Autre recherche fondamentale

600 rongeurs, 480 souris et 120 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 420 tués à l'issue et 180 réutilisés. Ils reçoivent plusieurs injections d'un immunogène émulsionné avec l'adjuvant de Freund, puis un rappel sous anesthésie, avant d'être tués pour prélever leur rate et récupérer les anticorps. Le porteur indique que les bons répondeurs sont tués tandis que les mauvais répondeurs sont tués ou versés à un programme de formation. Il affirme le recours aux rongeurs "indispensable" et le prélèvement d'organes possible seulement sur un "organisme entier".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps monoclonaux ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps monoclonaux soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après immunisation de l’animal, l’objectif est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’ajout d’une drogue immunosuppressive. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Les immunisations seront réalisées par voie intrapéritonéale dans un premier temps et par voie intrapéritonéale chez la souris ou intraveineuse chez le rat (stimulation forte des lymphocytes, qualifié de boost final). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris et le rat. Des prélèvements de sang pourront être réalisés à la veine sub-mandibulaire afin de suivre le niveau d’immunisation des souris ou la veine jugulaire chez le rat. A la fin du protocole, les prélèvements de rate et de ganglions lymphatiques seront réalisés afin de récupérer les cellules B productrices d’anticorps à la vue de la fabrication d’hybridome.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique de l’immunogène injecté à l’animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules B productrices d’anticorps (spécifiques de l’immunogène) pour générer des lignées monoclonales d’hybridomes sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

Pour la génération d’anticorps monoclonaux chez la souris BALB/c ou le rat Wistar, nous effectuerons deux à trois injections par voie intrapéritonéale (i.p.) à quinze jours d’intervalle puis un rappel par voie intrapéritonéale et par voie intraveineuse, trois jours avant la mise à mort. Les administrations i.p. (5-10 ml/kg) sont réalisées sur animaux vigiles en contention. Lors de la première i.p., le liquide injecté contient l’immunogène émulsionné volume à volume avec (ou sans) de l’adjuvant complet de Freund. Les injections suivantes se déroulent de la même façon mais en présence (ou non selon la nature de l’immunogène) d’adjuvant incomplet de Freund. Quinze jours plus tard, le « boost » final est réalisé par voie intrapéritonéale (ou intraveineuse chez le rat). Ce dernier est réalisé via la veine pénienne sous anesthésie gazeuse. Pour ce rappel, l’immunogène est repris uniquement dans du tampon PBS dans un volume final de 0,1mL/animal. Trois jours plus tard, les animaux seront mis à mort et la rate sera prélevée stérilement. Les ganglions lymphatiques pourront également être récupérés. Une phase dite de « tolérisation » où le système immunitaire de l’animal sera rendu tolérant pour les antigènes « non-d’intérêt » pourra être réalisée par l’administration d’une drogue immunosuppressive. Deux à quatre injections ip seraient réalisées à 14 jours d'intervalle (soit 4 injections sur 42 jours au maximum), trois jours avant le début du protocole de l'immunisation décrit ci-dessus. Chez la souris, des prélèvements de sang via la veine mandibulaire permettront de tester la présence d’anticorps spécifiques dans le sérum. Le prélèvement sera réalisé sur souris vigiles. Un prélèvement sera réalisé un jour avant l’immunisation (basal) puis 7 jours après la deuxième immunisation et 7 jours après la troisième immunisation s’il y en a une. Le volume maximal prélevé est de 0,5 mL de sang total. Chez le rat, les prélèvements se feront au même timing par ponction de la veine jugulaire au travers du muscle pectoral sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4% pour l’induction puis maintien à 2% avec un mélange 50% air / 50% O2). Le volume maximal prélevé est de 1 ml. Un prélèvement terminal de sang pourrait être demandé par le sponsor. Dans ce cas, l’animal sera anesthésié comme indiqué ci-dessus, et un volume de 1 ml pour la souris et 4ml pour le rat serait prélevé. L’animal serait ensuite mis à mort.

