Système cardiaque

Anesthésiées pour la totalité des procédures, les souris ne reprennent jamais conscience: prélèvement de sang ou accès à un vaisseau pour y placer un dispositif, puis mise à mort immédiate. 253 souris vont être utilisées, 232 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 21 un niveau modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem sur organes. Il s'agit de mesurer l'effet de la carbamylation du collagène sur l'agrégation des plaquettes, le temps de saignement et la thrombose artérielle, à la suite d'une étude déjà menée sur des plaquettes humaines. Le RNT ne nomme ni le dispositif introduit dans le vaisseau ni le modèle de thrombose employé, et le porteur affirme que ce modèle n'a été associé à aucun signe de souffrance chez les animaux traités.

Objectifs

Selon les données de l'Organisation Mondiale de la Santé, d'ici à 2030, une personne sur six dans le monde aura 60 ans ou plus. Cet allongement de la durée de vie engendre une explosion des maladies chroniques telles que les affections cardiovasculaires. Du point de vue biologique, le vieillissement est le produit de l’accumulation d’un vaste éventail de dommages moléculaires et cellulaires au fil du temps. Au niveau vasculaire, le vieillissement conduit à des modifications des constituants des vaisseaux, dont le collagène. Le collagène voit ses propriétés structurales et fonctionnelles altérées en partie à cause de modifications chimiques appelées réactions de carbamylation. Ces réactions de carbamylation sont amplifiées lors de l'insuffisance rénale chronique, pathologie conduisant à des complications thrombotiques mais aussi hémorragiques qui font intervenir les plaquettes sanguines. Ce projet a donc pour but d'étudier les effets de la carbamylation du collagène sur les fonctions des plaquettes sanguines dans l'hémostase et la thrombose artérielle dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet d'expérimentation animale permettra de déterminer quels sont les impacts de la carbamylation du collagène et/ou des plaquettes sur l'agrégation plaquettaire, l'hémostase et la thrombose artérielle grâce à l'utilisation de modèles animaux parfaitement maîtrisés par le laboratoire porteur du projet. En d'autres termes, les résultats de ce projet permettront de déterminer si la carbamylation du collagène, qui survient au cours du vieillissement, constitue un facteur de risque d'évènements cardiovasculaires (thrombose, hémorragie) chez les patients insuffisants rénaux, dont le taux de mortalité dû aux maladies cardiovasculaires chez les personnes dialysées est de 10 à 30 fois plus élevé que dans la population générale. L'objectif etant de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques au cours du viellisssement.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. À l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour à la conscience. Trois types de procédures de courte durée (10 à 60 minutes maximum) seront menées. Elles incluront des manipulations limitées visant soit à obtenir un prélèvement sanguin, soit à permettre l’accès transitoire à un vaisseau sanguin pour la mise en place d’un dispositif exploratoire, avant euthanasie immédiate.

Impact sur les animaux

Durant l’anesthésie, une surveillance attentive sera assurée afin de détecter tout signe suggérant une dégradation irréversible de l’état général. En cas d’apparition d’un critère indiquant une souffrance ou une détresse non contrôlable, l’animal sera immédiatement euthanasié. La profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée afin de garantir l’absence de perception de douleur ou d’inconfort pendant toute la durée des procédures. En cas de signe de réveil, l’anesthésie sera ajustée afin de maintenir une sédation adéquate jusqu’à la fin de l’expérience. Des mesures seront prises pour prévenir l’hypothermie et assurer un confort optimal pendant l’anesthésie. Enfin, le modèle utilisé a déjà été validé dans des travaux antérieurs et n’a pas été associé à l’apparition de signes de souffrance ou d’effets indésirables chez les animaux traités.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale pour analyses post-mortem sur organes.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d'une étude réalisée ex vivo à partir de plaquettes humaines ayant montré que la carbamylation du collagène modifie l'adhérence des plaquettes. Ce projet vise donc à valider les effets de la carbamylation dans les processus d'hémostase et/ou de thrombose in vivo chez la souris. La formation de thrombose artérielle est un phénomène complexe, multifactoriel, multicellulaire, qui nécessite l'utilisation de modèles intégrés. Par ailleurs, aucun modèle de substitution n'existe pour mesurer l'effet d'une substance sur le prolongement du temps de saignement. Des mesures d'agrégation plaquettaire et du temps de thrombose artérielle seront également réalisés.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 253. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Les souris sont anesthésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons scientifiques, pratiques et éthiques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris mâles seront agées entre 8 à 20 semaines correspondant à des souris adultes dont les parramètres hémostatiques et vasculaires sont biens définis.

