Système endocrinien
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
KO thermique frequence Modélisation numérique de l’interaction des champs RF sur les récepteurs thermiques – Mécanismes et expérimentations vivo (MOTHERR1 )
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.
Objectifs
Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.
Bénéfices attendus
L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.
Procédures
Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).
Impact sur les animaux
L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.
Devenir
A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.
Remplacement
Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.
Effet préventif primaire d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé dans l’apparition des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés au surpoids chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
30 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, gardés vivants et replacés dans leur environnement d'étude à l'issue. Soumis à un régime gras, ils subissent cinq prélèvements de sang à la jugulaire et des prélèvements de selles, dont certains par écouvillon rectal ou isolement de vingt-quatre heures, pour tester un extrait végétal censé prévenir les troubles métaboliques du surpoids. Le porteur indique provoquer volontairement chez eux un surpoids et des désordres métaboliques, objet de l'étude. Il présente le chien comme l'espèce cible et affirme qu'il n'y a "absolument pas d'alternative" à son remplacement.
Objectifs
De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien des désordres associés aux maladies métaboliques (i.e. syndrome métabolique). Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle d'un extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) et son impact sur le profil métabolique chez des chiens exposés à un régime hyperlipidique, par leur suivi clinique et biologique (analyse du microbiote intestinal, paramètres biochimiques, métaboliques). L’activité prébiotique potentielle de l’extrait végétal standardisé sera également évaluée en présence d’un probiotique spécifique, déjà développé et commercialisé chez le chien. Parmi les facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques et inflammatoires, les protéines sirtuines, notamment les sirtuines 1 et 3, émergent comme des cibles potentielles pour des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques. Les sirtuines, des désacétylases NAD- dépendante, sont des régulateurs importants de l’activité des protéines impliquées dans le métabolisme cellulaire et le contrôle de l’inflammation. Différents travaux ont démontré les effets positifs de la modulation des sirtuines 1 et 3 dans les maladies métaboliques et inflammatoires. Par exemple, la modulation des sirtuines 1 et 3 induit des effets bénéfiques sur les métabolismes (notamment glucidique) via partiellement le contrôle de l’inflammation (voie PPARs et le facteur NF-KB) et du stress oxydatif. Par conséquent, tout traitement visant à augmenter l’activité désacétylase des sirtuines 1 et 3 pourrait constituer une approche thérapeutique qui pourrait s’avérer très prometteuse. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus un composant majoritaire de l'extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires comme les sirtuines 1 et 3, les PPARs et le facteur NF-KB. Notre hypothèse est que la richesse de cet extrait végétal en flavonoïdes, en anthocyanines et en acides phénols, et surtout leur potentielle action synergique et/ou additive pourrait lui conférer une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidique et glucidique plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation des graisses. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires comme les acides gras à chaîne courte (AGCC). Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé étudié (comparativement à son principal principe actif) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées au surpoids. Les composants de l'extrait végétal testé pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3. Ce projet pourrait apporter la preuve de concept que l’intérêt thérapeutique de plante étudiée chez le chien ne dépend pas d’un principe actif mais d’une action synergique de ses principaux constituants. Ce projet pourrait également permettre de faire émerger chez le chien une nouvelle classe de produits thérapeutiques qui combine l’extrait bactérien et l’extrait standardisé végétal dans la prévention de l'inflammation et des dérèglements métaboliques associés au surpoids.
Procédures
3 interventions : 30 chiens suivront un régime hyperlipidique avec administration ou non d'une supplémentation en extrait végétal standardisé ou d'un composant majoritaire de l'extrait étudié avec ou sans un probiotique déjà développé chez le chien, 30 chiens auront des prélèvements sanguins, 5 fois sur une période de 3 mois avec un intervale de 2 semaines minimum ; 30 chiens auront des prélèvements de selles (4 fois). 1- Les prélèvements sanguins se feront au niveau de la veine jugulaire par une personne expérimentée. L'acte de prélèvement dure 2 minutes environ (contention par un tiers, rasage et désinfection du site de prélèvement). 2- Concernant les selles, deux approches de prélèvement seront envisagées : - Dans la première approche, les chiens doivent être individualisés. Ils seront maintenus en box individuel de 4m² durant 24h pour le recueil des selles destinées aux analyses du microbiote (équilibre des différents groupes et espèces d’intérêt). Cela sera répété 4 fois lors de l'étude efficacité. - Dans la deuximème approche, les selles seront recueillies sur animaux vigiles à partir d'un écouvillon (stérile) rectal. le chien est légèrement contenu, un écouvillon est délicatement introduit de 2 à 3 cm dans l'anus et tourné sur la paroi une dizaine de fois, puis retiré. L'animal est alors remis dans son box. Les deux mode de recueil des selles sont de nature légère. Dans le cas d'individualisation, les animaux seront isolés en box individuel mais avec un contact visuel avec leurs congénères. La méthode par écouvillonnage rectal permet de recueillir une petite quantité de selles qui devrait être suffisante pour l'analyse. L'objectif secondaire de ce mode de prélèvement est d’établir si les selles récoltées par ce biais sont représentatives du microbiote intestinal. Si c’était le cas, nous pourrions envisager de ne plus individusaliser pendant 24 h nos chiens pour le recueil des selles dans le cadre de l'étude du microbiote intestinal (dans le cadre de la règle des 3R, nous raffinerons ainsi notre procédure de recueil des selles).
Impact sur les animaux
Les animaux soumis au régime hyperlipidique vont développer des désordres métaboliques liés au surpoids, ce qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par le surpoids. Aucune nuisance n'est attendue de l'extrait standardisé étant reconnu pour ses vertus par la pharmacopée et déjà utilisé chez le chien, de même pour le probiotique utilisé. En cas de souffrance, l’animal sera mis en observation pour d’éventuels soins. Si la souffrance, pour des raisons inconnues, persiste, il sera exclu de l'étude.
Devenir
Les animaux sont replacés dans leur environnement d'étude après chaque procédure. Le comportement des animaux est surveillé après chaque procédure pour s'assurer de leur bonne santé.
Remplacement
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Eu égard à la nature de ce projet (démonstration scientifique de l'efficacité et de la tolérance sur espèce cible), il n’y a absolument (et à l’évidence) pas d’alternative qui permettrait le remplacement le chien.
Réduction
Nous utilisons 6 chiens par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque chien, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (balade et moments en liberté, jeux...). Un suivi régulier des animaux est assurés par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur sont mis en place chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
Il s'agit de l'espèce cible des résultats du projet. Il n'y a donc pas d'alternative qui permettrait leur remplacement. Les chiens sont des adultes de 2 ans, en bonne santé et n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois.
