Système cardiaque
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Étude du rôle des cellules immunitaires innées dans la progression de la drépanocytose chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à quatre-vingt-dix gavages quotidiens, quinze injections, deux séjours de huit à vingt-quatre heures en cage métabolique et jusqu'à vingt-quatre heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène : 1 825 souris vont subir ce protocole, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que les crises vaso-occlusives provoquées chez ces souris entraînent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes que vivent les personnes drépanocytaires. L'objet du projet est d'identifier des cellules immunitaires comme cibles thérapeutiques dans les complications rénales et cardiaques de la maladie. Le choix de souris de quatre semaines à six mois est justifié par l'absence de fibrose liée à l'âge, qui assurerait "une variabilité minimale des résultats expérimentaux".
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique récessive causée par une mutation d’un gène, qui provoque une déformation des globules rouges. Cette pathologie entraine des complications rénales et cardiaques. Malgré les traitements actuels, les complications multiorganiques persistent. Des recherches récentes soulignent le rôle clé de certaines cellules immunitaires dans l’amplification des réponses inflammatoires, aggravant les lésions tissulaires et les dysfonctionnements des organes. Ce projet vise à explorer l’implication de ces cellules dans les complications liées à la drépanocytose et à évaluer leur potentiel en tant que cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires impliqués dans les complications aiguës et chroniques rénales et cardiaques de la drépanocytose. En se concentrant sur la contribution des cellules immunitaires, l’objectif est d’identifier des marqueurs pronostiques validés ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques capables de dépasser les limites des traitements actuels, en s’attaquant directement aux causes sous-jacentes des atteintes organiques associées à la drépanocytose. À terme, cette recherche pourrait contribuer à améliorer de manière significative les résultats cliniques et le bien-être global des patients atteints de cette maladie.
Procédures
- Biopsie de la queue : une seule biopsie de moins de 2 mm (10 secondes) réalisée sur une souris. - Prélèvement sanguin : un prélèvement sur souris vigile (durée environ 30 secondes) et deux prélèvements sur souris anesthésiées (durée environ 1 minute). - Mesure de la pression artérielle : deux mesures non invasives de 20 minutes sur souris vigiles pendant deux jours consécutifs. - Injections : 15 injections (une par jour) sur souris vigiles (environ 20 secondes par jour). - Administration orale : entre 15 et 90 administrations orales (une par jour) sur souris (environ 20 secondes par jour). - Administration par mini-pompes osmotiques : implantation sous-cutanée de pompes pour la délivrance continue du traitement (durée de la chirurgie : environ 5 minutes). - Séjour individuel dans des dispositifs métaboliques d’une durée de 8 à 24 heures, réalisé une à deux fois selon le protocole. - Exposition à une atmosphère hypoxique contrôlée : une à deux expositions d’une durée de 3 à 24 heures dans un environnement à faible teneur en oxygène.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront des douleurs légères et de courte durée à la suite de la biopsie de la queue et de la mesure de la pression artérielle. - Elles subiront également le stress d’un confinement individuel dans des cages métaboliques pendant une durée de 8 à 24 heures. - L’administration par voie orale, le prélèvement sanguin et les injections leur causeront une douleur légère et de courte durée ou un inconfort minime au site d’injection. -Douleurs modérées et de courte durée après chirurgie pour la pose de la pompe osmotique. - Les crises vaso-occlusives, qui reproduisent les complications aiguës observées dans le contexte de la drépanocytose, provoquent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes douloureux sévères ressentis chez les patients drépanocytaires. - L’administration par voie orale quotidien entraînera un certain inconfort chez les souris, mais cette technique sera réalisée à l’aide de sondes d’alimentation en plastique polypropylène, afin de minimiser les risques de lésions œsophagiennes.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et d’analyser les reins, le cœur et le foie.
Remplacement
Le modèle animal permet d’étudier la physiopathologie rénale, cardiaque et hépatique en tenant compte de l’ensemble des paramètres physiologiques présents chez un organisme vivant. Les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas reproduire cette complexité, notamment les interactions entre les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, ce qui les rend peu pertinentes pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux requis est calculé sur la base d'un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire pour obtenir des conclusions biologiquement pertinentes. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque animal, un maximum d’organes et d’échantillons biologiques sera prélevé afin d’éviter la répétition des expériences sur de nouveaux animaux. Ces tests statistiques sont adaptés à la taille de nos échantillons. Les accouplements sont optimisés pour obtenir les animaux d’intérêt avec le meilleur rendement possible.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour réduire le stress, l’anxiété et la souffrance des animaux : 1/ Des points limites clairs et stricts, spécifiques au projet, ainsi qu’un système de notation de la douleur ont été définis pour surveiller le bien-être des animaux et permettre une intervention si nécessaire. 2/ Pour limiter la douleurs, des prélèvements seront effectués sous anesthésie, des analgésies sont prévues pour traiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est essentiel pour étudier les pathologies rénales, cardiaques et hépatiques, car il reflète la complexité de l’organisme vivant que les modèles in vitro ou in silico analyses ne peuvent pas reproduire. Les souris âgées de 4 semaines à 6 mois sont idéales, car elles ont dépassé le sevrage physiologique et ne sont pas encore à un âge où une fibrose des organes (rein, cœur, foie, etc.) pourrait se développer en raison de facteurs liés à l'âge pendant la drépanocytose, ce qui permet d’assurer une variabilité minimale des résultats expérimentaux.
Evaluation de l’effet protecteur d’émulsions lipidiques enrichies en acides gras polyinsaturés dans un modèle murin de péritonite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection d'endotoxine bactérienne dans l'abdomen sur animal vigile, puis une ponction dans le cœur sous anesthésie gazeuse : les gestes infligés à chaque souris tiennent en trente-cinq secondes. 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère. À forte dose, le produit injecté provoque fièvre, hypothermie, hypotension et faiblesse musculaire, jusqu'à la mort, pour tester si une émulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturés limite les effets d'une péritonite. Vingt souris par groupe sont prévues spécifiquement pour l'étude de l'atteinte des points limites, alors que le porteur ne retient de l'injection que "de faibles douleurs, de courte durée".
Objectifs
Les inflammations généralisées associées à une infection grave constituent 1/3 des décès à l’hôpital et sont causées, dans un grand nombre de cas, par des péritonites : infections originaires de la cavité abdominale. La plupart des péritonites sont dues à des bactéries libérant de puissants activateurs de l’inflammation : les lipopolysaccharides (LPS, endotoxines). Les LPS présents dans la cavité péritonéale passent rapidement dans la circulation, déclenchant une réaction inflammatoire incontrôlée. Les lipoprotéines, dont le rôle est de transporter les lipides (cholestérol, triglycérides) dans la circulation, ont la capacité de lier, neutraliser et détoxifier les LPS circulants. L’association entre LPS et lipoprotéines est favorisée par la protéine de transfert des phospholipides (PLTP). Notre groupe a pu démontrer dans des expériences préliminaires que l’inactivation des LPS par les lipoprotéines sous l’effet de la PLTP peut avoir lieu encore plus précocement : dans la cavité péritonéale, avant que les LPS n’aient pu rejoindre la circulation. De nombreux patients en soins intensifs sont placés sous nutrition parentérale, permettant l’apport de nutriments par voie intraveineuse. Les gouttelettes lipidiques présentes dans ces émulsions possèdent des propriétés similaires à celles des lipoprotéines. Dans un projet précédent, notre équipe a pu montrer que l’Intralipide, émulsion riche en acides gras poly-insaturés oméga 6, en présence de PLTP, réduit partiellement la mortalité chez les souris sans toutefois diminuer l’inflammation. Néanmoins, il existe plusieurs formulations d’émulsions lipidiques différant par leur composition en acides gras et notamment des versions enrichies en oméga-3. De manière importante, les oméga-3 et oméga-6 peuvent moduler la réponse inflammatoire. De plus, certains travaux ont montré que la PLTP a la capacité de moduler la distribution des acides gras dans la circulation. Ce projet vise donc à comparer l’impact des émulsions enrichies en oméga-3 ou oméga-6 sur les effets délétères des LPS dans un modèle de péritonite chez la souris. La réponse inflammatoire et le temps d’atteinte des points limite suite à l’injection de LPS dans la cavité péritonéale seront comparés chez des souris type sauvage (PLTP active) et des souris génétiquement modifiées dépourvues de PLTP active (souris PLTPKO), supplémentées ou non en émulsion.