Comprendre comment l'acide rétinoïque commande la formation du cœur conduit ici à bloquer sa réception pendant le développement embryonnaire. 1 050 souris vont être utilisées, 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 800 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever les organes. Les femelles adultes ne reçoivent qu'une administration orale unique de moins d'une minute, les atteintes déclarées portant sur les embryons et les fœtus, qui peuvent développer des malformations cardiaques légères à modérées avant d'être prélevés à différents stades. Le porteur écrit que si le phénotype est trop sévère aux stades précoces, il ne "produira" pas les animaux des stades plus tardifs.

Objectifs

Les malformations cardiaques congénitales touchent plus d’un pourcent des naissances viables chez l’homme. Ces malformations sont la conséquence d’évènements précoces survenant au cours de la vie embryonnaire. Les malformations cardiaques peuvent être liées à des anomalies génétiques et/ou à des expositions de la mère à des agents conduitsant à des malformations durant la gestation. En particulier, l’acide rétinoïque (AR), dérivé de la vitamine A fourni par l’alimentation, joue un rôle clé dans la formation du cœur. Des dérégulations de la voie de l’AR (excès ou carence) durant le développement embryonnaire se traduisent par de graves malformations du cœur. L’objectif de ce projet est de comprendre comment la voie de l’AR contrôle le développement des différents types cellulaires nécessaires à la formation normale du cœur. Pour se faire, nous allons utiliser des modèles murins génétiquement altérés permettant de bloquer la réception de l’AR au cours du développement embryonnaire et analyser les conséquences sur le développement des différentes structures cardiaques.

Bénéfices attendus

Il est estimé que 15% des femmes enceintes dans le monde souffrent de déficience en AR, la compréhension du rôle de l’AR durant le développement embryonnaire est un prérequis essentiel au développement de mesures préventives et de thérapies dans le futur. Nous attendons de ce projet qu’il améliore nos connaissances sur le rôle de la voie de l’AR dans la formation du cœur des vertébrés et qu’il fournisse une explication mécanistique à l’origine des malformations cardiaques congénitales liées à une altération de la voie de l’AR.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration unique d'un traitement par voie orale (moins de 1 minute)

Impact sur les animaux

Les animaux adultes resentiront une gêne légère et de coute durée lors de l'administration du traitement. Les embryons et foetus peuvent développer des malformations congénitales de sévérités variables (légères à modérées)

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organes et réaliser des analyses post mortem.

Remplacement

Notre projet consiste en l’étude de la morphogénèse cardiaque durant le développement embryonnaire qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. Le cœur humain comme celui de la souris est composé de quatre cavités, une aorte et un tronc pulmonaire. Nous allons étudier le développement de ces différentes structures ce qui rend l’utilisation du modèle poisson (contenant un seul ventricule et un seul gros vaisseau) ou d’autres modèles d’invertébrés incompatibles avec nos recherches.

Réduction

Par une approche statistique nous réduirons au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques adaptés. Si nous constatons un phénotype trop sévère aux plus jeunes âges, nous ne produirons pas les animaux des stades foetaux les plus tardifs.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des souris contention. Afin de ne pas générer de souffrance foetale inutile, si nous obervons un phénotype trop sévère aux stades embryonnaires, nous ne produirons pas les animaux des stades les plus tardifs.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celle du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des malformations cardiaques congénitales et de leurs causes génétiques et/ou environnementales. Pour les accouplements, les femelles seront utilisées durant la fenêtre de fertilité des rongeurs, entre 2 et 8 mois. Afin de suivre le développement cardiaque des embryons et foetus seront prélevés à différents stades de développement embryonnaire et foetal.

Biopsie de deux millimètres au bout de la queue, tatouage des coussinets avant le sevrage, gavage oral, prélèvement de sang à la joue toutes les deux semaines, jeûne de douze à quinze heures, puis mise à mort par dislocation cervicale. 20 960 souris vont être utilisées, 20 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 800 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur annonce que les souris seront étudiées avant l'apparition du phénotype dommageable, et décrit aussi une baisse d'appétit, un amaigrissement et une diminution de l'activité liés aux lésions prétumorales et au vieillissement accéléré. Rien ne justifie un effectif de 20 960 animaux au-delà d'une phrase sur le "nombre minimum d'animaux nécessaires".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de développer de nouvelles lignées de souris présentant une activation ou diminution d’une molécule d'intérêt récemment identifiée impliquée dans le métabolisme des lipides et qui serait responsable du vieillissement cellulaire. Nous souhaitons moduler génétiquement son expression dans un contexte de lésions précancéreuses et tester son effet thérapeutique sur la progression des lésions dans le tissu. Nous souhaitons confirmer des données obtenues dans un modèle cellulaire sur sa capacité à induire le vieillissement cellulaire.

