Autre recherche fondamentale

26 veaux de quatre à huit semaines vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 20 tués à l'issue et 6 gardés en réserve, réaffectés s'ils ne servent pas. Une injection de lipopolysaccharide provoque une inflammation, puis 20 prélèvements sanguins sur 72 heures retirent jusqu'à 262 mL de sang par animal, pour tester l'association d'un anti-inflammatoire et d'un antibiotique. Le porteur prévoit une mise à mort par tige perforante et exsanguination, les produits testés n'ayant pas d'autorisation de mise sur le marché. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la diffusion des principes actifs et juge "indispensable" le recours à l'animal entier.

Objectifs

Ce projet présente 4 différents objectifs: 1- Étudier les symptômes cliniques après une stimulation par LPS par administration sous cutannée 5.0 µg/kg par animal. 2- Évaluer la sécurité et l'efficacité d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action après une provocation expérimentale au Lipopolysaccharide (LPS) en comparaison avec l'antibiotique longue action seule (sous-cutané) et l' AINS seul (sous-cutané) en tant que monoproduits et une solution saline. 3- Évaluer les propriétés pharmacocinétiques des doses sélectionnées de l'AINS en association avec l'antibiotique longue action. 4- Évaluer l'évolution de certains marqueurs inflammatoires pertinents après le traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en avant les bénéfices de l'association de l'AINS avec l'antibiotique longue action, l'efficacité et la sécurité de cette administration conjuguée. Cela permettra de mettre en avant l'action de ce complexe sur les marqueurs de l'inflammation.

Procédures

La première étape est de créer le modèle inflammatoire. Pour cela, les 20 animaux sélectionnés recevront une administration de LPS ( Lipopolysaccharide provenant des bactéries Escherichia Coli) à la dose de 5.0 µg/kg soit 1 mL/50 kg. Puis les animaux seront répartis en 4 groupe de 5 animaux. Ils auront une administration sous cutanée de formulations tests c'est à dire d'une injection sous-cutanée d'un AINS en association avec un antibiotique longue action en comparaison avec l'AINS seul, l'antibiotique longue action seule en tant que monoproduits et une solution saline. Volume administré: 1 mL/40 kg. Puis Des prélèvements de sang seront également réalisés, 20 temps de prélèvements sur 72h (T0, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 9, 12, 18, 24, 28, 32, 48, 56, 72 h aprés administration. La collecte de sang sera effectuée à l'aide d'un vacutainer avec des tubes d'héparine de lithium (LiHe) et d'héparine de sodium (SoHe) et des aiguilles stériles de taille appropriée. Les aiguilles seront remplacées entre chaque veau et chaque prélèvement. Les échantillons de sang seront prélevés au niveau des veines jugulaires. Les sites de prélèvement seront alternés autant que possible. Volume total prélevé: 262 mL de sang par animal sur 72h. La création du modèle inflammatoire se fait le jour des administrations des produits tests et consiste à faire une administration en sous cutannée. Toutes les administations se font sur une seule journée. Les prélèvements sanguins seront réparti sur 3 jours. La phase animale de ce projet se terminera 72h aprés l'administration des éléments tests.

Impact sur les animaux

Il est possible d'observer des effets indésirables. Il peut s'agir d'une forte fièvre, modification de la respiration, modification du comportement général des animaux ( exemple déambulation, toux...), présence éventuelle d'écoulement occulaire ou nasal.

Devenir

A la fin de ce projet, tous les animaux traités seront euthanasiés selon les bonnes pratiques vétérinaires et la réglementation en vigueur, car ces animaux auront reçu des éléments tests sans AMM. Méthode physique: étourdissement à l'aide d'une tige perforante suivi de l'exsanguination. L'exsanguination consiste à la section des veines jugulaires et/ou artères carotides. Il est prévu 6 animaux réserves. Si les 6 animaux réserves ne sont pas utilisés ils pourront dans ce cas être replacés. La décision sera prise par le vétérinaire responsable.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d'un ou de plusieurs principes actifs dans le sang et leurs effets sur l'animal, il est donc indispensable de recourir à l'animal entier.