Bénéfices attendus
Environ 6 millions de personnes meurent d’une infection chaque année dans le monde, et le taux de mortalité dans le cas d’une infection liée à une péritonite est d’environ 50%. A ce jour, aucun traitement ne s’est avéré efficace pour résoudre l’inflammation sévère liée à l’endotoxémie (présence de LPS) et au sepsis. Le présent projet, basé sur de premiers résultats prometteurs avec une première émulsion, permettra de déterminer si l’utilisation en voie intrapéritonéale d’une émulsion lipidique optimisée pour sa composition en acides gras anti-inflammatoires pourrait constituer un moyen efficace de limiter les effets délétères de l’endotoxémie liée à une péritonite.
Procédures
Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles : 1 (5 secondes) Prélèvement intracardiaque sans chirurgie, sous anesthésie gazeuse : 1 (30 secondes)
Impact sur les animaux
De faibles douleurs, de courte durée, peuvent être occasionnées lors de l’injection intrapéritonéale. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur souris vigiles sous contention manuelle, ce qui peut engendrer un stress transitoire le temps de la manipulation (moins d’une minute). L’injection intrapéritonéale de LPS peut entrainer les effets suivants : - A faible dose : état fébrile transitoire d’environ 4 heures (fatigue, tremblements) - A forte dose : syndrome d’inflammation systémique aiguë (fièvre, hypothermie, hypotension, faiblesse musculaire) pouvant déboucher sur la mort de l’animal dans les cas les plus sévères. Cette condition associée à une classe sévère fera l’objet d’une attention particulière pour les points limites.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Notre étude exclut l’utilisation de modèles in vitro ou d’animaux dont l’anatomie, le système circulatoire et immunitaire sont trop éloignés de celui des mammifères. En particulier, la présence d’un compartiment péritonéal est ici cruciale pour étudier l’influence de l’injection des émulsions, des lipoprotéines et de la protéine de transfert des phospholipides (PLTP) dans ce même compartiment afin de voir leur effet au niveau local, où s’accumulent les LPS au cours d’une péritonite. Nous utiliserons le plus petit modèle de mammifère, la souris, en tirant parti de l’existence d’un modèle génétiquement modifiées dépourvues de PLTP active (PLTPKO), disponible et déjà utilisé par notre équipe.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, le projet requiert : - 7 animaux par groupe pour les études cinétiques sur 24h. Ces animaux seront mis à mort à l’issue de leur unique prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, ceci afin de récupérer un volume maximum de sang. - 20 souris par groupe pour l’étude d’atteinte des points limite.
Raffinement
Le génotypage des souris sera effectué à partir de prélèvement de follicules pileux, cette méthode étant non douloureuse et non invasive pour les animaux en comparaison des méthodes classiques de prélèvement de tissus. Les deux injections intrapéritonéales (LPS et émulsion lipidique) seront réalisées sur animaux vigiles sous contention manuelle. Une crème antidouleur sera appliquée localement au site d’insertion de l’aiguille. Pour les animaux ayant reçu la dose élevée de LPS, des points limites spécifiques seront déterminés. Ces animaux seront en état de syndrome inflammatoire sévère et peuvent présenter des difficultés à boire et se nourrir. L’utilisation de nourriture hydratée placée directement dans les cages permettra un accès facilité à la nourriture et à l’eau. La prise en charge de la douleur chez ces animaux sera faite par ajout d’un antidouleur morphinique mélangé à l’eau de boisson ainsi qu'à la nourriture tout au long de la période d’étude. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque (sans chirurgie) se fera sous anesthésie gazeuse. La souris sera maintenue à 37°C à l’aide d’un plateau chauffant le temps de la ponction. De la crème antidouleur sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite immédiatement mis à mort avant réveil.
Choix des espèces
Espèce (souris) : Les souris type-sauvage présentent une forte activité PLTP. Les souris déficientes en PLTP sont disponibles pour notre équipe de recherche. Elles constituent un bon modèle d’activité PLTP faible, comme observé dans de nombreux cas de sepsis chez l’Homme. L’espèce souris présente ainsi une bonne alternative à l'expérimentation sur d'autres espèces de mammifères dont la maintenance est plus laborieuse. Stade adulte (2 à 5 mois) : La réponse inflammatoire chez la souris est affectée par l’âge ce qui se traduit par une certaine tolérance aux endotoxines, l’installation d’une inflammation chronique et une diminution de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires d’où la nécessité d’utiliser des animaux plutôt jeunes et d’âge homogène.
Etude de la cinétique de thrombose veineuse en Hypoxie et normobarie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une première chirurgie abdominale avec réveil de quarante minutes, six heures d'hypoxie reproduisant les conditions d'un vol long-courrier, puis une seconde chirurgie sans réveil pour prélever le caillot et le sang, certains groupes recevant en plus un gavage quotidien ou des injections répétées. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs après le réveil, une perte temporaire de mobilité et un stress accru, les souris génétiquement modifiées présentant un risque de saignement plus important. Il affirme que l'étude in vitro des plaquettes et des cellules endothéliales ne reproduit pas l'intégralité du vaisseau sanguin, ce qui fait à ses yeux de la souris un "modèle de choix" pour la thrombose veineuse.
Objectifs
Nous cherchons à comprendre comment se forment les caillots dans les veines, en comparant des conditions qui ressemblent à un voyage en train et à un vol long-courrier. Nos premiers résultats montrent que l’avion favorise la formation de thromboses, notamment par l’activation des plaquettes grâce à leur production d’énergie. Nous avons aussi observé que certains globules blancs ne participent pas au tout début, mais seulement après deux jours. Avec ce projet, nous voulons suivre plus finement l’évolution du caillot et la réaction de la paroi des veines. L’objectif est de mieux cibler les traitements pour prévenir les thromboses tout en limitant les risques de saignement.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de caractériser les étapes de formation et de lyse du thrombus en présence de l’endothélium. Cela permettra à long terme de prescrire aux patients une drogue pertinente en fonction des cellules intervenant en premier sur le site a de faibles doses pour éviter la comorbidité la plus commune le saignement.
Procédures
Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil de 40 minutes. Puis en fonction des lots; (à 6h, 24h, 48h,72h ou 96H) à une deuxième chirurgie ( 15 minutes) qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal. Les differents lots sont exposés entre les deux chirurgies à 6 heures d'hypoxie ou de normoxie. Un groupe d’animaux pourra etre soumis à du gavage sur 3 jours à raison d’une fois par jour, ou a une injection en intraveineux ( 2 fois au total) ou en intra peritonéal (Une fois par jour durant 5 jours maximum).
Impact sur les animaux
Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les animaux du groupe test exposés aux conditions d'hypoxie hypobare après la chirurgie peuvent perdre temporairement un peu de mobilité et avoir une augmentation du stress. Enfin, les animaux génetiquement modifiés ainsi que ceux traités avec la molécule x présenteront des risques de saignements plus importants pendant la chirurgie que les souris wild type.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.
Remplacement
A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.
Réduction
Le nombre d’animaux annoncé a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats significatifs avec un risque de premier espèce égale à 5%. Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction). Nous réitèrerons pas les groupes dont nous avons déjà réalisés l’étude du thrombus (40 souris en moins sur la totalité de l’etude).
Raffinement
Les animaux seront utilisés 4 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Nous disposerons dans cette cage de l’enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (39°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la durée de l’expérimentation (6H à 96h) ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose de d’analgésique sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Nous disposerons en plus dans la boîte d’hébergement de l’eau gélifiée contenant un analgésique pour que les animaux y est accès tout au long de la nuit. Le lendemain matin, une dernière injection est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare (sauf pour le groupe de 6h qui aura déjà été euthanasiés). En cas de signes de douleurs chez un animal une nouvelle injection de lui sera administré. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix de thrombose veineuse et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel et mature.