Impact sur les animaux

Les points limites ont été fixés sur la base de l’évaluation de signes caractéristiques de la douleur mais aucune mortalité et souffrance n’est attendue dans ce projet (Raffinement). Une grille d’évaluation clinique avec établissement d’un score sera utilisée et des mesures adaptées seront prises pour réduire ou supprimer la douleur des animaux en fonction de ce score.

Devenir

Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une bonne réponse immunitaire seront sélectionnés. Ces animaux seront mis à mort afin de pélever leur rate pour récupérer les anticorps monoclonaux. Après analyse des échantillons de sang par nos sponsors, les animaux montrant une mauvaise réponse immunitaire ne seront pas sélectionnés. Ces animaux seront soit mis à mort ou gardés en vie pour être réhabilité dans un programme de formation.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps monoclonaux contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules excrétrices d’anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été déterminé par un calcul de N = 10 animaux par série expérimentale. Ce nombre est suffisant pour générer les anticorps par la technique d’hybridomes.

Raffinement

L'acclimatation des animaux durera au minimum 5 jours. À réception, les souris seront collectivement hébergées (au minimum 3 souris par cage selon le poids) dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. Les rats seront hébergés par deux dans des cages dédiées de dimensions conformes aux recommandations en vigueur. L'eau et la nourriture (RM1, SDS Dietex, ou équivalent) seront données ad libitum. Les animaux auront accès à différents types d’enrichissements, changés de manière hebdomadaire afin d’éviter une éventuelle lassitude ou habituation (maison, coton, cubes de bois, rouleaux de carton, papier kraft). Les conditions d’hébergement et le bon état de santé́ des animaux seront contrôlés quotidiennement. Bien que aucune douleur ne soit attendue si les animaux venaient à présenter des signes de souffrance, des administrations de buprénophine seront réalisées jusqu'aux prélèvements terminaux. La buprénorphine serait administrée par voie sous cutanée, BID, à 0,01 mg/kg pour le rat et 0,05 mg/kg pour la souris. Pour les injections i.v., une anesthésie gazeuse à l'isoflurane sera utilisée.

Choix des espèces

Pour de nouvelles cibles antigéniques, l’utilisation d’animaux pour l’immunisation et la génération d’hybridomes reste nécessaire car aucun modèle in silico (modèle mathématique, analyse bio-informatique) ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d’un antigène. Les nouveaux modèles de génération d’anticorps monoclonaux (utilisation de souris transgéniques « xenomouse » produisant des anticorps humains ou immunisation in vitro de lymphocytes B de souris) ne permettent pas de s’affranchir également de l’utilisation des animaux. La maturité sexuelle des souris et des rats se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes d’immunisation. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite. Les souris BALB/c ou les rats Wistar seront donc âgées de 8 à 10 semaines lors du démarrage du protocole d’immunisation.

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

11 lapins vont être utilisé·es, gardés en vie en vue d'une adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale pour accéder au foie, puis une seconde intervention de prélèvement, l'ensemble pouvant durer jusqu'à une heure et demie, pour tester un pansement hémostatique à base d'alginate. Le porteur décrit l'accès au foie comme une "chirurgie lourde pour le lapin" et prévoit une euthanasie sous anesthésie en cas de complications, les autres animaux étant maintenus en vie. Il présente ce dispositif comme un futur pansement résorbable pour la chirurgie.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables non naturels sont utilisés comme traitement adjuvant. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate d’un pansement tissé, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches à différents temps post-opératoire. Il y aura 3 groupes de 3 lapins qui seront opérés (chirurgie d’implantation). Et à J+2 semaines, J+1 mois et J+3mois post-opératoire, nous opérons les lapins pour faire un prélèvement histologique de la zone d’intérêt (chirurgie d’exérèse). Si les conditions le permettent, les animaux ne seront pas systématiquement mis à mort au moment de la chirurgie d’exérèse afin de pouvoir être mis à l’adoption. Nous prévoyons 2 lapins supplémentaires en cas d’un décès lors de la chirurgie ou à cause d’une mise à mort liée à un point limite. Ce projet portera sur 11 lapins au total. Pour ce faire, il sera réalisé une série de lésions calibrées sur le foie du lapin, suivie de l'application d'une quantité prédéfinie de produit. L'évaluation de l'arrêt du saignement est faite selon la grille de score d'ADAM. En cas de reprise de saignement, le chirurgien fera une cautérisation avec le bistouri électrique (pince bipolaire) ou posera des points de suture. La biocompatibilité du pansement tissé a été testé en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’implantation pour permettre l’accès au foie tout en préservant les autres organes digestifs dans la cavité abdominale et une seconde chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement de tissu. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutanée). L’animal aura une à deux interventions chirurgicales. La chirurgie d’exérèse ne sera faite que si la zone d’implantation ne présente pas trop d’adhérences qui compromettraient l’état de récupération de l’animal. L’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie et sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle.

