Oncologie

540 souris vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à vingt-quatre prélèvements sanguins sur douze semaines de régime gras et sucré, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chez les autres, une injection unique détruit une partie des cellules du pancréas pour provoquer un diabète. Toutes reçoivent ensuite une mini-pompe implantée sous la peau lors d'une chirurgie de quinze minutes, puis passent un test de tolérance au glucose ou à l'insuline précédé de cinq heures de jeûne. Le porteur écrit que l'induction du diabète est "malheureusement strictement nécessaire", et que la mise à mort l'est tout autant, les organes devant être prélevés.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies à l’aide d’un traitement chronique. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs administrés de manière continue pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang.

Procédures

Une partie des animaux connaitra une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule nocive pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 5 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Une autre partie des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal à raison de 24 prélèvements par animal sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite implantées par des mini-pompes en sous cutané lors d’une unique chirurgie effectuée sous anesthésie générale et analgésie afin de délivrer notre traitement en continue durant 28 jours. Cette chirurgie sera de 15 minutes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen avec une solution et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur la pose de mini-pompes en sous-cutané qui implique une courte chirurgie effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte pourrait causer différentes contraintes liées à l’acte chirurgicale lui-même et notamment des douleurs post-opératoires et les risques inhérents à une chirurgie (stress thermique ou arrêt cardio-respiratoire lors de l’anesthésie, inflammation locale au niveau des cicatrises ou encore dans de très rare cas une infection). Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés. La première contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Nous assurerons un change supplémentaire des animaux dans le cas où une polyurie (production excessive d’urine) est constatée afin d’assurer un confort optimal d’hébergement. La deuxième contrainte concerne la procédure chirurgicale d’implantation de mini-pompes en sous cutané au niveau dorsale pour ne pas gêner les déplacements qui sera réalisée dans des conditions aseptiques, sous anesthésie générale et avec une prise en charge de la douleur à l’aide d’analgésique. Un soutien thermique (plateau chauffant) sera également apporté tout au long de la chirurgie pour limiter le stress thermique au cours de l’anesthésie générale. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésie, soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements administrés en continue pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

Injectées de cellules de lymphome T dans la veine ou directement dans la rate au cours d'une chirurgie, 743 souris immunodéprimées enchaînent ensuite jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie générale et cinq prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le développement de la tumeur peut provoquer un gonflement de l'abdomen et un déficit moteur des membres postérieurs. L'objectif est de mesurer l'efficacité de cellules CAR-T modifiées pour persister plus longtemps dans l'organisme, avec une production en laboratoire espérée d'ici cinq à dix ans. Toutes sont tuées à l'issue, leur sang et leurs organes prélevés pour compléter l'analyse d'efficacité et d'innocuité.

Objectifs

Les cellules CAR-T correspondent à un nouveau type de traitement qui utilise les cellules immunitaires du patient pour attaquer la tumeur, après modifications génétiques au laboratoire. Ces traitements ont révolutionné la prise en charge de certains cancers du sang et l’enjeu principal actuel est d’étendre l’utilisation de ces thérapies à d’autres types de cancer. Dans ce projet, nous nous intéressons à un cancer du sang rare, les lymphomes T, et nous avons développé un nouveau type de cellules CAR-T pour tenter de guérir cette maladie extrêmement agressive sans véritable traitement efficace à ce jour. Ces cellules CAR-T s’attaqueront spécifiquement à la tumeur grâce à des modifications génétiques additionnelles, qui leur permettront de persister plus longtemps dans l’organisme pour une meilleure efficacité. Les objectifs principaux de cette étude sont : - Évaluer l’efficacité antitumorale de ces nouvelles cellules CAR-T dans différents modèles murins et définir la dose minimale efficace, - Valider notre stratégie de modification génétique pour améliorer l’efficacité de ce traitement, - Évaluer la sécurité d’emploi de ce nouveau traitement. Ces résultats permettrons ensuite de valider l’évaluation de ce traitement chez l’homme dans le cadre d’un essai clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats in vivo générés dans le cadre de ce projet sont extrêmement importants pour valider le transfert de cette thérapie vers la clinique. L’objectif à moyen terme est de produire ces cellules CAR-T dans des laboratoires de recherche d’ici 5 à 10 ans, afin de proposer aux patients atteints de ces cancers du sang rares un traitement innovant potentiellement curatif.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Injection des cellules tumorales par voie intra veineuse, sous anesthésie générale (1x/souris, 5 minutes) - Injection des cellules tumorales dans la rate par voie chirurgicale, sous anesthésie générale (1x/souris, 15 minutes) - Imagerie sous anesthésie générale (maximum 12x/souris, 10 minutes), précédée de l’injection d’un produit de révélation de la tumeur sur souris vigile (maximum 12x/souris, 1 minute) - Prélèvements sanguins sous anesthésie locale (4x/souris, 5 minutes) ou anesthésie général (1x/souris, 5 minutes).

