Autre recherche fondamentale

Sorties de leur aquarium, anesthésiées, posées sur un champ glacé, 107 xénopes femelles subissent le prélèvement d'une partie d'un ovaire, opération de quatre à dix minutes répétée jusqu'à trois fois dans leur vie, à six mois d'intervalle au moins. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le projet en prévoit 43 par an. Elles vivent ensuite un à trois ans dans l'animalerie, tant que leurs ovaires reconstituent leur stock d'ovocytes. Sur les 107 animaux, 72 seront tuées parce que leurs ovaires ne régénèrent plus, et 35 seront réutilisées.

Objectifs

Le projet vise à comprendre les divisions méiotiques de l'ovocyte. Tous les êtres vivants se développent grâce aux divisions de leurs cellules : la cellule duplique son génome puis en redistribue une copie dans chacune des deux cellules filles. La méiose est un mode de division spécialisé spécifique aux cellules reproductrices. Chez les femelles, dans les ovaires, les ovocytes sont bloqués en début de méiose. Cet arrêt permet à l’ovocyte d’accumuler les composants nécessaires au développement du futur embryon. Lors de l’ovulation, un signal hormonal lève le blocage et l’ovocyte réalise les divisions de méiose. Notre équipe s’intéresse aux mécanismes moléculaires déclenchés par l’hormone qui conduisent à la division. Ces mécanismes sont encore inconnus et leur étude est très importante pour comprendre la formation de la cellule reproductrice femelle, qui est à la base de la reproduction des individus. Notre étude renseigne aussi sur la division des cellules, qui assure le développement et le maintien de l’intégrité des organismes vivants. Chez l’amphibien Xénope qui est utilisé dans ce projet, la progestérone déclenche dans l’ovocyte l’activation en cascade de différentes protéines, ce qui aboutit à la reprise de la méiose. Sur le plan moléculaire, le blocage de l’ovocyte dépend d’une enzyme qui phosphoryle les protéines. La progestérone induit une diminution de son activité. Ceci provoque la synthèse de nouvelles protéines qui conduisent aux divisions de méiose. Le projet vise à identifier les cibles de l’enzyme et à élucider le mécanisme par lequel elles déclenchent la division. Ce projet a des retombées importantes dans deux domaines : celui du cancer, qui résulte d’une dérégulation de la prolifération cellulaire, et celui de l’infertilité humaine, qui repose en grande partie sur la dérégulation des divisions de l’ovocyte.

Bénéfices attendus

Notre projet est lié à trois domaines d’enjeux majeurs en santé : infertilité, anomalies fœtales, cancer. La fréquence de l’infertilité n’a cessé d’augmenter ces 20 dernières années. La compréhension de ses causes est l’un des axes prioritaires de la stratégie européenne de recherche. Chez la femme, elle est souvent associée à des défauts de formation de l’ovocyte. C’est pourquoi il est important de comprendre les étapes de formation de l’ovocyte, qui est l’objectif de ce projet. Il est impossible de mener des expériences sur les ovocytes humains. Le modèle murin est assez inadapté car le contrôle de la différenciation de l’ovocyte présente des différences importantes avec les autres vertébrés. Le projet utilise les ovocytes de l’amphibien Xénope, très utilisé pour sa ressemblance génétique avec l'homme. Il permettra d’identifier des gènes importants impliqués dans les infertilités. Ce projet permettra aussi l’identification des protéines de l’ovocyte qui assurent le bon développement de l’embryon. Leur connaissance contribue à comprendre les défauts de l’embryon qui sont à l'origine d'interruptions de grossesses ou d'anomalies congénitales. Enfin, le projet s’inscrit au cœur de la cancérologie. La méiose utilise en effet les mêmes gènes que ceux de la division cellulaire, et le génome du Xénope est très proche de celui de l'espèce humaine. Ces études révèlent donc de nouvelles protéines qui, quand elles sont dérégulées, entraînent la tumorigenèse. L’atout majeur de l’utilisation du Xénope dans ce domaine a d’ailleurs été à l’origine de l’attribution du Prix Nobel en 2001.