THYROCRISP: Création et caractérisation de lignées génétiquement modifiées pour étudier les effets d’une hypothyroïdie ou d’une hyperthyroïdie médiées par invalidation de gènes clés de l’axe thyroïdien lors du développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
883 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués et une partie réutilisée pour d'autres projets. Les femelles sont injectées pour pondre, les têtards génotypés par écouvillon puis soumis à un test de nage, et les embryons surnuméraires comme les têtards non porteurs de la mutation sont tués avant terme. Le porteur crée cinq lignées génétiquement modifiées pour étudier l'axe thyroïdien, et anticipe le développement possible d'un goitre chez les têtards rendus hypothyroïdiens. Il affirme que la complexité de cet axe ne peut être reproduite in vitro et présente le choix d'un amphibien à un stade larvaire comme un respect des 3R.
Objectifs
Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent de nombreux processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de la signalisation de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie des êtres vivants et constituent des problèmes majeurs de santé publique et santé environnementale. Ainsi, l’étude des gènes contrôlés par les HTs est essentiel pour comprendre les mécanismes liés à cette signalisation. La complexité du système hormonal lié à la thyroïde ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de contrôles de la régulation de cet axe et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux. A l’heure actuelle, aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Le xénope dont la métamorphose est dépendante d’un pic en hormones thyroïdiennes identique à celles des autres vertébrés dont l’Homme, est un amphibien couramment utilisé comme modèle pour étudier l’axe thyroïdien et les perturbations de cet axe. Pour étudier le rôle de ces HTs, nous avons donc choisi le xénope comme modèle et des stades d'études (embryo/larvaire) qui permettent de satisfaire au mieux la règle des 3R. Notre projet a pour objectif la création de 5 lignées génétiquement modifiées chez le xénope, où l’inactivation d’un gène clé de la signalisation HTs dans chaque lignée, entraine soit une hyperthyroïdie soit une hypothyroïdie chez les animaux portant la mutation. La caractérisation de ces 5 lignées nous permettra de mieux comprendre les conséquences d’une déficience ou d’un excès en HTs sur le développement des animaux, en s’interressant plus particulièrement au développement du cerveau.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de pouvoir développer des modèles hypothyroïdiens et hyperthyroïdiens avec l’invalidation de 5 gènes sélectionnés pour leur rôle essentiel dans la signalisation thyroïdienne. Les hormones thyroidiennes (HTs) sont conservées parmi tous les vertébrés. Les HTs jouent un rôle clé dans les transitions des cycles de vie de ces vertébrés et notamment la métamorphose des amphibiens. Les retombées de ce projet seront, au niveau scientifique, de mieux comprendre les mécanismes d’action des HTs en étudiant les fonctions des protéines invalidées (stratégie de perte de fonction). Ce projet permettra en outre, d’établir des points de comparaison entre les modifications de l’expression des gènes observées suite à l’invalidation des 5 gènes clés de l’axe thyroïdien avec celles qui ont pu être observées suite à une exposition à des produits chimiques susceptibles de perturber la signalisation par les HTs. D’un point de vue applicatif, nous pourrons tester des stratégies profilaxiques afin de traiter les patients atteints de telles mutations, mais aussi analyser les comportements associés à la perte de fonction de ces gènes et faire des comparaisons avec ce qui est observé en écotoxicologie sur certaines espèces.
Procédures
Afin d'obtenir des œufs, les femelles adultes sont induites à pondre par injections en sous-cutané dans les sacs lymphatiques dorsaux avec de l'hormone chorionogonadotropine humaine. Elles sont capturées avec une épuisette (propre et désinfectée) dans laquelle ils sont maintenus manuellement sans pression, pour éviter qu’elles ne s’échappent pendant l’injection. Une pression légère sur le point d’injection est faite pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Dans le but d’identifier les animaux portant la mutation du gène ciblé pour chaque lignée, un prélèvement de mucus sur les têtards anesthésiés est fait de façon non invasive, à l’aide d’un écouvillon frotté délicatement sur la peau de chaque animal. La durée du prélèvement est d’environ 15 secondes par animal et ne sera effectué qu’une seule fois sur les animaux à génotyper. Un test de mobilité consistant à suivre le mouvement de chaque têtard pendant 10 minutes avec une alternance de périodes lumière/obscurité sera fait pour les animaux de chacune des 5 lignées afin de contrôler si la mutation affecte ou non cette mobilité.
Impact sur les animaux
Pour les 5 gènes choisis, l’invalidation des différents gènes ciblés devrait conduire soit à une baisse des HTs circulantes entrainant une hypothyroïdie générale de l’animal, soit au contraire à une augmentation des HTs circulantes entrainant une hyperthroïdie de l’animal. Pour les invalidations de gènes qui sont succeptibles d’induire des hypothyroïdies, nous anticipons la possibilité pour les têtards de développer une hypertrophie de la glande thyroïde (goitre).
Devenir
Procédure 1 : Induction de la ponte des femelles xénope (18 femelles de type sauvage dites Wild Type) et récolte des œufs. Toutes les femelles sont gardées et pourront être impliquées dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 2 : Création et élevage des animaux de chaque lignée où chacun des 5 gènes ciblés a été inactivé. Dans un 1er temps les 325 animaux impliqués dans cette procédure (soit 50 par lignée donc 250, et 75 animaux contrôles) seront élevés jusqu’au stade têtard pour être génotypés afin d’identifier et de conserver les animaux où le gène ciblé est bien inactivé, lesanimaux partiellement ou non invalidés ne seront pas conservés. Ensuite seuls les animaux pleinement invalidés sont élevés jusqu’au stade adulte où 2 couples d’animaux par lignée (soit 2x5 femelles et 2x5 mâles) seront conservés pour établir les 5 lignées qui serviront à produire les animaux portant chacune des mutations voulues. Tous les adultes des 5 lignées sont gardés et pourront être impliqués dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 3 : Analyse moléculaire et comportementale des 5 lignées. La mobilité des animaux mutants pour chacune des 5 lignées sera étudiée. Cela comprendra l’analyse de 540 têtards pour le comportement de nage (90 animaux x 5 lignées + 1 lignée contrôle) au stade NF48 (15 jours post fécondation). Puis sur les 540 têtards, seuls 90 têtards (15 têtards par groupe) seront conservés afin de réduire le nombre d'animaux en expérimentation et ils seront élevés jusqu'au stade NF55 (33 jours post fécondation) pour prélever différents tissus destinés à être analysés.