Réduction

Dans cette étude, il est prévu d'inclure 26 animaux ( 20 animaux administrés et 6 animaux de réserve). C'est le nombre d'animaux minimum requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation d'au minimum 2 semaines. De leur arrivée à la fin de l'étude, les veaux seront logés en groupes de 5 animaux. Les veaux seront couchés sur de la paille dans un système de litière profonde, de la paille propre étant fournie si nécessaire. Une attention particulière sera portée au raffinement et à l’enrichissement du milieu autant que possible. La thermorégulation et la ventilation des logements des animaux ne seront pas contrôlées puisque les logements sont ouverts sur l'environnement extérieur. L'éclairage naturel sera utilisé. La température et l'humidité du logement des veaux seront enregistrées pendant la phase animale.

Choix des espèces

Les veaux sont particulièrement sensibles aux LPS, et constituent donc une espèce de choix pour créer un modèle de l'inflammation. Les jeunes veaux sont très sensibles aux maladies respiratoires et constituent donc un modèle approprié à utiliser pour tester l'efficacité des produits contre les maladies respiratoires. Ils constituent également l'espèce cible de ce produit. Les veaux auront 4 à 8 semaines le jour de l'administration

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sur une journée, aux veines mandibulaire, saphène et fémorale, pour mettre au point une technique de micro-prélèvement. Le porteur admet que des sites de prélèvement seront "abîmés" puisqu'il s'agit d'une mise au point, et fixe la validation à 90% d'animaux aux sites corrects. Il justifie le projet par la réduction du nombre d'animaux dans de futures études, tout en qualifiant le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer huit prélèvements sanguins par animal en vigile via la technique du micosampling. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile par microsampling c'est à dire prélèvement à la veine mandibulaire, à la veine saphène et/ou à la veine fémorale (2 prélèvements maximum par site de 40 μl maximum). Nombre maximal de prélèvement par animal: 8

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de développer une nouvelle technique de prélèvement, via le microsampling, qui permettra de faire 8 prélèvements de 40 µL maximum et donc de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés pour les prochaines études

Procédures

La veille des prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse: Isoflurane) pour pouvoir raser les pattes arrières des animaux. Avant de commencer les prélèvements, les cages hébergeant les animaux seront placées sous lampes chauffantes pendant environ 15 minutes pour faciliter les prélèvements et dilater les veines. Cette opération peut être renouvellée autant que nécessaire si besoin. Les sites de prélèvement sanguin ( veine mandibulaire, saphène ou fémorale droite ou gauche) seront alternés au maximum. 4 prélèvements seront fait au niveau des mandibules droites et gauche et 4 autres prélèvements seront réalisés au niveau des saphènes droite et gauche et fémorales droite et gauche (1 prélèvement par site) Les temps de prélèvement seront: T5min, T15min, T30 min, T1h, T2h, T4h, T6h, T8h. Volume de sang prélevé: 40 µL par temps de prélèvement

Impact sur les animaux

Il est probable d'avoir des sites de prélèvement abimés car c'est une mise au point de technique... Un suivi quotidien (voire plusieurs fois par jour, à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin. Cette technique sera validée si 90 % des animaux présentent des sites de prélèvements convenables, non abîmés avec un bon aspect général des animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure , les animaux seront anesthésiés et euthanasiés par dislocation cervicale (possibilité d'exsanguination précédant la dislocation).

Remplacement

Le but de ce projet est de mettre en place une nouvelle technique de prélèvement sanguins ( le microsampling) chez la souris. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de valider cette technique sur un autre support , il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 40 animaux seront inclus pour une durée de 1 an. C'est le nombre d'animaux nécessaire et minimal requis pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux seront divisés en 2 groupes de 6, et les essais seront fait sur trois souches de souris différentes (souris SWISS, C57Bl6 et les souris SCID). Douze animaux seront utilisés pour chaque souche.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 maximum dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin.

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Les souches SWISS, C57BL6 seront particulièrement utilisées . La souche SCID, pourra aussi être utilisée. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-40g

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois formulations à doses croissantes, jusqu'à 100 mg/kg, en injection unique puis pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang à la mâchoire sur animal éveillé puis un prélèvement terminal au cœur, pour fixer la dose maximale tolérée en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique qu'il est probable que les animaux présentent des effets indésirables et fixe des points limites tels que convulsions, détresse respiratoire ou automutilation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'effet de l'"organisme entier" sur les molécules et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal de laboratoire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer la dose maximale tolérée de trois formulations différentes. Chaque formulation sera administrée à la dose de 10, 50 et 100 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer la dose maximale tolérée pour les trois formulations testées aprés une administration unique ou une administration répétée pendant 5 jours. La classe thérapeutique du principe actif est Neurologie, le but étant de déterminer les doses cibles pour les futures études de toxicologie demandées par les autorités pour un dépôt de dossier AMM.

