Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Influence de l’arasement des barrages en rivière sur l’histoire de vie de poissons migrateurs: cas de l’Anguille et du Flet
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
740 poissons, anguilles et flets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la majorité des anguilles étant relâchée après mesures et 140 individus tués. Capturés en rivière et en estuaire, ils sont anesthésiés pour une biométrie, puis 70 anguilles et 70 flets sont tués afin d'analyser leurs otolithes et leurs parasites, pour évaluer les effets de l'arasement de deux barrages sur ces poissons migrateurs. Le porteur indique que la capture et la manipulation stressent les poissons et que l'anesthésie peut perturber leur comportement. Il affirme qu'aucune modélisation ne peut prédire ces réponses et que le prélèvement en milieu naturel est "indispensable", alors que l'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser les réponses biologiques des poissons migrateurs aux modifications des conditions environnementales suite à l’arasement de deux barrages majeurs sur un bassin versant côtier. Les poissons migrateurs amphihalins, qui réalisent une migration entre milieux marins et milieux continentaux à des stades précis et sensibles de leurs stades de vie, sont particulièrement vulnérables à la présence de barrages qui empêchent la migration. L’Anguille d’Europe (Anguilla anguilla) et le Flet (Platichthys flesus) sont deux espèces amphihalines (reproduction en mer, croissance en eau douce), avec des répartitions spatiales différentes en rivière. Ces deux espèces apportent donc des informations complémentaires en permettant de caractériser les effets du démantèlement des barrages sur l’ensemble du bassin versant (cas de l’Anguille) et sur les zones en aval des ouvrages (cas du Flet). L’effacement des barrages est une occasion unique d’explorer les effets sur la variabilité des traits biologiques des individus (âge, taux de croissance, habitats utilisés, position trophique, parasitisme…). La caractérisation de ces évolutions au cours du processus de recolonisation est un enjeu important pour constituer un retour d’expérience solide permettant d’anticiper les conséquences de futures actions d’arasement de barrages. Les objectifs opérationnels de 2019 à 2022 étaient de finaliser l’état de référence pré-arasement. Les travaux d’arasement (finalisés en 2022) facilitent désormais le déplacement des espèces aquatiques migratrices en l’absence de ces ouvrages. Il s’agit donc d’obtenir des données post-arasement sur ces deux espèces piscicoles en suivant les mêmes protocoles que précédemment. L’euthanasie de certains des poissons est nécessaire à l’étude des traits biologique des anguilles et des flets.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique, conduit depuis 2012, a pour objectif de fournir un retour d’expérience sur l’effacement des barrages de rivières côtières. Afin de suivre les effets de cette opération de restauration, un suivi environnemental sur le long terme a été mis en place avant, pendant et après le démantèlement. L’objectif est de caractériser la démographie et l’expansion des populations des poissons migrateurs et la modification de leurs traits biologiques. La présente demande vise à poursuivre ces suivis sur la période post-effacement (phase de restauration de la vallée) au cours de laquelle de nombreux changements biologiques sont attendus. L’arasement des barrages devrait fortement modifier la répartition des anguilles et diminuer la compétition intra-spécifique, avec des effets sur la croissance, l’âge et la taille des anguilles en migration qui rejoignent la mer pour se reproduire. De plus, il est probable que la diminution de la densité à l’aval du barrage et l’accès aux zones amont induise une évolution du sexe ratio des géniteurs et une modification des caractères biologiques (ex. taux de croissance, âge de migration). La modification des écoulements de la rivière devait également modifier les habitats de la zone estuarienne avec des conséquences probables sur la croissance et la survie des juvéniles de flets. Cette étude fournit donc des informations précieuses pour la gestion des poissons migrateurs, notamment des anguilles dont la population est actuellement classée en danger critique d’extinction.
Procédures
Les anguilles seront capturées en rivière, puis anesthésiées pour être placées dans une gouttière spéciale où le poisson est maintenu sur le dos afin de réaliser des mesures (taille, poids) et de décrire l’état sanitaire externe (présence de lésions, parasites…). Cette opération prend environ une minute. L’individu est ensuite placé dans un vivier de réveil avant d’être remis à l’eau au maximum 60 minutes après le début des manipulations. Durant l’ensemble du projet, un maximum de 600 anguilles seront anesthésiées, puis relâchées en milieu naturel sur le site de capture. Les flets seront capturés dans la partie estuarienne de la rivière. Ils seront capturés au nombre de 35 individus par an, soit 70 au total durant le projet. Ces individus seront anesthésiés, puis euthanasiés. Au total, un sous-échantillon de 70 anguilles et de 70 flets seront euthanasiés afin de caractériser les caractères biologiques des individus (âge, taux de croissance, habitats utilisés, position trophique, parasitisme…). L’euthanasie de ces individus est indispensable pour estimer l’âge à partir des otolithes (pièce calcifiée de l’oreille interne des poissons) et décrire la présence de parasites internes.
Impact sur les animaux
La capture, la rétention et la manipulation pour effectuer la biométrie des individus pourra occasionner du stress pour les poissons. L’anesthésie peut vraisemblablement créer des perturbations du comportement de certains individus. Afin de limiter ce stress, le nombre de poissons dans le bain d’anesthésiant ne dépassera 5 individus de manière simultanée, voire moins dans le cas de gros individus afin de ne pas dépasser 5% du volume. Si les individus ne sont pas endormis après 10 minutes de balnéation, la solution d’anesthésiant est renouvelée afin de palier le phénomène de dilution et d’utilisation par les individus. La transition milieu aquatique/air libre éclairé (lampe à lumière blanche) le temps de réaliser la biométrie peut également être source de perturbations pour les anguilles. En conséquence, les manipulations seront réduites au strict minimum (généralement moins d’une minute) et la tête des poissons sera recouverte par un linge humide afin de limiter l’exposition à la lumière. Durant la pêche effective, une trop grande densité d’anguilles piégées pourrait entrainer des lésions des individus dans le piège. En conséquence, le piège sera relevé toutes les deux heures et la fréquence des relèves sera augmentée (toute les heures) si le nombre de captures excède 30 individus lors d’une relève afin de limiter les surdensités d’individus.
Devenir
La majorité des anguilles capturées seront gardés en vie et relâchés dans le milieu naturel après avoir réalisé des mesures biométriques (N = 600 maximum). Un total de 70 anguilles et de 70 flets seront euthanasiés afin de caractériser les traits de vie sur deux années.
Remplacement
Cette étude vise à comprendre l’impact de l’arasement des barrages sur le fonctionnement des populations de migrateurs amphihalins. Il n’existe actuellement aucune donnée sur la modification des traits de vie de l’anguille et du flet en réponse à ce type d’action de restauration. De plus, il n‘existe aucune méthode substitutive, notamment en modélisation, car il est impossible de prédire les réponses individuelles. Les processus étudiés ne peuvent pas être simulés en laboratoire, avec des organismes de substitutions (tels que des invertébrés), en raison de la complexité du cycle de vie (migration mer-rivière à large échelle spatiale). Il est donc indispensable de prélever ces poissons dans le milieu naturel.
