Multisystémique
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Co-exposition à des contaminants chimiques chez la faune sauvage : conséquences chez le Mulot sylvestre
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Capturés au piège dans des milieux contaminés par des métaux et des pesticides, 62 mulots sylvestres sont inclus dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, ou menées sous anesthésie sans réveil, et tous mis à mort. Une centaine d'individus peuvent passer par les pièges, ceux qui ne remplissent pas les critères d'inclusion étant relâchés sur place. Les mulots retenus subissent une prise de sang sous anesthésie le jour de la capture, la moitié restant ensuite jusqu'à cinq jours en cage pour une seconde prise de sang, avant la mise à mort qui permet de prélever leurs organes internes. Le porteur écarte tout remplacement, tout en indiquant qu'une partie du projet compare microbiote intestinal et microbiote fécal, dans l'idée de travailler plus tard sur des prélèvements fécaux non invasifs.
Objectifs
Les objectifs scientifiques du présent projet sont de caractériser les patrons de co-exposition à des métaux toxiques et des pesticides chez le Mulot sylvestre (un rongeur sauvage commun) et de décrire les indices de diversité et composition de son microbiote digestif (i.e. ensemble des micro-organismes qui vivent dans l’appareil digestif) en explorant l’occurrence i) de potentiels déséquilibres de la flore intestinale, ii) d’agents pathogènes, et iii) de gènes de résistance aux pesticides et médicaments. Ce projet va permettre d’apporter des connaissances sur les interactions entre co-exposition et état de santé ainsi que caractéristiques du microbiote chez les mammifères sauvages potentiels réservoirs d’agents pathogènes. Les données acquises sur les aspects d’exposition aux contaminants serviront également à appuyer un autre projet qui vise à développer un outil d’évaluation des risques environnementaux pour les sites et sols pollués, en alimentant les validations de modélisation de co-exposition aux contaminants dans les réseaux trophiques. Les données et prélèvements alimenteront aussi les bases de données et banques d’échantillons pour des suivis à long-terme des écosystèmes pollués.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la co-exposition à des contaminants chimiques chez la faune sauvage et renseignera l’influence des co-expositions à des contaminants en mélange sur l’état de santé des individus dans une situation d’« effets cocktails ». A travers une perspective relevant de l’écotoxicologie et de la santé environnementale réunies dans une approche « Une seule santé », ce projet apportera des connaissances sur la toxicologie du microbiote et des informations sur l’occurrence de co-résistances chez les communautés microbiennes in natura. Le projet est particulièrement innovant par le design expérimental choisi, combinant données de terrain sur un gradient de pollution et expérimentation en captivité contrôlant les expositions alimentaires aux pesticides. Les travaux visent à identifier les liens entre contamination environnementale, exposition à des contaminants en mélange chez la faune sauvage, déséquilibres microbiens (dysbioses), résistances aux biocides et état de santé. Il explorera le potentiel d’occurrence dans le microbiote digestif d’agents pathogènes zootiques ou zoonotiques pouvant développer des co-résistances. Ce croisement de données à l’échelle individuelle permettra, pour la première fois chez un micromammifère sauvage, d’aborder la toxicologie du microbiome dans ce contexte de co-expositions multiples à des métaux et des pesticides.
Procédures
Les animaux seront capturés in natura et maintenus en captivité durant moins de 24h dans les dispositifs de piégeage. Chacun des individus est identifié à l’espèce, sexé et pesé avant d’être inclus dans les procédures expérimentales ou relâché in situ sur son site de capture. Cette étape est menée sur animaux vigiles, elle dure 3 à 5 minutes à partir de la sortie du piège. Le nombre exact d’individus concernés ne peut être affirmé car il dépend des succès de piégeage, il concerne à minima les 60 Mulots sylvestres inclus dans les procédures expérimentales, et au maximum une centaine d’animaux en considérant les Mulots sylvestres ne satisfaisant pas aux critères d’inclusion et les autres espèces qui ne seront pas concernées par les procédures expérimentales. Une prise de sang sera menée sous anesthésie générale, le jour de la capture, pour chacun des 30 Mulots sylvestres étudiés dans la procédure expérimentale 1. Deux prises de sang seront menées sous anesthésie générale pour chacun des 30 Mulots sylvestres étudiés dans la procédure expérimentale 2, la première le jour de la capture puis la seconde après 5 jours de maintien en cage. Ces procédures seront réalisées par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé pour une prise de sang est de l’ordre de 1 à 2 minutes. A l’issue des expériences et toujours sous anesthésie générale, les 60 Mulots sylvestres seront euthanasiés par un personnel qualifié.
Impact sur les animaux
Au cours des expérimentations, les animaux peuvent ressentir un stress transitoire lié à la capture, à la contention et à la manipulation. La manipulation est potentiellement cause de douleur en cas d’incident pendant la contention (lorsque l’animal tente de s’échapper, de mordre, etc). La durée est transitoire sur les quelques minutes de manipulation. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie. Cette manipulation peut entraîner une douleur au réveil post-anesthésie, d’une durée limitée à quelques minutes ou heures, et réduite par l’utilisation d’un analgésique. Dans de rares cas, la prise de sang peut entraîner un écoulement sanguin anormal. Cet écoulement dure quelques secondes à quelques minutes et il est enrayé très rapidement. Dans de très rares cas des lésions peuvent être observées dans les jours suivant la prise de sang. Elles seront surveillées lors du bilan de santé durant l’encagement pour les animaux maintenus en captivité. Durant l’encagement, les animaux peuvent subir une perte de poids durant quelques jours. De même, les conditions de captivité peuvent entraîner des modifications de comportement des animaux telle que la fuite, l’inactivité, et manifestations de stress. Ces modifications sont généralement transitoires : elles se restreignent à la durée de la présence humaine dans l’environnement proche des animaux. Si ces modifications advenaient sur une durée supérieure, elles n’excèderaient pas 5 jours, durée maximale de l’encagement dans notre procédure. Le suivi des conditions de captivité et de l’état des animaux est effectué quotidiennement par observation visuelle depuis l’extérieur des cages, sans manipuler les animaux et en quelques minutes afin de limiter le stress causé par la présence humaine et la contention sur les animaux. Après 3 jours d’encagement, un suivi plus approfondi est réalisé. Cette étape, stressante et potentiellement cause de blessure en cas d’incident pendant la contention, est pour ces raisons limitée à une seule fois durant la période d’encagement. Les protocoles et méthodes employés dans les procédures permettent d’empêcher ou limiter les nuisances et effets indésirables, tel que décrit dans les procédures et les mesures de raffinement.
Devenir
Dans le cadre de cette expérience, aucune alternative ne permet d’éviter l’euthanasie des animaux pour atteindre les objectifs scientifiques des programmes de recherche, programmes dont les objectifs ont été validés par des comités scientifiques. La mise à mort des animaux est nécessaire dans ces procédures car le prélèvement des organes internes est incontournable.
