la régulation des gènes est modifiée, conduisant potentiellement à des variations du contenu cellulaire. En effet, ces transformations chimiques sont effectuées par des protéines sensibles aux variations thermiques. Ainsi les œufs des poissons pourraient avoir une composition différente qui pourraient influencer leur qualité et la santé de la descendance. Ce projet porte sur la perche commune, un poisson d’eau tempérée dont les conditions de reproduction normales sont connues et reproductibles en bassins. Il est prévu d’étudier le succès de la reproduction lorsque les animaux sont soumis à des températures de vernalisation de 6, 8 et 10°C. En parallèle, les modifications du génome seront étudiées au cours de l’ovogenèse pour comprendre le lien potentiel entre des changements environnementaux et le succès de reproduction chez cette espèce.

Bénéfices attendus

La perche est une espèce d’intérêt aquacole et de haute valeur commerciale dans plusieurs pays européens. Son élevage peut être fait soit dans des étangs où elle est soumise aux variations climatiques conduisant régulièrement à des écarts thermiques en hiver, soit dans des bassins en circuit fermé pour lesquels les variations de température et photopériode (durée du jour et de l’obscurité au cours d’une journée) naturelles sont mimées artificiellement. Dans ce dernier cas, la température hivernale pour la perche commune est réglée à 6°C conformément aux résultats scientifiques obtenus chez cette espèce. L’augmentation du coût de l’énergie conduit les fermes aquacoles à revoir leurs pratiques et il devient souhaitable de déterminer s’il serait possible d’augmenter la température hivernale ce qui permettrait de réduire les besoins liés au refroidissement de l’eau. A court terme, cette information sur la qualité des gamètes mâles (analyse en microscopie) et femelles (analyse du succès de reproduction) en fonction de la température permettra de déterminer s’il est possible de changer la température hivernale. A moyen terme, ces données pourraient être partagées avec d’autres scientifiques pour intégrer des modèles prédictifs de l’effet d’un réchauffement de la température hivernale de 2 ou 4°C par rapport aux conditions normales dans le milieu sauvage ce qui aurait des répercussions tant pour l’élevage en étang que pour la survie de cette espèce en milieu sauvage. Enfin à moyen et plus long terme, ce travail favorisera une meilleure compréhension des interactions entre les variations de température, la qualité des gamètes femelles à l’échelle cellulaire et moléculaire. En effet, il sera intéressant d’étudier simultanément les données sur les régulations moléculaires dans les ovocytes qui pourraient avoir pour conséquence de modifier la composition des œufs et ainsi influencer le succès de développement chez une espèce sensible aux variations de température d’eau douce tempérée.

Procédures

Les poissons du projet seront soumis à une échographie sous anesthésie générale pour déterminer leur sexe (il n’y a pas de dimorphisme sexuel chez la perche). Lors de cette anesthésie, une puce électronique est injectée sous la peau à l’aide d’une aiguille pour pouvoir ensuite identifier chaque individu (sexe et numéro) : 150 femelles et 75 mâles seront ainsi retenus pour le projet. L’ensemble des deux procédures dure 2 à 3 minutes pour chaque individu. Avant la saison de ponte, le stade de maturation ovocytaire des femelles sera déterminé pour évaluer le moment de la ponte des différents individus : pour cela, une canule sera introduite dans l’orifice génital sous anesthésie générale pour prélever quelques ovocytes. Cette procédure dure 1 à 2 minutes et concernera 90 femelles. A la fin du projet, une fécondation artificielle devra être réalisée pour étudier la qualité des pontes. Pour cela, les pontes et le sperme sont récupérés en une minute en exerçant une légère pression sur l’abdomen des individus. Cette procédure est pratiquée sans anesthésie pour ne pas compromettre la qualité des gamètes, et concernera 90 femelles et 37 mâles. Toutes ces procédures sont pratiquées couramment dans les fermes piscicoles.

Impact sur les animaux

Les manipulations de poissons nécessitent de sortir les animaux de l’eau ce qui pourrait engendrer un stress chez les animaux. De plus, l’injection d’une puce électronique et la canulation impliquent des nuisances liées à la l’introduction d’une aiguille ou d’une canule. Cela pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections quelques jours après l’intervention même si ces dernières sont rares.