Réduction
Le protocole mis en place pour la pêche des anguilles en migration n’a pas pour objectif d’être exhaustif et le nombre d’individus migrants capturés ne peut être connu à l’avance. Toutefois, les deux précédentes campagnes (pré-arasement) ont permis de capturer entre 90 et 200 individus. En conséquence, le nombre d’individus anesthésiés pour réaliser les mesures biométriques devrait être compris entre 100 et 300 anguilles. Les mâles et les femelles seront capturés afin de caractériser la variabilité liée au sexe ratio dans le bassin versant. La caractérisation des traits de vie et de leurs réponses à l’arasement des barrages nécessite le sacrifice d’un nombre d’individus statistiquement suffisant des deux espèces cibles présentes dans la zone d’étude, et qui permette la comparaison avec les échantillons déjà collectés avant l’arasement du barrage. Le nombre d’individus doit être suffisant pour réaliser des analyses statistiques robustes visant à décrire la variabilité des traits observés en fonction des années et des histoires de vie (i.e. habitats utilisés). Au cours du projet, un sous-échantillon de 70 anguilles argentées sera euthanasié (de manière aléatoire et sans distinction du sexe) afin de caractériser les traits de vie sur deux années (35 individus par année). Pour les flets, l’effort d’échantillonnage sera adapté jusqu’à l’obtention du nombre requis d’individus (pas d’individus capturés en surplus). Les flets seront capturés au nombre de 35 individus par an et au stade juvénile, essentiellement né durant l’année, afin d’estimer le taux de croissance des juvéniles dans la partie aval du bassin versant. Durant l’ensemble du projet, un maximum de 600 anguilles seront anesthésiées, puis relâchées en milieu naturel sur le site de capture. Un sous-échantillon de 70 anguilles et 70 flets sera euthanasié (de manière aléatoire et sans distinction du sexe) afin de caractériser les traits de vie. Au total : 35 spécimens euthanasiés x 2 années x 2 espèces = 140 individus euthanasiés + 300 anesthésiés x 2 années (anguille seulement) = 600 individus anesthésiés
Raffinement
La capture des anguilles sera réalisée grâce à un dispositif de piégeage installé sur la rivière et relevé toutes les deux heures durant la nuit de pêche afin d’éviter des risques de mortalité, de limiter le stress et la dépense énergétique des anguilles. Si le nombre de captures excède 30 individus lors d’une relève, la fréquence des relèves sera augmentée à une heure afin de limiter les surdensités d’individus dans le piège. Les anguilles capturées seront placées en stabulation dans des bacs contenant de l’eau de la rivière oxygénée, avec utilisation de bulleurs si nécessaire (suivant la température de l’eau). Puis elles seront anesthésiées afin de réaliser les mesures biométriques convenablement (taille, poids, état sanitaire, …). La manipulation d’un individu se fera avec épuisettes et gants, sur des appareils de mesures humidifiés et sera limité au strict nécessaire du protocole (généralement moins d’une minute de manipulation). Après la biométrie, les individus non euthanasiés seront mis dans un vivier de réveil contenant de l’eau de la rivière oxygénée pour leur permettre de se réveiller tranquillement. Les poissons seront ensuite relâchés sur le site de capture (60 minutes maximum après le début de leurs manipulations) dès que tous les signes de l’anesthésie auront disparus : reprise de l’équilibre, des réflexes médullaires et d’une activité de nage volontaire. Afin de réduire au minimum le temps entre la capture et l’euthanasie des flets, les individus seront manipulés avec des gants et placés dans la solution anesthésiante, puis euthanasiés au fur et à mesure des captures.
Choix des espèces
L’utilisation d’espèces amphihalines est indispensable car il s’agit d’un des objectifs du projet de restauration de la continuité écologique. En effet, les poissons migrateurs amphihalins, qui réalisent une migration entre milieux marins et milieux continentaux, sont particulièrement vulnérables à la présence de barrages qui empêchent la migration. L’arasement des barrages apparait aujourd’hui comme une solution efficace et durable pour rétablir la continuité écologique, mais les retours d’expérience sont encore très parcellaires et nécessitent d’être documentés. L’anguille et le flet apportent des informations complémentaires et essentielles permettant de caractériser les effets du démantèlement des barrages sur l’ensemble du bassin versant (cas de l’Anguille européenne) et sur les zones en aval des ouvrages, au niveau de la zone estuarienne (cas du Flet). Les anguilles capturées pour caractériser les traits de vie seront essentiellement au stade « argenté » qui caractérise la phase de migration vers les zones de pontes (océan). Ce stade est privilégié pour l’étude car il permet de qualifier les traits et la qualité des individus produits par le bassin versant. La capture d’individus non migrants au stade « jaune » en phase sédentaire peut avoir lieu accessoirement. Ces individus au stade « jaune » seront anesthésiés et mesurés, mais aucun ne sera prélevé (euthanasié). Les flets seront capturés au stade juvénile, essentiellement nés durant l’année, afin de qualifier la fonction de nourricerie de la partie aval du bassin versant.
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Caratérisation du tropisme de vecteurs adénoviraux mutés pour leur fibre
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
248 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Elles reçoivent des injections de vecteurs adénoviraux modifiés et deux prélèvements de sang sous anesthésie, pour cartographier la répartition de ces vecteurs dans l'organisme. Le porteur n'attend qu'une fièvre légère et passagère, et annonce une mise à mort pour analyser les organes. Il affirme que les expériences in vitro déjà menées ne reproduisent pas la complexité d'un organisme vivant et juge l'utilisation d'animaux "indispensable" à ce stade.
Objectifs
Les adénovirus sont des virus infectant une variété d’hôtes dont l’homme. Ce sont à la fois des éléments pathogènes responsables d’infections léthales mais également des vecteurs pour la thérapie génique et la vaccination. Des essais cliniques utilisent également des adénovirus pour traiter les cancers. Malgré cela, le mécanisme d’entrée des Adénovirus qui peuvent être à la fois des agents pathogènes et des vecteurs thérapeutiques, n’est pas complétement connu. Dans le cas précis de l’Adénovirus humain de sérotype 3, il a été montré que l’interaction avec les cellules hôtes se fait avec un récepteur spécifique. Nous avons produit des vecteurs adénoviraux humains modifiés dans les résidus intervenant avec le récepteur spécifique. Nous avons ensuite montré par des expériences in vitro que certain de ces vecteurs ne sont plus capables d’entrer dans des cellules exprimant ce récepteur. Nos objectifs actuels sont d’évaluer la répartition dans le corps des différents vecteurs. Nous réaliserons une étude de répartition des différents vecteurs dans le corps. Nous analyserons cette distribution. Parallèlement, nous mesurerons la réponse inflammatoire, la toxicité sanguine et hépatique des différents vecteurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser distribution dans le corps de vecteurs adénoviraux modifiés au niveau d'une protéine. Il permettra de confirmer les données acquises par les études in vitro du rôle de certaines régions de la protéine adénovirale dans l’interaction avec le récepteur spécifique. Ces retombées d’ordre fondamental pourraient avoir également un impact thérapeutique en infectiologie ainsi qu’en cancérologie. En infectiologie, l’identification de régions clés de la protéine adénovirale pour la fixation sur le récepteur spécifique pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de molécules (approche pharmacologique) ciblant ces régions afin de contrôler l’infection par l’adénovirus . En cancérologie, le contrôle du tropisme des adénovirus pourrait permettre d’envisager de les rediriger vers les cellules tumorales dans des approches comme la virothérapie.
