Autre recherche fondamentale

Les doses d'antibiotiques administrées aux lapins d'élevage sont transposées de celles utilisées chez l'humain, ce que ce projet entend corriger en mesurant leur élimination réelle chez cette espèce. 26 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit deux administrations intraveineuses espacées d'au moins sept jours, puis huit à neuf prises de sang par cathéter sur 48 à 120 heures, sur animal vigile et sous contention ferme. Les lapins ont soixante-dix jours au début de l'expérimentation, l'âge des animaux traités en élevage conventionnel, et l'objet du projet reste l'optimisation des posologies de la filière cunicole.

Objectifs

Les associations ou combinaisons d’antibiotiques dites synergiques sont classiquement utilisées en médecine vétérinaire, notamment dans la filière cunicole pour traiter certaines infections. Cependant pour certaines combinaisons d'antibiotiques, les doses utilisées chez le lapin correspondent à une transposition directe des doses utilisées chez l’Homme. Or ces doses ne sont probablement pas adaptées aux lapins car les vitesses d’élimination (et donc la durée d'action) de ces molécules peuvent être très variables d’une espèce à l’autre, et donc entrainer un biais majeur avec une perte probable de l’effet synergique entre les deux molécules et par conséquence une perte de l’efficacité de l’association. L’objectif principal de cette procédure expérimentale est de générer des données pharmacocinétiques (= suivi des concentrations sanguines au cours du temps) in vivo pour 3 combinaisons différentes d'antibiotiques chez le lapin. Par la suite, à l’aide de la modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (= technique permettant de relier les concentrations sanguines à l’effet escompté soit ici la diminution du nombre de bactéries pathogènes), les modalités optimales d’administration de ces trois associations seront déterminées (ajustement des doses et fréquence d'administration). L’étude inclut 3 antibiotiques parmi les plus couramment utilisés en pratique vétérinaire chez le lapin et ont été sélectionnés pour leurs différences pharmacocinétiques majeures, avec deux molécules à courte durée d’action et une molécule à plus longue durée d’action.

Bénéfices attendus

L’utilisation de solutions thérapeutiques à base d’associations entre antibiotiques tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Parmi ces associations, certaines sont très largement utilisées en médecine vétérinaire, notamment dans les élevages de lapins comme traitement des infections. Cependant, les doses actuelles pour ces associations sont probablement sous-optimales car elles ont été déterminées il y a plusieurs décennies, sans tenir compte des spécificités des espèces animales traitées ou de leurs bactéries pathogènes ciblées. Les études pharmacocinétiques in vivo telles que celles effectuée dans ce projet, couplées aux études pharmacodynamiques in vitro sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées chez le lapin vont, à terme, permettre d’optimiser les posologies (doses, fréquence d'administration) de ces combinaisons d'antibiotiques chez le lapin et ainsi garantir une meilleur efficacité tout en limitant le risque d'antibiorésistance.

Procédures

Durant l'expérimentation une source de stress viendra de l'administration des antibiotiques et des prélèvements sanguins qui seront faits sur animal vigile et nécessitent donc une contention ferme (2 administrations par animal au total espacé de 7 jours au minimum), mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Pour l’administration, un cathéter sera utilisé sur la veine le temps de l’administration puis retiré dès l’injection terminée. Chaque manipulation de contention pour l'administration ne dure pas plus de quelques minutes. Un cathéter sera également inséré dans une veine pour effectuer des prélèvements sanguins répétés (8 à 9) sur animal vigile sur une période de 48h à 120h après chaque administration. Chaque prélèvement ne durera que 1 à 2min.

Impact sur les animaux

L'administration des antibiotiques et les prises de sang sont des sources d’angoisse pour l’animal mais une contention adaptée inférieure à 1-2 min effectuée par des opérateurs formés limitera le stress engendré.

Devenir

A l’issue de l’expérimentation, les lapins seront mis à mort pour obtenir des échantillons de tissus.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche Pharmacocinétique/Pharmacodynamique envisagée.