Rôle des plaquettes dans la plasticité cérébrale et dans la récupération post-AVC chez la souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Dix minutes de chirurgie suffisent à provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion permanente d'une artère, puis l'antiagrégant plaquettaire est versé dans l'eau de boisson jusqu'au jour de la mise à mort. 810 souris vont être utilisées ainsi, 690 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau léger, toutes tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. S'y ajoutent deux injections, deux prélèvements sanguins, une évaluation neurologique et des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas, alors que le traitement lui-même expose les animaux à un risque de saignement. Le porteur veut savoir si les plaquettes participent à la réparation du cerveau après un AVC, et retient la souris adulte au motif que les techniques décrites y sont déjà validées dans la littérature et dans son laboratoire.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral (AVC) reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament ou d’un dipositif permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral. Seule une minorité de patients ont accès à ces traitements en raison de la fenêtre thérapeutique étroite, du nombre limité de centres spécialisés et des contre-indications. Aucun traitement ne prévient les troubles cognitifs post- accident vasculaire cérébral, qui touche 25% des patients. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients d’une part et de prévenir les troubles de la mémoire qui se développent au décours de l’AVC d’autre part. Certains patients non traités peuvent s’améliorer spontanément suggérant ainsi l’existence d’une plasticité cérébrale c’est-à-dire d’une autoréparation. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques. Au-delà de leur rôle dans la formation du caillot sanguin, les plaquettes sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs de processus physiopathologiques importants, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. Cependant, leur contribution à la réparation dans l’accident vasculaire cérébral n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase précoce. Cette question est d’autant plus cruciale que de nombreux patients sont traités par des médicaments qui empêchent la formation de nouveaux caillots en empêchant l’activation des plaquettes pour prévenir la survenue d’un second accident vasculaire cérébral. Or, il semble qu’il y ait un plus grand nombre de troubles cognitifs chez les patients traités par antiagrégants plaquettaires. L’objectif de ce projet sera de déterminer la contribution des plaquettes et des médicaments qui empêchent leur activation dans la réparation neurovasculaire post – accident vasculaire cérébral à long terme. Le projet se deroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
L’hypothèse de ce projet est que les plaquettes contribuent à la réparation cérébrale après un accident vasculaire cérébral et qu'un traitement anti-coagulant, administré à la phase tardive pourrait avoir un impact négatif ou positif selon la cible pharmacologique sur cette récupération post-ischémie cérébrale. Au-delà des seuls domaines de la biologie plaquettaire et de la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, cette approche originale fournira la base fondamentale pour les futures études précliniques sur la réparation post-ischémie cérébrale. De plus, les résultats pourraient avoir des implications cliniques importantes car la thérapie anti-plaquettaire est utilisée pour la prévention secondaire de l'accident vasculaire cérébral, avec pour seul objectif d’empêcher la formation d’un nouveau caillot mais sans aucune connaissance sur la réparation à plus long terme.
Procédures
Dans cette étude, un modèle murin d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion permanente procédure réalisée systématiquement sous anesthésie et analgésie sera utilisé. L’intervention chirurgicale dure environ 10 minutes. Chaque animal recevra deux injections (analgésie) ainsi que deux prélèvements sanguins (réalisé à J3 et le jour de la mise à mort). L’injection dure en moyenne 10 secondes, tandis que le prélèvement sanguin ne dépasse pas 2 minutes. Toutes les souris feront l’objet d’une évaluation neurologique qui dure environ 5 minutes. Ce modèle sera combiné à une administration dans l’eau de boisson d’un des traitements anti-plaquettaire dès l’induction de l’accident vasculaire cérébral jusqu’au jour de la mise à mort. L'intervention chirurgicale, l'évaluation neurologique, l'administration des traitements ainsi que les prélèvement sanguins seront réalisés dans l'EU1. L'enregistrement électrophysiologique sera réalisé dans l'EU2.
Impact sur les animaux
- Les injections d'anesthésiques et d'analgésiques causent un stress et une douleur modérée de courte durée les prélèvements sanguins causent un stress et une douleur modérée de courte durée. - L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur modérée chez l’animal de courte durée lors de l’incision de la peau. - La prise des traitements anti-agrégants peut induire un risque de saignement. - Les tests comportementaux induisent un stress et de l’anxiété modéré et de courte durée.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Le modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place à long terme dans le cerveau (plasticité cérébrale) après l’ischémie cérébrale. L’utilisation de souris déficientes en plaquettes ou de ses différents récepteurs permettra d’étudier leurs rôles respectifs dans le remodelage neurovasculaire post-ischémie cérébrale à long terme. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'accident vasculaire ischémique chez l'homme.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, une étude statistique a été réalisée au préalable à l’aide d’un logiciel spécialisé. Cette analyse permet de déterminer précisément le nombre minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Les groupes ont été conçus de manière optimisée, basée sur des études antérieures, garantissant ainsi l’utilisation du strict nécessaire d’animaux. De plus, le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé est bien maîtrisé par l’équipe, avec une mortalité extrêment faible ce qui permet de mener les recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, des méthodes statistiques adaptées seront appliquées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant l’engagement à réduire l’usage des animaux.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité dans l’étude. Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de materiel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé attentivement grâce à une grille de scores définie, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une mise à mort sera réalisée selon les réglementations en vigueur afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature et notre laboratoire. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 12 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés et dans une perspective translationnelle, l’accident vasculaire cérébral survient à l’âge adulte.
Etude de l’efficacité de l’Apernavec sur le lymphœdème primaire et le lipœdème EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées en moins de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, injectées jusqu'à cinq jours de suite, transférées d'un établissement à l'autre pour une lymphographie suivie de leur mise à mort, 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Presque toutes sont des femelles, le lipœdème ne touchant que les femmes. Le porteur cherche à étendre au lymphœdème primaire et au lipœdème une thérapie déjà développée pour le lymphœdème secondaire, qui doit passer en clinique en fin d'année. Pour ces 1 050 souris, la description des atteintes tient en une phrase, la formation de l'œdème, la chirurgie, l'imagerie et les injections provoquant des douleurs modérées et un léger stress.
Objectifs
Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.
Procédures
Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.
Impact sur les animaux
La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.
Remplacement
Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.
Entrainement et mise au point de procédures expérimentales d’échographie (EU2/2)
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Rats : 220
812 rongeurs, 592 souris et 220 rats, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, les adultes tués à la fin de chaque mise au point et 212 animaux réutilisés. Des femelles gestantes subissent jusqu'à dix anesthésies gazeuses quotidiennes de trente minutes sur les vingt et un jours de gestation, et leurs nouveau-nés sont séparés d'elles jusqu'à quinze minutes pour être échographiés, au risque d'un rejet ou d'une agression au retour dans la cage. Le porteur présente l'échographie comme un raffinement qui remplacerait des dissections chez d'autres équipes, tout en visant un "catalogue de prestations techniques" et la formation d'utilisateurs. L'effectif, lui, n'est adossé à aucun calcul de puissance et correspond au "nombre moyen nécessaire et suffisant" pour évaluer la reproductibilité des mesures.