Procédures

Les interventions consistent en un prélèvement d’une partie d’un ovaire, effectué sur un animal anesthésié en conditions stériles et placé sur un champ froid qui supprime la douleur. L’opération dure 4 à 10 min. Seules les extrémités des ovaires sont prélevées pour éviter tout saignement. L’ouverture est suturée sans contraindre les tissus ce qui évite les risques d’hématomes et d’abcès. Le réveil s’effectue en 20 à 30 min, et l’animal est ensuite surveillé pour vérifier la bonne cicatrisation cutanée. Puis il regagne son aquarium. Le projet requiert 43 opérations par an. Chaque femelle est opérée au maximum 3 fois pendant sa vie, chaque opération étant espacée d'au moins 6 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus en post-opératoire portent sur la douleur, le stress et des risques de complication dûs à l’opération. Le stress peut être provoqué par le prélèvement de l’animal dans l’aquarium et l’opération chirurgicale. À noter que le stress thermique potentiellement lié à l’anesthésie, le stress social qui serait engendré par l’isolement post-opératoire et le stress du jeûne pré-opératoire de 5 heures ne sont pas applicables : animal poïkilotherme « à sang froid », à vie solitaire, et nourri tous les 3 jours en conditions normales. La douleur peut être induite par la chirurgie. Les risques de complication sont de légers saignements temporaires de la cicatrice.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie tant qu’ils régénèrent leurs ovocytes suite aux opérations (maximum de 3 opérations par animal, aucun animal n’est opéré plus de 3 fois). Ils demeurent en vie dans l’animalerie entre 1 et 3 années. Ils sont euthanasiés par une méthode réglementaire de façon à lui éviter toute douleur. L’euthanasie est justifiée quand, après une seconde ou une 3ème ovariectomie partielle, les ovaires ne régénèrent plus leur contenu. Le projet reposant intégralement sur l’étude des ovocytes, les animaux ne produisant plus d’ovocytes ne sont donc plus utilisables pour le projet. À l’issue des 5 années du projet, 72 des 107 animaux du projet auront été euthanasiés. 35 seront encore en vie, après avoir subi une ou deux opérations. Ils seront ré-utilisés.

Remplacement

Notre objet d'étude est l’ovocyte, la cellule reproductrice femelle. Cette cellule est extrêmement spécialisée. Son organisation interne très complexe lui permet de réaliser les divisions qui vont lui permettre d’être fécondé par un spermatozoïde. Ces divisions particulières sont également importantes pour les premières étapes de la vie de l’embryon qui sera issu de la fécondation. L’ovocyte n’est donc comparable à aucune autre cellule, et ne peut être reproduit ou « créé » artificiellement par synthèse ou par des cellules souches ou par une modélisation virtuelle. C’est pourquoi nous sommes dans l'obligation d'utiliser des ovocytes intacts issus d’animaux, dans notre cas les Xénopes (des amphibiens), pour les étudier ensuite en laboratoire. Le modèle Xénope lui-même s’inscrit dans une stratégie de remplacement. L’autre modèle utilisé dans les laboratoires pour l’étude du même sujet, la formation de l’ovocyte, est la souris (ou le rat). Les ovaires de Xénope contiennent chacun jusqu’à 6000 ovocytes (contre une vingtaine chez la souris) et ont la capacité de régénérer (ce qui n’existe pas chez la souris). Utiliser le Xénope au lieu de la souris permet donc de limiter énormément le nombre d’animaux utilisés en laboratoire. Enfin, en parallèle à l’utilisation expérimentale des ovocytes, nous utilisons des outils bioinformatiques très récents (moins de cinq ans), basés sur l'intelligence artificielle, en amont des expériences. Ils permettent de guider et cibler les expériences au lieu de travailler de manière exploratoire comme par le passé. Cela permet de limiter le nombre de cellules utilisées, et donc d'animaux.