Remplacement
L’objectif de notre projet est de comprendre les effets d’une déficience ou d'un excès en hormones thyroïdiennes au cours du développement. La complexité de l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de régulation de cet axe et nécessite de recourir à des animaux modèles. Aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Nous avons choisi un modèle (amphibien) et des stades d'études (embryon/larve) qui permettent de satisfaire au mieux de la règle des 3R.
Réduction
La production d’animaux est réduite au maximum de façon à atteindre les objectifs. Pour les procédures 1 à 2, correspondant à la production de lignées, le nombre d’animaux utilisés correspond au meilleur compromis pour parvenir à établir le nombre de mutants, avec une reproductibilité sur au moins trois expériences indépendantes. Lorsqu’une ponte fournira plus d’embryons que nécessaire pour une expérience prévue, les embryons surnuméraires seront euthanasiés avant la fin des stades éleuthero-embryons.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage adapté à leur croissance et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés quotidiennement (température) ou de façon hebdomadaire (salinité, concentration en nitrate-nitrite et pH). Les têtards sont nourris avec de la poudre d’ortie avec un apport en proteines, puis après métamorphose les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche ainsi que de la nourriture riche en protéines (vers de vase), afin d’assurer aux animaux une croissance optimale. Ils sont maintenus à une densité recommandée par la directive européenne afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Enfin, les animaux sont l’objet d’un suivi quotidien et tout animal présentant des signes de maladies est isolé et soigné pour éviter toute propagation.
Choix des espèces
Le xénope (Xenopus laevis) est un modèle reconnu pour l’étude du système hormonal lié à la thyroïde. En effet la métamorphose est entièrement dépendante d'un pic en Hormone thyroïdienne. Ce pic a lieu à la naissance chez les humains (et la plupart des vertébrés) et permet la maturation du système nerveux. Cette espèce, comme tous les vertébrés, possède les mêmes hormones que les Hommes. Elle offre l'avantage 1) de ne pas être un mammifère et d'avoir un développement externe qui permet un traitement avec des différentes molécules par balnéation et non par gavage ou par injection, 2) d'être un vertébré tétrapode (à la différence des poissons) et d'être évolutivement relativement proche de l'Homme. De plus, son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés obtenus par fécondation in vitro, la transparence des embryons, les possibilités de transgénèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les femelles adultes de type sauvage permettront d’assurer la production des œufs qui serviront à créer les 5 lignées génétiquement modifiées présentant chacune l’inactivation d’un gène clé de la signalisation thyroïdienne. Pour établir les 5 lignées, les têtards seront élevés jusqu’au stade adulte pour sélectionner 20 adultes, soit 10 mâles et 10 femelles matures sexuellement correspondant à 2 couples par lignée créée. Pour caractériser les 5 lignées, les couples permettront d’assurer les reproductions, puis les tests de mobilité (comportement de nage) seront pratiqués sur les têtards issus de ces reproductions au stade NF48 (15 jours post fécondation) et les tissus seront prélevés pour analyse au stade NF55 (33 jours post fécondation).
Implication thérapeutique du blocage des CB1R et de l’inhibition des récepteurs SGLT2 sur la prise en charge de la néphropathie diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques, elles reçoivent pendant vingt-huit jours deux médicaments par gavage, avec incision de la veine de la queue pour mesurer la glycémie et échocardiographie sous anesthésie, pour tester une association contre la néphropathie diabétique. Le porteur indique que le diabète expose les animaux à un risque de déshydratation et d'hypothermie, pris en charge par du sérum et un tapis chauffant. Il juge "indispensable" de travailler sur un "organisme vivant en entier" et présente l'effet bénéfique de l'association au conditionnel.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) consiste essentiellement en l’amélioration du contrôle glycémique, la réduction du risque cardiovasculaire, un meilleur contrôle de la pression artérielle, l'inhibition du système rénine-angiotensine (SRA) et plus récemment, l’inhibition du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2). Les patients présentant une ND sont de plus en plus fréquemment soumis à un double traitement composé d’un bloqueur du SRA associé à un inhibiteur SGLT2. Toutefois, bien que cette approche soit efficace, la progression de la ND n’est freinée que dans 39% des cas. Cela démontre que les traitements actuels ne sont pas optimums et que les efforts de recherche doivent s’intensifier afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable. Ainsi, nous étudierons les effets combinés du bloqueur CB1R INV202 et l’inhibiteur SGLT2 Empaglifozine dans deux modèles de souris diabétique de type 2 présentant les principaux symptômes retrouvés au cours de la pathologie humaine dont la perte de fonction glomérulaire, le développement de fibrose ou encore la présence d'une forte inflammation. L’objectif secondaire sera de déterminer si cette approche pharmacologique entraîne une amélioration de la fonction cardiaque particulièrement impactée par la présence d’un diabète non ou mal contrôlé. Cet aspect se fera de manière non-invasive via la technique d’échocardiographie.
Bénéfices attendus
Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. En effet, selon les derniers chiffres de l’atlas de la Fédération Internationale du Diabète, le nombre d’adultes souffrant de diabète dans le monde est passé de 151 millions en 2000 à 463 millions en 2019. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu qu’une fois, après 9 semaines de régime afin de sélectionner les souris diabétiques. Les souris seront anesthésiées puis rasées sur le ventre afin de procéder à une échocardiographie avant et après traitement pharmacologique. L’ensemble de la mesure se fait en 45 minutes maximum. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Dans ce projet, nous allons utiliser des souris diabétiques. Les procédures prévues dans ce projet ne provoqueront pas de contraintes indues. Toutefois, le diabète pouvant conduire à un risque accru de déshydratation et d’hypothermie, nous opérerons un suivi quotidien des animaux afin de détecter tout dommage imprévu et ainsi intervenir pour soulager/abréger toute souffrance. Ainsi, les cages seront posées sur des tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie et en cas de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Enfin, les souris diabétiques sont susceptibles de développer une polyurie marquée, nécessitant un changement de litière plus fréquent. Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empaglifozine ou INV202+Empaglifozinee de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte.
Raffinement
Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 5 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. A 9 semaines, les animaux seront soumis à un régime riche en protéines pour une durée de 9 semaines dont les 4 dernières correspondront aux interventions pharmacologiques. Cette intervention commencera donc lorsque les animaux auront 14 semaines et se terminera à l’âge 18 semaines. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète de type 2 et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte. Pour une raison de coût financier, les animaux seront commandés à l’âge de 4-5 semaines et seront hébergés dans notre animalerie en attendant d’avoir 9 semaines d’âge.