Remplacement
Le projet concerne spécifiquement la faune sauvage vivant in natura et des réponses à l’échelle de l’individu. Le remplacement total n’est donc pas envisageable. Afin de faire les liens entre co-exposition aux contaminants, caractéristiques du microbiote et état de santé des animaux, l’ensemble des réponses doit être menée à l’échelle individuelle ce qui ne permet pas de s’appuyer sur des méthodes non-animales ou ex-vivo. Les besoins de connaissances sur la faune sauvage nécessitent d’étudier spécifiquement les espèces concernées, et les méthodes non-animales ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire ou extrapoler les réponses à l’exposition aux contaminants en mélange, à l’échelle des individus et des microbiotes. L’emploi de méthodes alternatives non-invasives uniquement n’est pas envisageable dans le présent projet pour atteindre les objectifs scientifiques recherchés. Une partie du projet vise à comparer les caractéristiques du microbiote intestinal et du microbiote fécal afin d’envisager ultérieurement des travaux basés sur des prélèvements fécaux non invasifs uniquement.
Réduction
Des bases de données et études existantes ont été mobilisées en amont pour guider la stratégie d’échantillonnage et affiner les hypothèses. Les effectifs d’animaux utilisés ont été rigoureusement définis en fonction des besoins statistiques et scientifiques. Les effectifs souhaités pour ce projet sont définis pour viser un effectif le plus faible possible en termes d’individus par procédure, site de capture et sexe, au regard des besoins de puissance statistique pour interpréter les résultats et détecter des effets biologiquement pertinents. Les procédures 1 et 2 prévoient chacune l’utilisation de 30 individus (31 en incluant un taux éventuel d’exclusion de 3%). L’utilisation d’un seul lot dans chacune des procédures pour mesurer l’ensemble des paramètres étudiés participe au principe de réduction. Les animaux étudiés dans ce projet permettront de mutualiser les prélèvements et d’alimenter les bases de données d’autres programmes de recherche en cours. La présente étude alimentera nos banques d’échantillons permettant de réduire l’utilisation d’animaux à des fins scientifique lors de futurs programmes de recherche.
Raffinement
Les captures sont menées à l’aide de pièges non-vulnérants non-létaux équipés de compartiments dortoirs contenant litière et nourriture. Les pièges sont relevés quotidiennement. En cas de conditions météorologiques extrêmes, les captures sont suspendues. Les conditions d’encagement respectent les standards des Rongeurs de laboratoire : cages normalisées munies d’un enrichissement environnemental, nourriture et eau fournies ad libitum. La durée de captivité est limitée à 5 jours. Des méthodes sont mises en place pour réduire le stress lié à la vue de l’humain et à la manipulation. La majeure partie de la manipulation et l’ensemble des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, leur durée s’élève à seulement quelques minutes. La prise de sang est réalisée en mettant en œuvre des mesures de raffinement : le prélèvement est mené sous anesthésie, un gel analgésique est employé, le geste est réalisé par des personnels compétents et expérimentés. Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L’espèce est le Mulot sylvestre Apodemus sylvaticus (Linnaeus, 1758), micromammifère de la famille des Muridae, sous-famille des Murinae. Ce rongeur est commun, abondant, et ubiquiste. Son statut de conservation est « préoccupation mineure » sur les listes rouges mondiale, européenne, nationale et régionales (France). L’aire de répartition de cette espèce euroasiatique couvre l’Afrique du Nord et l’Europe et l’ensemble du territoire français métropolitain. Les micromammifères sont des hôtes et vecteurs de contaminants chimiques et biologiques au sein des écosystèmes terrestres. Le Mulot est un modèle biologique fréquemment étudié en écologie, écotoxicologie, et éco-épidemiologie et présente une proximité phylogénétique avec les souris et rats de laboratoire, permettant ainsi de mettre en relation les résultats obtenus ici avec la littérature scientifique. L’espèce est facile à capturée et à maintenir en captivité quelques jours à semaines. L’espèce est suivie depuis 2006 sur le site d’étude. Seuls les Mulots sylvestres adultes, mâles et femelles non-gestantes et non-allaitantes, seront étudiés dans le projet. Les juvéniles seront exclus. Ce choix est guidé par des raisons scientifiques mais également réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. L’espèce étant peu longévive (espérance de vie maximale de 18 mois, moins d’un an in natura), seule une classe d’âge « stade adulte » sera considérée.
Etude d’un candidat médicament pour la drépanocytose dans un modèle de souris Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Anémie, inflammation, épisodes vaso-occlusifs et troubles respiratoires pouvant conduire à la mort : les 136 souris de ce projet portent une mutation qui reproduit la drépanocytose humaine, dans des procédures classées en souffrance sévère. Toutes sont tuées, puis autopsiées, cerveau, cœur, foie, rate, poumons et reins. Elles arrivent âgées de trois à quatre semaines et reçoivent dans leur eau de boisson un candidat médicament à différentes doses, l'équipe suivant leur état de santé et leur survie. Le RNT ne décrit comme procédures que deux prises de sang, et annonce des points limites sans préciser lesquels.
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique dans laquelle les globules rouges, au lieu d’être ronds, prennent une forme de faucille. Cela bloque la circulation du sang, provoque des douleurs, de l’anémie et des infections. C’est la maladie génétique la plus fréquente en France. Pour l’étudier, nous utilisons un modèle de souris qui présente les mêmes symptômes que les patients. Dans ce projet, nous allons tester un médicament prometteur. Il sera donné aux souris dans leur eau de boisson, à différentes doses. Leur état de santé sera suivi, ainsi que leur survie. Des analyses seront ensuite réalisées pour comprendre les effets du traitement.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux. Cette molécule pourrait être proposée à des patients qui expriment une forme sévère de la drépanocytose.
Procédures
Les animaux auront une prise de sang quand ils atteignent l'âge de 6 mois donc une anesthésie gazeuse (2 minutes). Une prise de sang sera effectuée systématiquement quel que soit l'âge de l'animal avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Concernant le candidat médicament les études toxicologiques n'ont pas démontré d'activité toxique aux doses utilisées. Les symptômes de la drépanocytose dans ce modèle animal sont surtout une anémie, une inflammation, des phénomènes vaso-occlusifs sous l'effet d'un stress oxydatif et des problèmes respiratoires pouvant conduire au décès de l'animal. Toutefois il est attendu une amélioration dose dépendante de l'état physiologique des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour étude anatomo-pathologique de leurs organes (cerveau, coeur, foie, rate, poumon, rein).
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, poumon, rate, rein, cerveau), comme il n'existe pas de système ex vivo capable de mimer la complexité entre les organes, un organisme entier vivant s'impose pour réaliser cette étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes car la drépanocytose est une maladie à transmission autosomique. Comme chez l'homme, l'espérance de vie des animaux présentant cette anomalie génétique peut être considérablement réduite en l'absence de traitement. Le nombre d’animaux a été fixé à 34 par groupe, calculé à partir de tests statistiques adéquats afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la fiabilité des résultats
Raffinement
Les conditions d'hébergement (bruit, température, hydratation, stress..) ne doivent pas amplifier les symptômes de la maladie. L'enrichissement sous forme de buchette à grignoter et de matériel de nidification est présent. Les techniciens en charge de ces animaux les manipuleront par cup handling ou tubing. Les observations se feront sans stimuler et sans manipuler les animaux. La pesée des animaux sera effectuée par tubing. Des points limites ont été établis et une médication à base d’analgésique pourra être instaurée ainsi qu’une observation renforcée.
