Autre recherche fondamentale

Vérifier que les solvants fournis par des clients ne font pas souffrir les animaux avant de lancer les études payantes : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du protocole. Chacune reçoit jusqu'à deux administrations par jour pendant quatorze jours, dans le péritoine, sous la peau, dans une veine ou par gavage. Le porteur indique que ces injections répétées peuvent réduire la mobilité, courber le dos, faire plisser les yeux, et provoquer irritation locale, inflammation du péritoine, douleur musculaire ou diarrhées. L'amendement au projet ajoute 120 animaux pour tester aussi la molécule elle-même, et le porteur range l'ensemble sous les principes de raffinement et de réduction.

Objectifs

Dans le cadre de l'amélioration continue de nos méthodes de travail, notre objectif est de valider les produits utilisés pour diluer les molécules d'intérêt fournies par nos clients, lorsque ces véhicules n'ont pas encore été testés au préalable. Cette validation est cruciale lors de l'arrivée de nouveaux projets afin de garantir que le produit choisi n'entraîne pas de douleur aiguë ou chronique chez les animaux. L'objectif principal de cette étude est de confirmer les produits injectés aux animaux sont innofensifs. En assurant l'absence de douleur ou de détresse liée à l'administration du produit, nous serons en mesure de procéder aux études de traitement répétées en toute confiance, sans compromettre le bien-être animal et en garantissant l'exactitude des résultats expérimentaux, s'incluant dans le principe de raffinement. Cela nous permet également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude, s'incluant dans le principe de réduction.Nous avons estimé, sur la base des projets réalisés à l'institut au cours des deux dernières années, que cette étude préliminaire pourrait être nécessaire au maximum six fois par an, en fonction des nouveaux projets nécessitant l'utilisation de produits non encore testés. Amendement 1 : Afin d’assurer une évaluation complète des conditions d’administration, cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent (par exemple lorsque seul une concentration inferieur à déjà été testé in vivo, ou lorsque la molécule seule pourrait avoir un risque de toxicite) nécessitant une modification du projet initial avec ajout de 120 animaux. Cette approche permettra de vérifier l’innocuité de l’ensemble de la formulation administrée, garantissant ainsi que ni le véhicule ni la molécule d’intérêt n’entraînent de douleur aiguë ou chronique chez les animaux, tout en maintenant la rigueur scientifique et le bien-être animal.

Bénéfices attendus

- Évaluation de la sécurité du produit : Assurer que l'administration du produit ne provoque ni douleur aiguë ni douleur chronique chez les animaux. Cela est crucial pour garantir que nos essais ne compromettent pas le bien-être animal. - Fiabilité des études : En validant la non toxicité du produit, nous serons en mesure de mener des études de traitement répété en toute confiance, ce qui nous permettra de fournir des résultats fiables et précis sur les effets des molécules testées.

Procédures

Chaque animal sera soumis à 1 administration d'un produit contrôle au maximum 2 fois par jour pendant 14 jours par voie intrapéritonéale, sous cutanéee, intraveineuse ou par gavage. Ces gestes durent environ 1 minute et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections répétés pouvant conduire de manière aigue à une diminution de la mobilité de l'animal ou a des anomalies posturales (dos vouté, yeux plissés). En chronique les injections peuvent induire une irritation locale ( injection sous-cutanée), une inflammation du péritoine (injection intra-péritonéale), une douleur musculaire (injection intramusculaire) ou des diahrées (gavage oral).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole et les organes seront collectés si un effet négatif du traitement est visualisé.