Objectifs
L’objectif de notre projet vise à prendre en charge la mise au point expérimentale de l’exploration de différents organes et phénomènes biologiques, physiologiques ou pathologiques, par échographie sur le rongeur. Une large partie de cette mise au point sera consacrée à l’exploration cardiaque où la reproductibilité des mesures est primordiale pour étudier les dysfonctions ou le vieillissement cardiaque. L’échographie sera également mise en œuvre pour la détection et le suivi du cancer (foie, pancréas, colon, sein, etc..), l’exploration du muscle (orientation, longueur de fibres, volume), l’étude de la perfusion cérébrale ou encore suivi du développement embryonnaire et du nouveau-né. Nous souhaitons également mettre au point des interventions guidées par échographie (administration et/ou prélèvement de substances dans des organes profonds) susceptibles de remplacer certaines interventions chirurgicales. La mise au point pourra aussi porter sur l’utilisation d’agents de contraste pour l’échographie (microbulles) pour mieux visualiser certaines structures ou étudier la perfusion sanguine dans de nombreuses situations. L’un des systèmes dont nous disposons permet de mesurer des différences de dureté tissulaire à l’intérieur d’un même organe et ainsi mettre en évidence de façon ultra précoce l’apparition de certaines lésions. Si cette application a été bien prise en main par les spécialistes du cancer du pancréas utilisant quotidiennement l’échographie dans le cadre de leurs recherches, nous devons la déployer sur d’autres thématiques pour la rendre accessible à des équipes non spécialistes en échographie. Notre ambition est de mettre en place un catalogue de prestations techniques aussi complet que possible et évolutif pour, in fine, pouvoir former les utilisateurs ou prendre en charge leur projet en tant qu’experts. Nous nous attacherons également à diffuser les méthodologies validées pour en faire un référentiel pour la recherche préclinique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette mise au point de procédures expérimentales robustes et reproductibles d’imagerie non invasive par échographie ou échocardiographie à destination de la communauté scientifique vise à faciliter l’accès au plus grand nombre à une modalité d’imagerie non invasive, peu stressante, ne nécessitant pas d’intervention lourde sur l’animal et permettant leur suivi longitudinal. Nous espérons que cette expertise apportée aux chercheurs permettra d’augmenter le recours à l’échographie en remplacement de méthodes invasives ou terminales (dissections). Ceci aura donc un impact positif sur deux critères de la règle de 3R : 1. Réduction : Suivi d’une même cohorte au cours du temps, détection plus précise (chaque animal étant son propre contrôle) afin de réduire la taille des lots d’animaux 2. Raffinement : Modalité atraumatique, générant un stress limité puisque l’animal est sous anesthésie, détection plus précoce des pathologies pour réduire la dégradation du bien être dans le cadre de modèle chronique. Raffinement de certaines procédures précédemment réalisées par chirurgie (injection de cellules tumorales dans des organes profonds comme le pancréas).
Procédures
Pour la mise au point d’exploration échographie non invasive, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse de 20 minutes maximum et cette anesthésie pourra être répétée 3 fois à 24h d’intervalle minimum. Pour la mise au point de procédures d’échographie avec injection d’agents de contraste, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum avec pose de cathéter veineux (5 minutes) avant début des acquisitions échographiques. Pour la mise au point d’interventions sous contrôle échographique, les souris subiront une anesthésie générale gazeuse qui pourra durer 1 heure maximum et, durant cette anesthésie, des injections ou des prélèvements seront réalisés (30 minutes). Pour l’optimisation du suivi du développement embryonnaire par échographie, les souris femelles non anesthésiées subiront deux injections d'hormones. Après fécondation, elles subiront une anesthésie générale gazeuse quotidienne de 30 minutes maximum, soit 10 anesthésies maximum sur les 21 jours de gestation. Toutes ces interventions pourront être réalisées alternativement ou successivement (à minimum 24h d'intervalle) dans les établissements utilisateurs (EU) 1 et 2. Les femelles gestantes pourront être transférées d'une EU à l'autre, par voie routière, sauf durant le dernier tiers de la gestation (à partir de 14 jours). Une échographie pourra être réalisée sans anesthésie sur les nouveaux nés (souris et rats) durant leurs premières heures de vie (moins de 48h) mais les nouveaux nés ne seront pas séparés de leur mère plus de 15 minutes. Le suivi pourra se poursuivre jusqu’au sevrage à raison d’une échographie par semaine maximum (soit 2 à 3 échographies par animal de 48 h à 21 jours de vie). Les explorations pourront se faire dans l'EU1 ou l'EU 2 mais aucun transfert ne sera autorisé avant sevrage.
Impact sur les animaux
L’exploration échographique du rongeur dans le cadre de mises au point techniques nécessite une anesthésie générale d’une durée relativement longue (20 minutes à 1h selon la procédure). La phase d’induction s’accompagne d’une phase d’excitation qui est un stress de faible niveau. La phase de réveil est également un moment critique. Selon la durée de l’anesthésie, l’animal peut voir sa température corporelle chuter. Il peut se déshydrater et perdre un peu de poids. Selon les modèles qui seront mis en œuvre, nous serons amenés à travailler sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) susceptibles d’entrainer stress, gêne respiratoire, difficulté de locomotion et / ou douleur. Les injections intraveineuses d’agents de contraste échographique (microbulles) pourront induire douleur locale et inflammation au niveau du site d’injection. Dans le cadre de suivis gestationnels, l’administration d’hormones (synchronisation de l’œstrus, facilitation de la mise bas) pourra se faire sur animal non anesthésié, sous contention, susceptible d’induire un stress. L’échographie néonatale, impose de séparer le nouveau-né de sa mère et du reste de la portée pour la durée de l’exploration échographique ce qui peut induire des comportements de rejet et / ou d’agressivité de la part de la mère à la réintroduction du nouveau-né dans la cage. L’anesthésie néonatale peut entrainer une dégradation des fonctions respiratoires et cardiaques, de l'hypothermie et une hypoglycémie.
Devenir
Tous les animaux adultes impliqués dans ce projet seront mis à mort à la fin de chaque projet de mise au point expérimentale échographique. Les animaux nés au cours des projets de suivi du développement embryonnaire et/ou mise au point d'injections et/ou prélèvements sous controle échographique et dont l'état général (santé et bien-être) le permettra seront proposés pour réutilisation aux chercheurs propriétaires des lignées en question et titulaires d'une autorisation de projet en cours de validité.
Remplacement
Pour certaines applications, mesure de dureté des tissus en particulier, nous pourrions avoir recours, pour les mises au point très préliminaires, à des objets mimant les tissus vivants (fantômes d’agarose) mais l’échographie est une modalité d’imagerie clinique et préclinique reposant sur les différences d’échogénicités entre les différents organes, fluides et tissus, in vivo, le recours aux animaux reste indispensable y compris dans notre démarche de mise au point expérimentale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre moyen nécessaire et suffisant pour être en mesure d’évaluer la reproductibilité de nos mesures. Ce nombre sera ré-évalué pour chaque nouvelle fonction étudiée, en fonction des spécificités de chaque projet et sur la base de recherches bibliographiques. Afin de réduire le nombre global d’animaux mis en œuvre, les animaux dont l’état de santé et de bien-être général le permet seront, autant que possible, réutilisés lorsque la procédure pratiquée ne remet pas en cause le bien-être et / ou la survie des animaux. Ce sont par ailleurs les mêmes animaux qui seront suivis au cours du temps pour mise au point d’un protocole expérimental donné. Tous les résultats obtenus seront mis à disposition des équipes de recherche pour servir d’études pilotes aux projets de recherches qui s’appuiront sur ces nouvelles méthodes. Ils leur permettront de déterminer la taille de leurs lots d’essais par une approche statistique.