Choix des espèces
Les animaux choisis présentent une modification génétique reproduisant les symptômes observés chez l’homme atteint de drépanocytose. Les animaux inclus dans notre étude proviennent du croisement de reproducteurs porteurs de l’anomalie, élevés chez un fournisseur agréé. Nous recevrons des animaux âgés de 3 à 4 semaines, soit un stade de croissance correspondant chez l’humain à celui d’un jeune enfant. Il est important de travailler sur ces jeunes animaux, car dans ce modèle, un individu âgé de 3 mois correspond à environ 20 ans chez l’homme. Par ailleurs, la maladie est généralement diagnostiquée avant l’âge adulte, ce qui justifie le choix de ce stade de développement pour l’étude.
Caractérisation d’un nouveau modèle de souris dans l’hyperthermie d’effort
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 328 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant courir jusqu'à deux fois une heure trente sur un tapis roulant. Les souris sont stimulées pour les maintenir en course, exposées trente minutes à une chaleur ambiante élevée ou anesthésiées au gaz pendant une heure trente, avec jusqu'à quatre mesures de température rectale sur animal éveillé. Le porteur décrit les effets attendus : montée de la température corporelle, mouvements spasmodiques, difficulté à respirer, contractions musculaires généralisées, perte de conscience. Le bénéfice annoncé, un test de prédisposition destiné aux athlètes et au personnel militaire, reste à venir quand les crises d'hyperthermie sont, elles, déclenchées d'emblée.
Objectifs
Les crises d’hyperthermie sont des maladies mortelles qui peuvent être de deux types : hyperthermie d’effort et hyperthermie maligne. L’hyperthermie maligne apparait à la suite d’une exposition aux anesthésiques volatiles lors d’une opération chirurgicale. L’hyperthermie d’effort survient au cours d’une activité physique prolongée et intense chez des athlètes, le personnel militaire ou les travailleurs en extérieur. Les deux types de crises d’hyperthermie se caractérisent par une élévation nocive de la température corporelle, un état neurologique dégradé et une contracture musculaire généralisée. Le décès des patients intervient si aucune prise en charge n'est réalisée. Chez l’homme, les patients atteints d’hyperthermie d’effort ont également montré une sensibilité aux anesthésiques. Un projet de recherche a été réalisé sur les prédispositions génétiques à l’hyperthermie d'effort en étudiant une cohorte de soldats ayant fait un épisode d’hyperthermie d'effort lors d’exercices de marche commando. A l’issue de cette analyse, des mutations génétiques ont été trouvées, permettant ainsi de faire le lien entre un gène et ces pathologies. Le but de ce projet est l’étude d’un modèle de souris portant une ou deux copies des mutations retrouvées chez les patients afin de valider son implication dans l’apparition des crises d’hyperthermie. Ce modèle de souris permettra également l’étude des mécanismes physiopathologiques de la maladie, ainsi qu’une meilleure détection et prise en charge des patients susceptibles d’être sujets à une crise d’hyperthermie.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de valider l’implication d’un nouveau gène dans l’apparition des crises d'hyperthermie et permettra d’avoir un moyen diagnostic chez les athlètes, les militaires et de manière générale les populations d’actifs afin d’identifier les personnes ayant une prédisposition à développer des crises d’hyperthermie. Enfin il permettra d’identifier les mécanismes au niveau cellulaire et moléculaire de cette maladie, permettant de développer de nouvelles approches thérapeutiques ou préventives.
Procédures
Certains animaux seront exposés 30 minutes à une température ambiante élevée. Certains animaux seront exposés à une anesthésie gazeuse d'1h30 avec prise de la température régulière sur l'animal anesthésié. Certains animaux seront exposés à un test d’exercice physique sur tapis de course (2 fois maximum, 1h30 maximum par test). 2 à 4 prélèvements de sang maximum seront réalisés sur les animaux éveillés. Tous les animaux auront 4 mesures maximum de la température rectale sur animal éveillé sauf les animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus chez les animaux sont ceux qu'on retrouve chez l'homme soumis à une anesthésie ou à un exercice physique intense et prolongé et/ou à une exposition prolongée à une température élevée, avec l'apparition de crises d'hyperthermie. Ils peuvent être les suivants : hausse de la température corporelle, mouvements altérés et spasmodiques du corps, difficulté à respirer, contractions généralisées des muscles, perte de conscience. Des nuisances telles de l'inconfort seront également présentes durant l’expérimentation car les souris seront soumises à des stimulations pour maintenir leur course sur le tapis. Un stress léger de courte durée est présent lors de la prise de température rectale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de préléver les tissus (muscles, cerveaux) pour les analyses moléculaires et la compréhension des mécanismes physiopathologiques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est l’étude d’un modèle souris portant une des mutations retrouvées chez des patients ayant fait une crise d'hyperthermie d'effort. Toutes les études préliminaires ne nécessitant pas d'animaux vivants seront réalisées sur des cellules afin de vérifier l'expression, la localisation et les autres protéines pouvant intéragir avec la protéine d'intérêt. Cependant les causes et les conséquences physiologiques des crises d'hyperthermie ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe dans les expériences est réduit à son minimum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Ce projet est basé sur un modèle de souris dont les caractéristiques ne sont à l’heure actuelle pas connues. Cependant les crises d’hyperthermie d'effort ont été étudiées chez des souris de fond génétique identique aux modèles souris développés pour ce projet. Nous pouvons donc nous baser sur les données de la littérature obtenues pour ces souris sans avoir à refaire une étude, pour évaluer le nombre d'animaux nécessaires pour un résultat exploitable et statistiquement fiable. Pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, les études ne seront réalisées dans un premièr temps que sur des animaux contrôles et ceux porteurs d'une seule copie de la mutation, ce qui correspond exactement à la situation humaine. Si la crise n'est pas déclenchée, alors des animaux où les deux copies du gène d’intérêt sont modifiées seront utilisés.
Raffinement
Si les animaux proviennent d'une autre animalerie, ils seront expérimentés une semaine après leur arrivée afin d'assurer une acclimatation à la nouvelle animalerie. Puis, durant 3 à 5 jours, les animaux seront manipulés une fois par jour pour mimer le prélèvement de sang. Les animaux seront amenés en pièce d'expérimentation au moins 30min avant le début et auront un temps dédié à l’entrainement au tapis de course afin de comprendre la consigne. La température corporelle sera mesurée à l’aide d’un thermomètre dédié aux souris par du personnel compétent. Une échelle d'évaluation spécifique permet l'application de points limites stricts et pertinents pour ce projet.