Procédures

- Les animaux auront une simple administration en période 1 puis aprés une période de repos d'au moins 3 jours, ils auront une administration répétées pendant 5 jours (administrations Intra péritonéale en période 1 et 2). - Les prélèvements seront de 3 prélèvements par animal en période 1 juste aprés administration à 30min, 2h et 6h. Puis les animaux auront une période de repos d'au moins 3 jours. En période 2, les animaux auront également 3 prélèvements aux même temps aprés la cinquième et dernière administration. Volume maximal prélevé: 60 µl Les prélèvements se font sur animal vigile (microsampling à la veine mandibulaire) ou sous anesthésie (prélèvement terminal en intra-cardiaque).

Impact sur les animaux

Le but étant de déterminer une dose maximale, il est fort probable d'avoir des signes d'effets indésirables sur les animaux. Les animaux seront observés au minimum deux fois par jours pour un prise en charge rapide de l'animal si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Immobilité prolongée de l'animal, décubitus - Suffocation, convulsion, détresse respiratoire - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : poil ébouriffé ou souillé) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à cette procédure, des tissus (coeur, cerveau, poumons, reins, foie, rate, pancréas, muscle et tube digestif) seront collectés pour analyse

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer une dose maximale tolérée. La classe thérapeutique des formulations testées: neurologie. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire les effets de l'organisme entier sur les molécules, il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 54 animaux seront inclus (27 male et 27 femelle). Les animaux seront répartis en 9 groupes de 6 animaux. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (2 fois par jour à minima) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, comportement de l'animal....).

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques. La souche C57BL6 est particulièrement utilisée dans le domaine de la neurologie. Jeune adulte. Stade de developpement requis pour ce type d'étude

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

Six cochons femelles de 20 à 25 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque animal reçoit six incisions d'au moins huit centimètres sur le thorax pour comparer deux colles chirurgicales, avec de la buprénorphine en cas de douleur au réveil. Le porteur indique que les tissus sont prélevés après euthanasie pour analyser la cicatrisation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'inflammation et la cicatrisation d'une plaie et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal entier".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer la réponse inflammatoire locale ainsi que le processus de cicatrisation d'une plaie aprés l'application de deux colles chirurgicales différentes utilisées pour des sutures cutannées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de suturer des plaies superficielles de façon simple et atraumatique. Les colles chirurgicale favorisent l'hémostase locale, renforcent les sutures et assurent l'adhésion tissulaire.

Procédures

Dans ce projet, six porcs femelles de 20-25 kg seront incluses. Aprés une période d'acclimatation d'une semaine, les animaux seront anesthésiés de manière générale ( "pig cocktail" 0.1 mg/kg). Six plaies superficielles seront faites au niveau de la zone thoracique de chaque animal. Les plaies seront des incisions linéaires, verticales, 3 à gauche et 3 à droite d'au moins 8 cm de longueur.La durée d'intervention sera inferieure à une heure par animal. La manipulation des animaux et la réalisation des plaies seront faites par un personnel expérimenté et formé conformément à la réglementation en vigueur. En cas de douleur suite à la réalisation des plaies, lors du réveil des animaux suite à l'anesthésie générale, il sera possible d'administrer de la Buprénorphine (0.1 mg/kg) en intra musculaire toutes les 6 à 8 h si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont les problèmes de cicatrisation. Apparition d'hématome, ou infection au niveau de la plaie.

Devenir

A la fin de cette procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les site d'application pour l'analyse des tissus

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire une réponse à l'inflammation ou un processus de cicatrisation au niveau d'une plaie, il est indispensable de recourir à l'animal entier. L'animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Six animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal d'animaux requis par les textes reglementaires pour avoir des résultats interprétables et significatifs.

Raffinement

Les animaux seront hégergés individuellement à partir de l'acclimatation jusqu'à la fin de la phase animale. Cet hébergement en individuel est nécéssaire pendant l'acclimatation à cause du risque de bagarre car il faut éviter le contact entre les animaux (chevauchement) ce qui pourrait fausser les résultats de l'étude. Une attention particulière sera portée aux animaux pour avoir un enrichissement du milieu adapté pour éviter l'ennui: contact visuel et olfactif entre congénères, surface suffisante de l'hébergement, présence de jouets... Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place permettant l'observation générale des animaux.