Réduction

L’utilisation de 8 à 10 animaux par association d’antibiotique (soit 26 animaux au total) est un nombre optimal afin d’estimer correctement les variations inter-individuelles des paramètres cinétiques (clairance, etc), tout en limitant le nombre de prises de sang pour chaque individu. De plus, chaque animal sera utilisé pour deux administrations pour chaque combinaison d’antibiotiques (3 combinaisons au total) ce qui permet de limiter le nombre total d'animaux . Une période de repos adaptée entre les 2 administrations permettant aux lapins d'éliminer les molécules garantit la fiabilité des résultats. Les résultats seront analysés grâce à une modélisation mathématique qui permettra par la suite d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux auront une période d’acclimatation d’une semaine. Ils seront hébergés par 2 par cage tout en respectant les normes du bien-être animal. Des enrichissements appropriés (des petits ballots de foin et bâtons à ronger) seront également présents dans l’environnement des lapins. Les gestes relatifs à l’administration des antibiotiques étudiés et aux prises de sang seront effectués dans une pièce isolée des autres animaux afin de réduire le stress de ces derniers. La contention lors de ces gestes se fera avec l’aide d’une grande serviette pour minimiser les gestes parasites de l’animal et risquer des blessures involontaires. Une phase de training à la manipulation sera réalisée (1 semaine) afin de diminuer le stress de la contention. L’utilisation d’un analgésique local (pommade) est envisagée si la pose de cathéter pour l’injection puis les prises de sang est trop douloureux. L’utilisation d’un cathéter pour les prises de sang répétées permettra de limiter l’inconfort comparé à des ponctions veineuses successives. Des points limites seront définis en fonction de la grille d’évaluation des expressions faciales du lapin. Une surveillance quotidienne du comportement et de l’état général des animaux sera effectuée au regard de leur consommation d’eau, de leur alimentation, et en effectuant des mesures du poids. Ces points clefs vont déterminer les points limites qui seront appliqués dès l'apparition d'éventuels signes précoces de la douleur. Si l’usage d’analgésique par voie systémique est nécessaire, l’animal sera retiré de l’étude.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible pour l’étude pharmacocinétique de ces 3 associations d'antibiotiques en médecine vétérinaire. Au début de l’expérimentation, les lapins seront âgés de 70 jours (soit entre 2kg et 2.5kg à l'arrivée des animaux). Ce stade correspond à l'âge standard des animaux traités en élevage conventionnel.

Cinq injections quotidiennes la première semaine pour déclencher une délétion génique, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, puis quatre autres sur quatre semaines, toutes sur animal vigile, avec neuf à douze pesées : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les chimiothérapies administrées provoquent la cardiotoxicité et la néphrotoxicité recherchées, avec une perte de poids anticipée et, plus rarement, tachycardie, fibrillation ventriculaire ou insuffisance cardiaque aiguë. Le porteur qualifie cette toxicité aiguë de généralement asymptomatique, et affirme que l'usage d'animaux vivants est "indispensable" parce qu'aucune méthode in vitro ne rend compte de l'"organisme entier". Toutes les souris sont tuées pour prélever les organes destinés aux analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.

Objectifs

L'autophagie est un mécanisme naturel essentiel permettant aux cellules de se débarrasser de leurs composants endommagés et de recycler certains éléments pour faire face à différentes situations de stress. Ce processus joue un rôle clé dans le maintien de l’équilibre cellulaire, en adaptant les ressources de la cellule aux besoins environnementaux. Des molécules naturellement produites par l’organisme peuvent moduler ce processus d’autophagie. Certaines d’entre elles sont libérées par différents organes (comme le foie, le cœur, les reins ou les muscles) et circulent dans le sang. En plus de leur rôle dans la gestion des nutriments et de l’énergie, elles peuvent aussi agir sur des récepteurs présents sur les cellules, ce qui peut freiner ou activer l’autophagie. Des études récentes ont montré que bloquer certaines de ces molécules favorise l’activation du processus d’autophagie dans plusieurs organes, notamment le cœur, le foie et les reins. Certains traitements anticancéreux peuvent entraîner des effets secondaires importants, notamment au niveau du cœur et des reins, augmentant ainsi le risque d’insuffisance cardiaque ou rénale chez les patients. Ce projet vise à évaluer si l’activation de l’autophagie, par le blocage de certaines molécules régulatrices, pourrait protéger ces organes et limiter les effets secondaires de certaines chimiothérapies, dans des modèles expérimentaux chez la souris.