Procédures
Tous les animaux auront des injections (durée de l’injection 1 minute) sous anesthésie générale et deux prises de sang (durée 1 minute) sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures impliquent l’administration de vecteurs adénoviraux. Il n’est pas attendu de souffrance des animaux à ces étapes sous anesthésie. Après injection, certains animaux pourront éventuellement avoir une fièvre légère et de courte durée liée à l’inflammation induite par les vecteurs.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses sur organes.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier de distribution des vecteurs adénoviraux chez la souris après deux modalités d’administration . Il a pour objectif d’identifier la capacité des vecteurs à infecter les cellules de différents organes. Il est possible d’analyser les interactions des vecteurs in vitro avec différents types cellulaires. Ceci a été réalisé précédemment par l’équipe avec les vecteurs adénoviraux que nous proposons de tester dans ce projet. Cependant, ces expériences in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité tissulaire et cellulaire d’un organisme vivant tel que la souris, ni d’identifier des interactions vecteurs-cellules non attendues. L'utilisation d'animaux vivants à ce stade est donc indispensable.
Réduction
Dans toutes les expériences, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le noùbre d'animaux par groupe a été évalué en fonction de publications précédentes. Ce nombre nous permettra d’évaluer la significativité des résultats obtenus (tests statistiques). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en œuvre séquentiellement. Ainsi, la deuxième procéure ne sera mise en œuvre que si les résultats obtenus dans la première procédure sont concluants.
Raffinement
- Les souris seront maintenues en environnement enrichi. - Toutes les injections réalisées seront réalisées sous anesthésie générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale. - Les souris seront suivies tous les jours afin de suivre différents signes cliniques. - Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence pour les pathologies humaines. Nous utiliserons plus particulièrement un modèle de souris transgénique ayant un récepteur de la DSG2 humaine présent dans les mêmes organes que chez l’homme. Les animaux utilisés seront des adultes âgés de 2 à 4 mois. Ces animaux seront acclimatés dans la pièce d’expérimentation une semaine avant d'être inclus dans le protocole. La fourchette d’âge choisie permet de s’adapter aux contraintes de production (élevage de production réduit au minimum) et correspond à celle utilisée pour analyser la biodistribution de vecteurs adénoviraux.
Etude de l’insuffisance rénale chronique chez les souris Alport
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses d'une insuffisance rénale chronique d'apparition spontanée, reçoivent des traitements pharmacologiques quotidiens et subissent des passages en cage métabolique jusqu'à quatorze heures et une injection rétro-orbitaire pour mesurer la filtration rénale. Le porteur prévoit de tuer les animaux perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des signes de souffrance, seuils qu'il présente comme des points limites. Il affirme le recours à l'animal "indispensable", les mécanismes de la maladie étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie souvent associée à l’hypertension artérielle et au diabète. Si l’IRC n’est pas correctement traitée, elle peut conduire à la dialyse. L’IRC mettant en jeux plusieurs organes, la découverte de nouveaux traitements de cette maladie nécessite des études précliniques chez l'animal. Nos travaux antérieurs ont montré l’efficacité de certains traitements chez la souris diabétiques Notre objectif est de tester l’efficacité de ces traitements dans un autre modèle non-diabétique présentant un développement spontané et rapide de l’IRC .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre les mécanismes de mise en place de l'insuffisance rénale, et de proposer de nouvelles pistes de traitement.
Procédures
Les souris de 4 semaines seront soumis à des 3 séries de traitements pharmacologiques quotidiens jusqu'à 8 /10 semaines d'âge. Au cours du traitement, les souris seront soumises (1) à un suivi régulier de leur poids (1 fois par semaine), (2) à une mesure de leur composition corporelle (2 à 3 fois), (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois), (4) à une évaluation du débit de filtration glomérulaire (DFG) (1 fois, 1 semaine avant la fin du traitement. A l’issue des traitements, les souris seront euthanasiées et analysées.
Impact sur les animaux
(1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vis versa (2) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) dans ll’EchoMRI (3) à la mesure de leur diurèse (1 à 2 fois): léger stress lié au passage (14h max) dans la cage métabolique (4) évaluation du débit de filtration glomérulaire: légère douleur liée à l’injection rétro-orbitaire
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure en vue de l'analyse de leur sang, leur urine, et leurs organes.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans le développement de l’IRC et qui sont impossibles à reproduire in vitro.
Réduction
Les modèles expérimentaux utilisés sont bien maitrisés par les expérimentateurs, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal. Il est prévu d’utiliser 410 souris. Le nombre de souris par groupe (n=10) est calculé au plus juste pour espérer observer une différence significative.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère : 4 souris par cage équipée d’éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), et alimentée en eau et en aliment ad libitum. Les animaux sont observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale, et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 20% du poids initial ; 2) Signes de souffrances (posture de prostration ou léthargie, comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.
Choix des espèces
L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Les traitements pharmacologiques débuteront sur des souris âgées de 4 à 6 semaines quel que soit le génotype. A ces âges, les reins sont pleinement développés et les souris ne présentent aucune altération détectable de protéinurie ou d’urémie (critères de détérioration de la fonction rénale). Les traitements seront poursuivis durant 8 à 10 semaines avant euthanasie.
Elevage de poux humains (Pediculus humanus corporis) sur lapins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
30 lapines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 25 destinées à l'adoption et 5 environ euthanasiées. Chaque animal est anesthésié et rasé sur le ventre, puis des poux humains sont déposés sur sa peau pour se nourrir de son sang pendant une heure, à raison de trois gorgements par semaine pendant cinq ans. L'objet est de maintenir un élevage de poux de corps humains pour l'étude des maladies qu'ils transmettent. Le porteur indique n'avoir trouvé aucune membrane artificielle capable de nourrir ces poux et retient le lapin, décrit comme "docile" et de grande taille, comme hôte.
Objectifs
L’élevage des poux humains est bien établi dans notre unité depuis 15 ans. Grace à cet élevage et à coté des agents connus, le rôle du pou de corps dans la transmission de plusieurs agents infectieux autresà été démontré. Cet élevage de poux est primordial pour l’étude de certaines maladies vectorielles d’où l’intérêt de ce projet. Les poux sont des ectoparasites hématophages. Le lapin est utilisé comme hôte, permettant de fournir 3 repas sanguins par semaine nécessaire au développement des poux.
Bénéfices attendus
Il permettra de maintenir une souche de poux du corps humain (Pediculus humanus corporis) nécessaire pour différents projets de recherche évaluant les interactions entre les pathogènes et le vecteur (poux) dans la transmission des maladies humaines et animales
Procédures
Les lapins seront anesthésiés par voie intramusculaire par un cocktail de kétamine/xylazine puis la profondeur de la narcose sera contrôlée (réflexe palpébral, dépression respiratoire). L'animal sera alors placé dans la gouttière où se trouve un tapis chauffant et un onguent ophtalmique (Ocrygel) lui sera appliqué. Le ventre sera rasé à la tondeuse et désinfecté à l'alcool chirurgical puis les poux y seront déposés pour un gorgement d'une durée maximale d'une heure. L'animal sera continuellement surveillé pendant la procédure afin de détecter tout signe d'éveil, qui entraînerait l'arrêt immédiat de la manipulation. A la fin du gorgement, tous les poux sont récupérés et l'animal est nettoyé à l'aide d'un aspirateur à faible puissance afin de s’assurer qu’il ne reste pas de poux. Sa peau est de nouveau nettoyée avec une compresse légèrement imbibée d'antiseptique puis l'animal est remis dans sa cage. Il sera surveillé régulièrement jusqu'à son réveil. Les piqûres de poux ne causent généralement pas de gêne à l'animal mais toute manifestation d'inconfort entraînera l'application d'une crème anti-démangeaisons (Cortapaisyl).