Remplacement

Tester le produit à injecter avant la réalisation de l'étude expérimentale est une étape essentielle qui contribue à la sécurité, à l'efficacité et à la rigueur scientifique de la recherche. Cette phase permet de garantir que les résultats obtenus sont fiables et que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile, répondant ainsi aux exigences éthiques et scientifiques des études expérimentales. Ceci va permettre d'identifier des potentielles réactions indésirables de l'injection ou du composé en lui même mais egalement d'optimiser sa formulation ci necessaire

Réduction

Une étude pilote de 8 animaux sera réalisée pour les études necessitant une administration répétée d'un composé lorsque le client ne l'aura jamais testé par lui même aupréalable (exemple: véhicule repris de la littérature). Tester le véhicule en amont permet d'anticiper et de corriger d'éventuels problèmes avant qu'ils n'affectent l'étude principale, évitant ainsi des répétitioins d'une étude et donc l'utilisation de plus d'animaux. Cela nous permettra également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude. Suite à nos retours sur les projets précédents et en concordance avec les études statistiques nous avons opté pour 8 animaux par groupe. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 8 animaux constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Amendement 1 : Cette étude inclura non seulement la validation des véhicules utilisés pour diluer les molécules d’intérêt, mais aussi l’injection de la molécule elle-même lorsque cela est pertinent.

Raffinement

La phase de test du produit contribue au raffinement des méthodes expérimentales en minimisant la douleur et la détresse, et en maximisant la qualité des données obtenues. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation ainsi que le poids chaque jour pendant les 14 jours de la procédure. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La souris est un mammifère permettant une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux pourront être utilisés à partir de l'âge de 1 mois jusqu'à 1 an, en fonction des exigences spécifiques de l'étude principale. Cette flexibilité d'âge nous permet d'adapter les animaux au modèle expérimental en phase avec les problématiques physiologiques pertinentes pour chaque étude.

Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".

Objectifs

Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes

Impact sur les animaux

L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.

Remplacement

Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.

Raffinement

Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.

Choix des espèces

Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.

Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".

Objectifs

La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.

Procédures

Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).

Impact sur les animaux

- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.

Remplacement

Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.

Réduction

Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.

Raffinement

À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.

Choix des espèces

Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.

Une injection de cardiotoxine dans chacun des deux tibias détruit le muscle de souris endormies à l'isoflurane, après cinq jours d'injections quotidiennes de tamoxifène et avant jusqu'à sept jours d'injections de glucocorticoïdes. 3 400 souris mâles vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme n'attendre aucun effet secondaire majeur et décrit des procédures qui n'entraînent généralement pas de souffrance, alors que le protocole repose sur la destruction chimique des muscles des pattes et sur un prélèvement sanguin qu'il chiffre à 25 % du volume corporel juste avant la mise à mort. Celle-ci consiste en une perfusion de paraformaldéhyde dans le cœur sous anesthésie à la kétamine, pour fixer d'un coup tous les organes.

Objectifs

Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.

Procédures

Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

A l'issue de la procédure tous le animaux expérimetaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 30 semaines. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3, 5 , 7, 14, 28 et 60 jours après injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée LysM-Cre, cette Recombinase Cre étant constitutive elle ne nécessite pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible LysM-CreERT2. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée LysM-Cre. Amendement Nous voulons ajouter trois modèles. Deux modèles dans lesquels GR est invalidé dans la fibre musculaire de manière constitutive (HSA-Cre) ou inductible (HSA-CreERT2). Le second modèle proviendra d’un fournisseur agrée de souris ayants subies une surrénalectomie. Nos résultats préliminaires montrent la nécessité d'étudier des stades intermédiaires, à savoir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21, 28, 40, 60 et 80 jours après l’injection de cardiotoxine, sans se limiter aux précédemment stades mentionnés.

Jusqu'à 40 ml de sang prélevés chaque mois sur animal conscient, ou une heure de contention sous des cages de moustiques qui se gorgent directement sur leurs oreilles, jusqu'à trois fois par semaine : 44 lapins vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur sang entretient des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques, et alimente les tests d'insecticides et de répulsifs menés en santé publique. Le porteur indique que la contention peut mettre les lapins en état de stress, avec yeux exorbités, râle et souffle court, et que des lésions aux oreilles apparaissent quand les tentatives de prélèvement échouent. Ceux qui atteignent quatre ans sont proposés à l'adoption, soit la moitié de l'effectif, les autres restant en vie pour la reconduction du même projet. L'espèce a été retenue notamment parce que les lapins cessent vite de réagir aux piqûres de moustiques, à la différence de l'être humain.