Impact sur les animaux

- Stress : l’ensemble des procédures, contentions et transports peuvent générer un stress chez la souris. - Douleurs légères : après injection intra veineuse ou abdominale, chirurgie, et prélèvement de sang. - Altération de l’état général : en lien avec le développement de la tumeur ou d’un éventuel effet secondaire du traitement. - Gonflement abdominal : en lien avec le développement de la tumeur. - Déficit moteur des membres inférieurs : en lien avec le développement de la tumeur. - Infection post-opératoire : en lien avec la chirurgie, risque nul en condition d’asepsie stricte. - Mauvaise cicatrisation : en lien avec la chirurgie, risque faible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure expérimentale. En effet, les animaux ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres procédures après l'injection de cellules tumorales. Le sang et les organes seront collectés lors de la mise à mort finale afin de compléter l’analyse de l’efficacité et de l'innocuité du traitement.

Remplacement

Ces nouveaux traitements basés sur l’utilisation des cellules immunitaires pour attaquer la tumeur sont préalablement testés in vitro à l’aide de lignées cellulaires pour remplacer les animaux. Ces résultats préliminaires nous permettent de déterminer les doses et les conditions d’intérêt à étudier plus en détail in vivo afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser par la suite. Néanmoins, les tests in vitro ne sont pas suffisants pour récapituler l’ensemble des mécanismes dynamiques immunitaires en jeu avec ces immunothérapies, ainsi que leurs effets multi-organes. Les expérimentations sur les animaux sont donc indispensables avant de passer aux études chez l’homme afin d’évaluer au mieux leur efficacité mais également leur profil de tolérance.

Réduction

Méthodologie de réduction du nombre des animaux nécessaires à l’expérimentation : - Évaluation in vitro approfondie sur les lignées cellulaires pour sélectionner un nombre restreint de conditions d’intérêt et de doses à tester pour l’étude in vivo. - Évaluation du nombre souris nécessaires et suffisantes pour garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables, à l’aide d’outils statistiques. - Utilisation d’un même groupe de souris contrôles non traitées pour évaluer l’efficacité de différents traitements CAR-T - Recueil du maximum d’information à partir de chaque animal, avec analyse chez un même animal de plusieurs paramètres : tests sanguins, imagerie longitudinale. - Les ressources cellulaires post-mortem seront mutualisées au sein de l’équipe de recherche afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris.

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux grâce à un suivi fréquent et adapté des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel animalier lors du change et les personnes en charge de l’expérimentation afin d’observer leur comportement, leur apparence et tous signes qui permettraient d’identifier des indications révélatrices de souffrance animale. Toutes les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et après application d’anesthésiques locaux. L’imagerie se fera sous anesthésie et les souris seront placées sur plateau chauffant pendant le suivi et pour le réveil afin de limiter l’hypothermie. Les chirurgies seront faites sous anesthésie et les souris recevront un analgésique, avant et jusqu’à 48h après la chirurgie. La chirurgie et le réveil se referont sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Une goutte de gel hydratant sera également appliquée sur chaque œil avant et après l'étape de chirurgie afin d'éviter un dessèchement. Les sutures seront surveillées régulièrement en post-opératoire afin de prévenir tout risque d’infection jusqu’à cicatrisation. Aucune chirurgie ne sera réalisée le vendredi pour permettre le suivi de 48h en semaine. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et extrapolables à l’homme. C’est également l’espèce où le plus d’outils sont actuellement disponibles pour permettre une étude approfondie et de répondre à notre question de recherche. Les souris immunodéprimées ont été décrites dans la littérature scientifique depuis plusieurs années comme le meilleur modèle pour greffer et étudier le développement des cancers du sang et servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies cellulaires. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 12 semaines en début de procédure, âge durant lequel la probabilité de prise de greffe est maximale selon les données de la littérature et l’expérience du laboratoire, et la tolérance au traitement est la meilleure. Cela permet aussi de comparer nos données aux autres données de la littérature qui utilisent de façon uniforme ces souris aux mêmes âges.

Immunodéprimées pour accepter sans rejet des cellules de mélanome humain, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leurs tumeurs et leurs organes. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour ou tous les trois jours pendant quatre semaines, une perfusion dans la veine de la queue et une séance d'imagerie de 30 minutes sous anesthésie. Le porteur teste un anticorps issu de son laboratoire face au traitement de référence, après des résultats sur cellules en culture qu'il juge prometteurs. La tumeur peut se nécroser et ulcérer la peau, ce qui déclenche alors une mise à mort anticipée.

