Oncologie

Capturés à la ligne ou à la palangre, gardés en bassin de une à cinq heures, anesthésiés puis ouverts au niveau de l'abdomen pour y recevoir des marques, 600 bars européens et lieus jaunes adultes subissent aussi le prélèvement de quatre écailles et d'un fragment de nageoire caudale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et tous les poissons sont relâchés en mer, le porteur reconnaissant qu'elles peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. L'objet déclaré est de cartographier leurs habitats et leurs migrations pour la gestion des pêches de deux espèces commercialement importantes. L'effectif de 600 individus résulte d'un compromis entre le coût de l'opération et les 90 recaptures espérées, soit 15 % des poissons marqués.

Objectifs

Un manque de connaissance existe sur les habitats dont les poissons ont besoin pour se reproduire, se nourrir ou grandir, et sur leurs interactions. Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique. Ce projet cherchera également à combler ces lacunes par le déploiement d’un réseau de télémétrie acoustique et le suivi par marquage des déplacements des deux espèces de poissons. Nous analyserons les mouvements et migrations de ces deux espèces cibles, composantes importantes des écosystèmes littoraux étudiés et des espèces commercialement importantes pour la région.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi de répondre aux questions suivantes : Quels sont les habitats fréquentés par ces 2 espèces ? Quelles fonctions (alimentation, reproduction, croissance, etc.) permettent-ils de réaliser ? Existe-t-il des migrations saisonnières entre ces habitats ? La population est-elle composée de sous-populations ? Ce projet répondra à ces questions en suivant les mouvements et les comportements de ces espèces par télémétrie acoustique et par géolocalisation. Ces nouvelles connaissances seront utiles pour améliorer la gestion et l'exploitation durable de ces espèces.

Procédures

Les bars et lieus jaunes anesthésiés et analgésiés seront soumis à une seule intervention chirurgicale, d'une durée de 5 minutes, nécessaire à l'implantation de marques archive et acoustique dans la cavité abdominale. Un prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale, d'une durée de 2-3 minutes, sera réalisé afin de déterminer l'âge des individus et faire des analyses génétiques respectivement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables incluent : - Le stress à la capture (intensité légère pendant environ 15 min) - la période de captivité avant intervention (intensité légère pendant 1 à 5 heures) – L’implantation des marques internes (intensité modérée pendant 5 min) - L’implantation de la marque externe (intensité légère pendant 30 s) – Le prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale et le marquage externe au bleu Alcian (intensité légère pendant 2-3 minutes) – Le stress lors la phase de réveil en milieu captif (intensité légère pendant 5-10 min). Ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes.

Devenir

L'objectif de l'étude est d’analyser les mouvements et les migrations du bar européen et du lieu jaune au stade adulte en Manche afin de mieux comprendre la structure spatio-temporelle de ces populations et la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. L’ensemble des poissons capturés sera relâché dans le milieu naturel après leur marquage.

Remplacement

Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique, il n’est donc pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement.

Réduction

Le nombre de poissons par espèce a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Il est prévu de marquer, dans le milieu naturel, 600 poissons adultes (50%-70% bar européen et 30%-50% lieu jaune) sur 4 sites répartis en Manche. Ce nombre est un compromis entre le coût de l'opération et le nombre de recaptures escomptées de 15% en moyenne soit 22.5 poissons par site et 90 poissons au total, les recaptures par espèce devant être considérées comme représentatives des populations étudiées.

Raffinement

Les techniques de pêche n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés (ligne ou palangre). Les individus seront maintenus en groupe dans de grands bassins afin qu’ils aient un comportement normal et calme. Si les poissons ont un comportement agité, une sédation légère sera réalisée. Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés dans des seaux opaques avec couvercles. Nous utiliserons une épuisette et un linge humide pour manipuler le poisson, en couvrant leurs yeux et en protégeant leurs écailles. Nous utiliserons un antalgique et les surveillerons au moins deux heures avant de les relâcher dans le milieu naturel. Ce projet comporte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur le bar européen, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. Il existe un besoin de quantifier les mouvements de l'espèce pour la gestion des stocks Mer Celtique, Manche, Mer du Nord et Golfe de Gascogne. Le projet s’intéresse aussi au lieu jaune, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. La gestion de l'espèce repose actuellement sur trop peu de données et il existe un manque patent de connaissances sur l'écologie de cette espèce. La proportion attendue des espèces marquées sera égale ou pourra être légèrement plus forte pour le bar. Nous nous focaliserons sur le stade adulte, car il permettra d'améliorer nos connaissances sur les migrations de reproduction et les zones de reproduction, habitats essentiels à protéger pour exploiter durablement ces espèces.