Objectifs

Nos travaux portent sur les insectes et arachnides responsables de la transmission de maladies infectieuses. De ce fait, nous avons des élevages de moustiques, de phlébotomes et de tiques. Nous avons besoin d'avoir accès à une source de sang pour maintenir ces élevages car cela permet à ces animaux de produire leurs œufs ou de croître. De plus, les moustiques, phlébotomes et tiques sont également utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines. Ainsi, les prélèvements sanguins peuvent également servir pour infecter ces insectes et archnides avec des virus ou des parasites et ainsi simuler la transmission de maladies. Egalement, dans le cadre des évaluations d’insecticides et/ou répulsifs utilisés en santé publique, l'efficacité de ces produits peut être démontré parce qu’ils empêchent la piqûre ou permettent de contrôler la population de vecteurs. L’objectif global de ce projet est le gorgement des moustiques, pblébotomes, tiques : - à des fins de production - à des fins d’expérimentations

Bénéfices attendus

La reproduction des insectes et archnides effectuée en laboratoire permet de maintenir les souches et ainsi de les utiliser dans les différents projets. Les élevages sont utilisés sur des projets de recherche dans divers domaines : 1. évaluation des insecticides utilisés en santé publique dans le cadre d’expertise ou de recherche. 2. évaluation de nouvelles formules d’insecticides pouvant donner lieu à des dépôts de brevets 3. recherche sur les maladies infectieuses transmises par ces insectes et arachnides 4. études sur le comportement de ces insectes et arachnides 5. autre objectif : fournir d'autres laboratoires et instituts pour des expérimentations et/ou des modules d'enseignement. Ces axes de recherche sont des voies importantes pour mettre en œuvre des moyens de protection efficaces contre les maladies transmissibles via ces insectes et archnides, tel le paludisme, transmis par les moustiques, qui fait chaque année de 1 à 3 millions de morts.

Procédures

Un prélèvement sanguin régulier sur animal conscient sera effectué sur une partie des lapins. Ils seront prélevés entre 1 à 2 fois par mois selon les demandes. Généralement, les lapins seront prélèvés mensuellement de maximum 40 ml de sang puis mis en repos pour 4 semaines. La durée du prélèvement en lui-même est d’une dizaine de minutes. L’autre partie des lapins sera mis régulièrement en contention pendant 60 min maximum afin que les moustiques (disposés en cages) puissent se gorger directement sur les oreilles des lapins. La fréquence sera entre 0 et 1 fois/semaine pour les gorgements simples (annuel) et entre 1 à 3 fois/semaine pour les gorgements liés aux évaluations insecticides utilisés en santé publique (entre 3 à 6 mois d’évaluation/an maximum). Il n’y a pas de gorgement direct pour les phlébotomes et tiques.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de gorgement direct sur lapin, celui-ci peut être en situation de stress (yeux exorbités, râle, souffle court…). De plus, la piqûre par des moustiques en direct représente également une nuisance, même sans effet visible d’inflammation ou de grattage. Les lapins prélevés, quant à eux, peuvent présenter des lésions au niveau des oreilles si les tentatives de prélèvements sont infructueuses.

Devenir

les animaux ayant atteint environ 4 ans seront mis à la retraite et proposés à l’adoption soit la moitié de l'effectif prévu. Les animaux ayant moins de 4 ans seront maintenue en vie en vue d'un nouveau dépôt du même projet scientifique (utilisation continue).