Choix des espèces

La réponse de l'inflammation et le processus de cicatrisation entre l'espèce porcine et humaine sont trés proche et quasi similaire. Espèce de choix pour ce type d'étude. Jeune adulte Entre 8 -10 semaines Poids entre 20-25 kilos Le collagène dermique et le contenu élastique de la peau du porc sont équivalents à l’homme.

24 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de deux tumeurs sous la peau, une injection intraveineuse d'une sonde fluorescente et une injection intratumorale d'un candidat médicament anticancéreux ciblant le récepteur TLR3, suivies de séances d'imagerie sous anesthésie à 24, 48 et 72 heures. Le porteur affirme avoir déjà vérifié l'absence de toxicité et l'efficacité aux mêmes doses, et présente l'étude comme une preuve de concept destinée à préparer un essai clinique chez l'homme. Sur le remplacement, il conclut que "seul un modèle animal" permet d'observer l'apoptose dans un "organisme" complet.

Objectifs

=> RATIONNEL : Le TLR3 est un récepteur de l'immunité permettant au corps de se protéger des infections virales. Le concept du TLR3 comme cible anticancéreuse existe depuis près de 30 ans, même si son mécanisme exact n’est connu que depuis peu. L’activation de ce récepteur entraine une mort programmée, appelée apoptose, spécifique des cellules cancéreuses (pas des cellules normales), ainsi qu’une inflammation locale ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes d’action induit une autovaccination à long terme contre la tumeur. Une nouvelle famille d’activateurs de ce récepteur a récemment été découverte (dont le candidat médicament de cette étude), homogène, actif, spécifique et très peu toxique. => BUT DU PROJET : L’objectif de cette étude est d’utiliser une sonde fluorescente afin de suivre le mécanisme d’apoptose cellulaire induit après administration du candidat médicament en injection locale, ainsi que sa spécificité pour les cellules tumorales exprimant le récepteur TLR3, in-vivo. Ce mécanisme sera regardé dans la souris par une analyse non invasive par imagerie de fluorescence sur tous les organes. Cette analyse quantitative au cours du temps sera effectuée grâce à un outil innovant de tomographie de fluorescence. Pour analyser la spécificité de l’apoptose des cellules tumorale exprimant le TLR3 (et non sur les organes ou tissus sains), induite par le candidat médicament, ce dernier sera injecté dans deux tumeurs (flanc-droit / flanc-gauche), avec les modèles exprimant le TLR3 sur un flanc et celui ne l’exprimant pas sur le flanc opposé. Chacune de ces tumeurs sera traitée par injection locale du candidat médicament à des doses connues comme efficaces dans ces modèles. Une injection a temps unique du candidat médicament sera effectuée, afin de suivre ses effets dans le temps. La sonde fluorescente marquant spécifiquement les cellules apoptotiques sera utilisée par injection intraveineuse 2h avant le premier point de cinétique, pour un signal durant jusqu’à 3 jours post-injection. Les analyses de fluorescence quantitatives sur l'ensemble du corps de l'animal (en 3D), seront effectuées sur animaux vivants sous anesthésie gazeuse respectivement à 24h, 48h et 72h après traitement. Afin de dissocier l’effet d'inflammation de l’effet d’apoptose induit par le candidat médicament, les souris utilisées ne posséderont pas de système immunitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude, comprenant une seule procédure, permettra de déterminer le mécanisme d’action d’apoptose spécifique des tissus cancéreux du candidat médicament dans un modèle physiologique complet et d’en apprécier la spécificité par rapport aux organes et tissus sains. Il s’agit d’une étude de recherche translationnelle, de preuve de concept et prospective, permettant de poser les bases d’une étude clinique (dans des conditions d’injection locales), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Procédures

Trois injections sont prévues dans cette expérience : 1/ La greffe tumorale bilatérale sous-cutanée (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris 2/ L’injection de la sonde fluorescente en intraveineuse (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. 3/ Le traitement en injection intratumorale et sous-cutané péri-tumorale (sous anesthésie gazeuse) – env 5 minutes par souris. A ceci, s’ajoute l’analyse de la fluorescence sur l'ensemble des organes et tissus des souris, qui est un acte non invasif et non douloureux, mais qui nécessite cependant l’immobilité complète de l’animal par une anesthésie sous isoflurane et une contention empêchant tout mouvement.