Impact sur les animaux

L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord chirurgical restreint dans la région sous costal plutôt qu’un abord abdominal plus vulnérant pour l’animal. L’abord abdominal nécessite une incision de grande longueur pour pouvoir placer les écarteurs et accéder au foie. De plus, lors de cette approche, le risque de faire une incision sur le coecum est important étant donné sa grande taille et la mise en évidence des viscères aurait accélérée la perte de chaleur et le desséchement de ces derniers, ce qui auraient entrainé plus de complications à gérer en post-opératoire. L’abord sous costal limite la taille de l’incision et nous ne touchons pas les viscères et ni le coecum. Cette approche permet de garder au chaud les organes et limite leur desséchement.

Devenir

La mise à mort des animaux sera décidée lors de la chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement histologique. Si nous observons trop de complications qui met l’animal dans une balance bénéfice/dommage en sa défaveur, alors l’animal sera euthanasié encore sous anesthésie générale. Dans le cas contraire, il sera maintenu en vie pour une adoption.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance et de suivre sa résorption sur un tissu lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique tissé permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire en cours de chirurgie. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 lapins/groupe = 3*3 =9), et il est prévu 2 animaux supplémentaires pour compléter l’un des groupes si nécessaires. Le nombre/groupe a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. En tant donné que c’est une preuve de concept, nous avons besoin de 3 animaux maximum par groupe pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères. Le lapin est un animal qui stresse très facilement et qui a besoin de temps pour s’habituer à son nouvel environnement et aux personnes. La veille de la chirurgie, l’animal sera injecté avec un analgésique (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Une anesthésie locale sera mise en place. En fin de chirurgie, après nettoyage de la peau avec du sérum physiologique et une application d’un gel anesthésique sur les berges permettra d’apporter une anesthésie locale. L’animal sera habillé d’un pyjama pour protéger la cicatrice. Un renfort de protection (une compresse et coton cardé) réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaires seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. La présence quotidienne du vétérinaire et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet evite toute souffrance, douleur ou stress inutiles. Le transfert des animaux vers la structure d’hébergement sera fait dans les boites de transport propres à chaque animal dans un véhicule adapté.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, plus gros qu’un rat et moins gros qu’un cochon, mais assez gros pour avoir accès à un foie dont la taille peut supporter les biopsie punch de 5 mm de diamètre (3 à 4) prévues et l’implantation du produit hémostatique pour obtenir un effet pharmacologique (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg environ pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

864 souris dites humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines, des prélèvements de moelle osseuse et de sang sous anesthésie, des injections répétées et un gavage, puis une irradiation qui provoque une anémie d'une dizaine de jours, pour tester une molécule censée limiter les dommages sanguins des rayonnements. Les retombées annoncées, augmenter la survie de patients exposés à des doses aiguës d'irradiation, restent au conditionnel et à long terme. Le porteur affirme que le projet n'a "pas d'alternative non animale" et qualifie l'étape in vivo d'"indispensable", ces souris immunodéficientes étant présentées comme les "outils de référence" du développement sanguin humain.