Objectifs

Le mélanome est le cancer de la peau le plus agressif, et son nombre de cas augmente fortement. En France, il provoque plus de 2 000 décès par an (Inca, 2020). Lorsqu’il est détecté à un stade précoce, la chirurgie suffit généralement pour l’enlever. En revanche, s’il s’est déjà propagé dans l’organisme (métastases), le pronostic est très mauvais, avec une espérance de vie médiane d’environ 6 mois. Ces dernières années, de nouveaux traitements ont été développés, notamment des anticorps spécifiques et des médicaments ciblant certaines protéines impliquées dans la croissance des mélanomes. Cependant, ces traitements perdent souvent leur efficacité rapidement à cause du phénomène de résistance, empêchant une guérison durable. C’est pourquoi la recherche continue à explorer de nouvelles approches. Nous avons mis au point une molécule thérapeutique appelée "anticorps" capable de reconnaître une marque spécifique présente à la surface des cellules de mélanome. Nos premiers tests en laboratoire montrent que cet anticorps ralentit significativement la multiplication des cellules cancéreuses, comparé à un anticorps témoin. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le mélanome.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité de notre anticorps comme traitement contre le mélanome en testant son effet sur des modèles de souris porteuses de tumeurs humaines. Pour cela, nous injecterons des cellules de mélanome humain à des souris et comparerons l'effet de notre anticorps avec un anticorps témoin. Nous comparerons également son efficacité à celle du traitement de référence. L’intérêt principal de cette approche est de cibler uniquement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines, ce qui limiterait les effets secondaires. Nos premiers tests en laboratoire ont montré des résultats prometteurs, mais il est essentiel de confirmer cette efficacité dans un modèle vivant avant d’envisager une application chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à un examen d’imagerie, sous anesthésie générale, une seule fois, ainsi qu’à des injections quotidiennes ou tous les 3 jours dans l’abdomen sur animal vigile, pendant 4 semaines maximum. Concernant le produit de contraste pour l’imagerie, une perfusion sera installée au préalable dans la veine de la queue de la souris (sous anesthésie) afin de pouvoir injecter le produit de contraste lorsque la souris sera dans l’imageur. L'examen aura une durée maximale de 30 min.

Impact sur les animaux

Dans cette étude sur le mélanome, les souris peuvent subir plusieurs effets indésirables liés à la croissance tumorale, aux traitements administrés et aux procédures expérimentales. La formation de la tumeur peut entraîner une gêne locale, voire une douleur si elle atteint une taille importante, pouvant aussi causer une perte de poids ou une altération de l’état général. Dans certains cas, la tumeur peut évoluer vers une nécrose, conduisant à une inflammation locale ou à une ulcération cutanée nécessitant une euthanasie anticipée. Les injections répétées des molécules thérapeutiques dans l’abdomen peuvent provoquer un léger inconfort abdominal et certains traitements anticancéreux peuvent affecter la fonction hépatique ou rénale, se traduisant par une fatigue accrue. De plus, la contention régulière pour la mesure de la tumeur au pied à coulisse ainsi que les injections fréquentes peuvent générer du stress, bien que ces manipulations soient effectuées rapidement pour minimiser l’inconfort. Enfin, l’imagerie, bien que non invasive, nécessite une anesthésie par isoflurane, qui peut induire une légère hypothermie ou une récupération plus lente chez certains animaux. Afin de limiter ces effets indésirables, une surveillance rigoureuse est mise en place et des critères éthiques stricts sont appliqués pour éviter toute souffrance excessive des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs et de certains organes. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie ainsi que l’efficacité de l’anticorps évalué.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé grâce à des tests de puissance statistique. La mesure des tumeurs par pied à coulisse permet de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, des enrichissements (comme des tunnels, des dômes et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite pour que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près (taille de la tumeur, poids). À partir d’une certaine taille tumorale, les souris recevront une injection de substances thérapeutiques dans l’abdomen, tous les jours ou tous les 3 jours, associée à une récompense à base de céréales sucrées pour diminuer leur stress. Pour l’examen d’imagerie, les souris seront anesthésiées avec un gaz pour qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Si des signes de douleurs sont observés dans le cadre de mise en ouvre de cette procédure alors des molécules analgésiques seront administrées aux animaux. Par ailleurs des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Des souris mâles et femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le mélanome, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser les deux genres. De plus, des souris âgées de 6 semaines ont un poids suffisamment stabilisé pour évaluer l’efficacité de cette immunothérapie.