Impact sur les animaux

# Des effets indésirables pour les animaux pourraient venir des modèles ou des traitements en eux-mêmes => L'absence de toxicité et l’efficacité du candidat médicament ont déjà été analysée sur ces mêmes modèles aux doses utilisées dans cette expérience avec d’excellents résultats. # Les actes d’injection (sonde fluorescente et candidat médicament) induisent une douleur ainsi qu’un stress => une anesthésie gazeuse sera effectuée lors de ces actes. # L’analyse de fluorescence n’est pas un acte douloureux, cependant il nécessite l’immobilité complète de l’animalsous anesthésie gazeuse et une contention empêchant tout mouvement. # La croissance tumorale (pouvant durer env 2 à 3 semaines) peut induire de nombreux effets indésirables (nécrose, perte de poids, mobilité réduite, stress, comportement anormal…). => ici les tumeurs seront analysées à une très faible taille, ce qui devrait limiter la majorité de ces effets indésirables. Cependant, une grille de score basée sur nos expériences précédentes nous permettra d’anticiper toute souffrance des animaux. De plus, la moindre plaie interférant avec les mesures de fluorescence, aucune souris ayant des plaies ou signes de nécroses ne sera incluse dans ces expériences.

Devenir

Tous les animaux ne pouvant pas rentrer en analyse (absence de croissance tumorale, présence de plaies interférant avec l’analyse ou autre critère éthique), seront mis à mort. Tous les animaux analysés seront mis à mort après la dernière analyse. En effet, aucun de ces animaux ne pourra être réutilisé. Cette mise à mort s’effectuera par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Remplacement

Seul un modèle animal permettra d’analyser des phénomènes d’apoptose indésirables au niveau des organes et tissus sains. Les preuves de concept in-vitro et ex-vivo de ce mécanisme d’action ont déjà été effectuées avec succès. A présent, un modèle préclinique complexe et physiologique est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique « first in human » (dans des conditions d’injection locale), et de déterminer les meilleurs biomarqueurs d’engagement de la cible ainsi que d’en définir une première approche qualitative et cinétique.

Réduction

Cette étude est menée dans un but prospectif. Ainsi l’utilisation de 5 souris par groupe et par modèle est considérée comme suffisant pour une validation de preuve de concept. Il est à noter que la greffe des deux tumeurs différentes (sur les deux flancs de la même souris), permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires à cette étude sans compromettre les résultats scientifiques. Cette expérience s’effectue sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps par des techniques douces d’imagerie, ce qui évite d’avoir à procéder à des actes chirurgicaux lourds ainsi qu’à des mises à mort de grands nombres d’animaux par des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soit une réduction du nombre des animaux pour répondre à la question posée.