Impact sur les animaux
Aucun
Devenir
La procédure étant légère, les animaux en fin de projet qui ne sont pas trop agressifs seront adoptés. Cela représente la majorité des lapins (soit 25/30). Sur 30 lapines utilisées sur les 5 ans, 5 en moyenne doivent être euthanasiés
Remplacement
Aucune alternative de remplacement des lapins pour l’engorgement des poux n’est actuellement disponible, malgré les différents essais que nous avons réalisés dans notre laboratoire pour gorger les poux sur des membranes artificielles comme c’est le cas des moustiques, puces, punaises de lit et triatomes que nous élevons également au sein de notre laboratoire
Réduction
Seulement six lapins seront utilisés par an en alternance pendant la durée totale de ce projet (60 mois), ce qui fait un total de 30 lapins. Les poux doivent être nourris 3 fois par semaine, les lapins seront utilisés en alternance pour chaque gorgement. Approximativement, chaque lapin sera donc utilisé 2 fois par mois, soit 24 fois par an.
Raffinement
La totalité de la procédure se déroulera sous anesthésie . Le dessèchement de la cornée sera soulagé par l'application d'un onguent ophtalmique (Ocrygel) et les éventuelles démangeaisons conséquentes aux piqûres de poux seront apaisées par une crème anti- démangeaisons (Cortapaisyl). Les lapins sont visités chaque jour y compris les week-end et jours fériés pour s’assurer que les animaux ont de la nourriture et de l’eau. Ils seront manipulés en dehors des procédures expérimentales, dans un espace calme, par du personnel formé et habitué. Les cages de chaque lapin seront enrichies avec du foin et des jouets en bois. Malgré cette surveillance pour réduire les douleurs et le stress, si nous constatons qu’un animal présente des signes de souffrance tels qu'une détresse respiratoire, prostration, atonie, ou un défaut d’alimentation avec une perte de poids >20%, l'animal sera isolé pour des soins. Si nous observons aucune amélioration il sera euthanasié par surdosage d'Euthasol.
Choix des espèces
Le lapin (New Zealand) est l’espèce animale la plus appropriée pour nourrir les poux, compte tenu du fait que c’était l’espèce qui a été utilisée pour adapter et établir un élevage de poux de corps humain au laboratoire. Ces lapins sont de grande taille à l'âge adulte et permettent de nourrir un grand nombre de poux en une seule fois. Par ailleurs, ils sont dociles et donc faciles à manipuler, ce qui est un avantage quand on doit travailler avec ces animaux trois fois par semaine. Ce projet n'inclura que des lapins adultes en raison de leur taille. La taille de leur ventre permettra de nourrir plus de poux en une seule fois et d'utiliser moins d'animaux.
Rôle du facteur de transcription PLZF dans l’inflammation et le vieillissement du système hématopoiétique
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Une partie est irradiée puis greffée de moelle osseuse et reçoit des injections de molécules pro-inflammatoires, tandis que les reproducteurs sont mis à mort après six mois d'accouplement et les animaux au génotype non recherché également éliminés. Le projet étudie le rôle du facteur PLZF dans le vieillissement du système sanguin, ou "inflammaging". Le porteur affirme que le dialogue entre cellules souches et microenvironnement ne peut être reproduit et rend le "modèle murin" impossible à remplacer.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines (dans un processus appelé hématopoïèse) subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons montré que le facteur de transcription PLZF est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin. PLZF participe à la régulation du compartiment des cellules souches hématopoiétiques (qui sont à l'origine de toutes les cellules du sang) et est associé à l'augmentation de certaines sous-populations que nous avons identifiées comme des cellules préactivées dans des voies de signalisation impliquées dans l'inflammation. Ces résultats suggèrent que PLZF pourrait être un acteur clé dans le vieillissement du système sanguin lié à l'inflammation chronique. Notre projet propose d'élucider le rôle de PLZF dans la physiologie du vieillissement des cellules sanguines soumises à des processus inflammatoires. Nous souhaitons donc étudier en détail les effets d’une inflammation chronique sur les différents types de cellules hématopoïétiques (notamment les cellules souches et les progéniteurs) ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles dans des modèles murins où l'expression de PLZF est altérée.
Bénéfices attendus
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit au cours du vieillissement des défauts fonctionnels qui peuvent être associés au développement d'hémopathies. Le vieillissement du système sanguin est notamment lié aux inflammations subies tout au long de la vie de l'individu, processus connu sous le nom d'"inflammaging" qui favorise l'émergence d'hémopathies malignes. Nous souhaitons élucider certains mécanismes responsables de ce processus, pour mieux comprendre les causes du développement des hémopathies et cibler les acteurs clés de ce phénomène.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 6-7 minutes. La greffe de cellules de moelle osseuse qui s'ensuit est réalisée sous anesthésie gazeuse d’une durée de 3 à 4 minutes. Les animaux seront soumis à des injections de molécules pro-inflammatoires (durée 1 à 4 semaines, injection 3 fois par semaine) nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse. Les animaux recevront des traitements par des molécules inflammatoires. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation suivie d’une transplantation de moelle osseuse sous anesthésie gazeuse. L'irradiation est réalisée au sein d'un appareillage bruyant, ce qui peut être source de stress. Lors de ces transferts adoptifs, l'irradiation et le délai de reconstitution entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Les animaux seront soumis à des observations et pesées quotidiennes, qui peuvent être source de stress.
Devenir
Ce projet nécessitera 456 souris. Les animaux reproducteurs sont mis à mort à l’issue de la période de 6 mois d’accouplement qui permet de générer les animaux de génotype d'intérêt. Les animaux ne présentant pas les génotypes d’intérêt sont également mis à mort. Les animaux d'intérêt utilisés dans ce projet sont mis à mort à l'issue des procédures à des fins d'analyse.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre le vieillissement des cellules souches hématopoïétiques, lequel implique des mécanismes largement dépendants d'une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux (cytokines, molécules d’adhésion). Ce dialogue permanent entre la cellule souche hématopoïétique et son microenvironnement nécessite d’avoir recours aux modèles murins qu’il n’est donc pas possible de remplacer actuellement.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d'animaux grâce à l’utilisation des techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre expérience passée nous a permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires à l'obtention d'un nombre suffisant de cellules souches et progéniteurs (populations rares) pour les analyses pré-citées, et nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage et en mettant à disposition de la nourriture humide. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté, le cas échéant sous anesthésie gazeuse (injections et prélèvements sanguins).
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, à partir de 6-7 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 âgés de 7 à 8 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe .
Production in vivo d’un anticorps monoclonal dirigé contre un marqueur de l’hémostase destiné à l’industrie du diagnostic in vitro
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
34 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de pristane puis d'hybridomes qui déclenchent une tumeur et une accumulation de liquide d'ascite dans l'abdomen, décrite comme source de détresse, avant un prélèvement terminal. Le projet produit in vivo un anticorps monoclonal destiné à des kits de diagnostic industriels, le porteur affirmant que la production in vitro n'a pas été validée et concluant à une "nécessité incontournable". Le recours à 34 000 souris pour produire un anticorps par la méthode d'ascite ressort comme l'élément marquant de ce projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de produire in vivo chez la souris un anticorps monoclonal (Mab) ultra-spécifique d’un produit terminal de la dégradation de la fibrine. Ce Mab entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs IVD exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique et la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif.