Greffées de cellules tumorales sous la peau, puis piquées de deux à sept fois pour recevoir des traitements, 800 souris voient leur tumeur mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec des douleurs locales liées à la croissance de la tumeur, et toutes les souris sont tuées pour prélever des organes. Le projet cherche à situer l'origine cellulaire ou tissulaire des signaux qui rendent la mort des cellules cancéreuses visible par le système immunitaire. Les retombées annoncées, des conditions thérapeutiques "transposables en applications cliniques", sont renvoyées au long terme.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un type de mort cellulaire déclenché dans le cadre de thérapies antitumorales comme les chimiothérapies. Il a été démontré qu'elle est déterminante pour l’effet à long terme de la thérapie anticancéreuse dans les contextes précliniques et cliniques. Elle implique un ensemble de motifs moléculaires associés aux dommages cellulaires. L'exposition et la libération spatiales et temporelles définies de ces motifs moléculaires dictent l'immunogénicité de la thérapie anticancéreuse. Il n’est pas encore démontré si une augmentation de l’effet de la tumeur ou des cellules malignes individuelles entraîne une immunogénicité. Cette incertitude a freiné l'exploration et l'application des traitements en lien avec la mort cellulaire immunogène. Les recherches visant à développer des mesures induisant ce mécanisme pour différents types d'entités tumorales bénéficieraient largement de la délimitation spatiale de l'émission de ces motifs et de leurs effets conséquents sur l'immunité antitumorale. Par conséquent, ce projet se concentrera sur l'élucidation du rôle et de l'origine (cellulaire ou tissulaire) des principaux motifs. Comprendre l’importance de ces motifs pour cette modalité de mort cellulaire immonogène et leurs modes d’interaction coopérative aidera les chercheurs à mieux mettre en œuvre lacette mort cellulaire dans différents types de tumeurs solides dans les thérapies cliniquement applicables.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider, dans des modèles précliniques, une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace contre plusieurs types de cancer, en association avec d'autres thérapies et immunothérapies. À court terme, nous espérons aborder la question de l'origine des motifs liés à la mort cellulaire immunogène, ce qui permettra d'affiner les stratégies de traitement anticancéreux. À plus long terme, nous prévoyons de définir des conditions thérapeutiques optimales transposables en applications cliniques.

Procédures

Les souris recevront une injection sous anesthésie générale (2 min). De plus, elles recevront entre deux et sept injections suivant la procédure (animal vigile, anesthésie locale, durée maximale 1min).

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de collecter divers organes pour des analyses immunologiques.

Remplacement

L'utilisation d'animaux vivants est essentielle car ce projet vise à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, et actuellement, il est impossible de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo à cause des limites des technologies actuelles.

Réduction

Ce projet prévoit d'utiliser un maximum de 800 souris, avec 10 souris par groupe dans les procédures. Les expériences seront regroupées autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux témoins. L'étude sera interrompue si la procédure initiale invalide l'hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) afin d'extraire un maximum de données pour chaque expérience. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Une analyse statistique a été réalisée pour calculer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou non selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Plusieurs justifications d’ordre scientifique, et pratique sont à la base du choix de la souris comme modèle préclinique, notamment le fait que la souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale. Cela permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, suffisamment grand pour une mise en place des méthodologies envisagées relativement aisée et dont la génétique est la mieux connue. La souris est le modèle le plus utilisé dans notre centre de recherche, ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la pratique expérimentale que nous avons acquise sur cette espèce est désormais confirmée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

Capturés à la ligne ou à la palangre, gardés en bassin de une à cinq heures, anesthésiés puis ouverts au niveau de l'abdomen pour y recevoir des marques, 600 bars européens et lieus jaunes adultes subissent aussi le prélèvement de quatre écailles et d'un fragment de nageoire caudale. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et tous les poissons sont relâchés en mer, le porteur reconnaissant qu'elles peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes. L'objet déclaré est de cartographier leurs habitats et leurs migrations pour la gestion des pêches de deux espèces commercialement importantes. L'effectif de 600 individus résulte d'un compromis entre le coût de l'opération et les 90 recaptures espérées, soit 15 % des poissons marqués.

Objectifs

Un manque de connaissance existe sur les habitats dont les poissons ont besoin pour se reproduire, se nourrir ou grandir, et sur leurs interactions. Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique. Ce projet cherchera également à combler ces lacunes par le déploiement d’un réseau de télémétrie acoustique et le suivi par marquage des déplacements des deux espèces de poissons. Nous analyserons les mouvements et migrations de ces deux espèces cibles, composantes importantes des écosystèmes littoraux étudiés et des espèces commercialement importantes pour la région.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie des espèces suivies et ainsi de répondre aux questions suivantes : Quels sont les habitats fréquentés par ces 2 espèces ? Quelles fonctions (alimentation, reproduction, croissance, etc.) permettent-ils de réaliser ? Existe-t-il des migrations saisonnières entre ces habitats ? La population est-elle composée de sous-populations ? Ce projet répondra à ces questions en suivant les mouvements et les comportements de ces espèces par télémétrie acoustique et par géolocalisation. Ces nouvelles connaissances seront utiles pour améliorer la gestion et l'exploitation durable de ces espèces.