Réduction

Les expériences de l’ensemble des membres de l’équipe sont planifiées, coordonnées et synchronisées de façon à n’opérer qu’un minimum d’animaux. Les besoins en ovocytes pour les expériences d’une semaine de travail sont précisément estimés, et oscillent entre 1000 et 2000 ovocytes. En conséquence, une seule femelle est opérée chaque semaine. Les 1000 à 2000 ovocytes requis correspondent à un à deux tiers du contenu d’un ovaire. Le contenu de l’ovaire n’est jamais vidé entièrement de façon à préserver les cellules souches qui vont assurer la régénération. En outre, les Xénopes ont la capacité de renouveler leur stock d’ovocytes au bout d’une période minimale de 6 mois : nos statistiques indiquent que 81 pour cent des animaux régénèrent après une opération, et 57 pour cent d’entre eux après une seconde. Ces capacités régénératives nous permettent de ré-utiliser une même femelle jusqu’à trois fois, limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total de femelles utilisées par le projet est de 107. Enfin, des outils statistiques et des modèles prédictifs sont utilisés en amont des expériences et permettent d’orienter les expériences nécessaires à réaliser, au lieu de travailler de manière exploratoire en multipliant les expériences comme par le passé. Ainsi, la propriété de régénération du Xénope, la synchronisation des demandes d’ovocytes de tous les membres de l’équipe et les nouveaux outils bioinformatiques disponibles réduisent considérablement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en aquarium de 25 L d’eau déchlorée, filtrée, oxygénée, à 20 degrés. Au-delà de 25 degrés, l’animal entre en léthargie. Des sondes surveillent en temps réel température, acidité et conductivité. Les aquariums sont enrichis par des tubes PVC où certains animaux aiment à se cacher, bien que le comportement préféré soit de rester allongé sur le fond de l’aquarium. La nourriture non consommée et les fèces sont éliminées quotidiennement. Un nettoyage des parois des aquariums avec une brosse ou une lingette est effectué tous les 15 jours. 6 à 12 animaux sont regroupés par aquarium. Dépasser 12 peut induire un stress. Aucun stress n’est relevé si le groupe est réduit ou l’individu isolé, car les individus sont solitaires chez cette espèce. À leur arrivée, les animaux sont mis en quarantaine pendant 4 semaines. Ils sont ensuite acclimatés en aquarium pendant au moins 2 semaines avant d’être intégrés à un protocole expérimental. Ils sont nourris à satiété 2 fois par semaine (vers de vase, cœur de bœuf et granulés de poisson). Ils sont prélevés à la main ou avec une épuisette, en évitant tout mouvement brusque afin de ne pas les stresser. Une grille de cotation répertorie toute anomalie et lui attribue un chiffre, de 1 à 3 : 1, surveillance attentive ; 2, surveillance accrue, isolement de l’animal pendant une semaine et soins éventuels, puis réévaluation de l’état de l’animal ; 3, point limite, euthanasie. À un niveau 2, des soins portant sur les affections cutanées peuvent être apportés. L’anesthésie, le prélèvement et l’euthanasie sont pratiqués dans une pièce isolée afin de ne pas stresser les autres animaux. La durée de la chirurgie est minimisée (4 à 10 min). Les opérations sont pratiquées sous anesthésie. L’animal est placé sur le dos sur un champ glacé, ce qui a un effet analgésique. Une surveillance post-opératoire est effectuée pendant 2 semaines.

Choix des espèces

L’ovocyte de Xénope (une espèce de crapaud) est un modèle très adapté pour l’étude de la division des cellules, en particulier les cellules reproductrices femelles (appelées ovocytes). Comprendre la formation de ces cellules est important pour trouver des thérapies soignant l’infertilité humaine et le cancer. Chaque ovaire de Xénope contient des milliers d’ovocytes de très grande taille et très riches en molécules. Ceci permet des approches au niveau des cellules mais aussi des molécules qui sont impossibles chez les espèces mammaliennes. Le Xénope est donc la seule espèce de laboratoire permettant d'étudier la cellule reproductrice femelle en combinant ces deux puissantes approches. Une autre originalité propre au Xénope est que ses ovaires sont capables de régénérer leur stock d'ovocytes, ce qui limite le nombre d'animaux utilisés. Enfin, l’ovocyte de Xénope est plus proche de l'ovocyte humain que ne l'est celui de la souris en ce qui concerne les mécanismes de la division, ce qui le rend incontournable pour la découverte de nouveaux gènes impliqués dans les défauts de fertilité chez la femme. Les animaux utilisés sont des femelles adultes parce qu’elles ont des ovaires pourvus en ovocytes, les cellules que nous étudions. Les embryons et les têtards en sont dépourvus. Les femelles achetées chez un fournisseur agréé ont entre 2 et 3 ans, âge de la maturité sexuelle chez le Xénope.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit jusqu'à trois administrations de molécules fluorescentes dans la veine de la queue ou sous la nuque, subit jusqu'à quatre prélèvements sanguins et jusqu'à sept séances d'imagerie sous anesthésie générale, avant une dernière injection au moment de sa mise à mort. Une souris qui perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée sans délai. Le projet sert à mettre au point les vecteurs d'une société privée qui répond à ce qu'elle décrit comme une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique".