Des probiotiques greffés sur un dispositif implanté dans l’intestin grêle pour moduler le métabolisme de l’hôte : preuve de concept sur le métabolisme des glucides alimentaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
24 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, la plupart tués à l'issue et deux gardés vivants s'ils perdent leur implant. Chaque animal subit une demi-journée de chirurgie pour poser un dispositif intestinal abritant des probiotiques, puis des prélèvements sanguins répétés jusqu'à 168 ml par cinétique sur deux mois de régime gras. Le porteur vise à terme une application chez l'humain contre le diabète de type II et l'obésité, mais l'objectif immédiat reste d'évaluer la tolérance du dispositif. Sur le remplacement, il affirme que la biodisponibilité des nutriments ne peut pas être reproduite in vitro et retient le mini-porc pour son système digestif proche de celui de l'humain.
Objectifs
Le dispositif "Symbiote" testé dans le projet pourrait avoir de nombreuses applications chez l’Homme, en particulier une contribution à la prise en charge du diabète de type II et des obésités : dans ces situations, il est admis que l’élimination d’un pourcentage significatif de la ration calorique présente un intérêt médical. De nombreuses approches thérapeutiques (inhibiteurs de l’alpha-Glucosidase pour diminuer l’absorption des sucres, médicaments diminuant le seuil de réabsorption du glucose, pour éliminer une partie du glucose sanguin dans l’urine) ont été proposées pour cela. Malgré leur intérêt thérapeutique, leurs indications sont limitées par leurs effets secondaires non négligeables. Notre dispositif "Symbiote" pourrait représenter une alternative à ces méthodes. En effet, les bactéries abritées dans le « réacteur » pourront représenter une masse biologique significative, consommant pour leur propre compte des nutriments qui auraient normalement été absorbés (d’autant que le « réacteur » est positionné dans une zone de l’intestin où la concentration en bactéries est relativement faible). Les bactéries seront choisies ou bien parce qu’elles sont déjà naturellement présentes dans l’organisme (par exemple divers types de Lactobacillus normalement présents dans l’organisme, dont Lactobacillus salivarius), ou bien parce qu’elles ont démontré un potentiel probiotique intéressant (E. Coli Nissle, par exemple, qui présentent le double intérêt d’avoir démontré un intérêt anti-inflammatoire et d’être relativement facilement accessible au génie génétique, ce qui permettra dans le futur d’envisager d’utiliser ces bactéries pour produire des molécules d’intérêt, par exemple des vitamines). Avant d’envisager une étude chez l’homme, l’objectif de cette étude pré-clinique sur du long terme chez le mini-porc est d’évaluer les effets du dispositif implanté sur la physiologie digestive de l’hôte, et sur son potentiel d’action dans le contrôle du métabolisme dans des situations de perte d’homéostasie (obésité et diabète de type II, mais potentiellement à terme également les pathologies liées à un dysfonctionnement du microbiote). L’ensemble des dispositions prises dans ce projet répond aux principes fondamentaux des 3Rs (réduction, raffinement, remplacement) dans le cadre de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont la contribution au traitement des pathologies induites par un microbiote inadapté : de nombreuses études ont mis en évidence le lien entre microbiote et diverses pathologies (dont obésité, certains cancers, etc). Les études cliniques qui deviendront possibles après cette expérimentation animale permettront d’explorer ce qui pourrait être une méthode originale de modulation du microbiote intestinal. Un tel dispositif a toute ces chances pour être bien toléré chez l’homme, car dans de nombreuses situations cliniques des sondes duodéno-jéjunales sont installées, et l’expérience montre qu’elles sont très bien tolérées.
Procédures
Des prélèvements de sang seront réalisés à 0, 15 et 60 jours après la mise en régime des animaux. Pour chacune des journées de prélèvements, 8 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante -0.5, 0, 0.5, 1, 2, 5 et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 168 ml par cinétique (8 mL x 3 cathéters x 7 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 25 kg. Des prélèvements de sang artériels seront effectués tous les 15 jours sur tous les animaux. Ces prélèvements uniquement sur du sang artériel seront réalisés à jeun pour permettre un suivi du statut physiologique des animaux pendant toute la durée de l’expérimentation. Chaque animal subira une demi-journée d’intervention chirurgicale. Les prélèvements de sang réalisés à J0, J15 et J60 après la mise en régime des animaux, s’effectueront pour chaque animal sur 3 demi- journée de cinétique de prélèvement de sang, cumulé sur 60 jours.
Impact sur les animaux
La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur à l'aide d'un analgésique et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous discusterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 seront mis à mort à la fin de la période expérimentale après 2 mois d’un régime HF-HF, sauf si le point limite est atteint avant. Les animaux expérimentaux sont mis à mort en fin d’expérience pour : 1) vérifier le bon positionnement des cathéters sanguins et du tænia artificiel 2) réaliser des prélèvements tissulaires pour des études métaboliques. Tous les animaux de la procédure 2 seront mis à mort pour vérifier le positionnement et l’état de l’ancrage du dispositif implanté. Dans le cas ou l’animal perde son dispositif et qu’il se retrouve dans les fèces, celui-ci sera gardé en vie et pourra être réutilisé à des fins pédagogiques au sein de la structure.
Remplacement
La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.
Réduction
L'effectif prévu dans le schéma expérimental de la phase 1 est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré, estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux/lot est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). Ils seront alloués aux différents groupes (si c’est le cas) en fonction des besoins. L’effectif prévu pour la phase 2 est le minimum requis pour un test de faisabilité d’implantation et de pérennité de l’ancrage du dispositif dans l’intestin par la voie endoscopique. 14 animaux seront utilisés pour la première phase du projet (procédure 1). Ils seront distribués en 2 lots : un lot témoin (dispositif implanté sans probiotique) et un lot expérimental (dispositif implanté avec probiotique greffé). 10 animaux seront utilisés pour la phase 2 du projet pour tester la fiabilité de la technique d’ancrage du dispositif par endoscopie. (procédure 2). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.
Raffinement
La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Elle peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et intéragir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.
Choix des espèces
Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études biomédicales. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.
Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
160 souris vont être utilisées, chacune maintenue en hypoxie intermittente huit heures par jour pendant seize semaines, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance léger. À trois reprises, elles reçoivent des injections de glucagon, d'insuline, d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline ou de dexaméthasone pour mesurer leur réaction, et passent trois prélèvements de sang à la queue ainsi que trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Les retombées restent au conditionnel : des traitements "Béta bloquant ou autre" ne seraient envisagés que si l'hypoxie dérègle bien le système sympathique. Le porteur écrit que "Tous les animaux sont gardés en vie" après l'échographie et regagnent leur animalerie "pour la suite du projet", et évoque ailleurs des examens menés avant une mise à mort finale, sans dire quand ni comment les souris sont tuées.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite par l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatiques associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique et cardiaque que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les dérèglements métaboliques associés au SAOS
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Ils suivront 3 ECG et 3 échographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la littérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (sans excès). Les injections d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/ml les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l’issue de la procédure d’échographie cardiaque et retournent dans leur animalerie d’hébergement pour la suite du projet.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l’âge adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Rôle de la myotubularine MTM1 dans l’insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras de douze semaines pour induire obésité et diabète, une chirurgie de constriction de l'aorte par thoracotomie que le porteur associe à une mortalité de 10 %, une injection de virus AAV, puis des mesures cardiaques, pour tester l'effet protecteur d'une protéine, la myotubularine MTM1. Les bénéfices sont annoncés au conditionnel, comme une "nouvelle perspective thérapeutique". Le porteur conclut qu'il n'existe pas de modèle in vitro permettant de "s'affranchir" du modèle animal.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la surexpression de la myotubularine MTM1 dans la progression de l'insuffisance cardiaque chez la souris, notamment dans un contexte lié à l'obésité. Nos résultats in vitro sur des cellules cardiaques en culture montrent que la surexpression de MTM1 réduit le stress oxydant et préserve les fonctions mitochondriales au cours d'un stress. Ces résultats suggèrent un effet protecteur de MTM1 et ouvrent la voie à des essais in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence les effets protecteurs de la surexpression de MTM1 dans l'insuffisance cardiaque liée à l'obésité, d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués et de proposer la myotubularine MTM1 comme nouvelle perspective thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse (60%kcal) pendant 12 semaines afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2; 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque, pendant 4 semaines; 3/ une injection iv par la veine caudale de virus associés aux adénovirus (AAV) permettant de surexprimer la myotubularine MTM1; 4/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux; 5/ une mesure de la composition corporelle (echoMRI).
Impact sur les animaux
Le régime HFD 60% induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime HFD auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La chirurgie TAC étant une procédure chirurgicale invasive impliquant une thoracotomie, elle peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Les AAV sont utilisés en thérapie génique et vaccinologie. Plus spécifiquement, les AAV-MTM1 sont actuellement en essais cliniques pour des thérapies géniques sur le chien (labrador) et chez l'homme atteints par la myopathie myotubulaire liée à l'X (pathologie consécutive à une mutation de MTM1). L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté.
Devenir
Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de modèle in vitro permettant de s’affranchir du modèle animal.
Réduction
Le critère principal de jugement sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales: anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage.
Choix des espèces
Ce projet vise à caractériser les effets de la surexpression de MTM1 sur la progression de l'insuffisance cardiaque. Ces aspects complexes et interconnectés ne peuvent être reproduits qu'in vivo sur des modèles expérimentaux. Seul l'animal vivant peut permettre d'évaluer ces paramèters et il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs. Les animaux utilisées seront âgées de 2 mois (jeune adulte). Les souris de 2 mois sont les plus réceptives à la chirurgie TAC et les plus sensibles à l'induction par AAV (des souris plus âgées ont été décrites comme pouvant être résistante à l'induction).
Etude pilote: implantation de cellules graisseuses dans le poumon présentant des lésions de fibrose
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système respiratoire
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, après dissection de la peau, elles reçoivent dans la trachée une injection d'une molécule provoquant une fibrose pulmonaire, puis une greffe de cellules précurseurs de cellules graisseuses, avant mise à mort et prélèvement des poumons au 21e jour. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids. Il présente le projet comme une étude de faisabilité et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un "organe entier".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie rare, chronique et progressive de cause inconnue. Elle est très sévère, avec une survie inférieure à 30% à 5 ans après le diagnostic. Cette maladie se caractérise par des dommages pulmonaires liés à une cicatrisation anormale et chronique, avec l'accumulation de tissu fibreux (fibrose) menant à la destruction des alvéoles pulmonaires. Ces alvéoles sont de minces sacs creux qui prolongent les voies respiratoires, où se déroulent les échanges gazeux avec le sang; elles sont essentielles à la respiration. L'accumulation de tissu fibreux dans le poumon est en grande partie due à l'accumulation de fibroblastes et à leur activité de sécrétion de différents facteurs. Ces fibroblastes sont des cellules d'aspects fusiformes, normalement présentes dans le tissu; ils sont parfois appelés "cellules de soutien". Dans la FPI, les processus menant à la fibrose sont encore mal connus. Or, des travaux récents ont mis en évidence la présence de cellulles graisseuses dans les poumons de patients atteint de FPI. De plus, des données ont montré que ces cellules graisseuses diminuaient in vitro l'activité des fibroblastes de fibrose. Dans d'autres organes, le tissu graisseux a une influence démontrée sur la fibrose (foie, rein, coeur). Nous souhaitons donc étudier son rôle potentiel dans la fibrose pulmonaire. Cependant, des travaux préliminaires n'ont pas permis de mettre en évidence de cellules graisseuses chez la souris dans les modèles de fibrose pulmonaire. Dans le cadre de ce protocole (étude de faisabilité d’une durée de 1 an), la greffe de cellules donnant naissance à des cellules graisseuses dans le poumon sera testée dans un modèle de fibrose pulmonaire chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces expériences préliminaires de transplantation de précurseurs de cellules graisseuses permettront de démontrer la faisabilité de cette approche pour étudier le rôle des cellules graisseuses dans la fibrose pulmonaire. Il s'agit d'une première étape importante afin d’identifier le tissu graisseux pulmonaire associé à la fibrose pulmonaire comme potentielle cible thérapeutique dans cette maladie mortelle.
Procédures
En début de procédure (jour 1), les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répété. Cette intervention dure 5 à 10 minutes pour chaque souris. Cinq jours plus tard, les souris recevront une injection unique de cellules capables de donner naissance à des cellules graisseuses (cellules précurseurs), soit au travers de la paroi thoracique, sous anesthésie gazeuse brève (5 minutes), soit via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale, (10 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure (jour 21), les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons.
Impact sur les animaux
L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et de la motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et de la motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon leur état général et leur poids.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. Les prélèvements seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'un seul protocole complet au cours de leur vie.
Remplacement
Le modèle murin est pertinent de par son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.