Remplacement

Les élevages de moustiques, phlébotomes et tiques nécessitent du sang pour produire des œufs ou leur croissance. À ce jour, il n’existe pas d’alternative totalement sans sang ou utilisant un sang artificiel, bien que des projets soient en cours pour explorer d’autres options, notamment pour les moustiques. Gorgement sur lapin : Les signaux émis par un animal permettent de reproduire les conditions naturelles et d’assurer un gorgement efficace. Les systèmes de gorgement artificiel (sang prélevé) ne conviennent pas toujours, notamment pour des études comportementales ou des tests de répulsifs/insecticides, car ils ne reproduisent pas tous les facteurs naturels nécessaires (comme le CO₂ ou l’acide lactique). Gorgement artificiel : Le sang acheté auprès de fournisseurs externes comporte un faible risque de contamination par des pathogènes ou des molécules (médicaments, vermifuges), ce qui peut nuire aux élevages. En revanche, le sang prélevé sur des lapins dans l’animalerie est contrôlé, exempt de pathogènes et sécurisé. Lors de traitements, les lapins concernés sont temporairement exclus. De plus, le sang prélevé destiné aux infections expérimentales doit être prélevé dans les 24 heures avant l’expérimentation.

Réduction

Pour les gorgements direct de moustiques avec lapin en contention, nous avons optimisé l'utilisation des lapins en limitant à deux lots de trois lapins, chaque lot utilisé une seule fois par semaine (lundi et vendredi). Nous n'utilisons qu'un lapin par insectarium (souches sensibles et résistantes), soit deux lapins, avec un troisième en réserve en cas d'agitation. Cela minimise le nombre de lapins. Nous avons également adopté des pratiques pour réduire le nombre de prélèvements. Pour les moustiques sains, le sang est réutilisé une seconde fois, diminuant les prélèvements. Bien que cela ne soit pas applicable aux repas infectieux, cela réduit la fréquence d’utilisation des lapins. Nous privilégions le gorgement artificiel sur membrane lorsque possible, réduisant ainsi le besoin de lapins en contention chaque semaine. Nous jugeons que le stress hebdomadaire de la contention est plus important que celui d’un prélèvement mensuel, d’où notre effort de réduction. Trois lapins par semaine suffisent pour obtenir 120 ml de sang, avec un roulement de 12 lapins pour leur repos et un lapin en cas de prélèvement infructueux, soit un lot total de 13 lapins. Pour l’évaluation des insecticides sur moustiques, trois lapins sont utilisés par lot : un pour les moustiques témoins, un pour les moustiques traités, et un troisième en réserve. Chaque lapin peut être utilisé une à trois fois par semaine, réduisant ainsi la nécessité d'en introduire de nouveaux. De plus, après deux jours, la majorité des résidus absorbés est excrétée, permettant de réutiliser les mêmes lapins sans risque de contamination. Enfin, l'expérience montre que les lapins peuvent être utilisés pour les prélèvements et les piqûres de moustiques jusqu'à un âge avancé (mais nous procéderons à une mise à la retraite aux alentours des 4 ans). Cela prolonge leur utilisation et évite le renouvellement fréquent des lots, participant ainsi à la réduction globale du nombre de lapins utilisés pour nos élevages et études.

Raffinement

Cliquez ou appuyez ici pour entrer du texte. Bien-être des lapines en animalerie : Des enrichissements comme des rondins de bois et blocs de sel (moins appréciés) ont été introduits pour permettre aux lapines de jouer ou ronger. Deux parcs ont été installés, offrant à chaque lapine une sortie hebdomadaire d'une demi-journée en rotation. Les lapines, hébergées par deux, sont regroupées dès leur arrivée, mais en cas d’agressivité, elles sont logées individuellement tout en pouvant se voir et se sentir à travers des parois en plexiglas. Dans ce cas, des enrichissements variés et des sorties fréquentes au parc favorisent leur sociabilisation. Gorgement direct : Les lapines destinées au gorgement direct sont installées dans une pièce calme, éloignée des bruits et du passage du personnel. Des panneaux signalent leur présence pour limiter les perturbations. Les gorgements se déroulent dans une pièce sombre afin de maintenir leur calme, et des friandises leur sont offertes après la contention. Prélèvements sanguins : Les prélèvements se font sur des animaux conscients, évitant l'anesthésie générale. Un délai de récupération de 2 à 4 semaines est respecté entre chaque prélèvement, selon la quantité de sang prélevée. Une crème anesthésiante (lidocaïne) est appliquée sur leurs oreilles 15 à 30 minutes avant le prélèvement. Après l’intervention, les oreilles sont nettoyées avec un antiseptique, puis une crème cicatrisante est appliquée avant de replacer les lapins dans leur hébergement. Retraite et adoption : Une mesure de raffinement envisagée est de fixer une mise à la retraite des lapines à l’âge de 4 ans, avec une proposition pour leur adoption

