Éthologie / comportement / biologie animale

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gène de l'autophagie est invalidé, puis les animaux passent des tests d'interaction sociale et d'ultrasons avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie ou une dislocation cervicale. Le porteur indique que les nuisances tiennent à une période d'isolement, au stress des tests et aux contentions. Il affirme que l'étude d'un défaut d'autophagie sur le comportement "ne peut se faire autrement" qu'in vivo, la retombée contre les troubles du neurodéveloppement restant renvoyée au long terme.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autre les capacités d’interaction sociale et d’ultravocalisations, à différents âges, chez des souris pour lesquelles un gène de l’autophagie a été invalidé. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs. Ils sont ensuite soumis à un protocole de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans la procédure du présent projet, les animaux subissent des tests non invasifs de comportement, jusqu’à la perfusion intracardiaque (n = 120), pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place ou jusqu’à l’euthanasie par dislocation cervicale (n = 120). Des nuisances et effets indésirables classés comme modérés sont attendus, en lien avec notamment la mise en place d’une période d’isolement pour les animaux, le stress induit par les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques.

Devenir

La procédure décrite dans ce projet sera réalisée sur des souris. C’est une procédure modérée qui concerne les 120 animaux issus de la lignée (animaux résidents) et les 120 animaux naïfs (visiteurs WT). L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris. Le nombre d’animaux est réduit en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. D'une manière générale, conçu les lots sont conçus pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans la procédure expérimentale (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 240 souris.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie).

20 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau selon leur état en fin d'essai. Pendant quinze semaines, elles reçoivent des additifs à base d'algues destinés à réduire leurs émissions de méthane et subissent huit prises de sang à la veine caudale. Le porteur indique que ces additifs peuvent réduire l'appétence et donc l'ingestion et la production laitière, effets qu'il qualifie de réversibles et sans conséquence sur la santé. Il affirme qu'il "n'est pas possible de remplacer" l'expérimentation in vivo, l'enjeu déclaré étant de diminuer les gaz à effet de serre de l'élevage bovin.

Objectifs

L'objectif de ce projet expérimental est de tester les effets d’additifs alimentaires à base d’algues marines sur les performances zootechniques (ingestion, production et composition du lait) et les émissions de méthane entérique de vaches laitières en lactation. Cette expérimentation in vivo permettra de démontrer l'intérêt éventuel de 3 additifs différents basés sur différentes espéces d'algues (algues rouges, algues vertes et extraits d'algues brunes seuls ou en association) pour la réduction des émissions de méthane entérique, sans effet délétère pour les performances animales.

Bénéfices attendus

L’agriculture représente 17,4% des émissions de gaz à effet de serre (GES) en France. L’élevage bovin émet 60,4% des ces GES agricoles. La réduction de ces émissions polluantes ets donc un enjeu majeur pour la durabilité des élevages. Le méthane entérique (CH4) représente 50-55% émissions de gaz à effet de serre (GES) en élevage bovin. En moyenne, les émissions de CH4 d'une vache laitière se comptabilisent à environ 400 g par VL/jour, soit environ 150 kg/an. L'alimentation est un des leviers majeurs pour réduire les émissions de CH4 entérique chez les bovins. D'après la bibliographie et les essais in vitro (assez peu d'essais in vivo pour l'instant), les attentes pour ce projet sont de diminuer de 10 à 20% les émissions de méthane entérique des vaches laitières, soit 5 à 10% des GES d’un élevage.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront herbergés et logés selon les normes en vigueur dans les élevages laitiers, durant 15 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Les vaches seront nourries à volonté et traitent 2 fois par jour. Des échantillons de lait seront prélevés à la traite (6 traites par semaine). Les seules prélèvements invasifs seront des prises de sang à la veine caudale, à raison de 2 par périodes (soit 8 au total). Les mesures de méthane sont réalisées à l'aide de dispositifs assimilés à des distributeurs d'aliments concentrés, comme ceux rencontrés dans les élevages bovins.