Devenir

A la fin de l’expérience, hormis les femelles utilisées pour les prélèvements d’ovaires, l’ensemble des perches communes (Perca fluviatilis) seront gardées en vie. Les géniteurs (75 mâles et 90 femelles restantes) seront alors, selon les besoins expérimentaux au laboratoire à la fin de l’expérience soit réutilisés dans une nouvelle expérimentation, soit réhabilités comme géniteurs dans une pisciculture.

Remplacement

L’étude de l’effet de la température sur le contrôle de la production des ovules et spermatozoïdes implique des liens physiologiques entre différents organes parmi lesquels le cerveau, les gonades ou le foie. Ces organes diffusent par voie sanguine des hormones dont la concentration peut varier entre les conditions de vie des poissons (bassins à des températures différentes). Même si plusieurs hormones potentiellement impliquées sont connues, nous ne pouvons pas contrôler l’ensemble de ces signaux extracellulaires. Aussi, il est indispensable de nous assurer une réponse physiologique complète des individus qui permettront des régulations fines de la progression de l’ovogénèse au niveau cellulaire et moléculaire. Cette expérience implique donc de devoir travailler sur animaux entiers. Si les cultures de gonades se sont développées ces dernières années, elles ne permettent pas de réaliser un développement complet des cellules reproductrices.

Réduction

La perche commune vit en bancs dans le milieu sauvage. Pour son bien-être en conditions captives, il est nécessaire de reproduire ce mode de vie tout au long du cycle de reproduction. De plus, il est possible que des interactions comportementales ou à l’aide de phéromones puissent influencer la progression du cycle de reproduction. Nous souhaitons minimiser les différences entre les groupes et avons décidé d’établir des groupes homogènes entre les 3 conditions avec 50 femelles et 25 mâles dans chaque bassin. Une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet de focaliser nos études sur un nombre de femelles et mâles adapté à nos besoins au départ. Le nombre de 50 femelles par condition a été établi en tenant compte des prélèvements tout au long du cycles (20 femelles par bassin pour l’expérience entière), de la mortalité éventuelle observée en conditions d’élevage et du fait que nous voulons mettre en évidence la diversité de qualité des ovules (étude de 15 pontes par condition pour effectuer une analyse statistique fiable). En effet, certaines femelles peuvent ne pas engager d’ovogenèse conduisant à l’absence de ponte. Concernant les mâles, 25 seront placés dans chaque bassin, leur présence est nécessaire pour le bon déroulement du cycle de reproduction. Ce nombre nous permettra de garantir l’obtention de sperme frais pour féconder toutes les pontes étudiées même à partir d’une condition même si les mâles des autres conditions ne sont pas spermiants.

Raffinement

Les procédures de puçage, de sexage ou de canulation peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (canulation ou sexage) ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage). De ce fait, les animaux seront préalablement anesthésiés pour limiter le stress et éviter la douleur. Même si les infections sont rares, les animaux seront surveillés de façon accrue la semaine suivant l’implantation de la puce ou la canulation. Le matériel utilisé est stérile ou désinfecté. Si nécessaire, un protocole de traitement mis en place au laboratoire sera utilisé. Les étapes de prélèvement de sperme ou des pontes chez les femelles sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulé seront stimulés. Ces critères sont visibles dès les premiers instants de manipulation des poissons. L’absence de sperme chez les mâles, ou d’une cloque sur l’orifice génital chez les femelles nous conduira à replacer immédiatement l’animal dans le bassin. La stimulation des individus correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale quelques jours avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin sur quelques jours (6-7 j/par bassin) et nous disposerons de 3 bassins. Cette organisation diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en favorisant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés également.

Choix des espèces

La perche commune (Perca fluviatilis) est une espèce d’intérêt aquacole pour laquelle l’amélioration du contrôle de la reproduction peut avoir des retombées économiques importantes. De plus, contrairement à de nombreux autres modèles, il s’agit d’une espèce à ovogénèse synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément selon un cycle contrôlé par des changements de photopériode et de température. Il est donc possible de comparer l’effet de variations de ces conditions à l’échelle moléculaire et cellulaire ainsi que leurs conséquences sur la génération suivante. Théoriquement, l’ensemble des ovocytes se développent de la même manière mais ce résultat n’a pas encore été démontré au niveau des régulations moléculaires. Les connaissances actuelles sur la progression de l’ovogenèse chez cette espèce sont assez fines pour garantir une comparaison rigoureuse avec la progression de l’ovogenèse en comparant le contenu moléculaire de cellules individuelles lorsque la température varie. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares (qui ne se sont pas encore reproduits). Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondu pourraient provenir de lots différents, et la qualité des pontes est connue pour être affectée par les pontes précédentes. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.