Choix des espèces

Cette espèce a été choisie pour sa taille et facilité de manipulation. Les lapins sont suffisamment gros pour supporter la prise de sang par les femelles moustiques contrairement aux petits rongeurs et sont plus faciles à manipuler et élever que des gros mammifères. De plus, ils permettent des prélèvements sanguins d'un volume plus important par rapport aux rongeurs. Leur facilité de mise en contention évite également le recours à l'anesthésie. Il est également à noter que les lapins ne présentent rapidement plus de réaction inflammatoire suite aux piqûres de moustiques (désensibilisation rapide), contrairement à l'Homme. Les lapins arrivent généralement à l'animalerie lorsqu’ils sont agés de 19 semaines. Ils ne sont utilisés que lorsqu'ils atteignent le poids de 3,5kg.

Dix-huit injections en neuf semaines, une vingtaine de mesures de l'épaisseur des articulations, neuf tests de répartition du poids sur les pattes et neuf tests de force de préhension : voilà le programme de chacune des 2 700 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une arthrite leur est induite par deux injections, avec douleurs articulaires, gonflements et raideurs apparaissant entre 21 et 28 jours, une mobilité réduite et des difficultés à s'alimenter. Le projet cherche à savoir si moduler un mécanisme de recyclage cellulaire ralentit la polyarthrite rhumatoïde, toutes les souris étant tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur justifie l'espèce par l'expertise disponible en élevage et manipulation, et conclut qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne reproduit cette complexité.

Objectifs

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie inflammatoire chronique qui touche les articulations. Elle concerne environ une personne sur cent, avec une fréquence plus élevée chez les femmes. Cette maladie provoque des douleurs persistantes, une raideur articulaire et des déformations progressives des articulations. À long terme, elle peut aussi entraîner des complications touchant d’autres organes et réduire l’espérance de vie. La maladie apparaît généralement autour de l’âge de 45 ans et sa fréquence augmente avec l’âge. En plus de ses effets sur la qualité de vie, elle a un fort impact professionnel, puisqu’environ la moitié des personnes touchées arrêtent de travailler dans les cinq ans suivant le diagnostic. L’objectif de ce projet est d’étudier si la modulation d’un processus naturel de recyclage des composants cellulaires, impliqué dans la régulation de l’inflammation, pourrait aider à prévenir ou à traiter cette maladie. En agissant sur ce mécanisme, nous espérons diminuer l’inflammation au niveau des articulations, limiter les dommages causés aux os et améliorer les symptômes ressentis par les patients. À terme, ce projet pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour mieux prendre en charge cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’explorer l’effet d’un modulateur de l’autophagie dans des modèles murins de polyarthrite rhumatoïde (PR), avec des bénéfices attendus à la fois pour mieux comprendre la maladie et pour développer de nouveaux traitements. Sur le plan fondamental, cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l’autophagie dans l’évolution de l’inflammation et des lésions articulaires caractéristiques de la PR. Elle analysera comment un déséquilibre de ce processus peut favoriser la survie des cellules inflammatoires et aggraver la maladie. Cette recherche vise à identifier les étapes clés du développement de la PR et à repérer de nouvelles cibles pour de futurs traitements. D’un point de vue thérapeutique, si l’inhibition ciblée de l’autophagie s’avère efficace pour ralentir la progression de la PR, cette approche pourrait déboucher sur de nouvelles solutions médicamenteuses. Ces traitements seraient particulièrement utiles pour les patients qui ne répondent pas bien aux thérapies actuelles ou qui ne les supportent pas, en offrant un meilleur contrôle de la maladie avec moins d’effets secondaires liés à l’immunosuppression. Les retombées de ce projet sont donc doubles : il contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes en jeu dans la PR et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques innovantes. À terme, ces avancées pourraient améliorer la qualité de vie des patients tout en réduisant l’impact économique et social de la maladie.

Procédures

Certaines souris possédant un fond génétique particulier recevront, en plus des autres actes, 5 injections successives d’un agent chimique destiné à réduire la quantité d’une protéine spécifique. Ces injections seront administrées sur animaux vigiles une fois par jour pendant 5 jours et dureront quelques secondes chacune. Pour induire l’arthrite, les souris recevront deux injections également sur animal vigile, chacune durant environ 15 secondes. Les traitements expérimentaux comprendront un total de 18 injections, d’une durée d’environ 10 secondes chacune (2 injections par semaine) sur une durée de 9 semaines sur animaux vigiles. Afin de surveiller l’évolution de l’inflammation articulaire, des mesures de l’épaisseur des articulations seront réalisées sur animaux vigiles tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un instrument de précision. Cette procédure prendra environ une minute par animal, avec un total d’environ 20 mesures par souris. L’état de l’arthrite sera évalué chaque semaine selon une grille d’observation spécifique, une évaluation prenant environ 2 minutes par animal et réalisée 9 fois par souris sur toute la durée de l’étude sur animaux vigiles. Des échographies des articulations seront effectuées toutes les deux semaines sous anesthésie légère. Chaque session durera environ 20 minutes et chaque souris passera 4 séances au total. Un test permettant d’évaluer la répartition du poids entre les pattes avant et arrière sera réalisé une fois par semaine sur animaux vigiles. Cette analyse, qui dure environ 5 minutes par animal, permettra de mesurer l’impact de l’arthrite sur l’appui des pattes. Chaque souris passera ce test 9 fois. Enfin, un test mesurant la force de préhension des pattes sera effectué une fois par semaine sur animaux vigiles, afin d’évaluer d’éventuelles faiblesses musculaires liées à la maladie. Ce test, d’une durée d’environ 5 minutes par animal, sera répété 9 fois par souris.

Impact sur les animaux

Les souris impliquées dans ce projet recevront des injections de molécules. Cette procédure peut provoquer une douleur locale légère et temporaire ainsi qu'une irritation à l'endroit de l'injection. Une inflammation cutanée temporaire peut également apparaître en raison des molécules injectées. Des symptômes d'arthrite, tels que des douleurs articulaires, gonflements et raideurs, surviennent généralement entre 21 et 28 jours après l'injection. Dans certains cas, des changements comportementaux, comme une réduction de l'activité ou un isolement, ainsi qu'une perte de mobilité, peuvent être observés. Certaines souris recevront des injections d'anticorps. Cette procédure peut entraîner une irritation locale temporaire et un stress dû à la manipulation. Dans les 24 à 48 heures suivant l'injection, une inflammation aiguë des articulations peut se développer, accompagnée de douleurs, de gonflements et de raideurs. Ces symptômes peuvent réduire la mobilité, entraîner des difficultés à s'alimenter et causer un inconfort général. Une perte de poids modérée peut également être observée. Les injections administrées au cours du traitement peuvent causer une douleur passagère au site d'injection et un stress lié à la contention. Une manipulation incorrecte pourrait entraîner des effets indésirables, tels qu'une irritation ou une hémorragie mineure. Effets secondaires généraux : La progression de l’arthrite peut entraîner des douleurs chroniques persistantes, provoquant des comportements de retrait, une diminution de la mobilité et un état général altéré. Des troubles alimentaires et un pelage abîmé peuvent également apparaître.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques afin de répondre à la question scientifique.