Impact sur les animaux

Les quelques essais in vivo de la littérature font parfois état d'une faible appétence des additifs à base d'algues, selon l'espèce, le mode de présentation et le taux d'incorporation dans la ration. Cela peut entrainer une baisse des quantités d'aliments ingérées et donc une baisse de production laitière. Par ailleurs, certaines algues sont connues pour fortement diminuer les fermentations ruminales (donc pour fortement réduire les émisisons de CH4 associées) ce qui peut avoir pour conséquence de réduire la digestibilité de la ration. L'objectif de cet essai sera justement de quantifier ces potentiels effets négatifs, néanmoins réversibles et sans conséquence sur la santé des animaux.

Devenir

Suite à l’estimation de l’état général des animaux en fin d’essai, la décision pourra être prise par le responsable de l'installation de réintégrer ces vaches dans le troupeau non expérimental. Si une alerte au niveau de l’état général d’un animal le justifiait, la cellule bien-être (SBEA) et le vétérinaire seraient consultés.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’animaux pour étudier l'impact de stratégies d'alimentation sur les performances zootechniques (notamment l'ingestion, la production laitière et la composition du lait) et les émissions de méthane entérique réelles. Les études in vitro ne peuvent que renseigner sur un potentiel antiméthanogène mais doivent être confirmées par des essais in vivo.

Réduction

20 vaches laitières seront utilisées pour ce projet, nombre minimum pour tester 4 traitements selon un carré latin (4 lots, 4 traitements, 4 périodes) et mettre en évidence des différences statistiques. Ainsi, chaque vache recevra chaque traitement dans un ordre différent, permettant de tenir compte des effet rémanents potentiels. Les vaches recevant également la ration témoin (sans additif), chaque vache sera son propre témoin pour réduire le plus possible le nombre d’animaux en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer l’effet des traitements expérimentaux. Les tests statistiques utilisés seront des analyses de variance (ANOVA, intégrant l'effet période et l'effet lot) pour comparer les performances des animaux (ingestion, production laitière, composition du lait, poids vif...) et les émissions de méthane entérique entre les 4 traitements. Chacun des traitements expérimentaux sera d'abord comparé au traitement témoin pour attester de l'effet significatif ou non de l'additif offert. Le cas échéant, les traitements expérimentaux seront comparés entre eux (comparaison deux à deux) pour déterminer lequel serait le plus efficace.

Raffinement

La conduite d’élevage sera conforme aux règles d’élevage en vigueur. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Des points limites adaptés ont été définis afin d’éviter au maximum toute forme de souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les vaches laitières utilisée sont de race Prim’Holstein. Pour diffuser les résultats, la race Prim’Holstein, qui est la race la plus répandue dans le monde en bovin lait, est la race appropriée. Les vaches seront en lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de vecteurs viraux et implantation de fibres optiques ou de lentilles, un test d'évitement de lieu associé à des chocs électriques, puis une perfusion intracardiaque létale pour fixer le cerveau. Le porteur relie ce travail à l'évitement observé dans le stress post-traumatique et espère y trouver des cibles thérapeutiques. Il affirme qu'un "organisme vivant intègre" est nécessaire, aucun modèle in vitro ou informatique ne pouvant selon lui le remplacer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans la persistance de l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les circuits liant l’hippocampe au noyau accumbens via le septum latéral. L’hippocampe a déjà été impliqué dans la persistance d’évitement de place et le noyau accumbens joue un rôle clef dans la génération du comportement d évitement. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’hippocampe contrôle la persistance de l’évitement de place chez la souris. Pour atteindre l’objectif général, nous réaliserons une caractérisation neuroanatomique et optogénétique des circuits neuronaux activés pendant l’encodage et le reversal de l’évitement de place. Un point clé de cette étude est l’aspect longitudinal indispensable à la caractérisation de ces circuits neuronaux. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ces différents circuits.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Ce projet implique 4 procédures expérimentales décrites en item 4. Chaque procédure (classe modérée) comprend la chirurgie stéréotaxique pour des injections de vecteurs viraux (30-45 min), le comportement d’évitement de place (10-30 min par jour pendant 3-4 jours) et la perfusion intracardiaque (10 min). La procédure 3 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de lentilles à gradient d’indice (30-45 min) et la pose d’une baseplate qui n’implique pas de chirurgie stéréotaxique (30-45 min) pour les études d’imagerie calcique. La procédure 4 comprend également une chirurgie stéréotaxique pour l’implantation de fibres optiques (30-45 min) pour les études d’optogénétique.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place et la perfusion intracardiaque n’engendrent ni douleur ni stress. L'intensité du choc électrique choisie (maximum de 0.2 mA) est largement inferieure aux intensités de chocs classiquement utilisées dans la littérature (0,7 mA). Par ailleurs, ce protocole a été démontré comme n’étant pas plus stressant que l’exploration délibérée d’un environnement familier. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses, l’usage d’anesthésiques et analgésiques est prévu, avant, pendant et après la chirurgie (jusqu’à 8 jours).