Objectifs

A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluorescentes permet de suivre leur localisation.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. L'imagerie prend quelques minutes (entre 2 et 5min).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale par injection de morphinique. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dit « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Achetés adultes chez des fournisseurs, à raison de dix individus par espèce, 120 oiseaux de douze espèces captives, du diamant mandarin au loriquet à tête bleue, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des billes métalliques leur sont implantées dans la langue, le larynx, la trachée et la syrinx, jusqu'à huit par structure, pour rendre visibles leurs mouvements sous rayons X pendant qu'ils vocalisent. Les séances de radiographie et de vélocimétrie laser durent trente minutes par individu et par demi-journée, les lasers étant placés sous les oiseaux pour éviter les brûlures de rétine. Le porteur écrit que les 120 individus seront tués si tous les oiseaux implantés vocalisent devant les caméras, le microscanner nécessaire à la reconstruction en trois dimensions imposant leur mort, et que les oiseaux non implantés qui n'auront pas vocalisé seront gardés en vie et adoptés.

Objectifs

Bien que la production de sons soit essentielle dans l'évolution des oiseaux, elle reste encore mal comprise, notamment au niveau de la mécanique des mouvements. La plupart des études sur la façon dont les oiseaux produisent des sons (chants, cris, appels) ont utilisé des méthodes indirectes, comme des dissections ou des tests sur des oiseaux anesthésiés. Notre objectif est d'exploiter les nouvelles techniques pour observer et mesurer en détail les mouvements des organes vocaux des oiseaux pendant qu'ils chantent, tout en enregistrant le flux d'air sortant de leur bec et les sons produits. L’objectif de cette étude est d’enregistrer, de quantifier pour ensuite modéliser : 1) Les mouvements du système vocal interne et externe lors de la vocalisation 2) Les flux d’air impliqués et 3) Les vocalisations produites sur une diversité d’espèces d’oiseaux. Le but est de comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son dans des conditions physiologiques, au plus proche des conditions naturelles de vocalisation. Pour cela, nous voulons filmer les oiseaux vocalisant, en utilisant à la fois un système multi caméras et de cinéradiographie biplanaire (rayons X), pour quantifier la cinématique des parties externes (par exemple bec, cou) et des parties internes (par exemple, trachée, syrinx) du haut du corps. Les enregistrements vidéo seront synchronisés avec des enregistrements acoustiques, à l’aide de microphones. Nous voulons également coupler ces observations à des mesures de flux d'air circulant à la sortie du bec, synchronisées avec des enregistrements acoustiques pendant la vocalisation. Pour cela nous utiliserons la méthode de Particle Image Velocimetry (PIV), une technique de mesure optique permettant d’obtenir le champ de vitesse d’un écoulement d’intérêt à partir de lasers. Pour comparer la production et la modulation du son entre les espèces et les sexes, nous avons choisi 4 familles d’oiseaux, représentant une diversité d’anatomies et de sons produits (c’est-à-dire Passeriformes, Columbiformes, Galliformes et Psittaciformes). Trois espèces par groupes ont été sélectionnées et des individus mâles et femelles seront utilisés pour chaque espèce de façon à mener des analyses comparatives en contexte phylogénétique.