Choix des espèces
Les techniques actuelles permettent de reproduire chez la souris les mutations à l’origine de maladie humaine. En effet, ce modèle est celui dont la physiologie se prête le mieux à l’exploration d’une pathologie déclenchée par l’exercice physique, en particulier par la proximité de ses structures musculaires et de son métabolisme avec l’homme. Par ailleurs, le coup de chaleur d’exercice ou hyperthermie d’effort est une maladie qui survient chez des sujets jeunes tels que des athlètes, le personnel militaire ou les travailleurs en extérieur. C'est pourquoi nous utiliserons des souris jeunes adultes à partir de l'âge de 8 semaines jusqu’à l’âge de 6 mois afin de se rapprocher au mieux de ce qui se passe chez l'homme.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses de mutations qui leur font développer une maladie neurodégénérative avec l'âge, les souris de ce projet reçoivent en plus un sepsis provoqué par chirurgie, à six mois ou à douze mois. 200 d'entre elles vont être utilisées, 96 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 64 modéré et 40 léger, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles présentent pendant 24 à 48 heures une baisse d'activité, le poil hérissé et parfois des diarrhées liquides, avant d'être transportées vers un second établissement pour une imagerie cérébrale sous anesthésie profonde. Les souris qui servent à produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leurs modifications génétiques.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Caractérisation de l’effet prébiotique et nutrigénomique des produits alimentaires d’origine végétale
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.
Bénéfices attendus
Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.
Procédures
Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.
Devenir
A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.
Remplacement
Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.
Réduction
Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Opérées sous anesthésie pour déclencher un sepsis, transportées vers un second établissement, anesthésiées de nouveau une demi-heure pour recevoir un radiotraceur et passer à l'imagerie cérébrale, 200 souris au maximum vont être utilisées, dont 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris portent des modifications génétiques qui leur font développer une maladie neurodégénérative et des déficits cognitifs, le sepsis étant déclenché à six ou à douze mois d'âge. Le porteur décrit un poil hérissé, une posture voûtée, une baisse d'activité et des diarrhées dans les vingt-quatre à quarante-huit heures qui suivent, et une anesthésie profonde qui expose à un arrêt cardiorespiratoire. Les souris utilisées pour produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, les autres après l'imagerie, pour récupérer leurs tissus.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.
Développement d’anticorps chez le rat
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
La production d'anticorps destinés à des partenaires de recherche passe ici par l'immunisation de rats sur une période de 88 à 365 jours. 60 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tués en fin de projet par exsanguination sous anesthésie pour obtenir le maximum de sérum et prélever des organes. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 12, 15 puis 10 injections selon les voies et subir jusqu'à 20 prélèvements sanguins, avec des boules inflammatoires sous-cutanées de moins de six millimètres dans une partie des cas. Le porteur présente ces anticorps comme des outils "essentiels" pour la recherche et le développement, et met en avant les centaines de publications de ses partenaires qu'ils ont alimentées.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de générer des anticorps à partir de rat. L’immunisation des rate est réalisées par voie sous-cutanée, intra-veineuse ou par intra-musculaire sur une période de 88 à 365 jours. Cette immunisation va nous permettre de générer des anticorps spécifiques de l’antigène d’intérêt. Ces nouveaux anticorps ainsi produit sont des outils essentiels pour le monde de la recherche et développement. Les résultats obtenus grâce aux anticorps générés que nous avons générés ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la création de nouveaux anticorps monoclonaux et polyclonaux. Les anticorps jouent un rôle crucial dans la recherche scientifique et les applications thérapeutiques. Recherche Scientifique 1- Détection des protéines : Les anticorps permettent d’identifier et de mesurer certaines protéines dans des échantillons biologiques. 2- Analyse des cellules : Grâce à un marquage, les anticorps aident à reconnaître et à trier différents types de cellules. 3- Observation au microscope : Ils sont utilisés pour repérer des structures cellulaires. 4- Purification des protéines : Les anticorps permettent d’isoler des protéines d’intérêt à partir d’un mélange complexe. Applications Thérapeutiques 1- Traitements avec des anticorps monoclonaux : Utilisés contre le cancer, les maladies auto-immunes et certaines infections. 2- Thérapies ciblées : Les anticorps peuvent transporter des médicaments directement vers les cellules malades. 3- Neutralisation des micro-organisme : Ils peuvent bloquer l’action de virus ou de toxines bactériennes pour protéger l’organisme. 4- Stimulation du système immunitaire : Les anticorps peuvent renforcer ou réguler la défense immunitaire pour traiter certaines maladies, notamment le cancer. 5- Outils de diagnostic : Présents dans de nombreux tests médicaux, ils permettent la détection de différentes maladies. 1. . Les anticorps sont des outils puissants en recherche et en thérapeutique en raison de leur spécificité et de leur capacité à se lier à des cibles moléculaires précises. Leur utilisation continue de se développer, ouvrant la voie à de nouvelles approches pour la recherche fondamentale et pour le traitement de maladies.
Procédures
- Prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés, environ 5 min, maximum 20 prélèvements. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 12 injections. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection sur animaux anesthésiés, environ 20 seconde, maximum 10 injections. Exsanguination sous anesthésie, sans réveil.
Impact sur les animaux
Il existe plusieurs effets indésirables pouvant toucher les rats au cours de ces programmes de recherche : La préhension de l’animal lors des prélèvements et des injections pouvant entraîner un léger stress. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une petite boule inflammatoire dont le diamètre ne dépasse pas 6 mm au maximum dans moins de 50% des cas l’apparition Pour les injections intra-musculaires, une très légère douleur pourrait avoir lieu lors de l’injection avec un adjuvant, une analgésie sera mise en place dans ce cas
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.
Remplacement
À ce jour, il n'est pas envisageable de remplacer le modèle in vivo chez le rat pour la génération des anticorps. En effet, la réponse immunitaire est un phénomène complexe qui implique la coopération de multiples types cellulaires, pour lequel il n'existe pas d'équivalent in vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent, elles ne permettent pas d'obtenir des anticorps de qualité équivalente (propriétés et fonctions). Ces technologies de développement d'anticorps in vitro ne sont pas encore matures. Elles nécessitent un équipement spécifique et des réactifs adaptés et les chances de succès sont limitées, comme le démontre le faible nombre d'anticorps cliniques généré par ces approches alternatives.
Réduction
Le nombre de rat utilisé pour chaque expérimentation est réduit à un minimum de 2 animaux. Pour les anticorps polyclonaux, la purification des anticorps requiert une quantité conséquente de sérum, c'est pourquoi nous utilisons généralement 2 rats par immunogène. Pour les anticorps monoclonaux, nous immunisons 2 rats par immunogène. La réponse immunitaire variant d'une rat à l'autre et selon la nature des immunogènes, plusieurs rats sont nécessaires pour générer des anticorps monoclonaux de qualité.
Raffinement
Les rats sont logés dans des cages standard, en groupe (2 par cage). Ils bénéficient d'un enrichissement sous forme de tunnels pour améliorer leur environnement. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des rats pour limiter le stress au maximum. De plus, ils sont anesthésiés à l'isoflurane 3% lors de chaque intervention pour minimiser la douleur et le stress.
Choix des espèces
Le rat montre une très bonne réponse immunitaire basée sur les anticorps. De plus de nombreux outils existent déjà pour l’utilisation des anticorps générés dans la recherche et le diagnostic. Nous utilisons des jeunes adultes (environ 7-8 semaines) car c'est à cet âge que la réponse immunitaire est optimale.