Devenir

Notre étude nécessite d’une part de fixer les tissus cérébraux afin d’y réaliser des marquages immunohistochimiques. Ce but expérimental nécessitant la mise en place d’une méthode de mise à mort de perfusion intracardiaque. A l’issue de chaque procédure, les souris recevront une dose létale d’anesthésique et perfusées avec une solution fixatrice (4% paraformaldéhyde). Ces souris ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.

Remplacement

L’utilisation d'animaux vivants se justifie par la nécessité d’identifier des phénomènes physiologiques complexes au sein des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement chez la souris, ainsi que leur interaction fonctionnelle. De nombreuses structures cérébrales entrent en jeu et communiquent entre elles. Il est donc nécessaire d’étudier un organisme vivant intègre, qui ne peut être remplacé à ce jour par des techniques in vitro. De plus, le niveau de complexité dans une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que de nombreux mécanismes biologiques contrôlant la persistance de l’évitement actif restent inconnus.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 204 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont rapprochées les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri-opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés (la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement) et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical. Toutes les souris C57Bl6/j arriveront dans notre animalerie expérimentale à l’âge de 11 semaines. Les souris transgéniques seront élevées dans notre animalerie. Les procédures expérimentales débuteront après 1 semaine d’habituation. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris ne seront plus utilisées au delà de 10 mois.

219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.

Objectifs

L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.

Procédures

Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.

Impact sur les animaux

Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.

Remplacement

L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.

Raffinement

Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la pose d'un implant sous anesthésie, elles subissent une restriction d'eau à un millilitre par jour et une contention tête fixée trente minutes par jour pendant environ trente jours, avant d'être tuées pour un contrôle du cerveau. Le projet étudie les bases cérébrales du choix entre exploration et exploitation, le porteur mettant surtout en avant la visibilité internationale attendue. Il affirme que ces mécanismes ne s'étudient que chez l'animal vigile en situation de choix, sans modèle in vitro possible.

Objectifs

La prise de décision est un processus crucial qui régit chacun de nos comportements les plus évolués. Tandis que nous apprenons de notre environnement et prenons des décisions sur la base de ces connaissances, nous conservons également la capacité d’adapter notre comportement face aux modifications soudaines de l’environnement. Cette adaptation serait favorisée par l’équilibre entre les comportements d’exploitation (c'est-à-dire l'utilisation des connaissances déjà disponibles pour obtenir un gain connu) et ceux d’exploration (c'est-à-dire la recherche d’options plus favorables). Cette hypothèse résulte des études cognitives menées chez l'homme, les primates non humains et les rongeurs. L’objectif général de ce projet est d’étudier les mécanismes cérébraux responsables de la transition entre comportements d’exploitation et d’exploration chez la souris. De nombreuses structures corticales et sous-corticales pourraient participer à ce phénomène. En particulier, des recherches récentes proposent que le cortex moteur secondaire (M2) des rongeurs constitue un nœud critique permettant le contrôle flexible des actions volontaires. Ce constat est étayé par la spécificité de cette structure ayant un rôle démontré dans les comportements flexibles. Ce projet vise donc à éclairer le rôle du M2 pour décider quand explorer ou quand exploiter l'environnement. Pour cela, nous utiliserons l’imagerie cérébrale des structures d’intérêts lorsque la souris est soumise à un test comportemental permettant de quantifier les comportements d’exploitation et d’exploration. Enfin, nous testerons le rôle causal des connexions neuronales identifiées pendant l'exploration et l'exploitation en effectuant des manipulations sélectives des différentes voies sous-corticales.