Bénéfices attendus

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.

Procédures

-avant le sevrage, (2 contentions, quelques secondes ) pour biopsie de queue de 2 millimètres et pour le tatouage aux coussinets -lors des pesées (1 contention, quelques secondes ) - gavage oral à 3 ou 6 semaines de vie (1 ou 5 fois, avec 1 minute par gavage) -prélèvement de sang à la joue (1 fois toutes les 2 semaines, quelques minutes -1 jour avant la mise à mort (mise à jeun (1fois, 12 à 15H) mise à mort précoce par dislocation cervicale et prélèvement des tissus pour différentes analyses.

Impact sur les animaux

-léger stress due à la contention pour biopsie, identification, pesée et prélèvement sanguin -Le gavage oral quotidien peut engendrer des risques de fausse route. -Les souris induites développent des lésions non dommageables à un âge précoce et seront étudiées avant le phénotype dommageable. -Les lésions prétumorales et le vieillissement accéléré peuvent entraîner à un stade avancé une baisse de l’appétit, un amaigrissement et une diminution de l’activité.

Devenir

​Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure pour renouveler les croisements ou pour exploration des tissus et organes d'intérêt.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des lésions prétumorales ou le vieillissement, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par des tests statistiques adaptés, et qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux en cage ventilée. Une surveillance accrue sera mise en place tout au long de la procédure. Cependant, tout animal en souffrance sera mis à mort avant l'apparition des points limites stricts et spécifiques définis selon les recommandations en vigueur.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les jeunes souris de trois semaines sont utilisées car il est nécessaire que les organes soit suffisament matures et fonctionnels.

Une aiguille est enfoncée dans le genou droit de souris hémophiles pour y provoquer un saignement, geste répété quinze jours plus tard sur la même articulation. 29 souris vont être utilisées ainsi, 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'attendre aucune douleur après le réveil, et prévoit pourtant de poser nourriture et eau gélifiées au sol pour éviter aux souris de se redresser sur les pattes arrière compte tenu des douleurs du genou. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang, volume qu'il juge incompatible avec le maintien en vie de l'animal.

Objectifs

L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. L’arthropathie hémophilique partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde. Comme dans le stade précoce de l’arthropathie hémophilique, chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, il existe une inflammation articulaire. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, afin de prévenir les saignements récurrents responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, pour la faire régresser afin de bloquer la progression de l’arthropathie hémophilique, alors que les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 largement utilisés dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde entant que médicament de première intention pourrait être potentiellement efficace. Il s’agit de médicaments visant à contrôler l’inflammation. Il a été montré que les anti-TNF alpha étaient efficaces chez 60 à 70 % des patients avec polyarthrite rhumatoïde et les anti-IL6 ont montré une efficacité chez 55% des patients avec la polyarthrite rhumatoïde qui ont eu une rémission. Nous avons fait l’hypothèse que le ces anticorps pourrait réduire l’inflammation de la synovite comme traitement curatif chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la polyarthrite rhumatoïde. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité curative des anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 pour traiter la synovite de l’arthropathie hémophilique et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B

Bénéfices attendus

La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ces médicaments dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante de ces anticorps dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité de ces anticorps chez des patients hémophiles.