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

Pour relier la stéatose du foie aux troubles cardiaques, 960 souris sont rendues obèses et diabétiques par un régime suivi pendant 16 à 24 semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux. S'y ajoutent une injection quotidienne pendant 12 à 24 semaines, deux injections par jour deux fois par semaine pour induire une fibrose du foie, des mises à jeun, des gavages avec risque de lésion de l'œsophage, six prises de sang en deux heures et des explorations cardiaques sous anesthésie. Le porteur indique qu'un traitement agissant sur la voie étudiée est déjà commercialisé contre des maladies auto-immunes et pourrait voir son indication étendue.

Objectifs

La prévalence des maladies métaboliques du foie (MASLD) est en constante augmentation et touche environ un tiers de la population mondiale. Les études de cohortes chez l’Homme ont révélé son lien complexe avec les maladies cardiovasculaires. La MASLD a été associée à un risque accru de cardiopathie métabolique (CM) incluant arythmie, cardiopathie ischémique et insuffisance cardiaque. L'impact de la MASLD sur la CM va au-delà des facteurs de risque traditionnels et prédit de manière indépendante le risque de mortalité cardiovasculaire. Ces observations soulignent la nécessité d'étudier les liens entre la MASLD et la CM pour comprendre comment les troubles métaboliques hépatiques peuvent influencer la pathogénèse de la cardiopathie métabolique.

Bénéfices attendus

Les stéatopathies métaboliques (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ 40 pourcent de la population mondiale. La morbi-mortalité cardiovasculaire représente la première cause de décès chez ces patients atteints de MASLD. Ce projet a pour but de comprendre le rôle d'un lipide particulier d’origine hépatique et de ses récepteurs cardiaques dans la physiopathologie de la cardiopathie métabolique. En effet, cet axe pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement de ces maladies étant donné que des agonistes de cette voie existent actuellement sur le marché et sont utilisés dans le cadre de maladies auto-immunes et inflammatoire. Ce traitement déjà sur le marché pourrait avoir une extension de son indication pour les patients avec MASLD présentant une cardiopathie métabolique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection pour l'administration d'un agent viral (sous anesthésie, une fois, quelques minutes) et seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, une injection par jour sera réalisée pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Pour les souris sous traitement induisant une fibrose hépatique, le nombre d'injections est porté à 2 par jour 2 fois par semaine. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h) ainsi que des analyses cardiaques (sous anesthésie, 2 fois car un pour l'enregistrement du rythme cardiaque à l'électrocardiogramme et un pour l'échographie cardiaque), 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (électrocardiogramme, échocardiographie) 2) les conséquences de la maladie hépatique (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 3) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose), mise à jeun avec la sensation de faim, risque de lésion/irritation oesophagienne lors du gavage 4) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques 5) la douleur ponctuelle liée à l'injection 6) risque de saignement ou d'hématome lors des injections.

Devenir

Une fois les explorations cardiaques réalisées au terme du régime et du traitement, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les tissus d’intérêt (tissus adipeux, foie et coeur) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme hépatique en cas de MASLD sur l’activité cardiaque. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 960 souris. Ce nombre a été calculé grace à un test de puissance afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau (Changement de la litière, jusqu'à deux fois par semaine si nécessaire, en cas de souillure par les urines liée à l'apparition d'un diabète induit par les différents régimes/traitement Nourriture hydratée en fond de cage pour les animaux obèses ou qui perdent du poids). Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés (anesthésie) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent. Lors des anesthésies, application d'un gel olphtalmique pour la protection oculaire, utilisation tapis chauffant (37 degrés celcius) pour limiter l’hypothermie durant l'anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. Sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Les animaux seront étudiés à partir de 6-8 semaines de vie car atteinte de la maturité sexuelle et les souris sont métaboliquement stables (arrêt de la croissance), et pour la reproductibilité et standardisation des résultats internationaux (les études déjà publiées travaillant sur l'obésité et le diabète utilisent ces souris à partir de ces âges)