Bénéfices attendus

Cette étude est avant tout un projet de science fondamentale visant à comprendre les principes neuronaux permettant l’adaptation de la prise de décision dans des environnements changeants. Ce champ de recherche est en effet devenu un domaine extrêmement compétitif au niveau international, et pourtant n'est que faiblement représenté en France. Ce projet améliorera significativement la visibilité internationale de la recherche académique française et placera le porteur en position de force pour réévaluer les rôles complexes des régions motrices et leur connexions aux régions corticales. Au-delà de cet aspect fondamental, ce projet possède une forte composante translationnelle. En effet, l'accent mis sur l'exploitation-exploration des actions volontaires est central dans les neurosciences cognitives, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre efficacement le compromis exploitation-exploration est une caractéristique frappante de plusieurs troubles mentaux.

Procédures

1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1 d'implantation. Elle sera realisée une seule fois par souris, pour une durée maximale d'une heure. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

1) Anesthésie chimique sans chirurgie pour la procédure 1. 2) Restriction hydrique (1 ml/ jour) et contention « tête-restreinte » (30 min/jour) pendant environ 30 jours consécutifs. Ces nuisances sont indispensables pour l’imagerie biphotonique et motiver les souris à la tâche expérimentale.

Devenir

A l’issue des procédures les animaux sont mis à mort. Il est nécessaire de réaliser des contrôles histologiques ou des expériences d’immunohistochimie sur les cerveaux fixés afin de valider les coordonnées des sites d’injection des virus et des sites d'enregistrement.

Remplacement

L’étude des mécanismes de la prise de décision est un enjeu sociétal et économique majeur des neurosciences modernes, comme le relèvent de nombreuses situations humaines inadaptées (prise de risque, addiction au jeu, compulsivité, troubles psychiatriques). Par définition, ces mécanismes ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision et permettra de jeter les bases d'études plus appliquées.

Réduction

La nature innovante des méthodes utilisées (imagerie biphotonique chronique, et optogénétique chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l’expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre des animaux. En effet, certains tâches dans les procédures mettent en jeu des techniques non invasives et non douloureuses qui seront réalisées de façon quotidienne pendant le comportement chez le même animal. Ces techniques modernes permettent donc de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques pairés sur la base des données préliminaires déjà obtenues (moyenne et ecart-type) afin de satisfaire les conditions statistiques de puissance et de significativité (puissance (beta) de 0.8 et un seuil de significativité (alpha) de 0.05).