Thérapeutique de la cystinurie à partir d’un modèle murin
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Les souris qui n'ont pas le génotype recherché et les couples en fin de reproduction sont tués, comme les animaux entrés en procédure, dont les reins et le cœur sont prélevés après la mort. 2 043 souris vont être utilisées, 1 443 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 600 dans des procédures modérées. Ces souris forment spontanément des calculs de cystine, et 600 mâles subissent des recueils d'urine répétés jusqu'à treize fois, seize heures en cage métabolique sans nourriture, un gavage quotidien pendant deux semaines, pour certaines l'ablation d'un rein sous anesthésie. Le porteur précise que les animaux seront utilisés entre six et dix semaines, avant l'apparition vers six mois des calculs qui rendent leur état douloureux.
Objectifs
La cystinurie est une maladie génétique responsable de lithiase récidivante. La lithiase désigne la formation de calcul/concrétion solide dans les cavités rénales (dans les voies urinaires). Cette maladie touche près d'une personne sur 7000 mais représente la principale cause de lithiase génétique chez le sujet jeune et l'enfant. Cette maladie est causée par la mutation de transporteurs rénaux d'acides aminés (tel que la cystine) qui les empêche d'être réabsorbé de l'urine. La cystine se retrouve alors en quantité excessive dans l'urine et finit par précipiter sous forme de calculs urinaires (lithiase). L'obstruction causée par ce calcul est responsable de la crise de colique néphrétique. La répétition de ces crises de colique néphrétique peut conduire à une insuffisance rénale chronique, voire à la mise en dialyse dans les cas les plus sévères. La thérapeutique actuelle est insuffisante et repose essentiellement sur l'alcalinisation des urines, l'augmentation de la diurèse et sur l'utilisation de médicaments liant la cystine (D penicillamine, tiopronine) mais exposant les patients à des effets indésirables parfois sévères. Suite à l'apparition d'une mutation spontanée sur les transporteurs d'acide aminé urinaire dans un élevage, il existe un modèle murin présentant des lithiases de cystine comparables aux lithiases décrites chez l'homme. Cependant, elles ne font pas de colique néphrétique car les calculs se trouvent dans la vessie uniquement. Notre objectif est de prouver dans ce modèle murin, que l'alcalinisation urinaire est efficace dans la prévention des récidives de calculs cystinuriques et de déterminer quel traitement alcalinisant est le plus efficace.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce travail est de montrer que l'utilisation des nouveaux traitements peut permettre de réduire l'activité lithiasique chez les patients cystinuriques. Ces traitements pourraient permettre d'améliorer significativement la qualité de vie des patients cystinuriques et réduire le risque d'insuffisance rénale voire de mise en dialyse. Les procédures permettront de déterminer quel traitement est le plus efficace pour alcaliniser les urines, pour prévenir la précipitation de la cystine chez des souris sans dégradation de la fonction rénale et chez des souris rendues insuffisantes rénales.
Procédures
Les animaux utilisés pour ces procédures sont des souris cystinuriques. C’est-à-dire qu’elles forment spontanément des cristaux de cystines. L'accumulation de ces cristaux peut entraîner la venue de calculs urinaires conduisant au phénotype dommageable de ces souris. Cependant, les animaux seront utilisés à partir de 6-10 semaines, et les protocoles durant 4-6 semaines ou jusqu'à 3 mois, les souris n'auront pas encore développé ce phénotype dommageable survenant après 6 mois. Dans le cadre du génotypage d'une partie de ces animaux, les souris seront soumises au prélèvement d'une petite partie distale de la queue. Ce prélèvement ne dure que quelques secondes sur des souris vigiles. Les animaux seront soumis à des recueils urinaires soit par émission spontanée d'urine (technique du spot urinaire qui ne dure que quelques secondes), soit par recueil en cage métabolique de 16h (1 seule fois pendant la procédure). Les spots urinaires seront répétés de façon hebdomadaire : une ou deux fois par semaine durant 4 ou 6 semaines ou 3 mois, soit respectivement 4, 6, 8 ou 13 fois. Ces recueils sont effectués sur animal vigile. Certains animaux seront soumis à une chirurgie rénale réalisée sous anesthésie générale associé à une analgésie pré et post-opératoire (néphrectomie, chirurgie durant 25min). Certains animaux seront soumis à un gavage (procédure réalisée sur animal vigile, ne durant que 10 secondes) de façon quotidienne pendant 2 semaines soit 14 fois. A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin sous anesthésie générale puis d’une euthanasie, suivie des prélèvements nécessaires aux différentes analyses (rein, cœur, ...).
Impact sur les animaux
Le phénotype des animaux n'est pas dommageable avant un âge de plus de 6 mois, lorsque les calculs sont en nombre importants. Les expérimentations seront donc réalisées avant que ce phénotype apparaisse. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible ainsi qu'une éventuelle infection au niveau du site de prélèvement. Toutes manipulations quotidiennes de l'animal peuvent induire un stress chez ce dernier, mais en particulier le recueil d'urine en cage métabolique, et le gavage. Le gavage oral peut être source d’inconfort et d'irritation de la gorge pour la souris, de même qu'il peut occasionner des fausse-routes correspondant à l'administration involontaire du produit dans les voies aériennes. Concernant la chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. De plus, la chirurgie peut induire des douleurs à l'animal provoquées par la procédure (injections analgésie et anesthésie, ouverture des plans cutané et musculaire, sutures), des complications liées à l'anesthésie chimique (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire , stress thermique), une altération de l'état général de l'animal tel que la perte de poids ou la déshydratation, un stress de l'animal lié à l'hébergement individuel et privation d'aliment pendant 16 heures.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux expérimentaux par une méthode réglementaire. Les animaux qui n'auront pas le génotype requis pour les procédures ainsi que les couples en fin de reproduction seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Remplacement
Une partie des données seront obtenues par des analyses in vitro. Nous étudierons ainsi la cinétique de dissolution des cristaux de cystine in vitro en alcalinisant des urines de patients jusqu'à la disparition des cristaux. Toutefois ces données seront insuffisantes pour mener à bien le projet. En effet, chez les patients et chez les souris, la quantité d'espèce alcaline excrétée dans l'urine n'est pas le reflet direct de la quantité apportée par voie orale. Autrement dit, même si nous montrons que l'alcalinisation directe des urines permet de réduire la précipitation de la cystine, il restera à prouver que l'apport d'alcalin par voie digestive peut effectivement faire varier favorablement le pH urinaire. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable
Réduction
Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle et grâce à un calcul de puissance permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux prévu est de 600 souris mâles de 6 à 10 semaines pour les procédure expérimentales. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre d'animaux prévu est de 2043 pour l'élevage, incluant les 600 souris mâles utilisés pour l'expérimentation. La production et donc l’élevage des souris sera adapté aux besoins des différents protocoles. Les souris pourront être cryo-préserver s’il n’y a plus de procédure en cours.
Raffinement
Concernant l'hébergement, le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de différentes tailles permettant aux animaux de les décompacter, et grâce à des morceaux de bois à ronger. Les animaux sont observés quotidiennement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage, notamment au décours des cages métaboliques. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Les animaux seront pesés chaque semaine. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de poids. Les gestes invasifs, à l'exception du gavage qui nécessite que l'animal soit vigile pour ne pas induire de fausse route, seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Tous les autres gestes comprenant le recueil d'urine ne sont pas invasifs. Les animaux seront habitués aux cages métaboliques et aux contentions pour le gavage.
