Multisystémique

Quand l'injection d'insuline fait tomber leur glycémie sous 40 mg/dL, les souris reçoivent du glucose pour les remonter. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après seize semaines d'exposition à une privation intermittente d'oxygène pour prélever leurs organes. Elles sont habituées progressivement au tube de contention servant aux mesures de pression artérielle, transportées entre trois établissements distincts, et certaines portent un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Le porteur écrit que dix animaux par groupe suffisent pour ses analyses métaboliques et que cinq suffisent pour la télémétrie, sans détailler comment ces effectifs aboutissent aux 390 souris déclarées pour ce volet.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines : 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Elles subissent trois séries de tests de stimulation à l'insuline, au glucagon, à l'adrénaline ou à la dexaméthasone, trois électrocardiogrammes et trois échographies sous anesthésie, quarante-huit heures en cage de mesure des échanges gazeux, et des mesures de pression artérielle en tube de contention. Le protocole, réparti sur trois établissements voisins entre lesquels les animaux sont transportés, prévoit aussi soixante-dix chirurgies de trente minutes pour implanter un émetteur de télémétrie, suivies de quatorze jours de surveillance. La thérapie espérée contre les dérèglements métaboliques de l'apnée du sommeil reste énoncée au conditionnel, quand la privation d'oxygène, elle, court sur quatre mois.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.

Procédures

Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

Chaque souris peut recevoir jusqu'à 26 injections, dont 21 quotidiennes d'affilée, avant 21 jours d'hébergement continu en hypoxie, une instillation nasale, une gonadectomie de trente minutes et deux poses de pellet sous-cutané. Viennent ensuite les échocardiographies sous anesthésie, cinq prises de tension en boîte de contention d'un quart d'heure chacune, deux contentions pour récolte d'urine, et une mesure de tension invasive qui achève l'animal. 6 915 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour décrire le remodelage des vaisseaux au cours de l'hypertension pulmonaire et systémique. Toutes sont tuées pour prélever les organes utiles à l'étude et, écrit le porteur, ceux "susceptibles d'un usage ultérieur".

Objectifs

Le remodelage vasculaire, c’est-à-dire le changement de structure (cellules et matrice) et de réactivités (vasoconstriction et vasodilatation) des vaisseaux sanguins apparait lors de développement d’hypertension (primaire, secondaire ou pulmonaire). Ce remodelage est une composante importante du développement de l’hypertension. L’hypertension artérielle pulmonaire est une maladie rare (avec une prévalence de 15 a 55 cas par millions) et très grave qui entraine une insuffisance cardiaque droite nécessitant à terme une transplantation cœur-poumon. Cette pathologie est caractérisée en particulier par une multiplication des cellules formant la paroi des vaisseaux (cellules endothéliales et cellules musculaires lisses vasculaires) ce qui diminue leur diamêtre et a amplifie l’hypertension artérielle pulmonaire. L’hypertension systémique induit à long terme des altérations de la fonction des organes, en particulier cœur, cerveau et rein, et c’est un facteur de risque d’évènements cardiovasculaires majeurs (accident vasculaire cérébral, infarctus…). Les mécanismes cellulaires impliqués dans ces remodelages artériels ne sont pas pleinement élucidés. Nous étudions le rôle de cellules souches vasculaires ou périvasculaires impliquées dans le développement du remodelage vasculaire associé à l’hypertension.

Bénéfices attendus

Nous espérons que cette étude nous permettra de comprendre les mécanismes de remodelage artériel suite à une hypertension (pulmonaire ou systémique), de la phase de déclenchement à celle de stabilisation. Nous espérons décrypter le rôle des hormones sexuelles dans le déclenchement du remodelage artériel associé à la voie d'intérêt, précédemment mesuré par l’équipe et y corréler ou pas une éventuelle dysfonction rénale. Connaissant les mécanismes de remodelage artérielle menant à une hypertension, ainsi que les cofacteurs, favorisera le diagnostic (biomarqueur) et la précocité de la prise en charge. De plus nous pourrons espérer stabiliser le remodelage pour prévenir des formes plus grave. De même nous espérons améliorer la compréhension général de l'hypertension, et contribuer à comprendre pourquoi prés de 40 pourcent des patients traités pour, sont mal répondants aux traitements existant.

Procédures

Certains animaux subiront de 5 à 26 injections (vigile, 21 fois quotidiennement en continu au maximum, durée de la manipulation de 30 secondes). Ainsi qu’une une mise en hypoxie (animal vigile, 21 jours maximum en continu). Nous leur pratiquerons une instillation nasale (anesthésie gazeuse, dépôt de goutte immédiat). Et il y aura aussi une mesure de tension invasive (anesthésie, analgésie, procédure terminale, 10 minutes). D’autre animaux subiront une chirurgie (anesthésie, analgésie, gonadéctomie une fois, 30 minutes, et une pose de pellet sous-cutanée 5 minutes, deux fois). Puis une échocardiographie (anesthésie gazeuse). Ensuite il y aura une contention pour récolte d’urine (vigile, 2 fois, une minute). Ainsi que des prises de tension (vigile, 15 minutes en boite de contention, 5 fois). Et il y aura une mesure de tension invasive (anesthésie, analgésie, procédure terminale, 10 minutes).