Bénéfices attendus

Le cancer demeure aujourd’hui l’une des principales causes de mortalité. Bien que la chimiothérapie soit une stratégie anticancéreuse incontournable, son efficacité est souvent entravée par ses effets secondaires délétères. En particulier, la cardiotoxicité et la néphrotoxicité associées aux agents chimiothérapeutiques peuvent provoquer une détérioration progressive de la fonction rénale et cardiaque, limitant ainsi les options thérapeutiques disponibles et réduisant l’espérance de vie des patients. Environ 50 pour cent des patients atteints de cancer développent des complications cardiovasculaires liées aux traitements, et la toxicité cardiaque des anthracyclines concerne jusqu’à 26 pour cent des patients recevant des doses élevées. Par ailleurs, la maladie thromboembolique veineuse représente la deuxième cause de mortalité chez les patients cancéreux, soulignant l’ampleur de l’enjeu clinique et de santé publique. Dans ce contexte, il est urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques capables de prévenir ou de limiter ces toxicités sans compromettre l’efficacité des traitements anticancéreux. L’autophagie joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, notamment par l’élimination des organites et des protéines endommagés. La modulation de ce processus pourrait non seulement prévenir les dommages tissulaires causés par la chimiothérapie, mais aussi améliorer la tolérance des patients aux traitements anticancéreux. En ciblant les modulateurs de l’autophagie, cette approche innovante pourrait permettre d’activer les mécanismes naturels de protection cellulaire contre les stress chimiques. Les résultats attendus de ce projet pourraient ainsi déboucher sur le développement de nouvelles thérapies adjuvantes, limitant la toxicité des chimiothérapies, tout en préservant leur efficacité anticancéreuse. Cette stratégie pourrait significativement améliorer la qualité de vie et le pronostic vital des patients atteints de cancer. De plus, les bénéfices de cette recherche pourraient s’étendre au traitement d’autres pathologies où l’autophagie joue un rôle central, notamment dans les maladies cardiovasculaires et les maladies dégénératives. En résumé, ce projet ouvre la voie à des innovations thérapeutiques majeures dans le domaine de l’oncologie et pourrait contribuer à réduire de manière significative les risques liés aux traitements actuels, apportant ainsi une avancée précieuse pour la santé publique.