Choix des espèces
Le modèle utilisé est un modèle murin de cystinurie déjà existant suite à la survenue spontanée d'une mutation dans un transporteur rénal d'acide aminé. Ces souris sont viables, n'ont pas de phénotype dommageable dans les premières semaines de vie. Un élevage de ce modèle sera mis en place et constitué exclusivement d'animaux homozygotes pour la mutation et ne présentant pas de phénotype dommageable avant l’âge de 6 mois. Nous utiliserons des souris de 6-10 semaines, âge à partir duquel des cristaux sont analysables chez les souris mutantes, mais bien avant l'apparition d'un phénotype dommageable (lithiase urinaire) qui occure après 6 mois. Nous utilisons régulièrement le modèle in vivo murin et possèdons donc tous les outils nécessaires à l'élevage et l'utilisation de ce modèle.
Modification du projet : Impact de l’hypoxie intermittente sur l’activation du système sympathique et ses répercussions sur le métabolisme et la fonction cardiaque 2/3
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
Huit heures de privation d'oxygène par jour, de 8 h à 16 h, pendant seize semaines. 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 70 d'entre elles recevant en plus un implant de télémétrie posé au cours d'une chirurgie de trente minutes. Elles subissent des injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline et de dexaméthasone, des mesures de pression artérielle en tube de contention, des échographies cardiaques sous anesthésie et des transferts entre trois établissements. Toutes sont tuées après les seize semaines pour prélever des organes, une partie de ces prélèvements étant redistribuée à d'autres chercheurs du laboratoire pour des mises au point techniques.
Objectifs
Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -La privation intermittent d'oxygène (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système nerveux autonome ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ? Pour cela le projet met en place une collaboration multi-équipes pour mutualiser les expertises et le matériel. Le projet sera donc réalisé dans 3 établissements utilisateurs voisins.
Bénéfices attendus
L'activation du système sympathique dans les apnées obstrutives du sommeil commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au syndrome d'apnées obstrutives du sommeil.
Procédures
Dans l'EU1 Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale (durée moyenne 10 min) dans l'EU2. . Certains d'entres eux (5 par groupes et par souches soit 70 animaux), suivront une chirurgie permettant la pose d'implant de télémétrie nécessaire au suivi en temps réel de leurs paramètres vitaux (ECG, glycémie et pression) (durée de la chirurgie 30 min) dans l'EU1. Les animaux seront hébergés en cage adaptée à la mesure des échanges de gaz respiratoires pendant 48 heures (24 heures d’acclimatation et 24 heures de mesures) afin de mesurer la dépense énergétique des animaux dans l'EU2. Ces cages sont conformes aux normes européennes sur le bien-être des animaux, elles contiennent des enrichissements (tunnel) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Enfin des mesures de pressions artérielles seront réalisées sur les animaux à la fin de l'exposition à l'hypoxie deux fois 15 min à intervalle de 4 jours (sur 280 animaux (140 de chaque souche)).
Impact sur les animaux
Le modèle d'exposition à la privation d'oxygène intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagons devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augmenter légèrement la fréquence cardiaque. Les mesures de pression artérielle à la queue étant réalisées en placant les animaux dans un tube de contention, les animaux pourront être stressés lors de ces mesures. Ils seront donc habitués progressivement et plusieurs fois à cette contention avant les mesures. Les animaux opérés pour être équipés d’implants de télémétrie auront besoin de quelques jours de récupération avec un suivi quotidien avec vérification des points limites décrits en procédure expérimentale (sur 14jours). Comme lors de toute chirurgie, un risque infectieux existe. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et avec le même enrichissement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système nerveux autonome.
Réduction
Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal grâce a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice terminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Le nombre d’animaux a été évalué avec un test statistique tenant compte de la variabilité des précédentes expériences déjà réalisées au laboratoire en ce qui concerne les analyses métaboliques et en intégrant un effet de la privation de l'oxygène à hauteur de 20-30%. Nous obtenons un minimum de 10 animaux par groupe avec un risque de 5%. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques. Pour les données générées par la télémétrie, un n=5 devrait suffire car ces mesures sont très précises, réalisées sans stress des animaux et en continue (nombre de mesure supérieur à 1000).
Raffinement
Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses en particulier celles de mesure de pression. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies. Les animaux qui suivront la chirurgie implantatatoire pour la télémétrie bénéficieront d’un traitement antalgique. Enfin, des points limites adaptés et des critères d’arrêt de souffrance sont définis pour la procédure que suivront les animaux de ce projet. La mise en cage colarimétrie n'induit pas de nuissance particulière car elles sont de taille identiques à celles de l'hébergement et nous les aménagerons avec le même enrichissement. Un éventuel stress des animaux pourrait être engendré par le transport entre les différents EU mais les distances sont faibles entre eux. L'EU3 est situé un étage plus bas de l 'EU1 et l'EU2 est situé à 10 min de voiture. Ces transports seront réalisés par l'expérimentateur lui même (pour limiter le stress des animaux) avec le plus grand soin (voiture climatisée, conduite souple etc...)
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. L'utilisation d'animaux transgénique est le seul moyen d'évaluer spécifiquement l'implication du gène ciblé sur les perturbations métaboliques associées à l'hypoxie intermittente, la souris est l'espèce de choix pour ces expériences. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.
Réaction de sevrage, métabolites microbiens et régulation du système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, présentent du sang dans les selles ou restent voûtées en permanence sont mises à mort. 5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines reçoivent une injection intrapéritonéale tous les deux jours pendant quatorze jours, d'autres un gavage à l'âge de deux semaines, une instillation intranasale sous anesthésie ou des prises de sang hebdomadaires, et une partie est rendue immunodéprimée avant une greffe de moelle osseuse. Le porteur cherche à comprendre comment le microbiote intestinal du nouveau-né éduque son système immunitaire, sans expliquer ce qui fixe l'effectif à 5 400 animaux au-delà de la variabilité du microbiote et des effets de portée et de cage.
Objectifs
L’objectif global de ce projet est de comprendre comment le microbiote intestinal, par la production de métabolites, éduque le système immunitaire pendant la période néonatale et permet de maintenir un état symbiotique. Pour se faire, le projet visera à : (i) comprendre quelles cellules, bactéries, produits bactériens et molécules immunitaires sont impliqués pendant la réaction de sevrage pour diminuer la susceptibilité de développer des pathologies inflammatoires ; (ii) comprendre par quels mécanismes les métabolites microbiens participent à la persistance des effets bénéfiques de la période néonatale jusqu’à l’âge adulte. Répondre à ces deux objectifs permettrait d’identifier de nouveaux traitements comme des pro/pre/post-biotiques, ainsi que de nouveaux biomarqueurs au début de la vie afin de diminuer la prévalence aux maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le projet devrait faire progresser les connaissances scientifiques et profiter à la santé humaine. On sait peu de choses sur la façon dont le microbiote intestinal au début de la vie forme l'immunité à l'infection tout au long de la vie. Ce projet a le potentiel d'ajouter des données importantes au domaine scientifique en fusionnant l'immunologie et la recherche sur le développement précoce de la vie. Ce projet vise à identifier à la fois les biomarqueurs d'une formation immunitaire saine ou perturbée, ainsi que les composés potentiels qui peuvent restaurer une empreinte immunitaire saine. En recherchant et en testant différentes bactéries, métabolites et composés immunitaires, ce projet a le potentiel d'identifier des agents thérapeutiques qui pourraient être utilisés en médecine humaine comme de nouvelles thérapies de prévention de la dysrégulation immunitaire.