Bénéfices attendus

En comparant la façon dont différentes espèces d'oiseaux produisent des sons, chez les mâles comme chez les femelles, nous allons identifier des structures importantes pour mieux comprendre leurs capacités vocales, à l’échelle de l’individu, du sexe et de l’espèce. Pour la première fois, nous pourrons observer tout le système vocal en mouvement, grâce à l'utilisation combinée de plusieurs techniques : des radiographies en mouvement (cinéradiographie), une méthode optique pour mesurer les flux d’air (PIV) et des enregistrements sonores. Les données détaillées que nous allons collecter permettront de répondre à d’anciennes questions non résolues sur les mécanismes impliqués dans la production de sons chez les oiseaux. En approfondissant notre connaissance de leur communication vocale, nous pourrons mieux comprendre comment des systèmes complexes de communication se développent et évoluent.

Procédures

Les animaux seront filmés à l’aide de caméras rayons X à haute vitesse et enregistrés par des microphones. 1) Les enregistrements par cinéradiographie (rayons X) couplés à des caméras haute vitesse permettront de quantifier les mouvements des structures externes et des structures internes rigides (par exemple le bec, les anneaux cartilagineux de la trachée). Pour quantifier la cinématique des structures non rigides (comme la langue, le larynx) des marqueurs radio-opaques constitués de billes de métal (alliage d’étain et d’argent) seront implantés dans les différentes structures du système vocal avant les enregistrements. Le nombre de marqueurs variera en fonction de la taille de la structure (par exemple, 5 pour la langue, 3 pour le larynx, de 5 à 8 pour la trachée, 3 pour la syrinx) et leur position sera adaptée à la forme et la fragilité de la structure (par exemple, implantés dans les anneaux cartilagineux plutôt que dans les parties molles de la trachée). Une étude pilote sur 2 individus par espèce sera réalisée pour s’assurer que les oiseaux implantés sont bien capables de vocaliser. 2) Les oiseaux filmés en cinéradiographie sans marqueurs ou avec marqueurs seront enregistrés en vélocimétrie par images de particules. Cette technique permet de quantifier les mouvements d’air impliqués dans la vocalisation à l’aide de particules en suspension dans l’air et de lasers. Cela permettra de s’assurer que les mouvements du système vocal et de l’air pendant la vocalisation ne diffèrent pas entre les oiseaux implantés et les oiseaux non implantés.

Impact sur les animaux

Les risques pour les oiseaux pendant les enregistrements par vélocimétrie par images de particules, cinéradiographie et système multi-caméras seront prévenus au maximum. Nous maintiendrons la salle à moins de 27°C, fournirons de l'eau et limiterons les enregistrements à 30 minutes par individu et par demi-journée. Les lasers susceptibles de provoquer des brûlures seront positionnés sous les oiseaux pour éviter les impacts sur les rétines, déclenchés après leur phase d'exploration, avec des flashs brefs en salle obscure et éclairée par des lampes infrarouges. Les oiseaux seront étroitement surveillés pour tout signe de détresse, et des ajustements seront faits si nécessaire. Pour la cinéradiographie, les animaux seront surveillés pour éviter la surexposition aux rayons X, bien que les études précédentes n'aient pas montré d'effets secondaires. Toute mesure sera prise pour éviter l'inconfort et la douleur lors de l’implantation des marqueurs, avec une surveillance régulière des zones implantées et du comportement des oiseaux.

Devenir

Les animaux implantés, ayant permis la prise de données cinématiques doivent être scannés en microtomographie (CTscans) pour reconstruire le mouvement en 3D des organes étudiées. Cette procédure nécessite la mise à mort des individus. Par exemple, si tous les oiseaux implantés vocalisent dans le champ des caméras rayons X, les 120 individus seront mis à mort. Les animaux n'ayant pas vocalisé dans le champ de caméras (Rayons X) ou du système de vélocimétrie par images de particules et n'ayant pas été implantés seront gardés en vie et seront adoptés.

Remplacement

Comme les organes vocaux internes sont difficiles à visualiser, la plupart des mesures et des expériences ont jusqu'ici utilisé des méthodes indirectes, telles que des dissections, des préparations d'organes vocaux excisés et des mesures de la pression des sacs aériens, ou ont été enregistrées lors de stimulations neurales d'oiseaux anesthésiés. Malgré les résultats importants fournis par ces études, une contrainte majeure demeure : les structures impliquées ne peuvent pas bouger et moduler le son comme elles le feraient in vivo. Nous souhaitons mettre à profit les progrès méthodologiques récents en termes de collecte et de traitement des données pour comprendre comment les oiseaux produisent et modulent activement le son, dans des conditions physiologiques proches des conditions naturelles. De ce fait l’utilisation d’animaux vivants, libres de leurs mouvements est incontournable.