Raffinement
L'imagerie échographique permet d’explorer et mesurer les organes, la circulation et la perfusion sanguine sans douleur avec un stress minimal lié à l’induction de l’anesthésie (isolement et perte de connaissance). Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (à l'aide de grilles d’évaluation et de points limites adaptés à chaque modèle) sera strictement respecté et effectué quotidiennement en concertation avec les équipes de zootechnie. Pour ceux qui devront être transférés d’un établissement utilisateur à un autre, le transfert se fera par voie routière (15 à 30 minutes) dans le respect de la charte de transport établie par notre structure. Pour limiter le stress dû au transport les animaux seront transportés dans leur cage d’origine afin qu’ils conservent leurs repères olfactifs. Lors des explorations échographiques, les animaux seront maintenus sur un support d’imagerie chauffant pendant toute la durée de l’anesthésie générale. Dans le cas des nouveaux-nés, une attention particulière sera portée au maintien de l’environnement olfactif : 1/ pendant la procédure pour réduire le stress du nouveau-né et 2/ pendant la phase de réveil pour qu’il ne soit pas rejeté par sa mère après réintroduction dans la cage. Nous travaillerons sur des animaux ayant développé certaines pathologies (insuffisance cardiaque, infarctus, cancer etc.) mais dans le cadre de ce projet la phase la plus critique des mises au point expérimentales se situera dans les phases les plus précoces et ne devrait donc pas induire de nuisance particulière pour les animaux autres que celles en lien direct avec la méthode expérimentale. Si malgré tout nous devions voir apparaitre des signes de souffrances non soulagés par des traitements vétérinaires classiques (réhydratation parentérale, administration d’antidouleur de type morphiniques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens), les animaux seraient mis à mort rapidement. Nous veillerons à limiter autant que possible le stress subi par les animaux en employant des méthodes de manipulation les plus adaptées (préhension sans contention, maintien de l'environnement olfactif pour les nouveaux nés). Tout stress causé aux animaux serait par ailleurs rédhibitoire pour prétendre mesurer des paramètres physiologiques tels que ceux caractérisant la fonction cardiaque. Certaines injections pourront se faire sur animal non anesthésié (injection d'hormones) mais la plupart seront faites sous anesthésie générale, durant la procédure d'échographie.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre au point et standardiser différentes procédures expérimentales d’échographie, d’échocardiographie et d’écho-élastographie ce qui ne peut se faire que chez l’animal vivant en l’absence de modèles in vitro appropriés. L'utilisation de rongeurs tels que la souris et le rat permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, les cancers ou les maladies métaboliques ou encore le suivi du vieillissement. Le rat est plus particulièrement utilisé dans des applications de neurobiologie ou l’étude de la nécrose osseuse induite lors de radiothérapie du cerveau en particulier. Les rongeurs (souris et rats), grâce à leur courte durée de gestation (21 jours) sont également des modèles particulièrement adaptés pour mener des études de suivi de développement embryonnaire. L’échographie permet de détecter l’apparition de malformations éventuellement associées à certains génotypes et/ou observer le phénomène de résorption embryonnaire pouvant expliquer l’absence de certains génotypes à la mise bas (mortalité embryonnaire). Les animaux adultes seront âgés de 7 semaines minimum à réception dans nos zootechnies. Ils ne seront utilisés qu’après 5 à 7 jours de quarantaine. Les expériences seront majoritairement conduites chez de jeunes adultes de 8 à 12 semaines mais cet âge pourra varier en fonction de l’objet de l’étude (a minima après sevrage et jusqu’à 1 an). Une des procédures, qui nécessite la mise en œuvre de femelles gestantes. Ces femelles (souris et rates) seront mises en accouplement à partir de l’âge de 8 semaines. Les embryons pourront être objets de prélèvements et / ou injections guidées par échographie à tous les stades de développement donc y compris durant le dernier tiers de gestation. Les souriceaux et ratons issus de ces gestations pourront être imagés par échographie avant sevrage (de 1 à 21 jours).
Développement d’un modèle murin de lymphome: exploration du mécanisme d’action des cellules CAR-T – site 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Construire une souris porteuse de lymphome, puis y observer l'effet de cellules CAR-T sur les microbiotes pulmonaire et intestinal: 96 souris mâles de six semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au vingt-huitième jour. Irradiées aux rayons X la veille de l'injection des cellules tumorales, elles subissent trois prélèvements sanguins, des prélèvements de selles tous les deux jours et trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit une fatigue, une perte d'appétit, une perte de poids, puis dans les cas avancés une faiblesse ou une paralysie. Il présente ce travail comme le moyen d'être "les pionniers" de ce type de modèle et d'initier un programme de plus grande envergure déposable dans des appels à projets nationaux.
Objectifs
Les immunothérapies à base de cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre spécifiquement la tumeur a récemment révolutionné la prise en charge de certains cancers hématologiques. Néanmoins, les effets secondaires comme des infections pulmonaires sont nombreux chez les patients traités par ces celluels et conditionne l’efficacité du traitement et le pronostic vital du patient. A ce jour, aucune étude expérimentale n’a été réalisée et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents restent méconnus. L’ambition de ce projet est de développer un modèle murin de lymphome afin d’étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques et leurs interactions avec les microbiotes pulmonaire et intestinal. Pour cela, des souris seront ayant développées un lymphome seront traitées par ces cellules. Les objectifs sont i) de valider l'efficacité d'un traitement par ces cellules et 2) d’étudier l’impact de ce traitement sur la composition des microbiotes pulmonaire et intestinal et l'emergence de bactéries nocives . Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est expérimental puisque le projet a pour objectif de développer un modèle murin pour évaluaer l'efficacité d'un nouveau traitement d'immunothérapie à base de cellules génétiqument modifiées pour reconnaitre directement la tumeur et nous permettra ainsi d’être les pionniers dans la conception de ce type de modèle expérimental. Le deuxième levier majeur est clinique puisque le projet visant à étudier les interactions entre les ces cellules génétiquement modifiées et les bactéries du microbiote a pour but générer des nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer la prise en charge des patients traités par ce type d'approche. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux
Procédures
Les interventions suivront un calendrier précis sur une période de 28 jours. Jour -1 :Les animaux recevront une courte exposition aux rayons X dans le but de préparer le modèle expérimental (Laboratoire de Physique de Clermont rattaché à EU1). Cette étape dure quelques minutes et ne provoque qu’une gêne transitoire. Jour 0 : Une injection sera réalisée afin d’induire le développement de la tumeur (EU1). L’intervention est rapide et effectuée sur des animaux vigiles, avec manipulation douce et réchauffement préalable pour limiter le stress. Jour 2 : Une seconde injection sera réalisée pour administrer les cellules thérapeutiques ou de contrôle (EU1). Suivi du jour 0 au jour 28 : Des prélèvements de sang seront réalisés trois fois (EU1) au cours de l’étude pour suivre la réponse biologique. Des prélèvements de selles seront effectués tous les deux jours pour l’analyse du microbiote (EU1). Une surveillance clinique quotidienne (poids, aspect du pelage, activité, comportement) permettra de détecter précocement tout signe de souffrance (EU1). Des séances d’imagerie non invasives auront lieu à trois reprises (jours 7, 14 et 21)(EU2). Ces examens nécessitent une anesthésie courte (EU2) . Après chaque séance, les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet puis replacés dans leur hébergement habituel (EU1). Jour 28 : Les animaux seront euthanasiés (EU1) selon les méthodes réglementaires, afin de permettre la collecte des organes nécessaires aux analyses prévues.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un léger stress ou une gêne passagère liés aux manipulations, aux anesthésies courtes ou aux déplacements nécessaires aux observations. Ces effets sont temporaires et limités grâce à l’utilisation de cages adaptées, au suivi attentif du personnel et à des conditions d’hébergement confortables. La maladie induite par la tumeur peut provoquer une fatigue, une baisse de l’appétit, une perte de poids ou une diminution de l’activité. Dans les cas plus avancés, une faiblesse ou une paralysie peuvent apparaître. Les animaux seront observés chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse. Si nécessaire, un traitement adapté sera administré ou l’animal sera retiré de l’étude pour éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par l'analyse de la composition des microbiotes dans le poumons et l'intestin.
Remplacement
Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des co-cultures entre les cellules de lymphomes, les cellules genetiquement modifiées pour reconnaitre directement la tumeur mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’efficacité du traitement par ce type d'immunothérapie, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe le protocole d’immunothérapie par cellules modifiées qui est proposé aux patients atteints de lymphome et ainsi comprendre l’impact sur les microbiotes pulmonaire et intestinal dans ce modèle en caractérisant les effets directes (perte d’efficacité du traitement, resistance au traitement,…) mais également les effets indirectes (modification des microbiotes pulmonaire et intestinal, émergence de pathobiontes, inflammation…)
Réduction
Des tests in vitro préalables (co-cultures lymphome/cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre la tumeur) ont permis de limiter le recours aux animaux. Le nombre d’animaux in vivo a été calculé à partir d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats significatifs avec des lots de taille minimale (8 souris/lot, 3 répétitions). Chaque animal sera exploité au maximum (prélèvements multiples d’organes et fluides) afin d’optimiser l’information obtenue et réduire le nombre total nécessaire.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies avec un enrichissement de milieu varié (rouleaux en carton, coton pour nidification, matériaux à ronger) permettant l’expression des comportements naturels et la réduction du stress.En fonction de l’état clinique des animaux et de la progression tumorale, l’enrichissement sera adapté individuellement : raccourcissement ou retrait partiel des tubes en carton pour faciliter les déplacements en cas de mobilité réduite ;déplacement de la nourriture et de l’eau vers la zone la plus accessible ;utilisation de nourriture humidifiée ou émiettée et de gels hydratants pour maintenir la prise alimentaire et limiter la déshydratation ;ajout de matériaux de confort (nids de coton compactés) pour réduire la fatigue. Une surveillance quotidienne sera assurée (pesée, l’évaluation de l’activité, du comportement, de la posture, du pelage et de la respiration). Ces observations seront consignées dans une grille de scoring clinique spécifique au modèle de lymphome. Tout signe de souffrance ou de douleur déclenchera l’administration d’un traitement antalgique .En cas de non-amélioration, l’animal sera immédiatement euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les transports entre EU1 et EU2 sont de très courte durée (5 minutes). Les animaux sont déplacés dans des cages dédiées, enrichies et placées dans des cartons opaques. Ces mesures minimisent les stimuli stressants. Les trajets sont limités au strict nécessaire, réalisés par du personnel formé, avec surveillance clinique avant et après déplacement et établissement d’un certificat de transport. Les animaux regagnent leur hébergement immédiatement après chaque procédure.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris mâles de 6 semaines, pesant environ 20 g. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel, avec des populations lymphocytaires diversifiées et un microbiote intestinal stabilisé. Cette espèce est adaptée à l’étude des lymphomes car des lignées de cellules B tumorales y sont disponibles, et des protocoles établis permettent la modification génétique des lymphocytes T pour générer les cellules thérapeutiques in vitro. Le choix du sexe mâle est motivé par deux raisons principales : Comparabilité avec nos travaux antérieurs, déjà réalisés chez des mâles, ce qui garantit la cohérence et la continuité des données. Prépondérance masculine décrite dans les lymphomes, ce qui confère une pertinence scientifique et permet de limiter le nombre d’animaux en évitant la duplication des expériences sur les deux sexes (principe de réduction).