Une injection de cellules dans le foie, par une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, fait pousser des tumeurs chez 280 souris. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec un stress lié à la contention et une gêne possible au niveau de la cicatrice. Le porteur affirme pourtant que les tumeurs se développent sans affecter l'animal de manière importante, au motif que le foie est peu innervé et que sa fonction reste intacte. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour collecter leur foie et l'analyser en immunohistochimie et en anatomopathologie.

Objectifs

Le virus de l’Hépatite B (VHB) infecte le foie humain, causant une hépatite virale sévère qui évolue souvent en cirrhose, puis en cancer du foie (carcinome hépatocellulaire, CHC). Le CHC constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, et il n’existe à ce jour pas de solution thérapeutique satisfaisante. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre l’infection par le VHB, plus de 300 millions de personnes sont déjà infectées, et l’on considère qu’environ 1 million de décès sont liés au virus chaque année. Le but de notre projet est de mieux comprendre comment l’insertion du virus dans l’ADN des patients infectés modifie l’organisation des chromosomes, afin d’éclairer les mécanismes par lesquels le VHB augmente fortement le risque de cancer du foie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment le virus de l’hépatite B perturbe le fonctionnement des cellules du foie et favorise l’apparition d’un cancer. En identifiant les mécanismes en jeu, notamment certains gènes qui jouent un rôle clé dans le développement de tumeurs, cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements, plus ciblés et plus efficaces. À terme, ces avancées pourraient non seulement profiter aux personnes atteintes de cancer du foie, mais aussi contribuer à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour d’autres types de cancers, comme ceux du poumon ou du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection des cellules dans le foie, nécessitant un acte chirurgical sous anesthésie (15 minutes par souris).

Impact sur les animaux

Les effets sont le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Il existe également un stress induit par la contention de l’animal,et une gêne possible liée à la cicatrice. Les animaux sont évalués quotidiennement pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies pour analyses liées au projet (immunohistochimie, anatomopathologie, biochimie,…).

Remplacement

Nous avons réalisé le plus d’expériences possible en laboratoire sur des cellules en culture. Cela nous a permis d’obtenir des résultats importants tout en limitant l’usage d’animaux. Cependant, pour comprendre réellement comment le virus de l’hépatite B favorise le développement du cancer du foie, nous devons maintenant passer à des expériences chez la souris. En effet, la formation et la croissance des tumeurs dépendent de nombreux facteurs qu’on ne peut pas reproduire entièrement dans une boîte de culture : l’environnement du foie, les interactions avec d’autres organes, et la réponse globale de l’organisme. Dès que nous aurons obtenu les informations nécessaires dans ce modèle, nous reviendrons au modèle de lignées cellulaires.

Réduction

Nous avons tout mis en œuvre pour utiliser le moins d’animaux possible dans ce projet. En collaboration avec notre service de statistiques, nous avons soigneusement calculé le nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il en ressort qu’il nous faut 10 animaux par groupe expérimental pour pouvoir répondre de manière rigoureuse à notre question scientifique. Par ailleurs, nous avons restreint nos expériences au strict nécessaire, en limitant à la fois le nombre de cellules testées et le nombre de moments d’analyse, afin de réduire au maximum l’impact sur les animaux tout en conservant la validité des résultats.

Raffinement

Nous avons soigneusement planifié et optimisé notre protocole expérimental, en suivant les recommandations européennes, afin de réduire au maximum les contraintes pour les animaux. Concrètement, nous avons choisi une anesthésie plus légère, réduit la durée de la chirurgie et utiliserons un tapis chauffant pour stabiliser la température corporelle, ainsi que l’application d’une crème réparatrice pour favoriser la cicatrisation. Ensuite, grâce à une grille de surveillance, nous suivrons les animaux quotidiennement pour intervenir si nécessaire et éviter qu’ils ne développent un inconfort lié à la tumeur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (pathologie chez l'adulte).

Une greffe chirurgicale de cellules tumorales dans le foie, sous anesthésie, de cinq à dix minutes, est pratiquée sur des souris dont une partie a déjà reçu une injection à quinze jours de vie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie et leur rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de mesurer l'effet d'une protéine du virus de l'hépatite B sur les cellules immunitaires qui entourent la tumeur, à un stade précoce de cancer du foie. Le porteur annonce des douleurs de suture et des complications per-opératoires possibles, hypothermie et saignement, et mentionne l'injection pratiquée à quinze jours de vie sans jamais dire ce qu'elle contient.