Raffinement

Les compétences techniques et expérimentales du porteur du projet sont reconnues internationalement, comme prouvé par la qualité élevée des financements obtenus faisant suite à une évaluation exhaustive du projet par de multiples comités d’expert scientifique du domaine scientifique, et garantissent la qualité des procédures expérimentales et de leur raffinement (habituation des animaux, optimisation du comportement et des techniques d’enregistrement, points limites, …). Le projet ne comprend pas de chirurgies. Cependant, la procédure d’implantation, bien que non invasive et non douloureuse se fera malgré tout sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les animaux ne sont jamais isolés mais maintenus en groupe sociaux (5 par cage avec nourriture adaptée et enrichissement : nid, maison et tunnel) et manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée (2 fois par jour) après la restriction hydrique. Des points limites spécifiques suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux : 1) Déshydratation (persistance au test de pli) et/ou perte de poids supérieur à 25 % du poids mesuré au jour 1 avant restriction ; 2) Infection de l’implant (plaie purulente, rougeur, tuméfaction, abcès) ; 3) Qualité de l'implant (perte ou dégradation) ; 4) Neurologie (tremblements, ataxie marquée, tête penchée, crises convulsives). Ces points sont vérifiés deux fois par jour selon un tableau de suivi simplifié (absence/présence) permettant la mise en place de mesures rapides et ciblées (et d’arrêt si nécessaire) si ces points sont observés, respectivement : 1) arrêt immédiat de la restriction hydrique et sortie du protocole le temps nécessaire pour une prise de poids ; 2) analgésie générale (Buprenorphine) pendant 3 jours ; 3 et 4) euthanasie immédiate.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Par ailleurs, les mêmes mécanismes comportementaux qui nous intéressent ici (transition exploitation / exploration) sont en jeu chez les primates humains, non-humains, et les rongeurs, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez le rongeur à l’espèce humaine sans avoir recours à des primates non-humains. Les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris seront donc largement transférables à l'homme, et permettront de mieux comprendre les mécanismes synaptiques en jeu dans la prise de décision en général tout en jetant les bases d'études plus appliquées chez les humains. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des périodes d'hypergravité en centrifugeuse, qui provoquent stress, baisse d'activité et perte de poids les premiers jours, puis soumises à une série de tests comportementaux, boîte noir et blanc, reconnaissance d'objet, labyrinthe en Y et piscine de nage. Elles sont ensuite mises à mort pour prélever le cerveau. Le porteur relie le projet aux troubles cognitifs des astronautes et affirme que l'effet de la gravité sur un organisme entier ne peut être modélisé in vitro ou in silico.

Objectifs

Lors des voyages spatiaux, les astronautes sont soumis à des modifications de gravité qui compromettent leurs performances cognitives, et qui représentent encore l’un des principaux écueils concernant les vols de longue durée. Ce projet consiste à comprendre les mécanismes cérébraux, en particulier hippocampiques, induisant ces perturbations provoquées par des changements de gravité. En effet, si le système vestibulaire est le système sensoriel initialement impliqué dans le mal de l’espace, l’hippocampe, structure centrale auquel il est étroitement connecté, représente une cible potentielle de choix. Notre hypothèse est qu’une partie des troubles cognitifs des astronautes seraient liés à des modifications de la plasticité fonctionnelle des réseaux neuronaux hippocampiques, propriété reconnue comme support biologique des processus mnésiques.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe et des structures associées. En effet, on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est indirectement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulement à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération des fonctions cognitives qu’ils subissent lors de changements de gravité au cours des vols spatiaux. En utilisant différentes durées d’exposition à l’hypergravité, nous cherchons à évaluer à la fois les adaptations qui s’opèrent dans les premiers jours mais aussi sur le plus long terme et comment s’effectue la réadaptation à 1G post-exposition à l’hypergravité.

Procédures

Les animaux seront exposés à une période d’hypergravité . Ensuite, 96 animaux seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse pour permettre des prélèvements de tissus (expositions de 24h, 48h, 15j). Les autres seront soumis à des tests comportementaux. Les animaux effectuant des tests comportementaux seront divisés en 2 lots avec des protocoles de comportement différents (exposition à 24h, 15 j ou 30 j d’hypergravité). Pour le premier lot, le premier jour après la sortie de la centrifugeuse, les souris feront un test de la boite noire et blanche (10 min par souris). Ce test vise à évaluer l’anxiété des souris. Le deuxième jours le test de reconnaissance de place d’objet sera utilisé (test qui permet d’évaluer la mémoire spatiale et de reconnaissance à long terme) (2 sessions de 10 min à 4h d’intervalle par souris). Le 3ème jour la sociabilité et la reconnaissance sociale des souris sera évaluée grâce à un dispositif comportemental (2 sessions de 10 min par souris). Le 4ème jour les souris effectueront la première session d’un test d’évitement passif, la seconde partie du test sera effectuée une semaine plus tard (entre 1 et 5 min par souris)(mémoire émotionnelle). Après ces différents tests, soit 2 semaines après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structures et des enregistrements électrophysiologiques. Pour le lot 2, le jour de la sortie de la centrifugeuse les animaux effectueront le test d’enfouissement de billes (évaluation de l’anxiété,20 min par souris). Le jour 2, les souris effectueront un test d’alternance spontanée dans un labyrinthe en Y (mémoire de travail, 5min par souris). Le 3ème jour les souris commenceront un protocole en piscine de Morris. Ce test, réparti sur 5 jours donnera des indications sur la mémoire spatiale et l’apprentissage (4x4 essais de 1min max par jour). Une semaine après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structure et des enregistrements électrophysiologiques. Ces études vont nous permettre d’évaluer si les modifications sont concomitantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe).