Raffinement
Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement concomitament de l'anesthésie. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon une grille d'évaluation (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, douleur, etc.): en cas d'atteinte d'un ou plusieurs point limite, les animaux seront sortis de la procédure et euthanasiés. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront suivies de manière rapprochée. La douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle souris est pertinent car son système respiratoire est proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte.
Effet d’un régime supplémenté par un extrait végétal standardisé dans la prévention des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés à l’obésité chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Soumis à un régime obésogène, ils reçoivent un gavage quotidien d'extrait végétal pendant trois mois, avec prélèvements sanguins répétés et tests de tolérance au glucose, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le projet vise à tester un complément alimentaire destiné aux animaux de compagnie, le rat servant d'étape avant l'espèce cible, le chien. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut remplacer le rat, qui permet en outre de prélever des organes non accessibles chez le chien.
Objectifs
Notre étude cherche à montrer qu’un extrait végétal standardisé pourrait avoir des effets bénéfiques sur la santé notamment dans le cadre de troubles métaboliques liés à l'obésité. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la thématique de notre unité de recherche dont un des objectifs est d’améliorer le bien-être des animaux de compagnie par des approches nutritionnelles basées sur l'usage des extraits botaniques. De nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l’initiation et l’entretien du syndrome métabolique. Le premier objectif de ce projet sera d’explorer l’action prébiotique potentielle (modification de la diversité microbienne intestinale) d'un extrait végétal standardisé (versus son traceur de référence, un composant majeur de cet extrait). Il aura également pour but d'étudier l'impact de cet extrait végétal standardisé et de son traceur de référence sur le profil métabolique chez des rats exposés à un régime obésogène (hyperlipidique) par leur suivi clinique et biologique. Le deuxième volet de ce projet sera consacré à explorer les effets de l’extrait végétal standardisé (versus son traceur de référence, un composant majeur de cet extrait) sur l’expression et l’activité des facteurs susceptibles de participer aux dérèglements métaboliques, oxydants et inflammatoires.
Bénéfices attendus
Les protocoles mis en œuvre dans le cadre de ce projet devraient permettre de déterminer si l’extrait végétal standardisé testé (comparativement à son traceur) est apte à prévenir l’inflammation et les perturbations métaboliques associées à l'obésité. Notre hypothèse principale est que l’action synergique des composants majeurs (acides phénoliques, flavonoïdes, anthocyanes) de l’extrait végétal standardisé étudié augmente la diversité microbienne, renforce la barrière épithéliale intestinale et améliore le profil métabolique en prévenant l’accumulation notamment de la graisse viscérale. Par ailleurs, une des stratégies visant à limiter ou réduire le processus inflammatoire associé au surpoids/obésité est également l’utilisation de probiotiques ayant la capacité de supprimer la production de facteurs pro-inflammatoires ou favoriser la synthèse de métabolites anti-inflammatoires. Les composants de l'extrait étudié pourraient avoir une action synergique et/ou additive conférant une action anti-inflammatoire et régulatrice des métabolismes lipidiques et glucidiques plus efficace en impliquant notamment un rôle des sirtuines 1 et 3.
Procédures
5 interventions : 40 rats suivront un régime obésogène (hyperlipidique) et 48 rats auront des prélèvements sanguins, 4 fois sur une période de 3 mois ; auront des recueils de selles (4 fois) ; seront gavés oralement quotidiennement pendant 3 mois; feront des tests de tolérances au glucose (1 fois par mois pendant 3 mois) et seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
L'exposition des rats au régime obésogène peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. Les protocoles peuvent induire du stress, l'habituation des rats aux protocoles tels que le gavage ou encore le test de tolérance au glucose visera à atténuer ces effets indésirables.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Le remplacement des rats n’est pas possible pour répondre aux questions du projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro). Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal étudié avant de passer sur l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.
Réduction
Nous utilisons 8 rats par groupes afin d'avoir un nombre suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
L'exposition des rats au régime hyperlipidique peut induire des troubles métaboliques, les traitements du projet viseront à les prévenir/réduire. L'hébergement respecte les recommandations en vigueurs chez les animaux de l'étude. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Un suivi régulier des animaux est assuré par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). Les protocoles expérimentaux sont optimisés pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus. Nous utisons des points limites adaptés et des critères d'arrêt de souffrance détaillés à chaque procédure.
Choix des espèces
Les rats sont acclimatés à l'âge de 9 semaines avant de commencer l'étude à 12 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement. L'exposition des rats Wistar à un régime obésogène (hyperlipidique) permettra d'étudier la capacité de l'extrait végétal standardisé étudié à prévenir le développement de troubles métaboliques associés à l'obésité. Les effets de cet extrait végétal ne peuvent être étudiés de manière pertinente sur des modèles in silico et in vitro. Nous utilisons le rat en prémice de l'espèce cible (chien) afin de compléter notre étude pour valider les effets de notre extrait végétal standardisé tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques afin d'approfondir notre exploration (comme l'étude de la perméabilité et la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre de Ussing et en chambres d'organes isolés), non prélevables chez le chien.
Entérovirus, Immunité systémique et muqueuse, Nanoparticules
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections d'immunisation puis des prélèvements de sang et de salive sous anesthésie, pour identifier un candidat vaccin contre les coxsackievirus B, soupçonnés de favoriser le diabète de type 1. Le porteur indique que l'infection ne provoque pas de signes cliniques visibles, la souris n'étant pas un hôte naturel de ces virus. Il affirme que cette étape sur l'animal est "indispensable" et ne peut être remplacée in vitro, les mécanismes en jeu n'étant selon lui pas modélisables.
Objectifs
Les infections entérovirales non poliomyélitiques, en particulier les coxsackievirus B (CVB) sont associés à l'initiation et/ou la progression du diabète de type 1. Une augmentation de l'incidence du diabète de type 1 est observée notamment chez les jeunes de moins de 5 ans. Cette maladie auto-immune qui se manifeste par la perte de fonction des cellules pancréatiques productrices d'insuline résulte d'interactions complexes entre une prédisposition génétique, le système immunitaire et des facteurs environnementaux notamment les CVB. Le but du projet est d'élaborer une stratégie vaccinale universelle contre les CVB et des pathologies qui en découlent telles que le diabète de type 1. Cette stratégie consiste d'abord à identifier la voie d'inoculation générant la réponse immunitaire la plus protectrice vis-à-vis des CVB, puis d'étudier le meilleur candidat vaccin parmi les 5 espèces des CVB.
Bénéfices attendus
La finalité du projet est de choisir le candidat vaccin le plus efficace contre les CVB. Le projet s'inscrit dans la lutte contre les entérovirus; sachant que ces virus ont une responsabilité reconnue dans l'apparition du diabète de type 1.