Raffinement

La mise en place d’une grille de score et d’une fréquence de surveillance des animaux adaptée à l’étude, permettra d'éviter toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera effectuée deux fois par semaine avec une analyse scorée du comportement animal, du poids corporel et du volume tumoral. Les souris seront greffées sur chaque flanc en injection sous anesthésie gazeuse. Il est à noter que les deux modèles de tumeurs ont des comportements et temps de croissance très similaire. La très petite taille des tumeurs attendue dans cette étude devrait permettre à la fois une bonne analyse de la fluorescence ainsi qu’une souffrance et une gêne physique minimale pour l’animal. Cette expérience s’effectue par imagerie de fluorescence sur souris vivantes avec des analyses au cours du temps, ce qui évite d’avoir à procéder à de nombreux actes chirurgicaux et mises à mort d’animaux, avec des méthodes conventionnelles. Elle constitue en soi un Raffinement des méthodes pour répondre à la question posée. L’imagerie par fluorescence est une analyse « douce », non invasive et non douloureuse mais nécessitant l’immobilité de la souris pendant l’acquisition des données. Pour réaliser une analyse, l'animal est donc placé sous anesthésie gazeuse et est ensuite placé dans une cassette de contention pour éviter tout mouvement. Cette dernière est ensuite glissée dans la chambre noire de l’appareil. L’acquisition dure environ 5 minutes. De l’air chauffé circule dans l’appareil et permet de maintenir la température de l’animal. Ce temps court d’analyse, permet à l’animal une récupération rapide et autorise de répéter les acquisitions selon la cinétique décidée. Les animaux sont ensuite placés sur un plateau chauffant avec une lumière chauffante pour qu'ils se réveillent rapidement dans de bonnes conditions.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques permettant de démontrer dans un modèle vivant que les organes et/ou tissus normaux ne sont pas touchés par ces mécanismes d’action pouvant induire une toxicité du candidat médicament. En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé. Qui plus est, il existe aussi de nombreux outils (souris sans système immunitaire, appareillage de fluorescence adapté...), qui permettent d'étudier précisément les différents mécanismes d’action de thérapies chez cette espèce. Une souche de souris sans système immunitaire sera utilisée pour analyser uniquement l’effet d’apoptose indépendamment des mécanismes du candidat médicament sur le système immunitaire qui pourraient interférer. De plus, s'agissant d'une souche de souris sans poils, l'acquisition de fluorescence s'en trouvera facilitée. Des souris sans système immunitaire de 7 semaines seront utilisées. A cet âge, les souris sont physiologiquement adultes (ce qui est nécessaire dans notre étude en terme d’assimilation, maturation des organes...) etc.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont inoculées avec une bactérie transmise par les tiques, Rickettsia helvetica, par deux voies et trois doses, puis subissent des prélèvements de sang répétés à la mandibule ou à l'œil, pour évaluer le pouvoir infectieux de ce germe et repérer les organes cibles. Le porteur indique n'attendre "pas de symptômes importants" car la bactérie est rarement isolée chez l'animal ou l'humain, ce qui interroge l'ampleur du recours à l'infection. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle in vitro alternatif" pour tester ce pouvoir infectieux.

Objectifs

Notre projet a pour pour objectif d'évaluer le pouvoir infectieux chez la souris de Rickettsia helvetica, une bactérie très présente chez les tiques et transmise à l'Homme et les animaux (dont la souris), mais pourtant rarement isolée dans le tissu de l'Homme et des animaux. Pour cela deux types de souris seront infectées avec trois doses différentes et deux voies d'injection (sous cutanée et intra péritonéale) afin d'évaluer : - les symptômes (s'il y en a) observables suite à l'infection et les organes infectés par la bactérie - la dose infectieuse minimale nécessaire à l'infection chez la souris - la cinétique de multiplication de cette bactérie dans le sang des souris

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le cycle épidémiologique de la bactérie Rickettsia helvetica et notamment l'implication potentielle des rongeurs (ici modèle souris) dans ce cycle dans la nature

Procédures

A J0 les animaux seront inoculés avec différentes doses de bactéries selon deux voies d'injection (Intrapéritonéale ou sous cutanée), puis tous les 2 jours entre J4 et J12, ils subiront une prise de 10µl de sang par prélèvement à la mandibule ou à l'oeil (sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Nous ne connaissons pas le pouvoir pathogène de cette bactérie sur les souris, cependant cette bactérie semble très peu infectieuse chez l'animal et chez l'homme puisqu'il a été jusqu'à présent quasiment impossible de l'isoler d'un animal ou d'un homme. Elle a pour le moment seulement été isolée de tiques prélevées dans la nature. Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (J14) afin de pouvoir détecter la bactérie dans les différents organes et le sang des animaux et donc connaitre les organes cibles qui sont préférentiellement infectés par cette bactérie chez les souris.

Remplacement

La culture des Rickettsia est effectuée en culture in vitro de cellules de mammifères. Cependant, il n'existe pas de modèle in vitro alternatif permettant de tester le pouvoir infectieux de cette bactérie. Le modèle in vivo souris ne peut donc être remplacé dans cette expérimentation.

Réduction

Le nombre de souris utilisé par lot contrôle a été réduit de moitié (3 au lieu de 6) afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé. Les lots de 6 souris pour les lots infectieux sont le minimum d'animaux permettant d'obtenir des résultats scientifiquement robustes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par lot dans leur conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris).

Choix des espèces

Dans la nature et en laboratoire, les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par différentes espèces de Rickettsia. En effet les micromammifères sont souvent impliqués dans les cycles de transmission naturels de ces agents pathogènes. Pour la Rickettsia qui nous intéresse des rongeurs sauvages ont été retrouvés positifs en test PCR mais nous ne connaissons pas leur réelle implication dans le cycle épidémiologique de cette bactérie. Les souris représentent donc le modèle idéal à tester en laboratoire pour palier à ce manque d'information.