Étude de la modulation du métabolisme des monocytes sur la récupération post-infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Ouvertes au niveau du thorax pour qu'un infarctus leur soit provoqué, jusqu'à 140 minutes sous anesthésie profonde, 356 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, huit autres d'un niveau léger. Le porteur reconnaît une douleur modérée à sévère pendant et après l'opération. Viennent ensuite une échographie de vingt à trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés, avant le développement attendu d'une insuffisance cardiaque, que le RNT décrit comme sans conséquence clinique visible en raison du court délai avant la mise à mort. Les 364 souris sont tuées pour prélever leur cœur et leurs poumons et y mesurer l'infiltration des cellules immunitaires.
Objectifs
Après une crise cardiaque, le corps réagit par une inflammation qui peut parfois persister et fragiliser davantage le cœur. Ce projet vise à mieux comprendre cette réaction inflammatoire pour la maîtriser, tout en préservant les défenses naturelles de l’organisme. Nous nous intéressons à des cellules immunitaires appelées monocytes, qui jouent un rôle central dans l’inflammation et la réparation du tissu cardiaque. En étudiant leur comportement chez l’humain et chez la souris, nous cherchons à repérer les signes précoces d’une inflammation excessive et à explorer de nouvelles pistes pour la réguler. Notre objectif : développer des traitements innovants pour mieux protéger le cœur après un infarctus, anticiper les complications, et améliorer le suivi des patients les plus à risque.
Bénéfices attendus
Nous pensons que ce projet introduira une nouvelle approche thérapeutique post-infarctus du myocarde en limitant l’inflammation, réduisant ainsi le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce projet pourra également ouvrir la voie à de nombreuses études d’intervention post-infarctus du myocarde à fort impact, notamment en collaboration les centres de recherche clinique proches. Il générera des connaissances nouvelles de haute qualité, disponibles en accès libre. De plus, les techniques et expertises développées dans le cadre de ce projet pourront être appliquées à d’autres pathologies cardiovasculaires impliquant une dérégulation de l’inflammation, comme la myocardite. À plus long terme, l’objectif est de transposer ces avancées en stratégies thérapeutiques disponibles en clinique. Impacts économiques et technologiques attendus : L’insuffisance cardiaque représente un coût économique considérable, lié aux traitements à vie et aux hospitalisations fréquentes (estimé à 991 millions d’euros par an en France). Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou ralentir la progression de cette maladie pourrait réduire significativement cette charge économique. À court terme, ce projet permettra d’explorer une nouvelle voie thérapeutique dans le traitement de l’insuffisance cardiaque. À long terme, il pourrait ouvrir des perspectives vers le développement de solutions thérapeutiques ciblées. Au-delà de l’impact économique, l’insuffisance cardiaque altère fortement la qualité de vie des patients (environ 160 000 hospitalisations chaque année en France). En améliorant les approches thérapeutiques et les stratégies de prévention, notamment par la nutrition et l’exercice physique, nous pourrions atténuer les conséquences de l’infarctus du myocarde sur la vie des patients. L’impact à long terme de ce projet pourrait bénéficier à plusieurs milliers de patients chaque année
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale thoracique visant à induire un infarctus du myocarde, réalisée sous anesthésie générale profonde avec une couverture analgésique adaptée (140 minutes maximum). Le suivi des animaux implique un examen échographique (20 à 30 minutes) et cinq prélèvements sanguins par animal (moins d’1 minute chacun), réalisés sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation. .
Impact sur les animaux
La chirurgie thoracique provoque une douleur modérée à sévère, per- et post-opératoire, de durée moyenne. Aucune nuisance n’est attendue pendant les examens échographiques (non invasif). Les prélèvements sanguins engendrent une douleur légère de très courte durée. L’induction de l’anesthésie (ou la sédation selon l’examen) associée à ces interventions, de même que le réveil, induisent un léger stress ou inconfort de courte durée. Pour les groupes d’animaux ayant subi un infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu, mais sans conséquence clinique visible ou invalidante associée dans les conditions expérimentales prévues (délais court entre l’infarctus et l’euthanasie de l’animal).
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement de différents organes (cœur, poumons…), pour effectuer des analyses tissulaires et des analyses d’infiltration des cellules immunitaires.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur des données in vitro et in vivo déjà publiée montrant le rôle clef du métabolisme dans la réponse inflammatoire post infarctus. Dans le présent projet nous cherchons à identifier le rôle clefs de la réponse inflammatoire post infarctus, qui est un phénomène multi organe nécessitant une approche sur organisme vivant. En effet, les monocytes infiltrant le tissu myocardique sont produits à distance dans la moelle osseuse, puis circulent dans le sang et infiltrent le cœur.
Réduction
L’utilisation du même animal pour un prélèvement sanguin a différent temps permet d’augmenter la puissance statistique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le calcul des nombres d’animaux nécessaires a été réalisé avec l’appui du biostatisticien.
Raffinement
La chirurgie et les examens d’imagerie seront entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec une couverture analgésique adaptée. Grâce au recul de l’équipe sur ce modèle chirurgicale, nous appliquerons tous les raffinements mis en place jusqu’ici (abord chirurgical sans résection de côte, soin post-opératoire,…) Des points limites sont établis en conséquence, afin de permettre l’interruption de l’expérimentation en cas d’apparition de douleur, stress, angoisse ou dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou de soulager.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature pour les études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. Malgré certaines différences physiologiques, telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris s’est révélée être un modèle pertinent pour l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de l’inflammation. La disponibilité de modèles génétiquement modifiés permet également une compréhension plus détaillée des mécanismes sous-jacents. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde, nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque, est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, ce qui nous permet de bénéficier d’un excellent retour d’expérience. Les animaux seront âgés de 10 à 16 semaines au début de chaque procédure. Ce stade de développement est le plus couramment utilisé, permettant une réalisation maîtrisée et homogène de la chirurgie. Il permet également de s’affranchir de la variabilité interindividuelle apparaissant avec le vieillissement des animaux.
Implication de l’enzyme EZH2 dans un modèle murin de développement de maladie valvulaire cardiaque (rétrécissement aortique calcifié)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une souris qui ne réagit plus à un stimulus, ou qui reste inactive dans sa cage plus de six heures, est mise à mort. 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Génétiquement modifiées pour le métabolisme des lipides et soumises à un régime riche en graisses prolongé, elles développent une dysfonction de la valve aortique, subissent une biopsie du cartilage de l'oreille au sevrage, trois jours d'injections et une anesthésie gazeuse à chaque échocardiographie. Le porteur écrit que le modèle qu'il cherche à mettre au point a déjà été décrit par d'autres équipes, et repousse le calcul de puissance statistique à l'après-mise au point, sans justifier l'effectif de départ.