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

Greffées sous la peau du flanc d'une tumeur sous anesthésie, puis traitées par quatre injections dans l'abdomen à l'état vigile, 2 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser les cellules immunitaires de leurs tumeurs, de leur rate et de leurs ganglions. Le projet cherche à savoir si l'absence d'une protéine dans certains globules blancs rendrait les traitements anticancéreux plus efficaces, question que le porteur juge hors de portée des expériences in vitro. Les 2 560 animaux ne sont justifiés que par une ligne, le nombre ayant "été déterminé par une méthodologiste", et la surveillance annoncée pour des souris porteuses de tumeurs se limite à trois passages par semaine.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de comprendre comment cette maladie fonctionne afin de trouver des traitements les plus efficaces possibles. NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues montrent que d’autres globules blancs appelés lymphocytes, possèdent également la protéine NLRP3. En l’absence de NLRP3, ces globules blancs ont une activité antitumorale marquée contre différents types de tumeurs. Ce projet a pour but d’évaluer si l’absence de NLRP3 dans ces globules blancs permettrait de rendre plus efficace les traitements anticancéreux

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - D’apporter des connaissances nouvelles sur le rôle de NLRP3 dans les globules blancs appelés lymphocytes - D’évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées sur le flanc sous anesthésie générale. Les différents traitements seront réalisés en intrapéritonéal sur souris vigiles (4 doses par souris, chaque injection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront injectées en sous cutanées dans le flanc. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée dans de très rares cas est la formation nécrose. De plus, la manipulation des souris et la contention de ses dernières peuvent engendrer un stress. L’injection des cellules tumorales en sous cutanées peut induire une légère douleur chez l’animal. Ces dernières se feront donc sous anesthésie à l’isofluorane. De même, l’injection des traitements en intrapéritonéal peuvent induire une légère douleur chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les cellules. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que deux fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences. Le nombre d'animaux a été déterminé par une méthodologiste.

Raffinement

Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Les injections sous cutanées se feront sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

Cinq jours d'administration orale par canule, une injection qui déclenche un état septique ou un sérum toxique pour les reins, puis pour un quatrième groupe un mois de régime hypergras : 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traceur fluorescent leur est ensuite injecté et un capteur fixé sur le dos, avec deux anesthésies successives pour la pose et le retrait, et quelques heures d'isolement. Le porteur annonce les atteintes attendues, irritation de la gorge, saignements, œdème, péritonite, prise de poids massive et pelage gras pour les souris rendues diabétiques, risque d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, les prélèvements post-mortem étant présentés comme le seul moyen d'obtenir les tissus recherchés.

Objectifs

Les maladies rénales, aigues ou chroniques, sont un problème majeur pour la santé publique, affectant des millions de personne dans le monde. Même si des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification des mécanismes responsables de leur progression, il n’existe aucun traitement spécifique permettant à l’heure actuelle de diminuer ou d’arrêter la progression des maladies rénales de manière probante. Par conséquent, la détection de la maladie à des stades très précoces ainsi que la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques sont d’une importance cruciale pour mettre au point un traitement efficace Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d'une protéine impliquée dans la mort de cellules de petits vaisseaux sanguins dans la maladie rénale. En effet, la surexpression de cette protéine est associée à une dégradation de la fonction rénale dans différents modèles de maladies rénales expérimentales. Plus précisément, nous avons récemment montré que cette protéineest fortement surexprimée dans des cellules qui assurent la fonction de filtration du rein et que cette surexpression conduit à une mortalité de ce type cellulaire dans des cultures de ces cellulesin vitro. L’objectif principal de ce projet est de définir le rôle de la protéine dans l’adaptation fonctionnelle et structurelle du rein en réponse à des agressions aigues et chroniques, glomérulaires ou vasculaires, en utilisant desmodèles de souris transgéniques pour lesquelles une surexpression ou bien une inhibition de la protéine d'intérêt est inductible dans le temps et de manière tissu spécifique. Ces expériences permettront de répondre à ces questions : La surexpression de la protéine peut elle induire ou aggraver la maladie rénale dans plusieurs modèles expérimentaux? A l'inverse, est ce que l’inhibition de la protéine peut ralentir la progression de l’insuffisance rénale ? Peut on mettre en place une stratégie thérapeutique bloquant la surpression de la protéine afin de préserver la fonction rénale dans un contexte pathologique ?

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies rénales chroniques est en constante augmentation, affectant environ dix pour cent de la population mondiale, bien que beaucoup de cas restent non diagnostiqués en raison de leur évolution silencieuse. Une prise en charge précoce et une sensibilisation accrue sont essentielles pour prévenir leur progression vers l'insuffisance rénale terminale, nécessitant dialyse ou transplantation. Nous espérons que notre étude permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur cette protéine et la proposera comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance rénale. Nous effectuerons durant et après ces protocoles différentes analyses fonctionnelles, histologiques, cellulaires et moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés . Ainsi, nous espérons faire un pas supplémentaire vers le développement de stratégies thérapeutique ciblant cette protéine afin de ralentir la progression des maladies rénales voire la faire régresser.

Procédures

Un premier lot reçoit une administration orale une fois par jour pendant cinq jours, chaque session durant environ 30 secondes par animal. Ensuite, une administration unique est effectuée à l’état vigile, afin d’induire le modèle septique, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un deuxième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Deux administrations par voie veineuse sont ensuite effectuées sous anesthésie, afin d’induire le modèle, chacune prenant 10 secondes par souris. Un troisième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Une seule administration d’une molécule est ensuite effectuée à l’état vigile, pour induire le modèle, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un quatrième lot reçoit un régime hyper gras. Un inhibiteur génétique leur est administré deux fois par semaine pendant un mois, (30 sec par souris) à l’état vigile. Alternativement, un stimulateur sera ajouté à l’eau de boisson et administré durant 30 jours. Une mesure de la fonction rénale est réalisée sur les trois derniers lots grâce à une nouvelle technique nécessitant une anesthésie gazeuse. Cette procédure inclut l’administration d’un traceur fluorescent et l’installation d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal, pour une durée totale de cinq minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie est nécessaire pour retirer le capteur, ce qui prend environ deux minutes. En fin de protocole, les quatre lots font l’objet d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie (une minute par souris), suivi de l’euthanasie des animaux selon une méthode règlementaire, en vue des analyses et prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Un premier lot d’animaux subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique pour induire le modèle septique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le modèle pourra induire une perte d’activité et de poids et une élévation de la température. Un second lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique de sérum toxique pour les reins associé à un risque de saignement et œdème. Cette administration étant effectuée sous anesthésie générale courte, les nuisances de l’anesthésie sont ici très limitées. Un troisième lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration d’une molécule toxique pour les reins pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Un quatrième lot d’animaux diabétiques sera exposé à un régime riche en lipide qui s’accompagne d’une prise de poids massive, d’un soin altéré avec un pelage gras, d’une activité réduite avec un risque infectieux plus important. Une partie des animaux seront traitée par administrations répétés pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Il y a aussi un risque de péritonite et de saignements liés aux administrations répétées. Une autre partie sera traitée via l’eau de boisson pouvant conduire à une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie des souris. Les trois derniers lots subiront une mesure de la fonction rénale incluant deux anesthésies de courte durée pour la pose et le retrait du capteur pouvant induire un stress, un risque de saignement et d’œdème associé à l’administration du traceur fluorescent nécessaire à la mesure et un stress social lié à l’individualisation durant quelques heures. Tous les animaux subiront un prélèvement sanguin en fin de période de maintien sous anesthésie. L’anesthésie générale pourra conduire à des complications telles que : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de notre protéine cible sur le rein est la modification de la fonction rénale, qui est mesurée soit pas dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter individuelle du phénotype étudié dans nos modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique dédié aux calculs de puissance statistique avec comme paramètre principal la mesure de la fonction rénale. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 620 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour les souris diabétiques il y a des mesures de raffinement supplémentaires, change plus régulier à cause de la polyurie, nombre réduit de souris par cages et bâton à ronger à cause des croquettes molles riches en gras. En dehors d'une courte période d’hébergement individuel limité à deux heures pendant une mesure, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière. L'administration orale aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, la prostration, l'hérissement du pelage. Administration : Il existe aussi un risque de saignement qui sera limité par l’utilisation d’aiguille fines et leur réalisation par du personnel expérimenté. L’anesthésie permet de limiter la douleur pour certaines administrations, qui seront suivies d’une application de gel ophtalmique pour limiter l’inconfort. Pour diminuer les risques de détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique liés à l’anesthésie, les souris seront placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce: modèles bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique , plus que dans d'autres espèces. possibilités de tester l'implication de la voie de signalisation de la protéine cible dans l'insuffisance rénale grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. Concernant le stade de développement: Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore des signes de vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.

Relever la température hivernale des bassins piscicoles pour réduire la facture de refroidissement, voilà le débouché annoncé à court terme. 225 perches communes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 165 d'entre elles étant ensuite réutilisées dans une autre expérience ou versées comme géniteurs dans une pisciculture, les autres tuées pour le prélèvement des ovaires. Chaque poisson est sorti de l'eau, anesthésié, sexé par échographie et pucé sous la peau, et 90 femelles subissent en plus l'introduction d'une canule dans l'orifice génital. La récupération des pontes et du sperme, elle, se fait sans anesthésie, par pression sur l'abdomen, pour ne pas altérer la qualité des gamètes. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur des animaux entiers, les cultures de gonades ne permettant pas le développement complet des cellules reproductrices.

Objectifs

Les poissons des régions tempérées sont souvent sensibles aux variations de stimuli environnementaux présentant une saisonnalité. Tout écart important de ces stimuli par rapport à une situation normale, à laquelle est adaptée l’espèce cible, pourrait compromettre leur reproduction. Ainsi, le succès de reproduction d’une espèce dépend de sa capacité de résilience face aux écarts de ces stimuli par rapport à une référence. Le contrôle des étapes de production des cellules reproductrices femelles (l’ovogenèse) dépend notamment de variations de température chez la perche commune (Perca fluviatilis). Cette espèce, d’intérêt aquacole, peut être élevée avec succès dans des conditions captives dans lesquelles les variations thermiques saisonnières sont mimées. Il a été montré, dans ces conditions, qu’une exposition prolongée à une température de 6°C (vernalisation) durant l’ovogenèse garantissait l’obtention d’ovules de bonne qualité (avec cependant une très grande variation). En revanche, si la température de vernalisation ne descendait qu’à 14°C, l’ovogenèse s’arrêtait. Nous n’avons aucune donnée pour des températures intermédiaires. Or, dans les conditions environnementales actuelles, des écarts de cette température de vernalisation pourraient apparaitre plus fréquemment. Dans la cascade d’évènements qui lient la température au contrôle de la reproduction, on cite des modifications moléculaires sur l’ADN qui n’induisent pas de mutation. Toutefois la régulation des gènes est modifiée, conduisant potentiellement à des variations du contenu cellulaire. En effet, ces transformations chimiques sont effectuées par des protéines sensibles aux variations thermiques. Ainsi les œufs des poissons pourraient avoir une composition différente qui pourraient influencer leur qualité et la santé de la descendance. Ce projet porte sur la perche commune, un poisson d’eau tempérée dont les conditions de reproduction normales sont connues et reproductibles en bassins. Il est prévu d’étudier le succès de la reproduction lorsque les animaux sont soumis à des températures de vernalisation de 6, 8 et 10°C. En parallèle, les modifications du génome seront étudiées au cours de l’ovogenèse pour comprendre le lien potentiel entre des changements environnementaux et le succès de reproduction chez cette espèce.

Bénéfices attendus

La perche est une espèce d’intérêt aquacole et de haute valeur commerciale dans plusieurs pays européens. Son élevage peut être fait soit dans des étangs où elle est soumise aux variations climatiques conduisant régulièrement à des écarts thermiques en hiver, soit dans des bassins en circuit fermé pour lesquels les variations de température et photopériode (durée du jour et de l’obscurité au cours d’une journée) naturelles sont mimées artificiellement. Dans ce dernier cas, la température hivernale pour la perche commune est réglée à 6°C conformément aux résultats scientifiques obtenus chez cette espèce. L’augmentation du coût de l’énergie conduit les fermes aquacoles à revoir leurs pratiques et il devient souhaitable de déterminer s’il serait possible d’augmenter la température hivernale ce qui permettrait de réduire les besoins liés au refroidissement de l’eau. A court terme, cette information sur la qualité des gamètes mâles (analyse en microscopie) et femelles (analyse du succès de reproduction) en fonction de la température permettra de déterminer s’il est possible de changer la température hivernale. A moyen terme, ces données pourraient être partagées avec d’autres scientifiques pour intégrer des modèles prédictifs de l’effet d’un réchauffement de la température hivernale de 2 ou 4°C par rapport aux conditions normales dans le milieu sauvage ce qui aurait des répercussions tant pour l’élevage en étang que pour la survie de cette espèce en milieu sauvage. Enfin à moyen et plus long terme, ce travail favorisera une meilleure compréhension des interactions entre les variations de température, la qualité des gamètes femelles à l’échelle cellulaire et moléculaire. En effet, il sera intéressant d’étudier simultanément les données sur les régulations moléculaires dans les ovocytes qui pourraient avoir pour conséquence de modifier la composition des œufs et ainsi influencer le succès de développement chez une espèce sensible aux variations de température d’eau douce tempérée.

Procédures

Les poissons du projet seront soumis à une échographie sous anesthésie générale pour déterminer leur sexe (il n’y a pas de dimorphisme sexuel chez la perche). Lors de cette anesthésie, une puce électronique est injectée sous la peau à l’aide d’une aiguille pour pouvoir ensuite identifier chaque individu (sexe et numéro) : 150 femelles et 75 mâles seront ainsi retenus pour le projet. L’ensemble des deux procédures dure 2 à 3 minutes pour chaque individu. Avant la saison de ponte, le stade de maturation ovocytaire des femelles sera déterminé pour évaluer le moment de la ponte des différents individus : pour cela, une canule sera introduite dans l’orifice génital sous anesthésie générale pour prélever quelques ovocytes. Cette procédure dure 1 à 2 minutes et concernera 90 femelles. A la fin du projet, une fécondation artificielle devra être réalisée pour étudier la qualité des pontes. Pour cela, les pontes et le sperme sont récupérés en une minute en exerçant une légère pression sur l’abdomen des individus. Cette procédure est pratiquée sans anesthésie pour ne pas compromettre la qualité des gamètes, et concernera 90 femelles et 37 mâles. Toutes ces procédures sont pratiquées couramment dans les fermes piscicoles.

Impact sur les animaux

Les manipulations de poissons nécessitent de sortir les animaux de l’eau ce qui pourrait engendrer un stress chez les animaux. De plus, l’injection d’une puce électronique et la canulation impliquent des nuisances liées à la l’introduction d’une aiguille ou d’une canule. Cela pourrait induire des nuisances comme une douleur ou des infections quelques jours après l’intervention même si ces dernières sont rares.

Devenir

A la fin de l’expérience, hormis les femelles utilisées pour les prélèvements d’ovaires, l’ensemble des perches communes (Perca fluviatilis) seront gardées en vie. Les géniteurs (75 mâles et 90 femelles restantes) seront alors, selon les besoins expérimentaux au laboratoire à la fin de l’expérience soit réutilisés dans une nouvelle expérimentation, soit réhabilités comme géniteurs dans une pisciculture.

Remplacement

L’étude de l’effet de la température sur le contrôle de la production des ovules et spermatozoïdes implique des liens physiologiques entre différents organes parmi lesquels le cerveau, les gonades ou le foie. Ces organes diffusent par voie sanguine des hormones dont la concentration peut varier entre les conditions de vie des poissons (bassins à des températures différentes). Même si plusieurs hormones potentiellement impliquées sont connues, nous ne pouvons pas contrôler l’ensemble de ces signaux extracellulaires. Aussi, il est indispensable de nous assurer une réponse physiologique complète des individus qui permettront des régulations fines de la progression de l’ovogénèse au niveau cellulaire et moléculaire. Cette expérience implique donc de devoir travailler sur animaux entiers. Si les cultures de gonades se sont développées ces dernières années, elles ne permettent pas de réaliser un développement complet des cellules reproductrices.

Réduction

La perche commune vit en bancs dans le milieu sauvage. Pour son bien-être en conditions captives, il est nécessaire de reproduire ce mode de vie tout au long du cycle de reproduction. De plus, il est possible que des interactions comportementales ou à l’aide de phéromones puissent influencer la progression du cycle de reproduction. Nous souhaitons minimiser les différences entre les groupes et avons décidé d’établir des groupes homogènes entre les 3 conditions avec 50 femelles et 25 mâles dans chaque bassin. Une méthode de sexage des perches par échographie, nous permet de focaliser nos études sur un nombre de femelles et mâles adapté à nos besoins au départ. Le nombre de 50 femelles par condition a été établi en tenant compte des prélèvements tout au long du cycles (20 femelles par bassin pour l’expérience entière), de la mortalité éventuelle observée en conditions d’élevage et du fait que nous voulons mettre en évidence la diversité de qualité des ovules (étude de 15 pontes par condition pour effectuer une analyse statistique fiable). En effet, certaines femelles peuvent ne pas engager d’ovogenèse conduisant à l’absence de ponte. Concernant les mâles, 25 seront placés dans chaque bassin, leur présence est nécessaire pour le bon déroulement du cycle de reproduction. Ce nombre nous permettra de garantir l’obtention de sperme frais pour féconder toutes les pontes étudiées même à partir d’une condition même si les mâles des autres conditions ne sont pas spermiants.

Raffinement

Les procédures de puçage, de sexage ou de canulation peuvent engendrer un stress du fait d’une manipulation prolongée hors de l’eau (canulation ou sexage) ou une douleur correspondant à l’introduction d’une aiguille (puçage). De ce fait, les animaux seront préalablement anesthésiés pour limiter le stress et éviter la douleur. Même si les infections sont rares, les animaux seront surveillés de façon accrue la semaine suivant l’implantation de la puce ou la canulation. Le matériel utilisé est stérile ou désinfecté. Si nécessaire, un protocole de traitement mis en place au laboratoire sera utilisé. Les étapes de prélèvement de sperme ou des pontes chez les femelles sont rapides (inférieur à 2 minutes) et seuls les animaux spermiants ou ayant ovulé seront stimulés. Ces critères sont visibles dès les premiers instants de manipulation des poissons. L’absence de sperme chez les mâles, ou d’une cloque sur l’orifice génital chez les femelles nous conduira à replacer immédiatement l’animal dans le bassin. La stimulation des individus correspond à une légère pression sur l’abdomen des poissons qui déclenche la ponte ou la libération de sperme. Si ces étapes risquent de stresser les animaux du fait de la pêche et de la vérification quotidienne des femelles, la rapidité de la procédure nous permet de ne pas les anesthésier. Pour éviter les stress répétés, nous avons décidé de regrouper les femelles en fonction de leur stade de maturation ovocytaire lors d’une évaluation globale quelques jours avant le début de la saison de ponte. Ceci nous permet de concentrer les pêches de poissons dans un bassin sur quelques jours (6-7 j/par bassin) et nous disposerons de 3 bassins. Cette organisation diminue le stress des poissons dans chaque bassin tout en favorisant une meilleure efficacité dans notre gestion de la saison de pontes. Les mâles seront également isolés dans un bassin pour éviter qu’ils soient trop stressés également.

Choix des espèces

La perche commune (Perca fluviatilis) est une espèce d’intérêt aquacole pour laquelle l’amélioration du contrôle de la reproduction peut avoir des retombées économiques importantes. De plus, contrairement à de nombreux autres modèles, il s’agit d’une espèce à ovogénèse synchrone pour laquelle tous les ovocytes se développent simultanément selon un cycle contrôlé par des changements de photopériode et de température. Il est donc possible de comparer l’effet de variations de ces conditions à l’échelle moléculaire et cellulaire ainsi que leurs conséquences sur la génération suivante. Théoriquement, l’ensemble des ovocytes se développent de la même manière mais ce résultat n’a pas encore été démontré au niveau des régulations moléculaires. Les connaissances actuelles sur la progression de l’ovogenèse chez cette espèce sont assez fines pour garantir une comparaison rigoureuse avec la progression de l’ovogenèse en comparant le contenu moléculaire de cellules individuelles lorsque la température varie. Les animaux utilisés seront des adultes matures et primipares (qui ne se sont pas encore reproduits). Nous choisissons de travailler avec des animaux primipares car ils sont plus jeunes et proviennent le plus souvent d’un même groupe d’animaux ayant été élevés en même temps dans les mêmes conditions. Au contraire, des animaux ayant déjà pondu pourraient provenir de lots différents, et la qualité des pontes est connue pour être affectée par les pontes précédentes. Nous réduisons ainsi le risque que les animaux aient des histoires différentes ce qui pourrait éventuellement affecter le processus étudié et donc augmenter les variations individuelles qui pourraient interférer avec nos résultats. Nous pensons que le travail avec des primipares nous permettra de diminuer cette variabilité individuelle sans pour autant l’éviter complètement.