Bénéfices attendus
L’obtention in vivo de cet anticorps monoclonal permettra le maintien de la production de kits de diagnostic essentiels à la définition d’un statut clinique. Cet anticorps entre dans la composition d’outils de diagnostic biomédical utilisé par la majorité des hôpitaux et des laboratoires français, européens et américains pour le diagnostic de la CIVD (Coagulation Intra Vasculaire Disséminée), des thromboses veineuses des membres inférieurs (phlébites) et de l’exclusion de diagnostic de l’embolie pulmonaire. Ces dispositifs de diagnostic in vitro (IVD) exploitant ce Mab sont pleinement validés, au sens du marquage CE des dispositifs IVD, de la U.S. FDA et des divers organismes règlementaires internationaux. Les besoins de santé publique avec la nécessité absolue de ces dispositifs IVD exploitant ce Mab et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. Il est à noter que ces kits, ont joué un rôle clé dans la crise sanitaire liée à la maladie à coronavirus (COVID-19). Les instances scientifiques ont permis de définir un lien entre le taux du produit de dégradation de la fibrine dosé par les kits dépendant de cet anticorps et la gravité de la maladie COVID-19 (mauvais pronostic pour le patient).
Procédures
Mise en quarantaine des souris dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation Après respect d'une semaine de quarantaine, à J1 les souris reçoivent une injection d’un agent d’amorçage. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de cet agent est précédée 30 minutes avant par l’injection en sous-cutanée d’un antalgique. A J22, après expansion clonale, les hybridomes sont injectés en IP unique à raison de 4.106 cellules/souris. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. Suivi quotidien des animaux. Les animaux présentant des signes d’inconfort sont euthanasiés et ponctionnés de manière éthique. Récupération unique et terminale d’ascite par paracentèse dès apparition. Injection IP ou SC, durée de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Chez l'animal, une douleur et une détresse peuvent résulter de l'injection intrapéritonéale (IP) de l'amorce (pristane), de l'inoculation IP des cellules tumorales, et de la croissance des cellules tumorales dans la cavité abdominale (effets primaires) sous forme de plaques péritonéales qui s'infiltrent dans la paroi abdominale ou les organes abdominaux. Plus précisément, il semble que l'injection par voie IP produit un niveau de détresse modéré; on décrit que la production d'ascite et la croissance de tumeurs causent de la souffrance chez les patients humains. De plus, les changements pathophysiologiques et pathologiques complexes peuvent provoquer une détresse chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux sont concernés, les souris sont toutes euthanasiées en fin de protocole. L’ensemble des animaux inclus dans un cycle de production sont euthanasiés avant paracentèse.
Remplacement
L’alternative la plus logique pour la production de cet anticorps serait une production in vitro. Malheureusement, à ce jour, l’anticorps n’a pu être caractérisé techniquement et validé cliniquement que sur des lots issus de production en condition in vivo. L’ensemble des résultats concernant la capacité de certains clones à produire in vitro les mêmes anticorps selon le même cahier des charges requis pour les dispositifs IVD concernés, démontre la nécessité incontournable de poursuivre la production de ce Mab en condition in vivo (incapacité des hybridomes à tolérer un transfert en extension d’échelles notamment de rendement de production et ou de qualité fonctionnelles des anticorps obtenus). Les besoins de santé publique de ces dispositifs IVD exploitant cet anticorps, et en l’absence de solution alternative, imposent le maintien de la production de ce réactif. La société nous demandant de réaliser des productions d'anticorps in vivo, est consciente de l’aspect éthique de l’expérimentation animale et s'engage à ne recourir à la production in vivo que dans des cas de stricte nécessité. En parallèle, de ce protocole, les essais de passage en in vitro se poursuivront notamment via la mise en œuvre d’essai de tris des clones présentant les taux de sécrétion d’immunoglobulines les plus élevés. Il est également à noter que pour les nouvelles versions de cette gamme de produit, les anticorps utilisés seront fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro » (développement en cours)
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. Nous pourrons nous baser sur l’expérience acquise sur les anciens protocoles réalisés sur ces clones. L’utilisation de souris anciennes reproductrices permet également de ne pas utiliser d’animaux jeunes spécifiques au projet, mais d'utiliser des souris qui étaient vouées à être euthanasiées. Les expériences de sélection des clones possédant les meilleures capacités de sécrétion, devraient permettre à minima de réduire le nombre d’animaux engagés par protocole. La dernière demande d’autorisation concernait 21000 souris par an, la nouvelle demande impliquerait 17000 individus annuellement, soit une diminution d’environ 19%. A ce jour 1 souris permet la réalisation de 1400 tests.
Raffinement
Les recommandations (issue de CNREEA et parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris seront appliquées. L’unique paracentèse sera réalisée après euthanasie de l’animal, afin de limiter les manipulations de l’animal toujours sources de stress. Afin de minimiser la souffrance des animaux, l’injection de l’agent d’amorçage est précédée 30 minutes avant par l’injection d’un antalgique. En accord avec les discussions réalisées lors des réunions du bien-être animal, du comité d’éthique et des éléments évoqués avec la DDPP, un analgésique sera également distribué aux souris après inoculation des cellules dès l’apparition des premiers signes de douleur par injection. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 2 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion…) et signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 3 niveaux : normal, souffrance légère mise en œuvre d’antalgies à envisager, souffrance sévère arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les animaux bénéficient d'un hébergement, d’un environnement, d'une certaine liberté de mouvement, de nourriture, d'eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Afin de faciliter la sociabilité des souris, elles ne sont pas isolées dans une cage et des objets d'enrichissement sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont euthanasiés et prélevés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore.
Choix des espèces
Les hybridomes concernés ont été obtenus par fusion de splénocytes de souris et de myélome de souris, selon la méthode de Milstein et al (1975). Les clones obtenus n’ont jamais pu être produits autrement que chez la souris. Le Mab obtenu et validé dans les dispositifs IVD concernés, est un Mab obtenu et produit chez la souris. Les souris doivent être de même souche (syngéniques) à la fois pour l'immunisation en vue de la création du clone d'hybridome et pour la production subséquente de Mab, de sorte que les tissus utilisés soient histocompatibles. Les souris Balb/c représentent le meilleur choix puisque les cellules myélomateuses parentales employées dans le processus de fusion proviennent de cette souche. Les souris utilisées préalablement pour la reproduction présentent l’avantage pour la production de l'ascite parce que leur musculature abdominale a déjà été étirée (Falkenburg, 1998). Les animaux utilisés sont de préférence des femelles adultes Balb/C (anciennes reproductrices), car elles présentent une prédisposition physiologique favorisant une dilatation de leur paroi abdominale en diminuant le risque de compression d‘organe (respect des 3R).
Rôle des glucocorticoïdes dans la régénération musculaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés subissent une amputation de la première phalange pour génotypage, puis les animaux reçoivent des injections de tamoxifène et une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle, dont on étudie ensuite la régénération sous glucocorticoïdes. Le porteur affirme que le recours à un "organisme entier" est nécessaire parce que cellules immunitaires et hormones interviennent dans la régénération, et indique n'attendre aucun effet secondaire majeur. Les bénéfices thérapeutiques évoqués restent une compréhension des mécanismes, sans application décrite à court terme.