Remplacement

L’utilisation d'animaux dans les études sur l'arthrite induite est indispensable en raison de l'absence de méthodes alternatives capables de reproduire la complexité du développement et de la progression de ces maladies auto-immunes. Ces études permettent de mieux comprendre les interactions complexes entre les cellules immunitaires, le collagène et les composants du cartilage, ainsi que les réponses inflammatoires spécifiques à l'arthrite rhumatoïde. Les réponses immunitaires, impliquant des interactions entre les cellules T, les cellules B, les anticorps et le collagène de type II, ne peuvent être pleinement explorées que dans un organisme vivant. Actuellement, les alternatives in vitro ou ex vivo ne permettent pas de reproduire l'ensemble des paramètres biologiques observés in vivo, notamment la réponse systémique à l'inflammation auto-immune.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2700 souris, un nombre déterminé à l’aide d’une analyse statistique rigoureuse pour s’assurer qu’il est suffisant pour obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront organisées de manière à optimiser le nombre d’animaux impliqués, en réduisant au maximum le recours à des groupes témoins tout en garantissant la validité scientifique des résultats. Si les premières expériences montrent que l’hypothèse de départ est invalide, l’étude sera immédiatement arrêtée afin d’éviter l’utilisation inutile d’animaux. Lors des prélèvements, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur les tissus collectés (études immunologiques, observation des cellules et des tissus, analyses moléculaires), ce qui permettra d’exploiter au maximum les données obtenues à partir de chaque animal. Ces échantillons pourront également être partagés avec d’autres chercheurs pour éviter de multiplier les expériences et ainsi réduire encore l’utilisation d’animaux. Enfin, les résultats obtenus seront analysés à l’aide de méthodes statistiques adaptées afin d’en tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires en vigueur, en collaboration étroite avec le personnel de l’animalerie. Les souris auront un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’à un environnement enrichi (matériaux de nidification, tunnels) afin de favoriser leur bien-être et de limiter le stress. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour détecter précocement tout signe d’altération de l’état de santé. Une stratégie progressive de prise en charge de la douleur sera mise en place pour chaque modèle. Ce protocole permettra d'adapter l'analgésie à l'état clinique de l'animal. Le recours à des méthodes d'administration non invasives (eau de boisson enrichie en analgésique) sera privilégié chaque fois que possible. En cas de complication (plaie, réaction locale, difficulté alimentaire), des soins de support seront prodigués : application d’antiseptiques locaux, ajout de gel nutritionnel, et adaptation de l’enrichissement. En cas de comportement agressif, notamment chez les mâles, les animaux seront hébergés individuellement pour empêcher l’aggravation de blessures suite à des bagarres (blessures qui seront immédiatement soignées). Le personnel impliqué dans les procédures est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale et veillera à limiter le stress lors des manipulations. Les injections seront réalisées avec des aiguilles fines afin de réduire les traumatismes. Les animaux anesthésiés seront installés sur des tapis chauffants pour prévenir l’hypothermie, et leurs yeux seront protégés par l’application de gel ophtalmique. Les conditions d’hébergement, les soins et les protocoles pourront être ajustés en temps réel en fonction de l’état des animaux, dans une démarche continue de raffinement.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal repose sur des raisons scientifiques solides. Les souris sont les plus utilisées en recherche grâce à une expertise confirmée en élevage, manipulation et suivi vétérinaire. Elles garantissent des résultats fiables et reproductibles, essentiels au développement de nouveaux traitements. Les lignées sélectionnées pour ce projet ont été choisies pour leurs caractéristiques adaptées à l’étude de l’arthrite rhumatoïde : Les souris seront utilisées dès 7 à 8 semaines, âge correspondant à un développement physiologique complet, garantissant des résultats fiables. L’utilisation de ces modèles est indispensable pour comprendre l’arthrite et tester des traitements innovants. Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet aujourd’hui de reproduire cette complexité.