Procédures
Les interventions type inoculation seront réalisées sous anesthésie, de même que les prélèvements des fluides corporels. L'immunisation se fera au nombre de trois injections. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements. Les prélèvements de salive se feront au nombre de 3 prélèvements par souris.
Impact sur les animaux
L'infection aux CVB ne provoque pas de signes cliniques notifiés ou visibles, car la souris n'est pas un hôte naturel des entérovirus utilisés dans ce projet. Cependant, le déroulement de ce projet peut entrainer quelques désgréments chez l'animal au niveau des points d'injection (classe légère), mais toutes les précautions sont mises en place pour limiter la souffrance et le stress de l'animal.
Devenir
A la fin du protocole, une mise à mort de tous les animaux sera réalisée pour la récolte des échantillons nécessaires aux expériences.
Remplacement
Cette étude chez l'animal constitue la dernière étape du projet de recherche. Elle est indispensable pour la suite, et ne peut être réalisée par une méthode in vitro, car les mécanismes en jeu dans cette étude n'étant pas modélisables in vitro.
Réduction
Le choix des échantillons utilisés dans cette étude est la résultante de résultats d'études précédentes in vitro qui ont permis une réduction significative du nombre aussi bien de sérotypes (5 sur une centaine des sérotypes d'entérovirus) que de peptides (3 sur une dizaine de peptides possibles) et, par conséquent, le nombre d'animaux utilisables se retrouve significativement réduit. Le nombre d'animaux par groupe est également prévu pour avoir un effectif minimum permettant des bonnes pratiques d'expérimentation et une analyse statistique significative des résultats.
Raffinement
Les conditions d'hébergement seront étroitement surveillées (enrichissement, alimentation). Le protocole établi prend en compte un nombre limité d'inoculations afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. Les prélèvements de fluides se feront sous anesthésie pour éviter une souffrance inutile. De plus, les points limites (comportement agressif, altération de l'état général, diminution de la sociabilité), seront particulièrement surveillés et les animaux sacrifiés dès la constatation de ces signes afin d'abréger leur souffrance. L'évaluation de la souffrance sera effectuée en utilisant comme support la grille de score incluant comme paramètre le poids, l'état du pelage, le comportement interactif, le score grimace chez la souris et la réaction à la manipulation. Par exemple, suite à l'injection il peut y avoir l'apparition d'abcès qui sera évaluée niveau 3. Ces appréciations seront transcrites sous forme de notes de 0 à 3 (0=absence de douleur, 1=douleur légère, 2=douleur modérée, 3=douleur sévère). Le total sera calculé afin d'apprécier l'état général de l'animal en fontion du score total (de 1 à 5 douleur légère, de 6 à 10 douleur modérée, et de 11 à 18 douleur sévère). Ainsi, le point limite à ne pas dépasser est celui correspondant au score total de 11. Les prélèvements de sang se feront seulement en 2 fois, à J0 et à terme car des études antérieures du laboratoire ont mis en évidence que les prélèvements intermédiaires n'apportaient pas d'informations significatives pouvant justifier ces prélèvements.
Choix des espèces
Ce modèle animal représente l'un des rares modèles à être sensibles aux infections à CVB, ces derniers étant des virus humains. Les animaux seront utilisés à un âge entre 3 et 5 semaines. L'utilisation des animaux à un âge relativement précoce se justifie par le fait que la souris a une sensibilité très variable à l'infection par les entérovirus. Cette variation de sensibilité est surtout liée à l'âge de l'animal: la sensibilité à l'infection par les entérovirus est élevée avant l'âge de 6 semaines et baisse au-delà de cet âge.
Analyses de l’infiltration immunitaire au sein de l’ovaire par des cellules issues de moëlle de souris invalidées ou non pour les récepteurs aux oxystérols LXR (Liver X Receptors) chez une souris hôte immunocompromise.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 15 sans réveil. Elles reçoivent une greffe de moelle par voie intraveineuse au sinus rétro-orbital, un prélèvement sanguin puis une stimulation hormonale provoquant une superovulation, avant mise à mort pour prélever ovaires et tissus lymphoïdes. Le porteur indique qu'une réaction du greffon contre l'hôte peut survenir et précise qu'aucun traitement antidouleur ne sera administré car il modifierait les paramètres de l'expérience, les animaux atteints étant alors tués. Il étudie le rôle de récepteurs dans l'hyperstimulation ovarienne liée à la procréation assistée et justifie la souris par la proximité de son cycle avec celui de l'humain.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans un démarche d’exploration de l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris NSG ayant subi une greffe de cellules de moelle issues de souris WT, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. Le but du projet est de visualiser in vivo, le comportement des cellules immunitaires issues des moelles greffées sur le profil d’infiltration du tissu ovarien. Ce test fonctionnel in vivo va nous permettre de mieux comprendre la place jouée par LXR au sein de ces cellules dans la genèse du phénotype. Après 1 mois post- greffes, les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation par Injection IP de PMSG, 7,5UI/souris. Les tissus prélevés seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs des différents sous types immuniaires afin de caractérisé l’infiltrat. Ces études seront conduites en utilisant 3 donneurs de moelle osseuse distinct : 1) La lignée sauvage (Wild-Type ou WT) servant de control, 2) la lignée LXRs invalidés (LXR DKO ou LXR-/-) correspondant à un knock-out total des récepteurs LXRalpha et LXRbeta et 3) la lignée rescue pour l'expression de LXRbeta spécifiquement dans les cellules de Granulosa (Tg-AMH LXRbeta). Nous anticipons que les lignées KLXR DKO et Tg-AMH LXRbeta devrait se comporter de manière identique puisque les cellules immunitaires issues de ces souris sont déficientes pour les récepeteurs LXR. Ainsi nous pourront évaluer l'étendue et les caractéristiques de l'ensemble des infiltrats au regard du génotype des moelles implantées. Ainsi nous espérons être en mesure de conclure quand au rôle des LXRs dans les cellules immunitaires au sein de l'ovaire lors de la stimulation hormonale par la PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin).
Bénéfices attendus
Cette étude, couplé au reste du projet de recherche, qui est de plus grande envergure, va ainsi permettre de connaitre le role intrinsèque joué par les récepteurs LXRs au sein du compartiment immunitaire qui compose le tissu ovarien. Plus précisement, la greffe de cellules issues des souris transgéniques sauvages ou invalidées pour les LXRs sera injecté dans des souris avec un fond génétique NSG. Ceci va permettre de faire un rescue du répertoire immunitaire des ces souris et les cellules de l'immunité spécifiqes devraient ainsi recolonisées l'ovaire permettant de mieux comprendre comment ce dernier réagit à la stimulation à la PMSG. En termes plue vulgariseés, cette étude va permettre de comprendre le role des récepteurs LXR qui se trouve dans les cellules immunitaires au cours de la réponse de l'ovaire à une stimulation hormonale chez des patientes inclus dans un programme de procréation assistée. In fine, ces travaux pourraient permettre de trouver des biomarqueurs prédictifs de la réponse ovarienne à cette stimulation hormonale et ainsi éviter l'apparition de situation pathologique telle que le syndrome d'hyperstimulation ovarienne.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire NOMBRE 1 DUREE 1 minute Procédures d'implantation de moelle : implantation sous anesthésie par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire NOMBRE 1 DUREE 3 minutes
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, en particulier dans le domaine de l'immunologie. Ainsi, il y a un recul très important sur les nuisances susceptibles d'être rencontrée au cours des différentes procédures. Certains animaux peuvent éventuellement développer une GVH. De fait, les souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) après la troisième semaine pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Aucun traitement antalgique ne pourra être réalisé car il conduira de facto à modifier les paramètres expérimentaux (en particulier les anti-inflammatoires). En cas de GVH, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Chaque animal sera implanté par une moelle d'un donneur sauvage ou transgénique puis inclus dans le protocole de stimulation par la PMSG. L'ensemble des animaux seront mise à mort en fin d'experimentation pour prélèvement des ovaires et tissus lymphoïdes secondaires en vue de la caractérisation du profil immunitaire.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules vis à vis de leur statut LXR. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype d’infiltration in vivo. Cette approche d'anticipation permet ainsi de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et limiter l'étude au strict nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 45 individus.
Raffinement
Deux points sont à prendre en compte : i) les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 40 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin. ii) l’implantation de cellules immunitaires dans les porteurs NSG peut dans certains cas induire une réponse de l’hôte contre le greffon (GVH-Graft Versus Host syndrome). Cette réponse apparaît dans les 3 semaines qui suivent l’implantation. A cette période, les souris seront mises en observation soutenues pour détecter toutes manifestations de ce syndrome. Toutefois, ce type de complication est rencontrer essentiellement lors du conditionnement des souris par irradiation, ce qui n’est pas le cas ici, ou lors de l’injection de cellules immunitaires « matures » (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells). Dans le cas présent les cellules injectées seront des cellules de moelle, qui présente un risque faible de GVH.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Enfin, le modèle NSG constitue un modèle de choix pour la transplantation de cellules de moelle. Nous utiliserons des femelles de 8 semaines concernant les donneurs de moëlles et des souris de 2 à 4 mois pour le modèle NSG. Les âges ont été determiné à partir des données de la littérature.
Évaluation du potentiel anti-obésité d’un composé ciblant le récepteur à l’Acide gamma amino butyrique de type B (GABAB))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, reçoivent un composé par gavage oral et subissent des prélèvements sanguins lors de tests de tolérance au glucose, avant une mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur reconnaît un isolement en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire, compensé selon lui par le rapprochement des cages. Il teste un candidat médicament anti-obésité et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative" que l'animal, un modèle informatique étant selon lui impossible.
Objectifs
Contexte : Pour les autorités réglementaires, la prévention de l'obésité d'origine alimentaire chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. Nous allons utiliser un modèle d’obésité d’origine alimentaire, des souris seront rendues obèses par exposition à un régime riche en graisse (RRG), dans lequel les lipides représentent 60% de l’apport calorique, les animaux seront mis en contact avec cette alimentation pendant 12 semaines avant de débuter le traitement.
Bénéfices attendus
L’obésité est un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Actuellement, plus de 300 millions de personnes sont obèses et ce nombre ne cesse de s’accroître. Ces patients ont un risque accru de développer des pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et plusieurs types de cancers. Soigner l’obésité permettrait ainsi de réduire de manière significative l’incidence de toutes ces maladies associées. Malheureusement, les traitements existants à l’heure actuelle sont peu efficaces et les régimes hypocaloriques ne conduisent qu’à une perte de poids temporaire, suivie très fréquemment par un retour rapide au poids initial dès la fin du régime (phénomène dit de « yo-yo »). Seule une intervention chirurgicale associant une réduction de la taille de l’estomac et une déviation de l’intestin est à ce jour efficace à long terme pour traiter l’obésité. Cependant, les risques et effets secondaires liés à cette chirurgie en font un choix de dernier recours réservé aux cas d’obésité les plus graves. Nous manquons ainsi de traitements qui permettraient une prise en charge efficace de la majorité des patients obèses tout en limitant les contraintes et effets secondaires. Ce type d’étude permettrait de découvrir de nouvelles pistes de traitement pharmacologique.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront potentiellement réalisés lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, si le composé montre une efficacité à diminuer le poids corporel des animaux obèses. Les quantités de sang prélevées sont minimes et correspondent à moins de 1% du volume sanguin total. L'acte en lui-même n'est pas douloureux.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte pour nous permettre de pouvoir quantifier la consommation de nourriture, afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux lors des différents actes expérimentaux (gavage, RMN, test de tolérance …), nous allons habituer les animaux aux expérimentateurs et à l’acte lui-même quand cela sera possible (habituation au gavage une semaine avant le début du traitement). De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle thérapie pour lutter contre l’obésité, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale, le niveau de complexité d’une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que les nombreux mécanismes biologiques qui contrôlant la balance énergétique restent inconnus. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé́ en se basant sur notre expérience ultérieure et en utilisant un estimation mathématique adapté. Les résultats seront analysés en utilisant des tests statistiques appropriés.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 18 semaines (10 semaines de RRG chez l’éleveur). Ils seront manipulés pendant 2 semaines, une semaine d’habituation générale à la manipulation des animaux (mesure du poids corporel et de la prise alimentaire) et 1 semaine d’habituation à l’administration par gavage oral. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs et aux procédures qui seront pratiquées tout au long de l'étude. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et permettent de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris arriveront à l’âge de 18 semaines dans notre animalerie, et nous commencerons un traitement de 4 semaines à partir de l’âge de 20 semaines (deux semaines d’habituation). Nous allons étudier l’effet d’un composé sur des animaux obèses, pour cela nous avons besoin que les animaux soient en contact avec le RRG pendant un minimum de 12 semaines (début du RRG chez des animaux adultes et âgés de 8 semaines).