Objectifs
Dans le cadre d’une blessure les glucocorticoïdes comme la cortisone peuvent être prescris pour leurs effets anti-inflammatoires efficaces mais dont la prise prolongée peut induire une perte de la masse musculaire. Les études sur les effets des glucocorticoïdes réalisées in vitro sur des cellules en culture montrent des résultats souvent contradictoires. Ainsi, malgré cette utilisation courante le mode d’action précis grâce auquel les glucocorticoïdes produisent leurs effets bénéfiques comme délétères sont encore mal connus. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la dégénérescence et la régénération musculaire via certain type de cellule immunitaire. Cette étude permettra aussi de mieux décrire, in vivo, le lien entre une partie du système immunitaire et les cellules souches du muscle. Enfin, grâce à ce projet nous espérons pouvoir identifier le meilleur moment pour administrer les traitements aux glucocorticoïdes en évitant les effets secondaires indésirables.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques de régénération musculaire. Ce projet permettra aussi de décrire les effets induits par des traitements aux glucocorticoïdes. Nous pourrons ainsi disséquer les conséquences d’un potentiel dysfonctionnement du système immunitaire sur les processus d’inflammation mais aussi les conséquences sur la réparation des fibres musculaires. En comprenant les cibles et le rôle précis des glucocorticoïdes des traitements pourront être développer pour cibler un type cellulaire en particulier et être administrés au moment adéquat.
Procédures
Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Tatouage et biopsie sont alors non douloureux. La phalangéctomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Les animaux vigiles, c’est-à-dire non anesthésiés, seront soumis principalement des injections de différents types ne nécessitant pas de contention de plus de 30 secondes. Une première vague d’injection de tamoxifène, permettant l’invalidation du récepteur des glucocorticoïdes, sera réalisée une fois par jour pendant 5 jours. Ensuite, l’induction de la lésion musculaire se fera sur des animaux endormis à l’aide d’un gaz à savoir l’isoflurane. Les animaux endormis recevront une injection unique de cardiotoxine dans chacun des tibias. Une fois l’animal endormi cette procédure dure environ 1,5 minute. Durant la régénération musculaire, les traitements par glucocorticoïdes seront réalisés grâce à une injection par jour sur une période allant de 1 à 7 jours maximum. L’injection unique d’une molécule, pour visualiser la prolifération cellulaire, sera réalisée par injection sur des animaux vigiles deux heures avant leur mise à mort. Le prélèvement de sang sera réalisé via l’artère temporo-mandibulaire sur des animaux vigiles juste avant leur mise à mort et représentera 25% de leur volume corporel. Enfin, pour l’anesthésie létale les animaux vigiles seront injectés avec un mélange de xylazine/kétamine afin de subir une chirurgie. Cette dernière consiste à réaliser une perfusion de paraformaldéhyde intracardiaque cœur afin que le système circulatoire permette au fixateur d’atteindre tous les organes. Cette technique permet de fixer et préserver les tissus de manière homogène.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. La phalangéctomie et le tatouage sont des techniques d'identification utilisées depuis plusieurs décénies dans le laboratoire et ne présentent pas d'effets secondaires majeurs. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant. En effet, 7 jours de traitement aux glucocorticoïdes ne provoquent normalement pas d’atrophie musculaire. Ainsi, nous n’attendons pas d’effets secondaires majeurs causés les molécules injectées. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).
Devenir
A l'issue de la procédure tous les animaux expérimentaux seront mis à mort pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes et synthétiques (dexaméthasone) sur la régénération musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, lors de la régénération musculaire, les cellules du système immunitaire provenant de la circulation sanguine sont impliquées mais aussi d’autres facteurs comme les hormones. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un animal entier afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte (exemple : niveaux d’hormones circulantes). Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils nécessaires pour mener à bien cette étude. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production d’un nombre assez important d’individu, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire sur la régénération musculaire ont mené à une bonne connaissance du modèle ainsi que des traitements à réalisés. Ainsi, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement et disposons de protocoles précis pour chaque expérimentation. Par ailleurs, les deux pattes des souris seront systématiquement utilisées afin de réduire de moitié le nombre d'animaux requis.
Raffinement
Dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Néanmoins, si l’un des animaux atteint un point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort par afin d'éviter toute souffrance inutile. Par ailleurs, après injection, les souris seront attentivement suivies. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …). De plus, le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’administration du composé induisant un dommage musculaire. Enfin, comme tous les traitements sont déjà bien décris et le modèle validé, nous n’aurons à optimiser aucun traitement pouvant entrainer des effets secondaires délétères sur les animaux.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur la souris, animal pour lequel le processus de régénération musculaire est semblable à celui de l'homme et pour lequel nous disposons de tous les outils moléculaires nécessaires pour mener à bien cette étude. Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront des mâles entre 10 et 15 semaines pour éviter les variations causées par la puberté. La régénération musculaire se faisant en plusieurs étapes, nous effectuerons une cinétique. Dans un premier temps, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la dégénérescence musculaire et l’inflammation en analysant les souris à 1, 3 et 5 jours après injection de la cardiotoxine. Puis, nous étudierons les mécanismes d'action entraînant la régénération musculaire et les mécanismes anti-inflammatoire en analysant les animaux à 7, 14, 28 et 60 jours après l’injection de la cardiotoxine. Un groupe d’animaux sera également analysé en l’absence de traitement à la cardiotoxine, constituant ainsi le jour 0. Pour la majorité des expérimentations nous utiliserons les souris de la lignée constitutive ne nécessitant pas d’injection au tamoxifène. Néanmoins, si nous observons des phénotypes sur ces souris, nous voudrions exclure une cause développementale c’est pour cela qu’il nous sera indispensable d’utiliser une seconde lignée inductible. Il est difficile à cette étape de prévoir à quel stade nous utiliserons ces souris car cela dépendra du phénotype des souris issues de la lignée constitutive.
Optimisation de la prise de greffe hématopoïétique chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est irradié puis reçoit une injection intrafémorale décrite comme douloureuse, et une partie est transplantée avec des cellules souches hématopoïétiques humaines, avant euthanasie pour quantifier la prise de greffe. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce processus in vitro et que la transplantation chez l'animal est le "seul outil" disponible. Les retombées annoncées pour les patients greffés de moelle osseuse sont renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
L’utilisation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) suscite un fort intérêt médical du fait de leur potentiel de régénération et de différenciation. Elles sont présentes dans la moelle osseuse et sont à l’origine des cellules sanguines. Elles sont utilisées au cours des transplantations hématopoïétiques dans le but de traiter les patients atteints de leucémies ou de maladies génétiques affectant les cellules du sang (leucocytes, globules rouges, plaquettes). L’une des limites de la greffe cependant, provient de la faible proportion de CSH capables de migrer vers les niches hématopoïétiques localisées dans la moelle osseuse et de s’y implanter. La grande majorité des CSHs est en réalité perdue ou détruite avant d’atteindre la moelle osseuse. Ainsi, une proportion importante des greffons, notamment ceux issus des sangs de cordons ombilicaux présentant de faibles quantités de CSHs, ne peut pas être utilisée pour la greffe. Une solution permettant d’augmenter le nombre de greffons disponibles consiste à augmenter la proportion des CSHs « utiles », c’est à dire capables de s’implanter dans la moelle osseuse. Cette amélioration permettrait en outre de limiter les risques d’échec de greffe chez les patients transplantés. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est d’évaluer l’effet de l’injection de molécules impliquées dans le guidage des cellules vers les niches hématopoïétiques médullaires, en association ou non avec des complexes stabilisateurs, préalablement à l’injection des CSHs, sur l’efficacité de l’implantation des CSHs humaines dans la moelle osseuse. Les expériences de transplantations seront réalisées dans un modèle de souris n’ayant pas de système immunitaire, ne rejetant donc pas la greffe de cellules humaines.