Objectifs

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se développe souvent sur un terrain cirrhotique associé à une inflammation chronique. Le virus de l’hépatite B (VHB) est le facteur de risque majeur du CHC. Le CHC est la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Des travaux de recherche ont montré une corrélation entre certaines formes virales du VHB et la sévérité de l’atteinte hépatique jusqu’au cancer du foie. Ce projet a pour objectif de développer des travaux, portant sur l'impact de ces formes virales, via la modulation de la réponse immunitaire, au cours de la carcinogenèse hépatique. L’un des mécanismes semble passer par la modulation de l'infiltration immunitaire intratumorale. L'objectif est de caractériser la composante immunitaire dans le microenvironnement tumoral (TME) en présence de ces différentes formes virales. A l'aide de nouvelles approches et modèles expérimentaux, le mécanisme de l'impact pro-tumoral de ces formes virales du VHB à un stade cancer du foie précoce sera étudié. Ce projet présente l'avantage d'étudier spécifiquement le stade précoce du CHC établi (3 semaines post-transplantation)

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes associés à la modulation de la carcinogenèse hépatique liée à l’infection par le virus de l'hépatite B (VHB), qui pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques améliorant la prise en charge de carcinome hépatocellulaire de patients. La principale hypothèse est qu'une protéine du VHB module le micro-environnement tumoral facilitant l’activité pro-tumorale de certaines sous populations immunitaires. Grâce aux modèles murins, la modulation de l'activité et/ou du recrutement de l'infiltrat immunitaire intra/péritumoral par cette protéine virale, exprimée dans les hépatocytes, sera déterminée. À terme, ces travaux de recherche pourraient permettre de bloquer ces interactions intercellulaires et, en conséquence, la progression du carcinome vers un stade tardif.

Procédures

Une injection unique à 15 jours de vie (une fois par animal concerné, d'une durée de 5 secondes) sur souris vigiles. Une injection de cellules tumorales du foie murin sera réalisée par greffe : cette transplantation chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et couverte par des antalgiques en pré-opératoire, et en post-opératoire. Cette intervention ne sera réalisée qu'une fois par animal et sa durée est évaluée entre 5 à 10 minutes. Une euthanasie sera réalisée à la fin du projet de recherche à l'aide d'une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La manipulation des souris, en particulier les injections, peuvent induire un stress et une douleur de courte durée au site d’injection ou encore une inflammation locale. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. La greffe au niveau du foie implique une chirurgie, les souris pourront donc éprouver de la douleur au niveau des sutures des plans cutanés et musculaires, ainsi que les complications per-opératoires (hypothermie, saignement) malgré une prise en charge médicamenteuse adaptée.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié sous anesthésie afin de prélever le foie et la rate et permettre de réaliser de nombreuses analyses post-mortem (histologie, quantification de paramètres cliniques, virologiques et immunologiques...) pour répondre à la question scientifique. Cet acte nécessaire sera réalisé par du personnel compétent et selon les bonnes pratiques d'euthanasie des animaux en utilisant une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous avons précédemment réalisé des cultures cellulaires en utilisant des modèles 2 et 3 dimensions de différentes lignées cellulaires et d'hépatocyes primaires afin d'étudier in vitro l'impact de l'expression de protéines du virus de l'hépatite B (VHB) sur la progression tumorale. Nous avons développé un modèle de co-culture en transwell permettant d'étudier les interactions entre les cellules d'hépatome exprimant ou non ces protéines du VHB et une sous-population immunitaire. Cependant, la mise en place d'un modèle in vitro récapitulant l'ensemble de la réponse immunitaire innée et acquise hépatique n'est pas encore disponible, même dans un modèle d'organoïdes multicellulaires. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers le modèle in vivo pour étudier l'impact de la présence d'une des protéines du VHB sur l'activation des différents acteurs du système immunitaire au cours du carcinome hépatocellulaire.