Procédures

Les bars et lieus jaunes anesthésiés et analgésiés seront soumis à une seule intervention chirurgicale, d'une durée de 5 minutes, nécessaire à l'implantation de marques archive et acoustique dans la cavité abdominale. Un prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale, d'une durée de 2-3 minutes, sera réalisé afin de déterminer l'âge des individus et faire des analyses génétiques respectivement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables incluent : - Le stress à la capture (intensité légère pendant environ 15 min) - la période de captivité avant intervention (intensité légère pendant 1 à 5 heures) – L’implantation des marques internes (intensité modérée pendant 5 min) - L’implantation de la marque externe (intensité légère pendant 30 s) – Le prélèvement de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale et le marquage externe au bleu Alcian (intensité légère pendant 2-3 minutes) – Le stress lors la phase de réveil en milieu captif (intensité légère pendant 5-10 min). Ces procédures peuvent occasionner des mortalités directes ou indirectes.

Devenir

L'objectif de l'étude est d’analyser les mouvements et les migrations du bar européen et du lieu jaune au stade adulte en Manche afin de mieux comprendre la structure spatio-temporelle de ces populations et la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. L’ensemble des poissons capturés sera relâché dans le milieu naturel après leur marquage.

Remplacement

Cette étude vise à caractériser les habitats marins utilisés par le bar européen et le lieu jaune dans leur milieu naturel, et à analyser les comportements migratoires entre les habitats essentiels de ces populations naturelles. Ces processus sont le résultat d’interactions complexes entre des individus et leur environnement physique et biologique, il n’est donc pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement.

Réduction

Le nombre de poissons par espèce a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Il est prévu de marquer, dans le milieu naturel, 600 poissons adultes (50%-70% bar européen et 30%-50% lieu jaune) sur 4 sites répartis en Manche. Ce nombre est un compromis entre le coût de l'opération et le nombre de recaptures escomptées de 15% en moyenne soit 22.5 poissons par site et 90 poissons au total, les recaptures par espèce devant être considérées comme représentatives des populations étudiées.

Raffinement

Les techniques de pêche n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés (ligne ou palangre). Les individus seront maintenus en groupe dans de grands bassins afin qu’ils aient un comportement normal et calme. Si les poissons ont un comportement agité, une sédation légère sera réalisée. Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés dans des seaux opaques avec couvercles. Nous utiliserons une épuisette et un linge humide pour manipuler le poisson, en couvrant leurs yeux et en protégeant leurs écailles. Nous utiliserons un antalgique et les surveillerons au moins deux heures avant de les relâcher dans le milieu naturel. Ce projet comporte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur le bar européen, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. Il existe un besoin de quantifier les mouvements de l'espèce pour la gestion des stocks Mer Celtique, Manche, Mer du Nord et Golfe de Gascogne. Le projet s’intéresse aussi au lieu jaune, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. La gestion de l'espèce repose actuellement sur trop peu de données et il existe un manque patent de connaissances sur l'écologie de cette espèce. La proportion attendue des espèces marquées sera égale ou pourra être légèrement plus forte pour le bar. Nous nous focaliserons sur le stade adulte, car il permettra d'améliorer nos connaissances sur les migrations de reproduction et les zones de reproduction, habitats essentiels à protéger pour exploiter durablement ces espèces.

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

Pour relier la stéatose du foie aux troubles cardiaques, 960 souris sont rendues obèses et diabétiques par un régime suivi pendant 16 à 24 semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux. S'y ajoutent une injection quotidienne pendant 12 à 24 semaines, deux injections par jour deux fois par semaine pour induire une fibrose du foie, des mises à jeun, des gavages avec risque de lésion de l'œsophage, six prises de sang en deux heures et des explorations cardiaques sous anesthésie. Le porteur indique qu'un traitement agissant sur la voie étudiée est déjà commercialisé contre des maladies auto-immunes et pourrait voir son indication étendue.

Objectifs

La prévalence des maladies métaboliques du foie (MASLD) est en constante augmentation et touche environ un tiers de la population mondiale. Les études de cohortes chez l’Homme ont révélé son lien complexe avec les maladies cardiovasculaires. La MASLD a été associée à un risque accru de cardiopathie métabolique (CM) incluant arythmie, cardiopathie ischémique et insuffisance cardiaque. L'impact de la MASLD sur la CM va au-delà des facteurs de risque traditionnels et prédit de manière indépendante le risque de mortalité cardiovasculaire. Ces observations soulignent la nécessité d'étudier les liens entre la MASLD et la CM pour comprendre comment les troubles métaboliques hépatiques peuvent influencer la pathogénèse de la cardiopathie métabolique.