Procédures
- Prélèvement sanguin 1 ou 2 fois maximum par procédure ou 1 fois par semaine pendant trois semaines et terminal sous anesthésie. Quelques secondes à chaque fois - Injection par voie intrapéritonéale une fois tous les deux jours, par animal, pendant 14 jours ou 1 ou 6 fois maximum par procédure. Durée : quelques secondes - une instillation intranasale. Durée : 2 min sur souris anesthésiée - Gavage 1 fois à l’âge de 2 semaines. Durée : quelques secondes - Injection intraveineuse 1 fois à l’âge adulte. Durée : quelques secondes sur souris anesthésiées
Impact sur les animaux
L’introduction d’une aiguille selon les bonnes pratiques vétérinaires pour les administrations et les prélèvements induisent une douleur et un inconfort de courte durée. Le gavage de substances, effectué conformément aux bonnes pratiques de gestion des animaux, peut causer inconfort de courte durée. Certains traitements entraînent une pathologie intestinale avec diarrhée transitoire et une perte de poids qui peut varier de 10 à 20%. Un traitement peut entraîner une perte de poids au jour 4 chez certains individus (
Devenir
Toutes les expériences nécessitent l'analyse des cellules dans les tissus intestinaux et d'autres organes. La seule façon d'évaluer cela est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Aucune alternative non-animale n’est disponible pour accomplir ce projet. L’interaction complexe que représentent les milliards de bactéries du microbiote intestinal et son hôte ne peut être reproduite in vitro. Les nouveaux modèles organoïdes tridimensionnels ne peuvent pas représenter la grande variété de cellules immunitaires dans l’intestin ainsi que le recrutement de ces dernières, ou encore mimer les différents signaux produits par notre système nerveux central, qui joue un rôle prépondérant dans l’éducation du système immunitaire. De ce fait, pour répondre aux questions de ce projet, il est toujours essentiel et nécessaire d’utiliser des modèles animaux.
Réduction
D'après la littérature et nos résultats antérieurs, les effectifs par groupe prévus permettent d'atteindre des tailles d'effet compatibles avec la question biologique, en prenant en compte la forte variabilité des données (microbiote) et étant donné que le projet inclut des effets portée et cage. Le calcul de ce nombre tient compte d'un minimum de sang, de cellules et d'organes à prélever pour analyse et inclut pour chaque série d'expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il prend également en compte la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure les artefacts expérimentaux et donc les erreurs d'interprétation. De plus, les expériences ont été conçues afin d’utiliser un maximum d’organes de la même souris afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons utilisé une aide statistique pour déterminer le nombre minimum de souris à utiliser par groupe pour obtenir des résultats significatifs, en tenant compte de la variabilité inhérente à l'expérience. Ces tests ont été développés à partir d'outils référencés. Les données seront analysées grâce à des modèles ajustés sur plusieurs facteurs (âge, sexe de l’animal, traitement). Plusieurs facteurs de variabilité indésirable seront à prendre en compte tels que l’effet portée, cage et répétition de l'expérience.
Raffinement
Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles les animaux sont inclus est léger ou modéré. Le degré de souffrance modéré concerne les expériences entrainant une maladie inflammatoire, dont la sévérité peut être précisément suivie par une perte de poids, l’aspect général et un marqueur d’inflammation présents dans les fèces. De cette façon, l’expérimentateur peut estimer la douleur. Au cours de procédures comportant des maladies inflammatoires l’état des souris sera monitoré chaque jour visuellement et tous les 2 jours par une pesée, un contrôle de l’aspect général et l’inspection des selles. Lors de procédures comportant des maladies inflammatoires, l'utilisation de gel hydrique ou/et une réhydratation sous-cutanée sera pratiquée en cas de besoin. Si la perte de poids excède 20%, si la souris présente des signes de détresse clinique grave (léthargie, posture voûtée permanente, piloérection marquée, absence de toilettage), ou qu’une présence de sang dans les selles est observée, l’expérience sera interrompue et les souris présentant un ou plusieurs de ces symptômes seront mises à mort. Pour certains gestes, l’anesthésie sera aussi utilisée.
Choix des espèces
Ce projet vise à explorer et comprendre les interactions complexes, dans le temps, entre les cellules du système immunitaire et le microbiote. Il est donc impossible de modéliser de telles interactions in vitro ou in silico, d’autant plus que relativement peu de choses sont connues dans ces interactions. De plus, les traitements antibiotiques ont déjà été validés dans cette espèce. Le modèle de choix est la souris, qui se prête idéalement aux expériences sur le système immunitaire et le microbiote intestinal, bien connus dans cette espèce. Les souris que nous utiliserons seront des jeunes souris entre la période postnatale et le péri-sevrage (0-4 semaines), des souris adultes (8-15 semaines) et des souris âgées (plus de 6 mois). Ce projet étudie l'influence du microbiote au début de la vie sur les résultats de l’inflammation de différents organes à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'utiliser des souris gestantes et de tester leur progéniture tout au long de la vie jusqu'à l'âge de 15 semaines et à un âge avancé.
Étude de facteurs de sensibilité aux encéphalites à JEV (Japanese Encephalitis Virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une injection intrapéritonéale de virus de l'encéphalite japonaise, à forte dose : 202 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 174 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent en plus une injection quotidienne pendant cinq jours. Deux lignées portent des mutations trouvées chez des enfants atteints d'encéphalite grave, et le projet cherche à savoir si ces mutations aggravent l'infection, le virus se répliquant notamment dans le système nerveux central. Le porteur classe la sévérité globale comme modérée tout en annonçant des symptômes neurologiques sévères possibles, dont une paralysie des membres postérieurs, et se limite pour tout raffinement à des gels hydriques, une réhydratation, du chauffage des cages et de l'enrichissement.
Objectifs
Les encéphalites virales chez les enfants sont un problème majeur de santé publique dans la région Asie-Pacifique. Des altérations de la réponse immunitaire semblent entrainer une sensibilité accrue au développement de symptômes neurologiques sévères. Le but de ce projet est d'étudier deux mutations conduisant à l'inactivation de deux protéines distinctes, retrouvées chez des patients souffrant d’une encéphalite au virus de l'encéphalite japonaise afin de savoir si elles sont potentiellement impliquées dans la sévérité de la maladie. L’étude in vivo des infections invasives au virus de l’encéphalite japonaise nécessite un modèle murin pour évaluer l’impact de ces deux mutations génétiques sur la sévérité de l’infection. En effet, le virus est capable d’induire des symptômes sévères et des séquelles à long terme du fait de son neurotropisme, chez la souris comme chez l'homme. Nous utiliserons deux lignées de souris distinctes, dans lesquelles les mutations dans les deux gènes d'intérêt empêcheront la synthèse des protéines à étudier. Lors de l’infection des souris par voie intrapéritonéale, le virus va se disséminer dans la circulation sanguine et se répliquer dans différents tissus notamment le système nerveux central, permettant un suivi de l'infection dans les souris porteuses des mutations comparées aux souris contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la mise en évidence de facteurs de sensibilité dans le cadre d’encéphalites causées par le virus de l’encéphalite japonaise.