Objectifs

Les chimiothérapies et radiothérapies peuvent altérer la production des cellules sanguines et immunitaires par la moelle osseuse (appelé myelosuppression). Les recherches menées depuis 2013, par une partenaire, portent sur le développement d'une molécule X1 pour l'indication de la myélosuppression induite par la chimiothérapie et par irradiation. Notre projet se base sur des données préliminaires, qui démontrent un effet positif de X1, en combinaison avec des facteurs stimulant la formation de cellules impliquées dans l'immunité anti-bactérienne et virale et dans la formation de plaquettes sanguines, améliorant ainsi la survie des animaux traités après une myélosuppression induite par irradiation. Le présent projet vise à valider si le traitement par X1 peut améliorer la récupération fonctionnelle des cellules sanguines humaines après irradiation. Cette étude nécessite d’explorer les effets de l’irradiation par des études d’efficacité sur des rongeurs dits "humanisés" (souris ayant reçu une greffe des cellules humaines) traités ou non avec X1. Ces modèles murins sont les seuls à l'heure actuelle à récapituler le développement sanguin normal humain. Notre projet a plusieurs objectifs: L'Objectif 1 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans laquelle nous allons mesurer l’effet de X1, seul ou combiné aux facteurs décrits plus haut, sur l’atténuation de la toxicité des radiations sur les cellules sanguines humaines lorsque X1 est donné à partir de 2 heures après irradiation aux souris humanisées. L'Objectif 2 consiste en l'étude thérapeutique de X1 dans une moelle osseuse humaine. Dans cet objectif, nous testerons l’efficacité de X1 comme dans l'objectif 1, mais cette fois dans des souris portant une niche de moelle osseuse humanisée contenant une production sanguine humaine active. L'Objectif 3 consiste en l'étude prophylaxique de X1 dans laquelle nous étudierons si X1 peut aussi être utilisé pour atténuer la toxicité des radiations sur les cellules hématopoïétiques humaines dans les modèles de souris humanisées en apportant X1 avant l'irradiation. Cette étude permettra de prédire au mieux la réponse sanguine humaine à ce nouvel agent thérapeutique.

Bénéfices attendus

1-Atténuation de la myélosuppression et des séquelles associées (infections, hémorragies) chez les patients à des doses myélosuppressives de irradiation aiguë. Par conséquent, augmenter la survie des patients exposés de manière aiguë à des doses de irradiation (syndrome aiguë de rayonnement). 2-Augmenter la survie des patients exposés de manière aigüe à des doses myélosuppressives d’irradiation. Les cytokines aident à la récupération des lignées granulocytaire et macrophagique, mais sont sources d’effets indésirables graves. De plus, elles sont très couteuses à produire. Il y a donc un besoin de développement de nouvelles contre-mesures médicales. Celles-ci devront se caractériser par leur efficacité à améliorer les séquelles post-myelosuppression induite par une irradiation, par une atténuation complémentaire ou plus large de la myélosuppression associée. Ces nouvelles contre mesures devront également avoir un profil d'innocuité et de tolérabilité, un stockage facile et pouvoir être administrées rapidement dans un scénario de pertes massives. X1 est une bio-molécule administrée par voie orale. Elle a été initialement développée pour le traitement des infections virales respiratoires et de la neutropénie induite par la chimiothérapie. Son utilisation est justifiée en tant qu'agent de radioatténuation pour le syndrome hématopoïétique d’irradiation. En effet, les lésions induites par la chimiothérapie et la radiothérapie ont des voies communes qui entraînent une myélosuppression aigüe et des lésions résiduelles de la moelle osseuse. La gravité des lésions des organes dépend de la dose de rayonnement et de la durée d'exposition. Les lésions par rayonnement sensibilisent les organes et les cellules cibles entraînant le syndrome d'irradiation aigüe (ARS). Ces dommages multiples nécessiteront probablement plus d'une seule thérapie pour atténuer et améliorer la récupération. Par conséquent, une approche polypharmaceutique est justifiée, en particulier lorsque les sujets sont exposés à des doses plus élevées d’irradiations aiguës.