Objectifs
L’objectif du projet est de mettre au point un modèle murin de maladie valvulaire cardiaque appelée rétrécissement aortique calcifié. Cette pathologie se caractérise par un épaississement puis une calcification progressive de la valve aortique, limitant son ouverture et compromettant son étanchéité. Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement de la maladie et d’évaluer l’efficacité de traitements pharmacologiques, actuellement inexistants.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra, dans un premier temps, de mettre au point chez la souris un modèle de rétrécissement aortique calcifié (RAC), déjà décrit par d’autres équipes, qui pourra ensuite être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement du RAC, ainsi que pour évaluer le bénéfice potentiel de traitements pharmacologiques de cette pathologie in vivo. Dans un second temps, nous étudierons l’implication de l’activité de d'une enzyme dans différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaires, cellules inflammatoires, etc...), grâce à l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées (OGM) au cours du développement du RAC. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, proposer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de l’enzyme, spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant constituer une approche innovante pour limiter la progression du RAC chez l’Homme.
Procédures
Biopsie du cartilage auriculaire externe de 2mm au moment du sevrage. Injections quotidiennes durant 3 jours. Anesthésie gazeuse lors de chaque échocardiographie.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons, si notre modèle s’avère fonctionnel, à observer des signes de dysfonction cardiaque — notamment une augmentation du gradient transvalvulaire — et plus particulièrement de la valve aortique pendant plusieurs jours, évalués par échocardiographie. Cette dysfonction pourrait entraîner chez l’animal un état de fatigue, notamment à l’effort pendant plusieurs minutes. L’injection de la molécule induisant la délétion pourrait également provoquer des rougeurs, des douleurs ou une inflammation abdominale pendant quelques minutes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette étude.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro, car l’objectif de cette étude est de mettre au point un modèle murin de rétrécissement aortique calcifié (RAC), inexistant à ce jour.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons de manière séquentielle des mesures non invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation et de mutualisation des prélèvements réalisés au moment de la mise à mort pour les analyses ex vivo. Ainsi, les tissus prélevés pour chaque animal seront congelés, broyés puis réduits à l’état de poudre, afin d’être répartis pour différentes analyses : lipidomiques, protéiques et moléculaires. De cette manière, un seul animal sera utilisé pour l’ensemble de ces analyses ex vivo, en lieu et place d’un animal dédié à chacune des méthodes. À l’issue de la phase de mise au point du modèle animal, nous ajusterons le nombre d’animaux nécessaires aux procédures suivantes à l’aide d'un calcul de puissance statistique, afin d’optimiser et réduire encore le nombre d’animaux requis. Enfin, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures, afin de s’affranchir d’un effet lié au sexe et de valoriser l’ensemble des animaux géntiquement modifiés produits dans notre animalerie.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément aux normes en vigueur, avec un enrichissement environnemental adapté. Des points limites précis ont été définis (absence de réaction à un stimulus, inactivité prolongée dans la cage pendant plus de six heures, manifestation de signes de détresse), ainsi qu’une stratégie d’anesthésie et d’analgésie appropriée associée à un suivi quotidien des signes cliniques et à un suivi du poids hebdomadaire. Par ailleurs, les expérimentateurs auront des contacts pluri-hebdomadaires avec les animaux afin de favoriser leur habituation à la manipulation. L’identification des souris génétiquement modifiées par puçage sous-cutané et la biopsie du cartilage auriculaire externe nécessaire au génotypage seront réalisées de manière concomitante, au cours d’une procédure unique, sous anesthésie gazeuse. Cette organisation vise à limiter le stress et à réduire le nombre d’anesthésies.
Choix des espèces
La souris présente l’avantage indéniable de permettre l’utilisation d’outils de biologie moléculaire qui ne sont pas toujours accessibles chez le rat (modèle également développé au sein de notre laboratoire), tels que l’invalidation ciblée d’un gène dans différents types cellulaires, comme c’est le cas dans cette étude. Ces modèles sont particulièrement pertinents pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de la dysfonction valvulaire aortique responsable de la maladie cardiaque dont cette demande fait l'objet. Nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiée pour le métabolisme des lipides qui, associé à un régime alimentaire riche en graisses prolongé induit une dysfonction valvulaire aortique similaire à celle observé chez des patients. Des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et pesant 20 à 24 g, seront utilisés pour cette étude. À cet âge, la taille des souris permet de faciliter le suivi échocardiographique de la maladie.
Thérapie pour l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour des analyses tissulaires, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus leur est provoqué par une chirurgie de trente minutes, qui détruit une partie du muscle du ventricule gauche. Suivent trois échographies cardiaques, une injection pendant l'opération, puis deux injections par jour pendant les 72 heures suivantes. Le porteur annonce un bénéfice au conditionnel, un traitement qui pourrait stabiliser la fonction cardiaque après un infarctus, et affirme que les méthodes sans animaux sont "insuffisantes" pour reproduire les interactions entre organes.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires constituent la principale cause de mortalité à l'échelle mondiale, représentant un enjeu majeur pour les systèmes de santé. La réparation cardiaque post-ischémique, un processus biologique complexe, est un facteur pronostique déterminant suite à une crise cardiaque. L'amélioration de ce processus est cruciale pour prévenir l'évolution vers l'insuffisance cardiaque et optimiser le pronostic des patients. Dans ce contexte, le projet vise à évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique. Celle-ci repose sur la libération contrôlée d'une petite molécule. Cette molécule présente des effets multiples, ciblant notamment les cellules contractiles et les cellules inflammatoires, et agit en réduisant l'accumulation délétère du fer dans le tissu cardiaque. Les objectifs de ce projet sont donc doublement définis :1/Caractériser les effets de cette nouvelle approche thérapeutique sur la réparation cardiaque post-infarctus chez la souris et 2/Élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ce contexte thérapeutique.
Bénéfices attendus
L’enjeu de ce projet est d'améliorer la récupération du cœur après un infarctus et de prévenir l'insuffisance cardiaque, maladie grave. La cible est l'accumulation de fer toxique qui endommage le tissu cardiaque après une crise. Le bénéfice principal attendu est la réduction des dommages et l'amélioration de la réparation cardiaque grâce à une nouvelle molécule qui piège le fer. Une nouvelle molécule encapsulée dans un système de micro-capsules pour une action plus longue et plus ciblée sera testée. Si cette approche est validée, elle pourrait offrir aux patients un traitement plus efficace pour stabiliser la fonction cardiaque et obtenir un meilleur pronostic après un infarctus.
Procédures
Chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // 3 échographies cardiaques/souris // Une injection au moment de la chirurgie - durée 1 min// Une injection pré-opératoire et deux injections par jour pendant 72 heures post-opératoire - durée 1 min.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires. Les infarctus du myocarde vont entraîner la mort d’une partie du tissu cardiaque ventriculaire gauche.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour analyses tissulaires de l'efficacité du traitement.
Remplacement
Le projet est axé sur l'étude de la réparation cardiaque post-infarctus. L'utilisation de modèles animaux est indispensable car ce processus implique une physiopathologie intégrée (changements structurels et fonctionnels du cœur entier), une réponse inflammatoire systémique et la pharmacocinétique complexe de l'agent thérapeutique dans différents organes. Les méthodes cellulaires ou alternatives sont insuffisantes pour reproduire ces interactions multi-organes, le flux sanguin, la distribution du médicament et l'évaluation globale et dynamique de la fonction cardiaque. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'une crise cardiaque.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1.La souris est le modèle standard et le plus pertinent pour l'étude de la réparation cardiaque après un infarctus, permettant une comparabilité avec les données historiques et de la littérature. 2.Reproductibilité et Surveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques dans un délai de temps pertinent. 3.Complexité Biologique : Contrairement aux modèles cellulaires ou alternatifs, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions locales et systémiques impliquées dans la réparation cardiaque après un infarctus. 4. Stade de développement adulte. Cela rend le modèle hautement pertinent pour simuler les conditions physiopathologiques humaines et évaluer des thérapies visant la réparation ou l'amélioration du remodelage cardiaque dans un contexte clinique.