Procédures

La mise en place des modèles murins implique différentes séries d’injections, variables selon les groupes expérimentaux : Certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). D’autres souris ne recevront aucune injection préalable. Enfin, certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Pour la mise en place des traitements, les animaux recevront 4 injections sur 4 semaines et d’autres animaux recevront 24 injections sur 8 semaines puis 4 injections sur 4 semaines en fonction des groupes sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Les animaux seront pesés entre 9- 12 fois en fonction des groupes. Chaque pesée dure également quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de la cardiotoxicité et de la néphrotoxicité par les agents chimiothérapeutiques, effets bien documentés dans la littérature scientifique. Aucun effet indésirable supplémentaire n’est attendu en dehors de ces réactions prévisibles. La toxicité aiguë induite dans ce protocole est généralement asymptomatique, se manifestant parfois par des altérations transitoires de la fonction systolique ou des arythmies cardiaques. Toutefois, une perte de poids corporel est anticipée en raison des effets secondaires des traitements chimiothérapeutiques. Des manifestations symptomatiques graves mais rares peuvent survenir, notamment des épisodes de tachycardie, de fibrillation ventriculaire ou des signes d’insuffisance cardiaque aiguë. Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (i.p.), qui peuvent provoquer un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur localisée de courte durée au point d’injection. Enfin, la modulation du flux autophagique par l’administration de traitements pourrait induire des effets métaboliques imprévus. Ces effets incluent potentiellement des modifications du métabolisme énergétique et des altérations physiologiques générales.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques, car cela est nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable dans ce projet, car les modèles cellulaires ou informatiques ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes et des réponses physiologiques impliquées dans la toxicité de certains traitements. Ces effets indésirables résultent de mécanismes multiples qui mobilisent plusieurs systèmes biologiques de manière coordonnée, ce qu’aucune méthode in vitro ou in silico ne peut modéliser de façon fiable. Avant d’envisager l’expérimentation animale, des travaux préliminaires ont été réalisés sur des cellules en culture afin d’analyser certains mécanismes moléculaires de manière simplifiée. Des approches informatiques ont également été utilisées pour prédire certaines interactions biologiques et effets pharmacologiques. Ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas d’évaluer la toxicité globale ou les effets à long terme sur l’organisme entier. Les modèles murins restent aujourd’hui les plus adaptés pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Ils permettent d’étudier simultanément la transformation des médicaments, les interactions entre organes et les réponses immunitaires et inflammatoires associées. Ils offrent également des outils génétiques permettant d’explorer le rôle de certaines voies biologiques dans les effets secondaires observés. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 1440 souris, réparties entre les différentes procédures expérimentales. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’une analyse préalable, qui a permis d’estimer précisément le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables, tout en limitant leur utilisation au strict nécessaire. Afin de réduire encore le nombre d’animaux, les expérimentations seront organisées de manière à mutualiser les groupes témoins chaque fois que cela est possible. Cette approche permettra de limiter la redondance des procédures tout en conservant des comparaisons scientifiquement exploitables. De plus, l’étude pourra être arrêtée dès que les premiers résultats indiqueront que l’objectif scientifique ne pourra pas être atteint, ce qui évitera de mobiliser des animaux inutilement. Chaque animal inclus dans ce projet contribuera à la collecte de plusieurs types de données. À l’issue des procédures, différents organes et tissus seront prélevés pour réaliser plusieurs analyses complémentaires, portant sur les effets immunologiques, les lésions tissulaires ou encore l’étude des mécanismes cellulaires impliqués dans les effets secondaires des traitements. Enfin, il sera nécessaire de réaliser une analyse statistique sur les données recueillies afin de s’assurer que les différences observées entre les groupes sont bien significatives et non dues au hasard. Nous restons attentifs aux évolutions scientifiques permettant de réduire ou de remplacer l’utilisation d’animaux dans ce type de recherche.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Une surveillance régulière permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, tels que les yeux mi-clos, perte de poids corporel ou des comportements anormaux, ce qui permettra une intervention rapide pour adresser tout problème de bien-être. Des points limites précoces et adaptés à chaque type d'expérience seront établis pour garantir que la douleur et la souffrance des animaux soient minimisées autant que possible. La réaction au site d'injection sera régulièrement évaluée pour détecter tout signe d'inflammation ou d'infection, avec des interventions vétérinaires prêtes en cas de complication comme l’utilisation d’antiseptique. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres. Des ajustements seront faits en temps réel pour améliorer les conditions de vie des animaux ou modifier les protocoles de traitement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, permettant de s’appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les souris offrent également l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés ciblant les protéines d’intérêt, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les lignées sélectionnées sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes spontanés susceptibles de perturber l’interprétation des résultats. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.

La lignée de souris retenue est dépourvue de certaines cellules immunitaires, ce qui écarte le rejet des cellules cancéreuses greffées. 50 de ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe tumorale sur les deux flancs, dix d'entre elles se voyant en plus implanter une pastille d'hormones quatre jours plus tôt, et les tumeurs sont ensuite mesurées au pied à coulisse trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur écrit que les animaux sont tués à l'issue parce qu'ils "servent d'individu receveur de greffe" et ne serviront pas à d'autres projets, cette étude pilote visant seulement à choisir le modèle qui sera utilisé ensuite.