Procédures

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation de cellules souches et de progéniteurs humains du sang. Ces deux actes, d’une durée inférieure à 2 minutes chacun seront réalisés sous anesthésie générale sur un tapis chauffant. Nous utiliserons du gel ophtalmique pour prévenir le déssèchement des yeux. Pour l’injection des molécules, via 2 actes en sous-cutané et un acte en intrapéritonéale, ils se feront sur animal vigile, une fois et pendant 4 semaines pour l’hormone parathyroïdienne. Cet acte prendra 1 minute. Il y aura un acte de gavage durant 4 jours sur animal vigile prenant une minute. Suite à ces prélèvements et injections/gavages, il sera ajouté de l’hydrogel et des cupules de nourritures enrichies dans les cages afin d’aider les animaux à récupérer. Les souris seront irradiées en 1 fois pendant une période d'environ 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous aurons recours à un prélèvement de sang et de moelle osseuse, 3 mois après transplantation des cellules souches/progénitrices humaines du sang, pour vérifier que nos souris sont bien humanisées ce qui induira une douleur pour les souris. L’irradiation utilisée dans ce projet est subléthale mais provoque une anémie qui dure une dizaine de jours. Les souris recevront la molécule X1 par voie orale pendant 30 jours, dans le protocole thérapeutique. Le traitement en lui-même n’induit pas d’effet secondaire notable selon les expériences préliminaires réalisées par la compagnie qui produit X1. Les souris recevront transitoirement plusieurs injections de facteurs de croissance/hormonaux ce qui induit un risque d'inflammation locale temporaire ou des douleurs osseuses à courte durée.

Devenir

Afin de mesurer la récupération en cellules sanguines humaines après traitement, nous devons euthanasier les souris. Des organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) sont prélevés et les cellules qui y sont contenues sont soumises à une caractérisation cellulaire et à des tests fonctionnels in vitro. Ces protocoles sont importants pour pouvoir juger de la réussite ou pas du traitement effectué après ou avant l'irradiation.

Remplacement

Ce projet n'a pas d'alternative non animale. Nous allons réaliser des expériences in vitro en parallèle, mais ces tests ne récapituleront jamais l'hétérogénéité organique des réponses in vivo, étape indispensable pour l’évaluation des effets potentiels de radio-atténuation de X1 (seul ou combiné) pour le syndrome hématopoïétique aigue lié aux radiations. En effet, notre projet nécessite une étape indispensable in vivo afin d'étudier les effets de X1 en suivant la récupération et la production hématopoïétique humaine dans un modèle préclinique capable de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme. Nous utiliserons des souris sans système immunitaire qui représentent les outils de référence internationaux pour l’analyse fonctionnelle du développement sanguin humain d'après la littérature scientifique. Ces souris immunodéficientes sont appelées souris NSG; elles combinent une série de mutations génétiques qui altèrent leur système immunitaire dans sa globalité, les rendant aptes à ne pas rejeter les xénogreffes de cellules humaines d'origine sanguine.

Réduction

Nous avons à coeur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Pour celà, lorsque les effets de différents traitements seront testés en utilisant la même procédure expérimentale, les expériences seront combinées et réalisées en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle (qu'il est inévitable de faire pour que le résultat soit validé). Aussi, nous avons choisi de réaliser des expériences préliminaires (objectif 1) de choisir une dose d'irradiation et une seule souche de souris, pour réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux impliqués dans la réalisation des différents objectifs du projet seront surveillés régulièrement par l'expérimentateur et les animaliers afin de détecter toutes modifications comportementales et éviter autant que possible les souffrances, douleurs et angoisses inutiles. Afin d’améliorer le bien-être des souris, vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement sur la litière en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de moelle osseuse réalisé pour mesurer le niveau de reconstitution du système sanguin humain avant irradiation et traitement avec X1. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale

Choix des espèces

La souris domestique Mus Musculus est un mammifère de petite taille à l'âge adulte qui peut être facilement élevé et reproduit en captivité. De plus, la génétique et le comportement de cette souris étant parfaitement connus, cela permet de mesurer très facilement le bien-être, la souffrance et l'angoisse des animaux élevés en captivité et de pouvoir y remédier le cas échéant ; ce qui en fait un très bon modèle pour atteindre les objectifs scientifiques du projet proposé. Enfin, la souris reproduit de nombreux mécanismes fondamentaux existant chez l'homme ; les résultats des expériences réalisées chez la souris pourraient à terme améliorer l'étude des pathologies humaines ainsi que leurs thérapeutiques. Nous utilisons plus particulièrement un modèle de souris dépourvu de système immunitaire fonctionnel permettant les études sur le développement des cellules sanguines humaines normales et pathologiques.