Etude de la cardiotoxicité induite par les traitements anti-cancéreux. EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour tester des molécules censées protéger le cœur pendant une chimiothérapie anticancéreuse, 600 souris reçoivent une greffe de cellules tumorales puis de la doxorubicine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin du protocole, le porteur jugeant "indispensables" les prélèvements de cœur, de tumeur, de foie et de reins. Aux injections quotidiennes pendant quatre semaines s'ajoute une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, avec un risque de nécrose au site d'injection, d'intolérance à l'effort et d'hypothermie au réveil. Trois seuils déclenchent la mise à mort avant terme, la perte de poids, la taille de la tumeur et la détresse respiratoire.
Objectifs
La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.
Procédures
Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.
Remplacement
L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.
Raffinement
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.
Choix des espèces
L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.
Etude du rôle de nouveaux gênes candidats dans la formation de l’anévrisme intracrânien chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour ligaturer une carotide et les artères rénales, puis à quatre à six mois d'eau salée destinée à faire monter leur pression artérielle, 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées par perfusion à la fin du traitement, pour des analyses histologiques des vaisseaux du cerveau. Pour 72 d'entre elles, un gène est invalidé par une injection pratiquée aux premier, deuxième et troisième jours de vie. Le porteur écrit n'avoir jamais constaté de souffrance liée à une hémorragie intracrânienne, son modèle ne provoquant pas la rupture des anévrismes qu'il fait apparaître.
Objectifs
L'anévrisme intracrânien (AIC) est une anomalie cérébrovasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. L'AIC se caractérise par une dilatation localisée et un amincissement de la paroi des artères intracrâniennes, le plus souvent au niveau des bifurcations artérielles du réseau sanguin artériel cérébral. La complication dévastatrice de l'AIC est sa rupture et l'hémorragie cérébrale qui en résulte, mortelle dans la moitié des cas ou laissant des séquelles neurologiques majeures. Il n'existe malheureusement aucun outil de diagnostic pour prédire la formation ou le devenir d'un AIC chez un individu donné. Les traitements actuels sont invasifs, chirurgical ou endovasculaire, avec un risque significatif de morbidité procédurale. A ce jour, la prise en charge des patients atteints d'AIC reste donc extrêmement difficile et controversée. Les facteurs de risque tels que l'hypertension, l'augmentation de l'âge, le tabagisme, la consommation excessive d'alcool, les antécédents familiaux d'AIC mais également le sexe féminin, prédisposent à la formation et à la rupture de l'AIC. De par son caractère multifactoriel, la mise en place de modèles expérimentaux in vivo mimant l’AIC est essentielle pour mieux comprendre sa formation, son développement et sa rupture.
Bénéfices attendus
La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie cérébrale dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Le projet pour lequel cette saisine est déposée nous permettra donc, (i)d'identifier le rôle potentiel de différentes mutations dans la formation des anévrismes (ii) de répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'AIC. En identifiant les mécanismes par lesquels certaines mutations favorisent la formation des anévrismes dans les artères cérébrales, ce projet devrait permettre de découvrir des cibles pharmacologiques potentielles pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture, mais également de découvrir de potentiels marqueurs biologiques pour suivre l'évolution des AIC et en prédire la rupture. (iii) de découvrir de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'AIC est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Faciliter le diagnostic et le pronostic et ainsi offrir une perspective de traitement pharmacologique sont de véritables enjeux pour une meilleure prise en charge de ces patients.
Procédures
Modèle d'anévrisme intracrânien effectué sur 136 souris : 2 chirurgies à 1 semaine d'intervalle pour ligature des artères carotide et rénales puis traitement en eau de boisson par ajout d'une solution saline pendant 4 à 6 mois. Chaque chirurgie dure entre 15 et 30 minutes. Perfusion de 136 souris (procédure terminale: la totalité du protocole de perfusion dure environ 20 minutes) Mesures de la pression artérielle pour un suivi longitudinal (basal, milieu de traitement et fin de traitement) sur 120 souris porteuses de mutation. Chaque cycle de mesures dure entre 20 et 30 minutes. Injections pour invalidation d'un gène (1 injection/jour pendant 3 jours: durée 30 secondes)
Impact sur les animaux
La présence d’un anévrisme intracrânien est, la plupart du temps, asymptomatique, ce qui en rend difficile sa détection, de surcroît chez la souris. La rupture d’un anévrisme, quant à elle, est imprévisible et brutale, suivie dans 50% des cas par un coma voire une mort subite. Les symptômes de la rupture sont consécutifs à l’hémorragie intracrânienne qu’elle occasionne. Leur intensité dépend de l’ampleur et de la localisation de l’hémorragie. Notre modèle d’AIC n’est pas un modèle de rupture. Par conséquent, nous n’avons jamais constaté de nuisances ou de souffrance en lien avec la survenue d’une hémorragie intracrânienne. Une perte de poids transitoire est observée les 2 jours suivant chacune des chirurgies. Le retour au poids initial se fait en 2 à 3 jours post-chirurgie. Les souris sont surveillées 2 à 3 fois/jour/3jours en post-opératoire avec injections d'anti-douleur et d’anti-inflammatoire. Ces injections nécessitent une contention pouvant potentiellement stresser l’animal. Pour chacune des chirurgies réalisées, des incisions des plans cutanés et musculaires sont nécessaires. La cicatrisation des points est donc à surveiller pour éviter toute infection. Enfin, le suivi de pression artérielle est réalisé sur souris vigile. Cette étape pouvant stresser l’animal, une période d’acclimatation d’1 semaine est nécessaire pour l’obtention de mesures fiables et reproductibles.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après les 4 à 6 mois de traitement hypertenseur pour prélèvements en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
La pathologie anévrismale met en jeu différents compartiments cellulaires (cellules inflammatoires, endothéliales, musculaires lisses) et intègre plusieurs paramètres anatomiques (structure de la paroi et géométrie des vaisseaux) et systémiques (pression artérielle, vieillissement). Il n’existe malheureusement pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro, ex vivo ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques nécessaires pour statuer sur l’implication des différentes mutations étudiées dans cette pathologie. C’est pourquoi le recours au modèle animal est indispensable et ne peut se substituer à un autre modèle.
Réduction
Le modèle d’AIC est un modèle connu pour avoir environ 10% de mortalité, péri-opératoire essentiellement. De par notre expertise, nous avons pu améliorer ce protocole et dans nos mains, la mortalité péri-opératoire est quasi-nulle (moins de 1%). Quand ce sera possible, nous envisageons l’étude de 2 gènes en parallèle. Dans ce cas, le groupe contrôle servira pour les 2 gènes étudiés, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cette approche nous permettra également d’identifier « in vivo », dans la pathologie anévrismale, si oui ou non le gène étudié est pertinent. En fonction des résultats obtenus, nous saurons s’il est pertinent de poursuivre l’étude de cette mutation dans un nouveau projet ou non.
Raffinement
Les souris, stabulées en conditions normales d’hébergement, seront au nombre de 3 à 5 par cage, avec accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Durant les 3 premières semaines du protocole, les souris seront surveillées plusieurs fois par jour pour pouvoir identifier, au plus tôt, une souffrance de l’animal et mettre en place les mesures nécessaires pour limiter ce stress ou cette douleur. De plus, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d'analgésiques adéquats dès que nécessaire.
Choix des espèces
Pour le système cérébro-vasculaire, il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal entier, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. A ce jour, il n’existe pas d’approche expérimentale apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. De plus, la souris est un animal chez lequel les manipulations génétiques permettent la création de modèles de maladie humaine, en particulier de maladies des petits vaisseaux cérébraux. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. Les souris seront toutes utilisées à l’âge adulte. Ces dernières étant traitées au maximum pendant 6 mois, le début des expérimentations commencera quand les souris seront âgées entre 10 et 12 semaines. Sur les 136 souris, si les modèles retenus sont des modèles conditionnels, 72 souris (soit 3 mutations maximum) devront alors être invalidées de façon précoce pour le gène candidat dans un territoire donné, par une injection à la naissance d'une solution aux jours 1, 2 et 3 de vie des animaux.