Objectifs

La sénescence cellulaire est un programme cellulaire déclenché en réponse à divers stimuli tels que des dommages à l’ADN. Les cellules sénescentes sécrètent un cocktail de molécules appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) qui peut modifier l’architecture de la tumeur et ainsi promouvoir la croissance tumorale, l’évasion immunitaire et les métastases. La compréhension des interactions entre cellules sénescentes, leur SASP et les cellules cancéreuses offre l’opportunité de découvrir de nouvelles thérapies efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets des cellules sénescentes et les molécules qu’elles sécrètent sur plusieurs types de cancer (cancer du poumon, du sein ou du foie). Cette étude pilote nous permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour la suite de notre étude in vivo.

Procédures

Toutes les souris recevront une greffe de cellules cancéreuses sur chaque flanc (deux au total par animal) qui formeront des tumeurs solides. Chaque greffe sera réalisée sous anesthésie générale qui durera moins de 5 minutes, le temps d'une piqure d'aiguille. Pour les souris receveuses de greffe de cellules de cancer du sein : chaque animal (10 au total) recevra la greffe d'une pastille d'hormones 4 jours avant la greffe de cellules pour que la tumeur se forme. Cette intervention durera moins de 5 minutes sous anesthésie générale. Après une semaine d'acclimatation et trois fois par semaine jusqu'à euthanasie : l'état global de chaque animal sera observé et pesé (10 secondes par pesée), le volume de chaque tumeur sera mesuré avec un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Nous allons greffer des cellules cancéreuses à des souris et le suivre le développement de tumeurs. Le greffes seront réalisées sous anesthésie légère qui durera moins 5 minutes pour chaque animal. Les procédures que vont subir les animaux peuvent causer du stress et de légères douleurs. Les animaux seront euthanasiés 4 semaines après la greffe ou lorsque la tumeur atteindra une taille limite. Certaines souris (10 au total) recevront la greffe d'une pastille d'hormones qui durera moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure peut causer du stress et de légères douleurs au niveau de la zone de greffe. Le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive, le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par mesure avec un pied à coulisse et seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude 3 fois par semaine. Les possibles nuisances liées aux gestes et intervention que vont subir les animaux : stress dû à l'anesthésie, douleur au niveau de la zone de greffe de cellules, douleur au niveau de la zone d'incision pour la pastille d'hormone, stress dû à la manipulation régulière.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils servent d'individu receveur de greffe et ne serviront pas pour d'autres projets.

Remplacement

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas les cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées.

Réduction

Les effectifs de 5 animaux par groupe ont été choisi. Chaque animal recevra deux greffes identiques (une sur chaque flanc), cela nous permet d’obtenir un grand nombre de tumeurs en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Nous obtiendrons une réponse statistiquement significative et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. En raison du déficit immunitaire partiel des souris choisies, des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. La nourriture ansi que l’eau sera desinfecté ou stérilisé. Par ailleurs, nous avons mis en place les points limites nécessaires. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer que leur état de santé n'est pas détérioré et nous suivrons à chaque pesée (trois fois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Les tumeurs seront aussi palpées (pour détecter leur présence précoce), leurs volumes seront mesurés 3 fois par semaine et nous observerons aussi leur aspect. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. Le cas échéant, des soins locaux par spray seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle pour l'étude en oncologie. Il s'agit d’un mammifère au système immunitaire et à la physiologie assez proche de l'Homme qui permet d’utiliser les données générées dans une approche translationnelle valide. La lignée de souris choisie ne possède pas certaines cellules immunitaires, cela veut dire qu’il n’y a pas de risque de rejet des cellules greffées. Nous utiliserons des souris âgées de 5 à 6 semaines. C'est un âge où l'animal est considéré adulte et peut supporter au mieux la greffe de cellules.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.