Réduction

À part une étude réalisée en 2015, aucune n’a examiné la diversité des mécanismes de production des sons chez différentes espèces d'oiseaux. Nous nous basons sur cette étude pour choisir les espèces et le nombre d’individus à étudier. Dans cette étude, quatre groupes d’oiseaux avaient été sélectionnés : les Paléognathes, Columbiformes, Psittaciformes et Passériformes, car ils représentent une grande diversité anatomique, sonore et évolutive. Comme les Paléognathes (autruches, émeus, nandous) sont souvent de grande taille et difficiles d’accès, nous avons les avons remplacés par les Galloanserae, un autre groupe ancien qui diverge tôt dans l’évolution des oiseaux modernes. Nous avons choisi d’inclure 3 espèces par groupe (soit 12 espèces au total), afin d’avoir une étude plus équilibrée et statistiquement solide que celle de 2015, dans laquelle le nombre d’espèces par groupe variait de 1 à 2. Habituellement, les études en biomécanique impliquant la cinéradiographie ne concernent que peu d’individus (2 à 4) et d’espèces (1 à 3). Nous avons donc décidé d’étudier 5 individus par sexe (soit 10 individus par espèce), et d’analyser les données d’au moins 3 individus par sexe, ce qui permet de pallier aux difficultés de prise de données (comme un oiseau qui ne vocalise pas). Nous prévoyons d’analyser entre 5 et 20 séquences de sons par individu, ce qui nous donnera 30 à 120 séquences par espèce, un nombre considéré comme suffisant pour obtenir des données exploitables statistiquement pour des analyses comparatives entre les espèces. Nous utiliserons des modèles mathématiques appelés modèles linéaires mixtes pour comparer certains paramètres des sons (comme les fréquences de vocalisation) en fonction du type de vocalisation ou du sexe, et nous prendrons en compte les différences entre individus.

Raffinement

Les études biomécaniques sur les vocalisations des oiseaux nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés et en bonne santé. Le bien-être des oiseaux est essentiel à chaque étape de l'expérimentation. Ils proviendront de fournisseurs externes et seront logés dans des cages adaptées avec des enrichissements comme des perchoirs, des balançoires et des zones de bain. Chaque espèce sera hébergée individuellement pour minimiser le stress, et les sexes seront séparés pour éviter les reproductions non souhaitées. Toutes les méthodes seront adaptées pour réduire la douleur et le stress des animaux. Les procédures invasives seront limitées aux cas strictement nécessaires, avec un protocole d'anesthésie élaboré avec un vétérinaire. Une période d'acclimatation à la salle d'expérimentation sera mise en place, et des experts veilleront au bien-être des oiseaux 7 jours sur 7.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont des espèces captives, habituellement utilisées en expérimentation animale (elles ont toutes fait l'objet d'études expérimentales sur les vocalisations ou dans des conditions expérimentales similaires). Elles sont de taille relativement réduite et donc compatible avec le protocole expérimental choisi : Poule domestique (Gallus gallus), Sarcelle à collier (Callonetta leucophrys), Caille des blés (Coturnix coturnix), Diamant mandarin (Taeniopygia guttata), Canari domestique (Serinus canaria domestica), Moineau du Japon (Lonchura striata domestica), Pigeon biset (Columba livia), Tourterelle domestique, (Streptopelia risoria), Colombe diamant (Geopelia cuneata), Calopsitte élégante (Nymphicus hollandicus), Perruche ondulée (Melopsittacus undulatus), Loriquet à tête bleue (Trichoglossus haematodus) Bien que pour certaines espèces, seuls les mâles soient considérés comme chanteurs, toutes les espèces choisies produisent des vocalisations stéréotypées (mâles et femelles) mais diversifiées avec des mécanismes de production variés. Ces espèces représentent donc une diversité morphologique et acoustique au sein du groupe des Aves. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures. Tous les oiseaux seront achetés adultes ou sub-adultes (>1 ans), de façon à ce que leur apprentissage du chant soit consolidé et leurs organes vocaux matures.