Bénéfices attendus
Cette étude permettrait d’établir la preuve de concept que l’injection de molécules (sélectionnées sur la base de leur effet sur les CSHs) augmente la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques (CSHs) lors d’expérience de transplantation. A terme, ces résultats concourront à l’optimisation des protocoles de transplantation de cellules hématopoïétiques chez l’humain, dans le but d’augmenter les chances de réussite thérapeutique et le nombre de patients pouvant bénéficier d’une greffe de moelle osseuse.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe (entre 3min environs et 5 min environ selon la lignée de souris) et à l’injection intrafémorale d’une molécule sélectionnée sur la base de son activité sur les CSHs. Cette injection qui dure quelques minutes sera réalisée sous anesthésie (1h environ) avec une prise en charge analgésique. Certains animaux seront également transplantés avec des CSHs humaines par voie intra veineuse. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Ces procédures permettront de tester 5 molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs
Impact sur les animaux
L’injection dans l’os est douloureuse. Elle sera effectuée sous anesthésie et sera accompagnée d’une prise en charge analgésique. Les animaux seront irradiés pour permettre la prise de greffe. L’irradiation non létale des souris n’est pas sensée provoquer de douleur ou d’altération majeur de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rare cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limité au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique durant 1 mois dans l’eau de boisson.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier, dans la moelle et dans le sang, la concentration de la molécule étudiée pour les études de pharmacocinétique ainsi que la proportion de CSH humaines présente dans la moelle des souris pour les expériences de transplantation.
Remplacement
La prise de la greffe au cours des transplantations de CSH est un phénomène complexe et il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de mimer ce processus in vitro. Le passage par une expérience de transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs à se loger au niveau de la moelle osseuse et ainsi d’identifier des molécules capables d’améliorer cette étape.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous déterminerons sur un petit nombre de souris les conditions expérimentales optimales de transplantation en fonction de chaque molécule testée. L’effet de cinq molécules différentes en association ou non avec des complexes stabilisateurs sera évalué. Notre expérience ainsi que la littérature dans le domaine nous montrent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe et par expérience est de 6 animaux afin que nous puissions rendre des résultats statistiquement significatifs sur le plan hématologique. Nos expériences préliminaires par étapes successives nous permettront d’optimiser les paramètres expérimentaux et de vérifier que ce nombre d’animaux est valide lorsque l’on combine injection intra-fémorale d’une molécule à tester et injection intra-veineuse de cellules hématopoïétiques.
Raffinement
Pour limiter au maximum l’impact sur le bien-être des animaux, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Par ailleurs, une prise en charge analgésique sera effectuée si besoin au site de l’injection intra-fémorale. Enfin une surveillance accrue sera réalisée entre le moment de l’irradiation et l’euthanasie de l’animal afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'humain. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de CSHs. Souris jeunes adultes (10-12 semaines) afin d’être dans des conditions dans lesquelles la prise de greffe est optimale.
Effet d’un inhibiteur d’histones désacétylases sur l’instabilité des triplets CTG dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de la dystrophie myotonique de type 1, elles reçoivent jusqu'à trente-six injections sous-cutanées sur douze semaines pour tester si une molécule réduit l'expansion d'ADN caractéristique de la maladie. Le porteur indique que les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau, et que les souris sont tuées à la fin pour des analyses incompatibles avec leur maintien en vie. Il présente cette étude comme un travail pilote et précise que les 12 souris proviennent de croisements déjà réalisés pour d'autres projets.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 est une maladie qui touche plusieurs organes tels que le muscle et le cerveau. Elle se caractérise principalement par un trouble du tonus musculaire et une détérioration progressive des fonctions neuromusculaires. Cinq formes cliniques ont été décrites dans la population atteint de la dystrophie myotonique de type 1. Parmi ces cinq formes, il y a une forme tardive qui se caractérise par une cataracte et une forme congénitale qui se caractérise par des problèmes musculaires et cognitifs très sévères. Le défaut génétique de cette maladie correspond à une expansion d'un morceau d'ADN dont la taille augmente généralement au cours des générations et dans les tissus. Plus la taille est grande, plus les symptômes sont sévères et l’âge d’apparition précoce. L’objectif principal du projet est d’identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la diminution de la taille du morceau d'ADN et donc de ralentir la progression de la maladie. L’objectif du projet est de tester les effets d'une molécule chimique sur la taille du morceau d'ADN chez la souris et ainsi savoir si cette molécule pourrait être utilisée comme outils thérapeutique.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de la dystrophie myotonique de type 1, la taille du morceau d'ADN dans les tissus augmente avec l’âge du patient et est corrélé avec la progression des symptômes de la maladie. Plus la taille du morceau d'ADN est grand plus les symptômes sont sévères. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire la taille de ce morceau d'ADN dans l’ensemble des tissus et donc à ralentir les symptômes chez les patients. Il a été montré qu’une molécule chimique peut réduire la taille de ce morceau d'ADN dans des modèles cellulaires. Une étude pilote chez l’animal permettra de savoir si cette molécule, peut également réduire la taille de ce morceau d'ADN dans plusieurs tissus tels que le muscle après 3 mois de traitement. Cette étude permettra également de savoir si l’effet de cette molécule est homogène entre les tissus et de mieux comprendre son mode d’action, in vivo. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible pour la dystrophie myotonique de type 1. Cette étude pilote est une étape importante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Le temps de la procédure est de 3 min. Les injections sous-cutanées seront réalisées 3 fois par semaine sur une période de 12 semaines. Le nombre maximum d’injections sera de 36 par souris. Les injections seront réalisées sur animal vigile. Les injections de la molécule d’intérêt se fera sur un lot de 6 animaux et les injections de l’adjuvant se fera sur un autre lot contrôle de 6 animaux. Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la période de traitement afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
Les souris hemizygotes, qui vont être utilisées dans ce projet, ne présentent aucun phénotype. Dans le cadre de ce projet, une procédure d’injection sous-cutanée va être utilisée. Les animaux pourront ressentir une douleur ponctuelle réversible liée aux injections. Les injections répétées peuvent causer des irritations et des ulcérations de la peau et des muqueuses. Les injections répétées seront réalisées à des endroits différents afin de diminuer les risques d’apparition de plaie, d’ulcère… Aucun effet indésirable résultant de la molécule ou de l’adjuvant a été répertorié dans la littérature.
Devenir
Afin de pouvoir analyser la distribution de la taille du morceau d'ADN dans différents tissus, les 12 souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. Les différentes analyses de biologie moléculaire réalisée dans le cadre de l’étude pilote ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Il a été montré qu’une molécule chimique réduit le morceau d'ADN dans les cellules. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. C’est pour cela qu’un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 est utilisé dans l’étude pilote. L’objectif de ce projet est d’étudier les effets de cette molécule sur la taille du morceau d'ADN dans différents tissus tels que le muscle qui est l’un des tissus les plus atteints chez les patients.
Réduction
Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, les 12 souris utilisées dans cette étude pilote proviendront de croisements réalisés pour d’autres projets du laboratoire qui ont été autorisés. Sur la base de nos expériences préliminaires, une analyse statistique a permis d’estimer à 6 le nombre de souris nécessaire par condition (Molécule versus Adjuvant). Le nombre d’animaux est minimisé dans le cadre d’une étude pilote avec un protocole mis en place précédemment par des collaborateurs internationaux.