Procédures
Certains animaux recevront une injection quotidienne intrapéritonéale pendant 5 jours (1 injection dure quelques secondes). Les souris recevront une injection intrapéritonéale de virus le jour de l’infection, (1 fois pendant quelques secondes).
Impact sur les animaux
Le degré́ de sévérité global dû à l'infection est considéré́ comme modéré pour les animaux contrôle et génétiquement modifiés. Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des procédures expérimentales présentes dans ce projet : • La piqure de l’aiguille lors des injections intrapéritonéales pourra entrainer une douleur faible et de courte durée (quelques secondes) • Du fait des fortes doses de virus injectées dans les souris contrôles et des mutations induites dans les lignées génétiquement modifiées, les animaux seront potentiellement plus sensibles à l’infection et pourront développer des symptômes neurologiques sévères (paralysie des membres inférieurs…).
Devenir
A la fin de chaque procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort soit pour pour des analyses ex-vivo ou par ce qu’ils sont infectés par le virus de l’encéphalite japonaise.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence des gènes conduisant à une plus grande sensibilité vis à vis de l'infection. Il est encore impossible de reproduire in vitro la complexité de l’organisme et le rôle du système immunitaire. Si des phénotypes sont obtenus dans le modèle murin (sensibilité ou non à l'infection) alors des études sur des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules cérébrales humaines in-vitro) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « organ on chip ») pourront être effectuées pour caractériser les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Ce modèle permet une alternative aux modèles historiques d’études des infections humaines que sont les primates non-humains. En proposant comme alternative la souris, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Notre expérience sur la procédure mise en œuvre dans ce projet nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle. Les animaux ne pourront pas être réutilisés puisqu’il est nécessaire de les mettre à mort pour prélever différents tissus.
Raffinement
Des signes cliniques spécifiques et précoces sont définis pour éviter toute souffrance inutile. Des aliments appétents (gel hydrique), la réhydratation, le chauffage des cages ou le renforcement de l’enrichissement sont mis en place pour améliorer le bien-être des animaux infectés.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée. Leur système immunitaire est proche du système immunitaire humain, ce qui facilite l’étude physiopathologique du virus. Elles ont déjà été utilisées pour étudier l'infection qui fait l’objet de ce projet. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre de générer des souches ayant les mêmes mutations que celles mises en évidence chez l’humain et donc d’étudier la sensibilité des ces souches au virus. Les animaux seront utilisés à l’âge de 12 semaines, car à l’âge adulte les souris non génétiquement modifiées sont résistantes à l’infection tandis que les souris modifiées génétiquement sont potentiellement sensibles. Pour voir si les gènes étudiés augmentent la sensibilité à l’infection il est essentiel que les animaux du groupe non génétiquement modifié soient plus résistants que les animaux modifiés génétiquement.
Étude de l’efficacité d’une molécule améliorant la fonction vasculaire dans des modèles de sepsis chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
2 216 souris vont être utilisées dans des procédures classées en niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever les organes vitaux. Un sepsis leur est provoqué, avec pour effets annoncés une baisse d'activité, un stress, une chute de température et la mort d'une partie des animaux. Chacune reçoit jusqu'à quatre injections et un prélèvement sanguin à la veine de la queue sur animal vigile, certaines une ponction cardiaque sous sédation profonde. Le porteur attend de cette molécule une preuve de concept sur la protection des vaisseaux sanguins, et ramène le nombre de 2 216 souris à des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés, sans autre précision.
Objectifs
Le sepsis est une complication grave d’origine infectieuse, qui peut être mortelle malgré des traitements souvent coûteux. Il provoque une réaction inflammatoire excessive qui détériore les vaisseaux sanguins et perturbe fortement la circulation. Aujourd’hui, protéger les vaisseaux est devenu une priorité pour mieux soigner cette maladie. Des chercheurs ont identifié une nouvelle molécule capable de renforcer les vaisseaux sanguins. Cette étude vise à évaluer l'efficacité de cette molécule à améliorer la prise en charge du sepsis, et à déterminer dans quelles conditions elle serait la plus bénéfique, seule ou en association avec des antibiotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la preuve de concept de l’efficacité de cette molécule à protéger les vaisseaux sanguins lors d’une infection grave. À terme, il pourrait ouvrir la voie à de meilleurs traitements contre différentes infections du sang, en précisant comment et quand utiliser cette molécule. Il pourrait aussi permettre d’identifier un marqueur biologique associé, utile pour suivre son efficacité. Cette étape est essentielle pour envisager l’utilisation future de cette molécule dans la prise en charge du sepsis.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (maximum 4, durée 1 min), à 1 prélèvement sanguin à la veine de la queue (maximum 1, durée 1 min). Ces interventions seront réalisées à l’état vigile. Des animaux seront soumis à des ponctions cardiaques réalisées sous sédation profonde.
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvement sanguin réalisé peuvent occasionner un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Le sepsis provoqué peut entraîner une diminution d’activité, un stress, une baisse de température et la mortalité des animaux.
Devenir
Une fois les animaux mis à mort, nous prélevons les organes vitaux pour analyse.
Remplacement
Toutes les études préliminaires ont été conduites sur des modèles in vitro, cela nous a permis de sélectionner la molécule la plus pertinente à tester. Cependant le sepsis est une situation complexe impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux à utiliser a été calculé en se basant sur des expériences préliminaires et des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Une surveillance stricte et rapprochée sera assurée. Les cages seront enrichies (coton, maison en carton) pour limiter hypothermie et stress. La réhydratation intrapéritonéale systématique visera à prévenir la déshydratation. Des points limites adaptés permettront l’euthanasie anticipée si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour mimer une infection sévère (sepsis) chez l’Homme. Elle permet de reproduire l’ensemble des complications associés à cette maladie, notamment le dysfonctionnement des vaisseaux et d’organes. Nous utilisons des souris femelles et mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines. À 10–12 semaines, les souris ont un système immunitaire pleinement développé et stable. Les jeunes souris (moins de 8 semaines) ont des réponses immunitaires encore immatures, tandis que les souris âgées peuvent avoir des altérations immunitaires ou des comorbidités. L'âge de 10–12 semaines représente un compromis idéal pour limiter ces biais. De plus, cet intervalle d’âge est couramment utilisé dans les modèles animaux, ce qui facilite la comparaison des résultats avec ceux d'autres études publiées. Inclure des souris mâles et femelles permet de détecter d’éventuelles différences de susceptibilité, de réponse au traitement ou de physiopathologie entre les sexes — ce qui est important, car le sepsis affecte différemment les hommes et les femmes chez l'humain. Cela répond aussi aux exigences croissantes en matière de rigueur et d’équité biologique.