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui provoque une augmentation du niveau du stress chez le rongeur, lié à la perturbation de perception de la gravité, et à la difficulté initiale à se déplacer. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont présenter une faible activité motrice pendant une période de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitataire et reprendre une activité normale. Une baisse de la température corporelle due à l’inactivité des animaux se produira lors des 3 premiers jours d’exposition. De nombreuses études ont aussi montré une diminution de la masse corporelle les premiers jours de centrifugation. Cette perte de poids est due à une hypophagie médiée par une réaction au stress vestibulaire induit par la centrifugation, au bout de 3 à 4 jours les animaux recommenceront à s’alimenter normalement et reprendront du poids.

Devenir

Les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure (soit 300 souris) pour la réalisation d'analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculosquelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements électrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveaux d’organismes ayant été exposés à une hypergravité, qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisamment proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=12 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. En effet, un calcul d’effectif sur le site biostatgv.sentiweb.fr nous a permis d’aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Dans une optique de réduire le nombre d’animaux nous avons décidé de n’utiliser qu’un seul groupe d’animaux témoins et non pas un groupe témoins pour chaque temps d’exposition à l’hypergravité. Aussi, les animaux serviront en plus de la récupération de leur cerveau à des prélèvements sanguins afin d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Une semaine de manipulation des animaux sera réalisée avant les expérimentations afin de réduire le stress lié à la manipulation. Pendant cette semaine les animaux des groupes utilisés pour l’étude comportementale seront aussi habitués à être transportés dans un tunnel en polycarbonate rouge. Le tunnel sera placé à demeure dans la cage puis la souris sera encouragée à entrer dans le tunnel qui sera soulevé afin de faire ensuite délicatement glisser la souris dans la main. Cette méthode permet de ne pas soulever les souris par la queue et enlève par conséquent un facteur important d’anxiété. Lors des tests comportementaux les souris seront placées dans la pièce expérimentale 30 minutes avant le début des tests afin de leur permettre de s’habituer à ce nouvel environnement. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins). Leur environnement est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement leur état de santé et particulièrement d’éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle euthanasie (cf grille de points limites).

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité jusqu’à 2G. Nous avons également choisi d’utiliser des souris C57BL6 car leur génome est connu et que des modifications de leur génome est possible et pourrait nous être utile par la suite (OGM sans otoconies par exemple). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données. Nous utilisons des souris adultes entre 3 et 5 mois car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soient atteints. De plus, les astronautes sont toujours adultes, nos données seront donc plus facilement transposables à l’humain.

872 amphibiens vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les grenouilles vertes relâchées et les xénopes tués. Des adultes capturés dans la nature reçoivent une injection d'hormone sous anesthésie pour obtenir des pontes, puis les têtards sont soumis à des tests de comportement face à un prédateur, en cages flottantes ou en mésocosmes. Les 436 grenouilles vertes et leurs têtards sont relâchés, tandis que les 436 xénopes et leurs têtards reçoivent une surdose d'anesthésique, cette espèce classée envahissante ne pouvant être remise dans le milieu. Le porteur présente l'étude comme utile à la conservation de la grenouille verte, quasi menacée, et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'observation directe des interactions.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs et/ou prédateurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une vingtaine d’années dans les mares, cours d’eau et rivières. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouilles vertes et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouilles vertes seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront soit placés en cages flottantes dans une mare, soit en mésocosmes placés en laboratoire. Dans les deux situations, les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densités différentes (1 et 3 têtards.L-1). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de xénope induirait des comportements anti-prédateurs. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides du Maine-et-Loire.