Raffinement
Les conditions d'hébergement des animaux seront adaptées pour réduire à son minimum le stress et la souffrance animale. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec des nids de lanière kraft. La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de celui-ci. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de la boisson, la nourriture et de l’état des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration de la molécule et de l’adjuvant pour visualiser tout signe de toxicité imprévue qui nécessiterait l’euthanasie de l’animal. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent.
Choix des espèces
Un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1 sera utilisé dans le cadre de ce projet. Dans ce modèle de souris, la taille du morceau d'ADN malade augmente au cours des générations et dans les tissus. Notre choix s'est donc orienté vers ce modèle afin de valider le rôle de notre molécule sur la dynamique de ce morceau d'ADN, in vivo. Les souris hémizygotes d’intérêt seront inclues au début de la procédure à l’âge de 3 mois. Les souris seront euthanasiées à l’âge de 6 mois après 3 mois de traitement. Les changements de la taille de ce morceau d'ADN sont facilement détectés dans les tissus de souris âgées de 3 mois par les méthodes de biologie moléculaire utilisées au laboratoire. Il a été montré que les variations de taille de ce morceau d'ADN sont plus importantes chez des souris de 6 mois comparées aux souris de 3 mois.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un agent chimique mutagène est injecté pour induire des mutations au hasard dans le génome, puis les descendants sont suivis pour repérer ceux dont la maladie auto-immune est modifiée, avec puçage et biopsie de la queue. Le porteur indique que l'agent chimique rend stériles 70 % des mâles et que les animaux sont tués dès les premiers signes de la maladie. Il affirme le "besoin" de recourir à la souris, aucun modèle in vitro ou in silico n'existant selon lui pour ces maladies génétiques.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes) Une puce électronique sera implantée à tous les animaux de 3 semaines d’âge par voie sous cutanée. Des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à 3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.
Etude pilote pour évaluer le phénotype d’une lignée de souris porteuses d’une mutation humaine du gène TAF8
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent une mutation humaine du gène TAF8 associée à une déficience intellectuelle, et sont génotypées par rognage de phalanges avant l'âge de dix jours puis observées jusqu'à seize semaines. Le porteur n'attend aucun effet indésirable mais surveille l'alimentation et d'éventuelles crises d'épilepsie chez les nouveau-nés. Il présente cette étude pilote comme un préalable qu'il juge impossible à remplacer, seize souris étant conservées jusqu'à seize semaines et les autres tuées au sevrage.
Objectifs
L'initiation de la transcription par l'ARN polymérase II (Pol II) est contrôlée par l'assemblage séquentiel des facteurs généraux de transcription (GTF) au niveau des promoteurs. TFIID est le premier GTF à se lier au promoteur. Chez les métazoaires, TFIID est composé de la protéine de liaison à la boîte TATA (TBP) et de 13 facteurs associés à TBP (TAFs). Il est intéressant de noter que si de nombreuses cellules ont besoin du complexe TFIID canonique, d'autres sont moins affectées par la déplétion de certaines sous-unités TAFs. Le développement du système neuronal requiert particulièrement la présence de TFIID, car des mutations dans les gènes codant pour les sous-unités TFIID ont été associées à des troubles neurologiques et à une déficience intellectuelle chez des patients humains. Chez la souris, la perte de fonction de Taf8 est létale au stade de l'implantation [1]. Nous avons récemment identifié une mutation homozygote (c.781-1G>A) du site d'épissage de TAF8 (intron7/exon8) chez une patiente présentant une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie [2]. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation. Des analyses effectuées sur des fibroblastes dérivés de cette patiente ont montré de façon surprenante que, bien que la protéine TAF8 mutante ne soit pas détectable et que l'assemblage du TFIID soit altéré, la transcription par la Pol II n'est pas significativement affectée. D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été identifiés (données non publiées de nos collaborateurs): tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilepsie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez ces patients. Le but général de notre projet est d'analyser les conséquences moléculaires de cette mutation humaine au cours du développement et de la différenciation mais aussi d'étudier le phénotype comportemental en utilisant la souris comme modèle (mutation Taf8H). Dans un premier temps, nous souhaitons valider l'absence de phénotype dommageable des souris homozygotes adultes avant d'initier dans un deuxième temps un projet d'analyse comportementale. [1] doi.org/10.1242/dev.127.24.5449 [2] doi.org/10.1093/hmg/ddy126
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet préliminaire qui nous permettra de confirmer l'absence de phénotype dommageable chez les souris homozygotes Taf8H/H. Une fois, l'absence de phénotype dommageable avérée, nous soumettrons une autre saisine pour l'analyse des capacités intellectuelles des animaux mutants. A terme, ces projets apporteront des connaissances fondamentales sur le fonctionnement de la transcription et permetteront de mieux comprendre la cause de déficiences intellectuelles chez l'homme.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés par rognage de phalanges avant l'âge de 10 jours.
Impact sur les animaux
La patiente qui a été étudiée au laboratoire présente une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation (âgée de 4,5 ans au moment de l'étude). D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été récemment identifiés (données non publiées de nos collaborateurs). Tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilespie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez deux des trois patients. Aucun effet indésirable n'est attendu chez les animaux Taf8H/H mais une attention sera portée au suivi de l'alimentation et à l'occurence éventuelles de crises d'épilepsie chez les nouveaux nés et du développement moteur.
Devenir
Le but de cette saisine est l'observation des animaux de leur naissance jusqu'à 16 semaines qui correspond à l'âge maximal prévu pour les analyses futures. Tous les animaux seront génotypés mais seules 8 souris Taf8H/H et 8 souris contrôles (+/+ ou H/+) seront conservées pour l'observation jusqu'à l'âge de 16 semaines: les autres souris seront euthanasiées au moment du sevrage. les animaux suivis seront eux euthanasiés à 16 semaines.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de vérifier qu'une mutation à l'état homozygote n'induit pas de phénotype dommageable ou affectant le bien être des souris, avant d'initier un projet d'analyse comportementale. Il n'est donc pas possible de remplacer ces animaux.
Réduction
Le nombre de 6 portées minimum pour obtenir au moins 8 animaux Taf8H/H homozygotes a été choisi pour nous assurer de l'absence de phénotype. Les mêmes animaux seront analysés tout au long de leur vie (naissance jusqu'à 16 semaines) pour minimiser le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Le but de cette saisine est de vérifier que la mutation Taf8H à l'état homozygote ne provoque pas de phénotype dommageable, même si aucun problème n'est attendu puisque les patients humains sont viables et se caractérisent principalement par une déficience intellectuelle. L'élevage des animaux sera fait par un personnel compétent dans des conditions du respect du bien être animal, par du personnel compétent sensibilisé à la possibilité de l'apparition d'un phénotype délétère chez les mutants. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux. A la naissance, la capacité d'alimentation de tous les souriceaux sera évalué par la présence de lait dans l'estomac. L'état des animaux sera évalué 3 fois par semaine (propreté, déplacement, vivacité et posture) jusqu'à l'âge de 16 semaines. En cas de souffrance animale, l'avis du vétérinaire sera démandé pour une éventuelle action avant euthanasie si aucune solution ne se présente.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser une mutation découverte chez l'homme et associée à des problèmes cognitifs. La souris est un modèle de choix qui nous permettra de dériver des lignées cellulaires utiles pour les études moléculaires in vitro tout en analysant le développement du système nerveux et le comportement des animaux mutants. Le but de cette saisine est de nous assurer de l'absence de phénotype délétère chez les homozygotes: les animaux seront donc observés de la naissance jusqu'à 16 semaines où ils seront euthanasiés.