Impact sur les animaux

L’injection d’une molécule pour induire le modèle expérimentale peut provoquer une inflammation péritonéale chronique et des dépôts, du côté du diaphragme ou du péritoine. Les injections peuvent provoquer une douleur légère de courte durée et une inflamation peritonéal. L'hébergement en hypoxie peut générer un stress passager pour les animaux. L'hypertension pulmonaire induite pourrait induire dans de rare cas un arrêt cadio-respiratoire. Les anesthésies pour chirurgie ou pour des analyses peuvent induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La chirurgie peut conduire à des risques hémorragique ou à de douleurs post-opératoires ou encore à un risque infectieux jusqu'a une semaine. Un stress des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. Les mesures de pression systolique et les prélèvements de sang peuvent provoquer des hématomes ou dans de rares cas une hémorragie. Les instillations intranasales peuvent provoquer un arrêt momentané de la respiration et un éternuement. La castration/ovariectomie n'entraine pas de nuisances particulière, l'effet principal étant une augmentation de l'appétit.

Devenir

Toutes les souris en procédures sont euthanasiés pour prélever les organes d’intérêts direct necessaires (biochimie, histologie, culture cellulaires) et ceux susceptibles d’un usage ultérieur.

Remplacement

L'objectif du projet est d’une part de mettre en évidence les mécanismes du remodelage artériel lors d'une hypertension pulmonaire. D’autre part de déterminer l’importance des hormones sexuelles et d’une dysfonction rénale dans l’installation de l’hypertension artérielle suite à un remodelage artériel médié par la voie d'intéret. Pour cela, il est nécessaire de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires et systémique : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), cardiaques (retentissement éventuel d’altérations de la fonction cardiaque gauche et droite), respiratoires (hypoxie), dus système renine-angiotensine et éventuellement nerveux. Cela ne peut être réalisé que par une étude sur organisme entier, nous avons donc choisi un modèle de souris, pour leurs susceptibilités à l’hypoxie et du fait de l’existence des lignée transgéniques d’intérêt. Si nous caractérisons les voies biochimiques, leurs mécanismes seront prioritairement étudiés ou sur lignée cellulaires.

Réduction

Au total, 6915 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d’animaux par lot a été adapté à ces calculs. De multiples organes seront prélevés, comme le mésentère et le rein, pour une étude annexe sur le remodelage vasculaire systémique.

Raffinement

Les animaux seront stabulés avec leurs congénères (2 à 6 par cage), par fratrie pour les mâles, avec du matériel d'enrichissement : lanières de papier, morceau de bois, maison en carton. Ils seront observés quotidiennement par du personnel compétent et informé des paramètres à contrôler et de façon hebdomadaire par les membres de l’équipe de recherche. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12heure par jour (6heure-18heure). La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les animaux sous anesthésie sont toujours placé sur un tapis chauffant a 37 dégré, avec de l'ocrigel sur les yeux pour éviter qu'ils ne deviennent trop sec. Un suivi La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique en péri-opératoire puis en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème desinfectante et antiseptique. Après chirurgie cardiaque, la 1ère semaine, les animaux seront nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Des points limites suffisament prédictif ont été définis et seront quotidiennement évalués avec des annotations sur les etiquettes de suivi post-opératoires.

Choix des espèces

Les souris (Mus Musculus) sont un modèle classique à la fois pour l'étude du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et systémique. Les lignées choisies nous permettront d'étudier nos modéles avec une suractivation de la protéine ou une absence de celle-ci ainsi que le devenir des cellules progéntrice d'intérêt avec le modéle de tracking fluorescent. De plus les lignées nécessaires n'existent pas dans d'autres espèces animales, à notre connaissance. Les animaux seront impliqués dans le projet a 6-12 semaines, soit le début de l’âge adulte, l'étude ne portant ni sur le développement, ni sur les ages avancées.

Les expérimentateurs excluent de l'étude et mettent à mort tout animal dont l'état ne s'améliore pas, selon une grille de score prévue pour chaque procédure. 2 000 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à la fin pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Dès l'âge de six semaines et pendant une quarantaine de semaines, elles reçoivent un régime hypercalorique et des boissons au fructose qui les rendent obèses, diabétiques et porteuses d'une stéatose hépatique, avec une à deux administrations de composés par jour, des jeûnes de six heures, une épilation sous anesthésie pour l'échocardiographie et jusqu'à trente semaines d'hébergement seule en cage. La finalité déclarée est de disposer de modèles reproductibles, utilisables ensuite pour tester des candidats thérapeutiques contre l'obésité et la stéatose.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques chez la souris, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possible. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Trois prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (en début, milieu et fin de projet) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (1 fois, durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement (max 3 fois). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes (1 fois). Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique (3 fois).