Procédures

Le transport durant 30 minutes sera assuré dans une double boite réduisant les risques de chocs. Femelles et mâles seront injectés d’hormones pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Avant l’injection, les amphibiens seront anesthésiés dans un bain de sédatif (endormissement en 15 minutes, réveil en 10 minutes). Après l’accouplement et l’ovulation, les œufs seront laissés dans les bacs et les adultes seront déplacés dans un autre mésocosme avec les mêmes conditions environnementales. Une partie des têtards obtenus (n=250 têtards de grenouilles vertes et n=250 têtards de xénopes) seront répartie dans les cages flottantes dans la mare et une autre partie des têtards obtenus (n=180 têtards de grenouilles vertes et n=180 têtards de xénopes) seront répartis en mésocosmes sous conditions contrôlées. Ces têtards élevés en milieu contrôlé seront au bout de trois jours (stade 25) passés en tests de comportement. Ces tests seront au nombre de trois (avec 48h entre chaque test), deux face à un prédateur (xénope adulte et grenouille verte adulte) et un face à un contrôle (grenouille en plastique). Les tests seront filmés et dureront 30 minutes (15 minutes d’acclimatation puis 15 minutes de test). Chaque groupe expérimental passera une fois le test dans chacune des trois conditions. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards seront replacés dans le milieu naturel pour les grenouilles vertes après avoir été pêchés de leur bac d’élevage, placés dans une double boite de transport puis rapportés sur leur site d’origine après 30 minutes de transport. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront en revanche placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des xénopes adultes.

Impact sur les animaux

Il est envisageable qu’un individu soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et par conséquent développe une maladie. L’effet indésirable le plus probable est le stress lié au transport et aux conditions d’hébergements. De plus, à leur arrivée dans le laboratoire, certains animaux pourraient ne pas s’acclimater à leur environnement.

Devenir

Les six grenouilles vertes adultes et les 180 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les six xénopes adultes et les 180 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie en balnéation car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante. Les 250 têtards de xénope placés dans les cages seront après métamorphose mis à mort avec une surdose d’anesthésiant et les 250 têtards de grenouille verte après métamorphose seront libérés dans la mare.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie, la croissance et le comportement des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur et d’un prédateur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition et face à la prédation car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouilles vertes et les trois couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et trois femelles et trois mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs et donc la quantité de têtards nécessaire pour l’expérimentation en cages flottantes et en mésocosmes. Pour l’étude sur les têtards en mésocosmes, les trois réplicats par modalité (grenouilles vertes ; xénopes ; grenouilles vertes – xénopes) sont le minimum pour obtenir des résultats statistiques viables (modèle linéaire permettant d’étudier les interactions statistiques sur le comportement des individus testés). Par ailleurs, la densité de têtards (3 têtards.L-1), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus. Les triplicats permettent de rendre compte de la variabilité interindividuelle existante au sein des groupes tout en obtenant une moyenne au plus proche de la réalité.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau (au-delà des seuils précités), un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie en balnéation avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en mésocosme, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu jusqu’à ce que la qualité d’eau revienne aux seuils exigés ci-dessus. Enfin, les tests de comportement seront toujours précédés d’un temps d’acclimatation (15 minutes) au dispositif afin que les individus puissent revenir à un taux d’activité normal après le transfert des mésocosmes vers le dispositif de test. Il est prévu également un repos de 48h entre chaque test. Le bien-être sera évalué par une grilles déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénopes lisses Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières de Maine-et-Loire. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie.