Éthologie / comportement / biologie animale

1 050 lézards vivipares, espèce sauvage de la faune française, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchés dans des enclos semi-naturels sans être tués. Cent cinquante femelles gestantes capturées subissent une restriction alimentaire et des températures nocturnes élevées, trois prises de sang et une mesure de réponse inflammatoire, et leurs 900 petits sont marqués un à un. L'objet est de mesurer comment le réchauffement nocturne et le manque de nourriture pèsent sur la reproduction de cette espèce. Le porteur affirme qu'aucun équivalent cellulaire ou in silico ne peut remplacer l'animal pour une étude écophysiologique en conditions contrôlées.

Objectifs

Les changements climatiques récents ont modifié la date des évènements de reproduction, la distribution géographique et l'abondance de nombreuses espèces à travers le monde. Ces changements sont très variables en direction et en ampleur selon les espèces, et les animaux ectothermes terrestres sont particulièrement affectés par la modification des conditions thermiques. Chez ces espèces, le réchauffement climatique a des effets létaux via les températures élevées durant le jour mais aussi via des actions chroniques en provoquant une accélération du vieillissement ou des déséquilibres énergétiques. Les études climatiques indiquent une augmentation plus rapide des températures nocturnes que des températures diurnes dans la plupart des régions du globe, mais très peu d’études ont quantifié les effets écophysiologiques des températures nocturnes. Chez les ectothermes terrestres, des températures nocturnes plus élevées pourraient ouvrir de nouvelles niches temporelles en prolongeant le temps d’activité potentiel ou en permettant l’activité nocturne dans les environnements trop chauds pendant la journée, ce qui serait bénéfique. À l’inverse, elles pourraient accentuer les effets délétères déjà constatés avec l’augmentation des températures diurnes en provoquant des taux de vieillissement et des déséquilibres énergétiques accrus car les compensations comportementales durant les phases d’inactivités sont très restreintes. Au-delà des conséquences physiologiques directes de la modification des cycles thermiques diurnes et nocturnes, les changements climatiques peuvent affecter les ectothermes via des effets indirects sur l’abondance de leurs proies. Conjointement, l’augmentation des températures nocturnes et une plus faible disponibilité des ressources nutritives pourraient ainsi avoir des effets délétères sensibles, en particulier pendant la gestation chez les ectothermes vivipares, car cette modalité de reproduction impose à la mère des dépenses métaboliques et énergétiques importantes. Les effets combinés de ces deux facteurs sont rarement explorés. Dans ce contexte, il est nécessaire d’étudier les effets combinés des températures nocturnes et de la disponibilité alimentaire sur la physiologie et les comportements des femelles pendant la gestation ainsi leurs conséquences sur l’aptitude des femelles et de leur progéniture.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de faire progresser notre compréhension de la flexibilité de la phénologie de la reproduction et des effets combinés des températures nocturnes et des ressources nutritives sur la qualité de la reproduction à l’aide d’une approche expérimentale. Nos travaux antérieurs suggèrent que les femelles lézards qui mettent bas plus tôt font face à des coûts énergétiques mais augmentent la croissance, la survie et la probabilité de reproduction à l’âge d’un an de leurs jeunes. Ces effets devraient être exacerbés s’il existait des déséquilibres énergétiques forts induits par des températures importantes lors des phases d’inactivité et exacerbés par une disette alimentaire. Mettre en évidence les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire sur la condition physiologique et physique des femelles nous permettra de progresser dans la bonne direction pour quantifier ces effets. De plus, nous avons démontré que les trois dernières décennies avaient été marquées par une accélération de la croissance et de l’effort de reproduction dans les populations naturelles, mais que le réchauffement climatique pouvait aussi précipiter certaines populations vers l’extinction en accélérant de manière trop importante le rythme de vie des lézards. Dans ce contexte, l’expérience permettra aussi de mieux anticiper les effets du réchauffement climatique sur la reproduction en conditions naturelles et de mesurer si ces effets sont seulement directs ou indirectement induits par les effets du climat sur les ressources. Ces effets indirects sont difficiles à quantifier en conditions naturelles ce qui justifie cette approche expérimentale.

Procédures

Des femelles gestantes seront capturées dans un élevage en extérieur au sein d'enclos semi-naturels au printemps (n=150) et maintenues en captivité dans différentes conditions thermiques nocturnes et de disponibilité de la nourriture en fonction de leur lot expérimental (6 lots, 25 femelles par lot) pendant 1 à 2 mois. Des prélèvements sanguins (durée de manipulation de 3-4 minutes) seront effectués sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 prélèvements par animal). Des mesures de la réponse inflammatoire (durée de manipulation de 4-5 minutes) seront effectuées sur animaux vigiles au début de la gestation, au premier tiers de la gestation et en fin de gestation (n=150, 3 mesures par animal). A la fin de la gestation, les nouveaux nés seront marqués individuellement (n=900; durée de manipulation de 2 minutes). Tous les animaux seront relâchés dans des enclos semi-naturels en extérieur pendant l'été puis recapturés au printemps pour des mesures non invasives afin de suivre leur survie, leur croissance et leur reproduction future.

Impact sur les animaux

Comme nos projets passés l’indiquent, les protocoles du projet induiront une variabilité naturelle de la vitesse de la gestation sans effets létaux pour la mère ou la descendance ainsi qu’une restriction nutritive modérée pour les femelles. Les effets attendus sont ceux d’une accélération thermique de la gestation dans la gamme de variation naturelle et une sous-nutrition modérée induisant éventuellement un stress modéré se traduisant par une moins bonne condition physique et immunitaire, un plus haut niveau de mobilisation des réserves ou de dommages oxydatifs chez les femelles ainsi qu’un nombre plus faible de juvéniles produits. Les procédures expérimentales seront pour l’essentiel non invasives en dehors de trois prises de sang et de l’évaluation de la réponse immunitaire qui nécessitera une piqure. Ces manipulations sont très bien tolérées par les animaux adultes de cette espèce et induisent principalement un stress ponctuel au moment de la manipulation. Les lézards vivipares sont par ailleurs très tolérants à la mise en élevage dans les conditions de captivité de ce projet et à la manipulation par un expérimentateur. Pendant l’expérience, les animaux sont maintenus en conditions d'élevage enrichies dans leur cage individuelle et une phase d'acclimatation sera proposée avant le début de l'expérience.

Devenir

Les animaux sont tous relâchés dans les enclos semi-naturels donc replacés en captivité dans des conditions extérieures proches du milieu naturel sans réutilisation dans de futurs projets.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle biologique par un équivalent cellulaire ou in silico car l'étude écophysiologique de la plasticité de la reproduction nécessite l'utilisation d'animaux dans des conditions contrôlées au laboratoire et aussi en conditions naturelles comme dans notre projet.

Réduction

Un échantillon important d’animaux sera utilisé pour quantifier les conséquences écophysiologiques et les effets intergénérationnels des températures nocturnes et du manque de nourriture (150 femelles adultes et 900 descendants soit 1050 individus maximum) dans la mesure où ces animaux sauvages présentent une forte variabilité inter-individuelle, parce que les animaux seront divisés en 6 groupes expérimentaux et du fait que nous effectuerons un suivi pendant une année en conditions semi-naturelles où la mortalité annuelle est identique à celle dans les populations sauvages. Ces effectifs ont été réduits au minimum par rapport aux 6 groupes expérimentaux du projet et aux besoins du suivi longitudinal sur une année. On utilisera une méthode non-invasive échographique pour valider le statut de reproduction des femelles adultes et ainsi éviter de manipuler des femelles non gestantes. Les analyses statistiques consisteront à comparer les traits des six groupes expérimentaux à l'aide d'analyse de variance (modèles linéaires classiques) ou de modèles mixtes pour les données répétées (données mesurées plusieurs fois pendant la gestation ou après la gestation).

Raffinement

Afin de raffiner les protocoles, les animaux seront manipulés dans des conditions semi-naturelles proches de leur environnement sauvage pendant la quasi-totalité de l’expérience. En dehors des périodes d'élevage, les animaux seront maintenus dans de grands enclos extérieurs de 100 m2 chacun dans une prairie naturelle avec la végétation, les proies naturelles et les interactions sociales typiques d'une population sauvage. L'habitat de chaque enclos est enrichi de zones d'abri, de thermorégulation et de boisson pour optimiser la diversité des microhabitats offerts aux individus. En élevage, on raffinera aussi les conditions d'élevage grâce à un enrichissement des cages et à l'utilisation de conditions climatiques avec des cycles jour. Les cages individuelles sont enrichies à l'aide d'un abri, d'une pierre artificielle pour la thermorégulation et d'un éclairage blanc naturel enrichi en ultraviolet. Des points limites associés à la perte de masse seront appliqués avec arrêt des procédures expérimentales en cas de dépassement du point limite et basculement des conditions d'élevage des animaux vers des conditions optimales ad libitum, si nécessaire avec soins demandés par le vétérinaire référent, avec fin des mesures et des protocoles expérimentaux si les points limites sont dépassés.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le lézard vivipare, Zootoca vivipara (Lichenstein 1823). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis 30 ans dans notre laboratoire et dont les populations naturelles en France ont été bien décrites. Le modèle biologique est intéressant pour comprendre l’écologie de vertébrés « ectothermes » comme les reptiles ou les amphibiens terrestres. Ce groupe comprend de nombreuses espèces menacées d’extinction en Europe et à valeur symbolique et écologique forte. Une thèse a permis d'analyser la plasticité thermique de la phénologie de la reproduction dans des populations naturelles. Ce projet visera à quantifier les conséquences d’une gestation accélérée la nuit et d’une restriction alimentaire pendant la gestation sur les femelles et les juvéniles à l'aide d'une approche expérimentale. Les animaux utilisés seront tout d’abord des femelles adultes gestantes (de 2 ans ou plus). Afin de limiter les variations inter-individuelles, nous ne prendrons pas de femelle sub-adulte (1 an) qui serait gestante car cette première reproduction à 1an est plus rare en conditions naturelles et leur morphologie (taille, masse) serait trop différente de celles des femelles adultes. Le statut de reproduction sera confirmé par une échographie. Dans un second temps, les nouveau-nés issus de la reproduction de ces femelles seront étudiés. Les populations semi-naturelles seront composées par ailleurs de tous les stades de développement (juvéniles, sub-adultes et adultes) pour générer une structure d’âge et de sexe « naturelle » comparable à celle des populations sauvages. Les animaux sont tous identifiés individuellement par un marquage à la naissance et les individus adultes et subadultes sont par ailleurs photographiés en phase ventrale chaque année pour confirmer le marquage individuel à la naissance en cas de doute.

12 vaches laitières vont être utilisées dans une procédure classée en gravité légère, puis conservées pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais. Elles sont soumises à un test de motivation par conditionnement opérant dans une aire en U, avec isolement social partiel et privation d'accès à la nourriture jusqu'à six heures, pour valider un outil censé mesurer leur intérêt pour une alimentation variée. Le porteur indique que l'environnement nouveau et l'isolement peuvent générer un stress transitoire et que la privation d'aliment provoque une sensation de faim. Il présente l'étude comme visant à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin participant au bien-être des vaches laitières.

Objectifs

Dans les systèmes d’élevage de bovins laitiers actuels, l’alimentation des vaches laitières peut être qualifiée de monotone car les rations qui leur sont offertes sont généralement peu complexes en termes de composition et ne varient pas ou peu dans le temps. Pourtant lorsqu’elles en ont la possibilité, les vaches laitières composent un régime alimentaire diversifié en sélectionnant, pour constituer leur ration, un large éventail de plantes dont la disponibilité et la composition varient dans l’espace et dans le temps. Cependant, la question de l’importance de la diversité alimentaire dans les systèmes d’alimentation des ruminants d’élevage n’a émergé que récemment. L’objectif de ce projet est de valider un test comportemental (appelé conditionnement opérant) permettant d'évaluer la motivation des vaches laitières pour un régime diversifié comparativement à un régime monotone. Après validation dans le cadre du présent projet, le test de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire sera mis en place lors de futurs projets dédiés à l’étude de l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières. A plus long terme, cela permettra de déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et participe à leur bien-être.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer et de valider un test d'évaluation de la motivation pour la diversité alimentaire chez la vache laitière. Une fois validé, ce test sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront d’apporter des connaissances sur l’importance de la diversité alimentaire pour les vaches laitières en prenant en compte le point de vue de l’animal grâce à l’étude de la motivation de ces dernières pour la diversification de leur régime alimentaire. A plus long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un prérequis indispensable pour le bien-être des vaches laitières et s’il est donc nécessaire ou non de développer des systèmes d’élevage permettant aux vaches de diversifier leur régime alimentaire pour garantir leur bien-être. Les résultats de ce projet ont vocation à permettre de faire évoluer les pratiques d’élevage en faveur du bien-être des vaches laitières. Au-delà de la question de la diversité, ce projet permettra de valider le test de motivation alimentaire chez la vache laitière, qui pourra être réutilisé pour répondre à d’autres questions en lien avec le comportement alimentaire.

Procédures

Le comportement des vaches laitières sera étudié grâce à des tests comportementaux réalisés en trois phases (une phase d’habituation, une phase d’apprentissage et une phase de réalisation des tests) dans une aire de test en forme de "U", en présence d'aliments habituels et d’aliments nouveaux, avec des congénères dans un parc d'attente à proximité (maximum 20 sessions par animal sur 1 mois toutes phases confondues).

Impact sur les animaux

Le test de motivation mis en place dans le cadre de ce projet sont des tests de comportement individuel de courte durée (10 min). Ces tests seront réalisés dans une aire de test spécifique (aire en « U ») qui est localisée dans un bâtiment non connu des vaches au début du projet. La découverte d’un environnement nouveau et l’isolement social peuvent générer du stress chez la vache laitière. Néanmoins, ce stress est transitoire puisque la concentration sanguine en cortisol (hormone du stress) retrouve le niveau observé avant le début de l’isolement dans un environnement nouveau en 45 minutes. Dans notre projet, afin de limiter le stress engendré par la découverte d’un environnement nouveau et par l’isolement social, une phase d’habituation progressive à l’aire de test sera réalisée avant la réalisation des tests de motivation. Lors de cette phase d’habituation, les vaches laitières seront dans un premier temps amenées en groupe de 12 vaches dans une aire d’attente adjacente à l’aire de test dans le bâtiment nouveau, puis seront introduites deux par deux et enfin seules dans l’aire de test avant de passer à la phase d’apprentissage et à la phase de réalisation des tests. Afin de maximiser l’intérêt des vaches pour les aliments lors des différentes phases, l’accès à l’alimentation sera bloqué 3h avant d’être amenées dans le bâtiment de test (en fin de matinée vers 11h) et pendant toute la durée de réalisation des tests (durée maximale sans accès à l’alimentation = 6h). Le fait de bloquer l’accès à l’alimentation pourra générer une sensation de faim. Cependant, cette restriction d’accès à l’alimentation ne devrait pas entrainer de restriction alimentaire. En effet, les vaches laitières ingèrent la majorité de leur ration au moment de la distribution de leur ration qui a lieu 2 fois par jour (à 8h et à 16h). De plus, lorsque le temps d’accès à l’alimentation est réduit, elles sont aussi capables d’adapter leur comportement alimentaire afin d’ingérer la totalité de leur ration journalière.

Devenir

Dans le cadre de ce projet, seule une procédure légère qui n’est pas susceptible d’avoir d‘effets importants sur le bien-être et aucun effet sur la santé des animaux sera réalisée. Les animaux seront donc conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable de l’installation expérimentale. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci est effectivement possible.

Remplacement

Ce projet vise à développer et valider un test de motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Une fois validé, ce test de motivation sera mis en place dans le cadre de futurs projets qui permettront de déterminer l’importance de cette diversité alimentaire du point de vue de l’animal. A long terme, les nouvelles connaissances apportées par ce projet participeront à déterminer si la diversité alimentaire est un besoin pour les vaches laitières et si elle participe à leur bien-être. La considération du point de vue de l’animal implique d’analyser les réponses comportementales des vaches laitières vis-à-vis de la diversité et de la monotonie alimentaire. Il est donc impossible de se passer de l’utilisation de vaches laitières pour atteindre l’objectif de ce projet.

Réduction

Le nombre de vaches laitières impliquées dans ce projet a été défini sur la base des connaissances bibliographiques sur le comportement alimentaire et les capacités d’apprentissage des vaches laitières afin de pouvoir étudier la variabilité interindividuelle de la vitesse d’apprentissage du principe du test de motivation et de la motivation des vaches laitières pour la diversité alimentaire. Cela permettra de définir plus précisément le nombre d’animaux nécessaires pour les projets futurs mettant en œuvre ce test ainsi que la durée de la phase d’apprentissage nécessaire pour que les vaches comprennent le principe du test.

Raffinement

Les animaux de ce projet sont des vaches laitières habituées à être manipulées par les personnes qui réaliseront le projet. De plus, l’expérimentation mise en place est basée sur un test de comportement permettant d’étudier la motivation des vaches pour la diversité alimentaire. Ce test n’induit aucune douleur mais peut générer un stress de courte durée. Pour limiter le stress potentiellement induit par un isolement social (partiel car présence de congénères à côté de l’aire de test) et un environnement inconnu au début du projet, une phase d’habituation progressive est mise en place et une récompense alimentaire est présente dans le test. Des points limites sont définis afin de sortir une vache du protocole en cas de non habituation à la procédure. En dehors des périodes de test, les vaches sont maintenues dans leur environnement d’élevage habituel qui est adapté à leurs besoins comportementaux, environnementaux et sanitaires.

Choix des espèces

La question de l’intérêt de la diversité alimentaire a été abordée chez les petits ruminants. Cependant, il existe très peu d’études traitant de cette question chez la vache laitière, alors que ces dernières sont les ruminants dont les systèmes d’alimentation sont généralement parmi les plus monotones. La problématique de l’étude est donc spécifique aux vaches laitières et nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches laitières utilisées dans ce projet seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la principale race de vache laitière fournissant du lait pour l’alimentation humaine et de la race la plus répandue en France et dans le monde. Les vaches laitières seront des vaches adultes car le projet vise à valider un test de motivation pour la diversité alimentaire dédié aux vaches laitières et donc à ce stade.

676 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Certaines subissent un tatouage, une amputation de la queue et l'implantation d'une puce radiofréquence, et un groupe de femelles reproductrices est soumis à un régime riche en graisses, avant enregistrement des comportements sociaux dans un dispositif de suivi vidéo. Le projet, de recherche fondamentale, modélise des comportements de type autistique et l'effet de l'obésité gestationnelle. Le porteur classe l'amputation de la queue parmi les gestes légers tout en reconnaissant qu'elle provoque stress et douleur, et affirme que le comportement ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de 4 souris pendant plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 5 modèles de souris portant chacun l’inactivation d’un gène impliqué dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 4 objectifs : Objectif 1 : Modélisation de comportements complexes de type autistique chez 2 modèles murins de TSA à différents stades du développement. Objectif 2 : Etudier l’effet de l’inactivation du gène associé au TSA dans certains types de neurones sur les interactions sociales et les comportements répétitifs respectivement. Objectif 3 : Etudier l’effet de la réexpression du gène cité précédemment sur les comportements complexes de type autistique. Objectif 4 : Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements complexes de type autistique chez la descendance du modèle murin de TSA. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationnelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.

Procédures

Dans ce projet, certains animaux subiront différentes interventions légère unique pour les identifier (tatouage, caudectomie, implantation d'une puce radiofréquence en sous-cutanée) permettant de les identifier et un lot de femelles reproductrices sera soumis à un régime riche en graisses sur une période 6 semaines. Dans tous les cas, des mesures adaptées ont été prévues pour pallier aux nuisances éventuelles occasionnées par ces procédures.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, certaines expérimentations sont susceptibles d'induire du stress (tatouage, anesthésie, implantation de la puce radio fréquence) ou du stress et de la douleur (caudectomie). Les enregistrements vidéo dans le système Live Mouse Tracker (LMT) qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs souris pourrait induire un stress lié au changement d’environnement. Le régime riche en graisses pourrait produire de l'anxiété mais ce n'est pas évident sur une période courte de 6 semaines.

Devenir

Les animaux enregistrés dans le système Live Mouse Tracker (LMT) et les animaux soumis au régime riche en graisses seront sacrifiés pour réaliser des prélèvements pour des analyses immunohistochimiques et histologiques.

Remplacement

Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre de souris générées pour cette étude (20 souris par groupe, par sexe et par génotype) a été établi à partir d'études comportementales réalisées précédemment se basant sur des tests de puissance statistiques (http://powerandsamplesize.com/Calculators/) ainsi que sur les données de la littérature utilisant ce système. Etant donné que l’utilisation du Live Mouse Tracker (LMT) est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus dans d'autres expérimentations. En effet, si les résultats de cette dernière sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons les expérimentations suivantes et le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et de même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score (jointe en annexe) sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré pour les animaux avec surpoids gestationnel. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.

Choix des espèces

Les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA. Tout d'abord, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées assez conséquentes facilitant l'étude de cohortes de plusieurs animaux. De plus, l'espérance de vie des souris est courte permettant d'étudier différents stades de développement en moins d'un an. Et enfin, les outils génétiques utilisés chez la souris permettent de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème jour de vie postnatale (P35) et le 40ème jour de vie postnatale (P40)) : Pour identifier des altérations précoces du comportement (de type autistique). En effet, les TSA apparaissent durant les 2 premières années de vie chez l'Homme. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour identifier des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. En effet, les patients atteints de certains syndromes autistiques (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi) développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans.

20 chiens vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, dix-neuf étant ensuite réutilisés dans d'autres études et un seul proposé à l'adoption. Pendant six semaines, ils reçoivent un aliment additionné d'un probiotique, subissent quatre prises de sang et deux "défis comportementaux" consistant en un trajet en voiture en caisse de transport. L'objectif est commercial, faire autoriser ce probiotique comme additif alimentaire pour chiens sur le marché européen, une troisième étude étant exigée par les autorités. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'effet d'un aliment sur l'anxiété du chien.

Objectifs

Le projet a pour but d'évaluer le bénéfice d'un probiotique inclus dans un aliment complet sur l'anxiété chez le chien.

Bénéfices attendus

Il est attendu du projet que le probiotique évalué puisse faire l'objet d'une autorisation en tant qu'additif entrant dans la composition d'aliment pour chien sur le marché Européen. Le probiotique utilisé dans l’étude a un effet calmant pour les animaux anxieux et ainsi améliorer la qualité de vie des chiens.

Procédures

Pendant l'étude, les chiens recevront un aliment complet avec ajout d'un probiotique sous forme de poudre chaque jour pendant 6 semaines, soit 42 jours. Chaque chien subira 4 prises de sang (volume de 1mL / prise) par voie veineuse et 2 défis comportementaux réalisés à J43 et J106 de l'étude. Le défi comportemental prendra la forme d'un court trajet en voiture d'une durée de 10 minutes, en caisse de transport.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles seraient: défécation ou miction incontrôlée, comportements d’échappement intenses et persistants pouvant nuire à l’animal, et vomissements durant le trajet en voiture. Les nuisances possibles au moment des prélèvements sanguins sont: hématome, infection.

Devenir

Parmi les 20 chiens, 19 seront ré-utilisés dans d'autres études, et 1 chien ayant atteint l'âge requis sera proposé pour un placement via le programme d'adoption de l'animalerie.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative prouvée permettant d'évaluer l'impact de la consommation d'un aliment sur l'anxiété chez le chien. Par conséquent, il n'est pas possible de remplacer le recours à l'espèce animale étudiée dans ce projet.

Réduction

Sur la base de la variation constatée sur des études similaires réalisées précédemment, il a été déterminé qu'avec 20 chiens, nous serons en mesure de détecter une différence statistiquement significative de 10% dans les paramètres physiologiques étudiés.

Raffinement

Les chiens suivent un programme de socialisation individuelle régulière se composant d'activités d'éducation canine, de promenade en laisse et de sortie en parc. Ceci pour favoriser des interactions positives avec le personnel soignant et ceux appliquant les procédures expérimentales. Les animaux bénéficient quotidiennement d'accès à de larges enclos gazonnés où ils peuvent s'ébattre plusieurs heures par jour sous la supervision d'animaliers. Ils sont logés en box individuel par couple dont les dimensions sont très supérieures aux minima réglementaires. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel soignant composé de vétérinaires, assistants vétérinaires et soigneurs animaliers, ainsi que de comportementalistes.

Choix des espèces

Le probiotique étudiée est destiné à l'espèce Canine, qui a déjà été évalué dans deux études précédentes. Les autorités sanitaires Européennes requierent qu'une troisièmé étude soit réalisée sur l'espèce animale concernée pour valider l'effet du probiotique étudié en tant qu'additif alimentaire. Les animaux seront au stade adulte considérant que l'ingrédient actif sera intégré en premier lieu dans des aliments pour chien adulte.

600 tortues cistudes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées sur leur lieu de capture. Le projet évalue une réintroduction de l'espèce en Alsace par capture, marquage et recapture, avec mesures biométriques, prise de sang, écouvillonnage et pose d'un dispositif de télémétrie collé à la carapace. Le porteur indique que les captures en piège durent moins de 24 heures et que les prélèvements n'ont lieu qu'une fois par an. Tous les individus sont relâchés pour un suivi à long terme de la population, le porteur indiquant que le remplacement n'est "pas applicable" puisqu'il s'agit d'évaluer une action de conservation en milieu naturel.

Objectifs

La tortue cistude d’Europe fait l’objet d’un programme de réintroduction en Alsace porté par la Collectivité européenne d’Alsace. Le programme scientifique lié à cette DAP vise à faire une évaluation écologique de ces actions de conservation. Les objectifs du projet de recherche sont : 1) étudier la structure et la dynamique de la population de cistudes après lâcher en milieu naturel à partir d’une approche classique de captures/marquages/recaptures par sessions de piégeages mensuelles en période d’activité de l’espèce. 2) identifier les mécanismes sous-tenant cette dynamique de population à partir d’ un suivi individuel de l’état de santé (biométrie, étude du microbiote cutané et cloacal), du comportement d’utilisation du milieu (écologie spatiale par télémétrie) et d’exploitation de ses ressources (étude du régime alimentaire par analyses fécales) et de la reproduction (suivi des sites de ponte et des émergences). 3) préciser les liens entre comportement, démographie et conditions environnementales biotiques (disponibilité alimentaire) et abiotiques (régimes thermique et hydrique) abordées par ailleurs pour apporter une base scientifique pour l’aide à la décision auprès des gestionnaires du site d’étude.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer le succès des actions de conservation menées en faveur de la cistude sur le site d’étude, et les mécanismes écologiques impliqués dans l’installation, la dispersion et la reproduction de l’espèce en lien avec les conditions environnementales biotiques et abiotiques. Ce projet est mené en partenariat étroit avec le gestionnaire du site, ce qui garantit le transfert de connaissances vers les institutions. Ce projet est le tenant français du programme Européen Emys-R, qui vise à comparer le succès des actions de reintroduction de la cistude en Europe, ce qui permettra d’étendre le rayonnement de nos résultats à travers les autres programmes de réintroduction ou de renforcement de l’espèce en France et en Europe.

Procédures

Les interventions se feront systématiquement sur animaux vigiles, sur les 600 individus estimés de la population. Les pièges seront relevés au mins une fois quotidiennement, ce qui limite la captivité en piège à moins de 24h. Les mesures biométriques (1 minute par animal) et les prélèvements (prise de sang et écouvillonnage de la nuque et du cloaque, 3 minutes par animal) n’auront lieu qu’une fois par an, lors de la première capture de l’année. La durée de pose du matériel embarqué est conditionnée par la rapidité de durcissement de la résine, spécialement choisie ‘preise rapide’, soit entre 5 et 10 minutes. Le matériel embarqué sera déployé pour quelques mois avant d’être retiré en fin de saison, soit 6 mois au maximum. Le retrait du matériel embarqué se fait très rapidement en excerçant un effet levier sur les points de colle, sans endommager la carapace.

Impact sur les animaux

Ce projet vise à évaluer le succès des actions de conservation menées en faveur d’une population de cistudes d’Europe introduite en Alsace. Le protocole et donc basé sur la capture et le suivi de ces individus en milieu naturel sur le site dédié à cette réintroduction.

Devenir

Tous les animaux sont relâchés sur leur lieu de capture pour assurer le suivi à long terme de la population

Remplacement

Le projet vise à faire une évaluation du succès des actions de réintroduction de cistude. De fait, le remplacement n’est pas applicable.

Réduction

La réduction des effectifs sera assurée en ajustant si possible les efforts de piégeage en fonction des succès cumulés des captures de l’année. La réduction du nombre de manipulations sera assurée en ne manipulant (prélèvements) les animaux qu’à leur première capture de l’année, les éventuelles captures successives sur une même année permettant d’apporter l’information de base concernant leur survie, leur état de santé et leur position géographique (et éventuellement la récupération du matériel précédemment déployé).

Raffinement

Le raffinement du protocole sera assuré en tenant compte des caractéristiques des individus, en particulier leur statut reproducteur qui devrait évoluer au cours du temps (les individus lâchés sont immatures à subadultes) et qui nécessite des précautions de manipulation supplémentaires chez les adultes et les nouveau-nés.

Choix des espèces

La cistude d’Europe est l’espèce faisant l’objet des mesures de gestion et de conservation que ce projet vise à évaluer. Le protocole initial validé par le Ministère prévoit le lâcher de 500 cistudes immatures, auxquels s'ajoutent une centaine d'individus nés en milieu naturel, soit 600 individus. Les premiers individus lâchés auront atteint leur maturité sexuelle d’ici la fin du projet, prévu sur 5 ans. Si tel est le cas, leur reproduction sera également étudiée par la recherche des pontes et des nouveau-nés (identification individuelle, étude biométrique et filiation). Les stades de développement utilisés sont donc : émergence, juvénile, immature et reproducteur.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent quatre tests comportementaux, la reconnaissance d'objet nouveau, un test de locomotion, un test d'interaction sociale et le labyrinthe surélevé en croix, pour caractériser un modèle de phénylcétonurie. Le porteur indique que les souris mutantes présentent une microcéphalie et une hypopigmentation sans phénotype dommageable référencé, mais que l'isolement et la manipulation des tests induisent un stress. Toutes les souris sont euthanasiées pour prélever le cerveau, le porteur affirmant que cette pathologie ne peut être modélisée qu'au niveau de "l'animal entier".

Objectifs

La phénylcétonurie est une maladie génétique due à une mutation dans le gène codant pour l’enzyme phénylalanine hydroxylase. Cette enzyme convertit la phénylalanine en tyrosine. Chez l’homme, le dysfonctionnement de cette enzyme induit une accumulation de phénylalanine qui mène à de sévères déficits intellectuels et développementaux. Chez la souris, peu d’études explorent le rôle de cette enzyme sur le comportement des animaux. Le but de notre projet est de réaliser un phénotypage comportemental des souris mutantes en particulier leur habileté motrice, leur capacités sociale et anxieuse ainsi que leur habileté cognitive

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension du phénotype des souris mutantes afin de pouvoir proposer par la suite de nouvelles stratégies thérapeutiques que l’on pourrait tester dans ce modèle afin de pouvoir soulager les patients atteint de phénylcétonurie.

Procédures

Pas de prélèvements ou de procédures chirurgicales sur animaux éveillés prévus. Les animaux feront 4 tests comportementaux une seule fois, à savoir le novel object recognition test (27 minutes), le test de locomotion (10 minutes), le test d’intéraction social (10 minutes), et le labyrinthe surélevé en croix (5min).

Impact sur les animaux

Les souris mutantes présentent une microcéphalie, ainsi qu’une hypopigmentation mais aucun phénotype dommageable n’est référencé dans la littérature. Les tests comportementaux ne présentent pas de nuisance particulière car ils explorent le répertoire comportemental des souris. Toutefois, tous les animaux seront soumis au stress de la manipulation et de l’isolement lors de l’application du test comportemental.

Devenir

Tout les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale afin de récuperer le cerveau pour compléter l'étude comportementale par une approche biochimique et moléculaire par des approche omiques et de qPCR.

Remplacement

La compréhension des mécanismes causaux de phénylcétonurie et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traiter nécessitent la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de cette pathologie. Une étude précise et détaillée du répertoire comportemental des animaux modèles permet de vérifier que ces modèles valident bien le critère de validité d’aspect pour la pathologie, et aussi d’évaluer, le cas échéant, l’efficacité d’une approche thérapeutique. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu’au niveau de l’animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Le calcul statistique pour l’optimisation des effectifs mène à des groupes de 16 souris par groupes (8mâles et 8 femelles) soit 32 souris pour 2 groupes.

Raffinement

L’ensemble des contraintes subies par les animaux au cours des expériences seront prises en charge. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 2 à 4 individus. Du matériel de nidification sera mis à disposition (ouate et cabane en carton). Les animaux seront manipulés quotidiennement par le même expérimentateur. Durant les expériences, le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement, notamment par l’évaluation du poids et de la posture. Des points limites adaptés seront mis en place .

Choix des espèces

La souris est le seul modèle animal de phénylcétonurie disponible à ce jour. Leur répertoire comportemental est suffisamment étendu pour l’étude des nombreuses affectations comportementales qui sont connues et susceptibles de survenir à l’âge adulte dans le cadre de la phénylcétonurie. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux fixés.

100 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées et environ 5 000 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un fragment d'oreille ou de queue pour établir son génotype dans le cadre de la gestion d'un élevage de lignées génétiquement modifiées. Le porteur décrit une douleur "légère et très passagère" et affirme qu'une anesthésie serait plus stressante que le geste lui-même. Il indique qu'au moins la moitié des souris n'ont pas le génotype recherché et sont mises à mort, l'objet de l'élevage étant de produire les animaux destinés à l'expérimentation.

Objectifs

L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés

Bénéfices attendus

Nécessité d'une caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés

Procédures

prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui-même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)

Impact sur les animaux

Aucune nuisance supplémentaire n'est attendue par rapport à des techniques de marquage et génotypage non-invasives, c'est à dire une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement de la biopsie

Devenir

Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.

Remplacement

Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive caudale ou auriculaire, n’ont pas été retenues.

Réduction

L'animalerie élève de nombreuses lignées transgéniques au phénotype non dommageable pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype (estimé à 5000 animaux sur 5 ans).

Raffinement

Les méthodes de prélèvement (biopsie auriculaire ou caudale) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage digital avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie auriculaire prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 15 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. La mise en place d’un anesthésique et/ou analgésique serait plus stressante que le geste lui-même. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec l'utilisateur et sur la base de point-limites pré-établis. Si l'utilisateur n'est pas joignable, la décision est prise par le soigneur, avec le vétérinaire si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. La majorité des animaux est utilisée au sevrage (entre 20 et 30 jours après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sevrage, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps. 5 à 10% des animaux sont utilisés avant sevrage lorsqu'un génotypage précoce est nécessaire.