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (environ 40 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère (quelques minutes) . Pour pouvoir relever la consommation alimentaire et hydrique, nous pourrons être amené à héberger les souris de façon individuelle pendant une partie ou toute la durée du projet (jusqu'à 30 semaines). Les souris seront stressées par cet hébergement, même si elles voient et entendent leur congénères. Pour palier le stress engendré, du sur-enrichissement (petits tunnels suspendus, boule de bois notamment) sera ajouté dans les cages et le personnel est formé à l'approche délicate des animaux, aux gratouilles lors des préhensions. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h. Lors des mesures de composition corporelle, l'animal peut ressentir un stress léger modéré , cela dure environ 2 minutes.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Pour les animaux immunodéficients, nous mettrons en place une zone dédiée et un process clair pour garantir leur statut sanitaire. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique pour chaque procédure est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et le mettront à mort. Les prélèvements de sang seront fait sous couverture analgésique.

Choix des espèces

Les souris sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques et des comorbidités associées. Les animaux sont utilisés à partir de 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

36 souris privées d'un fragment d'ADN vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent huit heures à 4 °C, suivent quatorze semaines de régime riche en graisses, subissent deux prélèvements de sang sur animal vigile et deux anesthésies de quinze minutes, avec un isolement en cage individuelle pouvant durer quatre jours. Les bénéfices avancés, de nouvelles cibles contre l'obésité, le diabète ou les troubles rénaux, tiennent au conditionnel et supposent que ce fragment d'ADN joue bien le rôle qu'on lui prête. Le porteur affirme que ces fonctions métaboliques ne sont modélisables que dans un organisme complet, et que seul un mammifère permet une première collecte de données.

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle d’une partie de l’ADN qui ne code pas pour une protéine, et qui était autrefois considérée comme peu utile. Pourtant, des recherches récentes suggèrent qu’elle pourrait jouer un rôle important dans le fonctionnement du corps, notamment dans la gestion de l’énergie, la régulation de la température corporelle et le bon fonctionnement des reins. Pour étudier cela, nous utiliserons des souris chez lesquelles cette portion de l’ADN a été supprimée. Elles passeront une série de tests pour évaluer leur métabolisme, leur comportement, leur poids et d’autres aspects de leur santé. Elles seront ensuite soumises à un régime alimentaire enrichi pendant 14 semaines, avec un suivi régulier. À la fin de l’étude, plusieurs organes seront analysés afin de mieux comprendre les effets de cette absence. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à de nouvelles pistes de recherche sur les maladies métaboliques ou rénales.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous utilisons une approche complète pour étudier l’impact d’une portion particulière de l’ADN qui ne produit pas de protéine. En combinant des tests sur le comportement, l’activité du métabolisme, des analyses sanguines et l’étude de plusieurs organes à la fin de l’expérimentation, nous espérons obtenir une vision globale de son rôle dans le corps. Si cette partie de l’ADN est effectivement impliquée dans la régulation de la température, la production d’énergie ou le bon fonctionnement des reins, elle pourrait devenir une cible intéressante pour développer de nouveaux traitements contre des maladies comme l’obésité, le diabète ou les troubles rénaux. Les résultats de cette recherche pourraient aussi nous permettre d’améliorer la détection de certains problèmes de santé grâce à de nouveaux marqueurs biologiques, ou même de proposer des traitements plus ciblés à l’avenir.

Procédures

Les animaux seront exposés à un environnement à 4 °C pendant 8 heures. Ils suivront ensuite un régime riche en graisses pendant 14 semaines. Deux prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux vigiles par contention, chaque prélèvement durant environ une minute. Les animaux seront également soumis à deux anesthésies médicamenteuses d’une durée de 15 minutes chacune.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances attendues, des contentions seront pratiquées, ce qui entraîne un stress léger. Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une légère douleur. Les animaux seront isolés, ce qui entraîne un léger stress. Les animaux seront soumis au froid, pouvant entraîner une diminution transitoire de leur température corporelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l’impact de l’inhibition d’un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation (thermorégulation, fonction hépatique, fonction rénale). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, des glucides, dérèglements mitochondriaux et biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses informations qui pourront ensuite être utilisées dans une approche translationnelle visant à mieux comprendre la physiologie humaine..

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques. Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seule cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique

Raffinement

Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d'animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l'eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). Si nécessaire, des soins locaux seront administrés. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Concernant les tests deux d’entre eux se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 4 jours maximim. A la fin de ces tests, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement), les animaux sont surveillés afin de vérifier qu'ils ne se battent pas. . Les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 8h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C, montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test et remis quelques minutes dans un environemment à 37°C.

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle d'intérêt porteur de modifications génétiques sur le gène d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 10 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.