Bénéfices attendus

Les stéatopathies métaboliques (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ 40 pourcent de la population mondiale. La morbi-mortalité cardiovasculaire représente la première cause de décès chez ces patients atteints de MASLD. Ce projet a pour but de comprendre le rôle d'un lipide particulier d’origine hépatique et de ses récepteurs cardiaques dans la physiopathologie de la cardiopathie métabolique. En effet, cet axe pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement de ces maladies étant donné que des agonistes de cette voie existent actuellement sur le marché et sont utilisés dans le cadre de maladies auto-immunes et inflammatoire. Ce traitement déjà sur le marché pourrait avoir une extension de son indication pour les patients avec MASLD présentant une cardiopathie métabolique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection pour l'administration d'un agent viral (sous anesthésie, une fois, quelques minutes) et seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, une injection par jour sera réalisée pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Pour les souris sous traitement induisant une fibrose hépatique, le nombre d'injections est porté à 2 par jour 2 fois par semaine. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h) ainsi que des analyses cardiaques (sous anesthésie, 2 fois car un pour l'enregistrement du rythme cardiaque à l'électrocardiogramme et un pour l'échographie cardiaque), 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (électrocardiogramme, échocardiographie) 2) les conséquences de la maladie hépatique (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 3) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose), mise à jeun avec la sensation de faim, risque de lésion/irritation oesophagienne lors du gavage 4) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques 5) la douleur ponctuelle liée à l'injection 6) risque de saignement ou d'hématome lors des injections.

Devenir

Une fois les explorations cardiaques réalisées au terme du régime et du traitement, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les tissus d’intérêt (tissus adipeux, foie et coeur) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme hépatique en cas de MASLD sur l’activité cardiaque. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 960 souris. Ce nombre a été calculé grace à un test de puissance afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau (Changement de la litière, jusqu'à deux fois par semaine si nécessaire, en cas de souillure par les urines liée à l'apparition d'un diabète induit par les différents régimes/traitement Nourriture hydratée en fond de cage pour les animaux obèses ou qui perdent du poids). Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés (anesthésie) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent. Lors des anesthésies, application d'un gel olphtalmique pour la protection oculaire, utilisation tapis chauffant (37 degrés celcius) pour limiter l’hypothermie durant l'anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. Sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Les animaux seront étudiés à partir de 6-8 semaines de vie car atteinte de la maturité sexuelle et les souris sont métaboliquement stables (arrêt de la croissance), et pour la reproductibilité et standardisation des résultats internationaux (les études déjà publiées travaillant sur l'obésité et le diabète utilisent ces souris à partir de ces âges)

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

Greffées sous la peau du flanc d'une tumeur sous anesthésie, puis traitées par quatre injections dans l'abdomen à l'état vigile, 2 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour analyser les cellules immunitaires de leurs tumeurs, de leur rate et de leurs ganglions. Le projet cherche à savoir si l'absence d'une protéine dans certains globules blancs rendrait les traitements anticancéreux plus efficaces, question que le porteur juge hors de portée des expériences in vitro. Les 2 560 animaux ne sont justifiés que par une ligne, le nombre ayant "été déterminé par une méthodologiste", et la surveillance annoncée pour des souris porteuses de tumeurs se limite à trois passages par semaine.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de comprendre comment cette maladie fonctionne afin de trouver des traitements les plus efficaces possibles. NLRP3 est une protéine largement décrite pour ses fonctions dans l’inflammation, dans des globules blancs appelés myéloïdes. Nos données préliminaires obtenues montrent que d’autres globules blancs appelés lymphocytes, possèdent également la protéine NLRP3. En l’absence de NLRP3, ces globules blancs ont une activité antitumorale marquée contre différents types de tumeurs. Ce projet a pour but d’évaluer si l’absence de NLRP3 dans ces globules blancs permettrait de rendre plus efficace les traitements anticancéreux

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont les suivants : - D’apporter des connaissances nouvelles sur le rôle de NLRP3 dans les globules blancs appelés lymphocytes - D’évaluer si NLRP3 pourrait être une cible thérapeutique ou un complément à l’immunothérapie

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanées sur le flanc sous anesthésie générale. Les différents traitements seront réalisés en intrapéritonéal sur souris vigiles (4 doses par souris, chaque injection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les tumeurs seront injectées en sous cutanées dans le flanc. De ce fait, une des nuisances pouvant être observée dans de très rares cas est la formation nécrose. De plus, la manipulation des souris et la contention de ses dernières peuvent engendrer un stress. L’injection des cellules tumorales en sous cutanées peut induire une légère douleur chez l’animal. Ces dernières se feront donc sous anesthésie à l’isofluorane. De même, l’injection des traitements en intrapéritonéal peuvent induire une légère douleur chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience car nous étudierons les cellules immunitaires présentes dans les tumeurs, rate et ganglions.

Remplacement

Nous avons déjà réalisé un certain nombre d’expériences in vitro pour caractériser les différences entre les cellules. Ceci nous a permis d’identifier des marqueurs d’intérêt et phénomènes à explorer in vivo. Malheureusement, le recrutement au site tumoral et l’implication dans la réponse immunitaire antitumorale ne peuvent pas être appréhendés in vitro à l’heure actuelle car ce sont des mécanismes trop complexes qui font intervenir plusieurs acteurs cellulaires et moléculaires. Une fois que nous aurons obtenus les résultats de cette étude chez la souris, le décryptage des mécanismes moléculaires mis en œuvre sera réalisé in vitro.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront réalisées que deux fois et par des personnes parfaitement formées aux gestes permettant d’optimiser la reproductibilité. De plus, chaque expérience de croissance tumorale sera accompagnée d’une analyse de l’infiltrat immunitaire afin de récolter un maximum d’informations sur les mêmes souris sans avoir besoin de recommencer les expériences. Le nombre d'animaux a été déterminé par une méthodologiste.

Raffinement

Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (la fréquence de surveillance sera bien entendu augmentée en cas d’observation de signes cliniques anormaux). Des critères d’interruption de l’étude ont été mis en place dans le cas où un animal montrerait des signes de souffrance. Les injections sous cutanées se feront sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales transgéniques disponibles pour l’expérimentation. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Des animaux de 6 à 8 semaines seront utilisés car leur système immunitaire est mature à cet âge.

Cinq jours d'administration orale par canule, une injection qui déclenche un état septique ou un sérum toxique pour les reins, puis pour un quatrième groupe un mois de régime hypergras : 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traceur fluorescent leur est ensuite injecté et un capteur fixé sur le dos, avec deux anesthésies successives pour la pose et le retrait, et quelques heures d'isolement. Le porteur annonce les atteintes attendues, irritation de la gorge, saignements, œdème, péritonite, prise de poids massive et pelage gras pour les souris rendues diabétiques, risque d'arrêt cardio-respiratoire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, les prélèvements post-mortem étant présentés comme le seul moyen d'obtenir les tissus recherchés.

Objectifs

Les maladies rénales, aigues ou chroniques, sont un problème majeur pour la santé publique, affectant des millions de personne dans le monde. Même si des progrès significatifs ont été réalisés dans l’identification des mécanismes responsables de leur progression, il n’existe aucun traitement spécifique permettant à l’heure actuelle de diminuer ou d’arrêter la progression des maladies rénales de manière probante. Par conséquent, la détection de la maladie à des stades très précoces ainsi que la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques sont d’une importance cruciale pour mettre au point un traitement efficace Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d'une protéine impliquée dans la mort de cellules de petits vaisseaux sanguins dans la maladie rénale. En effet, la surexpression de cette protéine est associée à une dégradation de la fonction rénale dans différents modèles de maladies rénales expérimentales. Plus précisément, nous avons récemment montré que cette protéineest fortement surexprimée dans des cellules qui assurent la fonction de filtration du rein et que cette surexpression conduit à une mortalité de ce type cellulaire dans des cultures de ces cellulesin vitro. L’objectif principal de ce projet est de définir le rôle de la protéine dans l’adaptation fonctionnelle et structurelle du rein en réponse à des agressions aigues et chroniques, glomérulaires ou vasculaires, en utilisant desmodèles de souris transgéniques pour lesquelles une surexpression ou bien une inhibition de la protéine d'intérêt est inductible dans le temps et de manière tissu spécifique. Ces expériences permettront de répondre à ces questions : La surexpression de la protéine peut elle induire ou aggraver la maladie rénale dans plusieurs modèles expérimentaux? A l'inverse, est ce que l’inhibition de la protéine peut ralentir la progression de l’insuffisance rénale ? Peut on mettre en place une stratégie thérapeutique bloquant la surpression de la protéine afin de préserver la fonction rénale dans un contexte pathologique ?

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies rénales chroniques est en constante augmentation, affectant environ dix pour cent de la population mondiale, bien que beaucoup de cas restent non diagnostiqués en raison de leur évolution silencieuse. Une prise en charge précoce et une sensibilisation accrue sont essentielles pour prévenir leur progression vers l'insuffisance rénale terminale, nécessitant dialyse ou transplantation. Nous espérons que notre étude permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur cette protéine et la proposera comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance rénale. Nous effectuerons durant et après ces protocoles différentes analyses fonctionnelles, histologiques, cellulaires et moléculaires afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés . Ainsi, nous espérons faire un pas supplémentaire vers le développement de stratégies thérapeutique ciblant cette protéine afin de ralentir la progression des maladies rénales voire la faire régresser.

Procédures

Un premier lot reçoit une administration orale une fois par jour pendant cinq jours, chaque session durant environ 30 secondes par animal. Ensuite, une administration unique est effectuée à l’état vigile, afin d’induire le modèle septique, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un deuxième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Deux administrations par voie veineuse sont ensuite effectuées sous anesthésie, afin d’induire le modèle, chacune prenant 10 secondes par souris. Un troisième lot reçoit la même administration orale que le premier lot. Une seule administration d’une molécule est ensuite effectuée à l’état vigile, pour induire le modèle, ce qui prend environ 10 secondes par souris. Un quatrième lot reçoit un régime hyper gras. Un inhibiteur génétique leur est administré deux fois par semaine pendant un mois, (30 sec par souris) à l’état vigile. Alternativement, un stimulateur sera ajouté à l’eau de boisson et administré durant 30 jours. Une mesure de la fonction rénale est réalisée sur les trois derniers lots grâce à une nouvelle technique nécessitant une anesthésie gazeuse. Cette procédure inclut l’administration d’un traceur fluorescent et l’installation d’un capteur de fluorescence miniaturisé sur le dos de l’animal, pour une durée totale de cinq minutes. Deux heures plus tard, une seconde anesthésie est nécessaire pour retirer le capteur, ce qui prend environ deux minutes. En fin de protocole, les quatre lots font l’objet d’un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie (une minute par souris), suivi de l’euthanasie des animaux selon une méthode règlementaire, en vue des analyses et prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

Un premier lot d’animaux subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique pour induire le modèle septique pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le modèle pourra induire une perte d’activité et de poids et une élévation de la température. Un second lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration unique de sérum toxique pour les reins associé à un risque de saignement et œdème. Cette administration étant effectuée sous anesthésie générale courte, les nuisances de l’anesthésie sont ici très limitées. Un troisième lot subira une administration orale quotidienne durant 5 jours qui peut être source de stress, d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris. Les animaux recevront ensuite une administration d’une molécule toxique pour les reins pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Un quatrième lot d’animaux diabétiques sera exposé à un régime riche en lipide qui s’accompagne d’une prise de poids massive, d’un soin altéré avec un pelage gras, d’une activité réduite avec un risque infectieux plus important. Une partie des animaux seront traitée par administrations répétés pouvant induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Il y a aussi un risque de péritonite et de saignements liés aux administrations répétées. Une autre partie sera traitée via l’eau de boisson pouvant conduire à une diminution transitoire de la prise hydrique en raison de la néophobie des souris. Les trois derniers lots subiront une mesure de la fonction rénale incluant deux anesthésies de courte durée pour la pose et le retrait du capteur pouvant induire un stress, un risque de saignement et d’œdème associé à l’administration du traceur fluorescent nécessaire à la mesure et un stress social lié à l’individualisation durant quelques heures. Tous les animaux subiront un prélèvement sanguin en fin de période de maintien sous anesthésie. L’anesthésie générale pourra conduire à des complications telles que : détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique.

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs de la caractérisation de l'effet de notre protéine cible sur le rein est la modification de la fonction rénale, qui est mesurée soit pas dosage de la concentration plasmatique de créatinine ou d'urée ou l'évaluation du débit de filtration glomérulaire.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter individuelle du phénotype étudié dans nos modèles expérimentaux. Des lots de dix animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d'un module statistique dédié aux calculs de puissance statistique avec comme paramètre principal la mesure de la fonction rénale. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux pour ce projet est de 620 souris. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées : Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. La surveillance des animaux par du personnel qualifié est quotidienne. Le bien- être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. Pour les souris diabétiques il y a des mesures de raffinement supplémentaires, change plus régulier à cause de la polyurie, nombre réduit de souris par cages et bâton à ronger à cause des croquettes molles riches en gras. En dehors d'une courte période d’hébergement individuel limité à deux heures pendant une mesure, les souris restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée régulière. L'administration orale aura un impact le plus limité possible grâce à l’utilisation de canules jetables. Il sera réalisé également par du personnel confirmé. Des points limites ont été définis, tels qu'une perte de poids trop importante, une paralysie des membres postérieurs, la prostration, l'hérissement du pelage. Administration : Il existe aussi un risque de saignement qui sera limité par l’utilisation d’aiguille fines et leur réalisation par du personnel expérimenté. L’anesthésie permet de limiter la douleur pour certaines administrations, qui seront suivies d’une application de gel ophtalmique pour limiter l’inconfort. Pour diminuer les risques de détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, stress thermique liés à l’anesthésie, les souris seront placées sur un plateau chauffant.

Choix des espèces

Concernant le choix de l’espèce: modèles bien maîtrisés dans cette espèce par le personnel du laboratoire ; nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique , plus que dans d'autres espèces. possibilités de tester l'implication de la voie de signalisation de la protéine cible dans l'insuffisance rénale grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées. Concernant le stade de développement: Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système rénal mature, tout en ne présentant pas encore des signes de vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.