Réduction

Un total de 840 animaux seront inclus dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Des souris contrôles seront réutilisées, si possible, entre différentes procédures afin de réduire le nombre d'animaux. A l'issue des procédures, de nombreux tissus seront récupérés sur chaque souris (sang, foie, rate, éventuelles métastases tumorales) afin de permettre de réaliser un grand nombre d'analyses sur une même souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernée et un suivi quotidien sera assuré par un personnel formé et compétent. De plus, les cages seront raffinées par la présence de lanières Kraft et des abris en carton et installées sur des portoirs ventilés. Aucune souris ne sera isolée dans une cage. Les animaux seront manipulés uniquement par du personnel qualifié et sensibilité au bien-être animal. Les procédures nécessitant l'endormissement de l'animal sont raffinées avec un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié, la gestion du risque d’hypothermie par l’utilisation d’une lampe chauffante ou d'un tapis chauffant durant les manipulations des animaux sous anesthésie, et l’ajout d’un gel de protection oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire si besoin. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle murin génétiquement identique (syngénique) est un modèle parfaitement calibré à l'expérimentation animale. De plus, il existe une homologie relative avec l'Homme dans le fonctionement du système immunitaire et les interactions foie/autres tissus, que nous souhaitons explorer. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement, soit à 15 jours de vie soit de 7 à 10 semaines de vie. L'établlissement d'un cancer du foie au stade précoce nécessitera une période allant de 3 semaines à 6 mois de suivi selon les différents modèles expérimentaux.

1 460 killifish turquoise d'Afrique vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergés seuls dans des bacs de trois litres. Ils sont nourris un jour sur deux pendant quatre semaines, placés dans une eau refroidie de 3 °C, traités par des molécules dont le porteur reconnaît la toxicité possible, et une partie subit une amputation de la nageoire caudale pour génotypage. Un lot est laissé vieillir jusqu'à la mort naturelle ou jusqu'à une mise à mort sur signes cliniques. Les autres sont tués pour prélever leur sang et leurs organes, l'espèce ayant été choisie parce qu'elle est le vertébré à la durée de vie la plus courte en captivité, six mois. Le porteur conclut que ce poisson est un modèle "unique et indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certaines caractéristiques trés symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, ou (iii) l'impact d'une manipulation génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion ou du déclin cognitif par exemple. Ceci permettra d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutritionnelles afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Les seules interventions prévues au cours de ce protocole, sont des interventions de type nutritionnelle, avec la mise à jeûn intermittent qui consiste à nourrir les poissons un jour sur deux sur une durée de 4 semaines, intervention qui chez le poisson Killifish a par ailleurs donné lieu a une publication qui montre les effets bénéfiques sur l'animal avec un allongement de la durée de vie. En plus de cette intervention, certains groupes d'animaux auront une alimentation supplémentée avec des metabolites d'intêret suspectés de jouer un rolé majeur dans les flux métaboliques au cours du viellissement. Un génotypage par amputation de nageoire caudale est également prévu. Celle-ci sera réalisée une seule fois au cours de la vie des poissons concernés et seulement dans le cas où la transmission ne peut être détecter par la présence de sondes fluorescentes. D'autre part, pour activer le metabolisme des poissons, nous utiliserons une exposition "au froid", comme déja employé et publié par une équipe de recherche, qui a eu pour conséquences majeures d'allonger la durée de vie des poissons Killifish incubés dans une eau dont la temperature est reduite de 3°C.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent les conséquences du traitement avec des molécules naturelles ou synthétiques (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Amputation de la nageoire caudale : Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes.

Devenir

Au terme de la procédure 1 : - tous les animaux du lot 1 seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. - les animaux du lot 2 mourront de manière naturelle ou seront mis à mort lorsqu'ils présenteront des signes cliniques le nécessitant. Au terme des procédures 2 et 3, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. Si les expériences proposées sont concluantes (c’est-à-dire si les modifications génétiques sont effectivement obtenues et si un phénotype métabolique est observé), alors une nouvelle DAP sera soumise en vue de faire le suivi des élevages pour maintenir les lignées respirantes dans la zootechnie et établir les procédures en aval.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler 4 gènes. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle Turquoise Killifish font de ce poisson un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques.

Raffinement

Les animaux inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une température de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental.

Choix des espèces

Pour étudier les mécanismes en lien avec le viellissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce idoine, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur et de l'Homme. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un viellissement systémique, là aussi comparable aux rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration fonctionnelle in vivo et mécanistique post mortem. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.

Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.

Objectifs

Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.

Bénéfices attendus

La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.

Procédures

Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.

Devenir

Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.

Raffinement

Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.

Choix des espèces

Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.