Procédures

Les souris seront séparées en 3 groupes : Groupe 1 : recevant un traitement par FIX pour traiter et prévenir les saignements tel qu’il est recommandé actuellement pour les patients hémophiles sévères Groupe 2 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-TNF alpha avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Groupe 3 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-IL6 avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Nous induirons un saignement articulaire responsable d’arthropathie chez des souris hémophiles B par ponction articulaire, réalisée sous anesthésie générale et médicament anti-douleur, selon la technique déjà publiée par notre groupe. Une mesure quotidienne du diamètre des genoux, sur 15 jours, étudiera la variation du diamètre qui sera exprimée en pourcentage par rapport à la valeur avant ponction. Le 15ème, une 2eme ponction sera réalisée sur le même genou (droit) afin de mimer des saignements articulaires à répétition qui caractérisent la maladie, le genou contrôle ne subira aucune ponction articulaire. Un traitement par FIX à demi-vie allongée tous les 4 jours sera administré chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 15 jours. Les souris du groupe 2 et 3 recevront pendant 15 jours un traitement combiné associant l’anticorps anti-TNF alpha ou anti-IL6 2 fois/semaine le même jour que la prophylaxie par FIX afin de limiter le risque d’hématome post-injection. Ensuite, un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure des marqueurs inflammatoires (IL6 et TNF alpha). Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress sont effectués sous anesthésie générale et administration d’un médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être et compte tenu des douleurs du genou, les conditions d’alimentation seront adaptées afin de leur éviter le redressement sur des pattes arrières avec nourriture et eau gélifiée au sol. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. deux ponctions articulaires : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin : 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. des injections: groupe 1 : 2 min, groupe 2 et 3 : 3-7 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort : 3-5 min

Impact sur les animaux

Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. • Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie et de l’injection, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucune douleur. Une possible gêne locomotrice peut être attendue, en cas d’apparition, de l’eau et de la nourriture seront mis à disposition dans la cage, au sol, pour éviter la station debout aux souris et le redressement sur les pattes arrière pour chercher leur nourriture. Les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 peuvent augmenter le risque d’infection. Les règles d’asepsie seront attentivement appliquées afin de réduire ce risque (tonte, désinfection cutanée avant ponctions, essuyage par compresse stérile, gants stériles) et surveillance clinique quotidienne.

Devenir

La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal

Remplacement

La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.

Réduction

En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal. Les mesures biologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.

Raffinement

Application des points limites strcits et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal avec en outre l'utilisation de l'analgésie et de l'anesthésie. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésie et analgésie.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.

Génétiquement privées de facteur IX, les souris de ce projet ne saignent pas spontanément mais risquent l'hémorragie au moindre traumatisme. 21 vont être utilisées, 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Chacune reçoit une injection quotidienne de facteur IX pendant cinq jours, puis une plaie vasculaire est pratiquée à une patte arrière sous anesthésie et les caillots formés sont comptés pendant quinze minutes. Toutes sont tuées, la mise à mort étant justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang total, volume que le porteur juge incompatible avec le maintien en vie.

Objectifs

L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX). La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. La prise en charge recommandée est le traitement prophylactique par concentrés de FIX afin de réduire voire éviter les saignements spontanés. Cette prophylaxie peut être également effectuée par la thérapie génique qui permet au patient de produire son propre FIX. Le FIX est une petite protéine qui peut diffuser à l’extérieur des vaisseaux et en cas d’apport régulier de FIX (comme lors d’une prophylaxie au long cours) et y former un réservoir extravasculaire autour des vaisseaux. L’objectif de ce projet est d’évaluer le comportement extravasculaire d’un variant du FIX appelé FIX-Padua chez les souris hémophiles B, ce variant est utilisé pour la thérapie génique de l’hémophilie B chez l’homme.

Bénéfices attendus

Au travers de la comparaison des groupes de souris recevant un traitement par FIX-WT ou FIX-Padua, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes extravasculaires du FIX, en particulier du variant Padua, et clarifier son potentiel à former des réservoirs tissulaires. Il permettra d’évaluer si cette accumulation extravasculaire contribue à une hémostase durable, même en l’absence de FIX plasmatique détectable. Ces résultats pourraient guider l’optimisation des stratégies de thérapie génique pour l’hémophilie B, en améliorant l’efficacité clinique et le phénotype hémorragique en réduisant les saignements sévères, notamment au niveau des articulations et des muscles.

Procédures

Les souris seront séparées en 2 groupes : Groupe 1 : traitement prophylactique par FIX naturel (FIX-WT) Groupe 2 : traitement prophylactique par le variant FIX-Padua Un traitement quotidien par FIX (naturel ou variant Padua) 100 UI/kg sera injecté chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 5 jours. Ensuite, l’activité coagulante du FIX extravasculaire sera évaluée 7 jours après la dernière injection de FIX, en l’absence de tout résidu du FIX dans le sang. Pour cette évaluation, le nombre de caillots sanguins formés seront comptés pendant 15 minutes à partir d’une plaie vasculaire au niveau d’une patte arrière. Un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure de FIX qui doit être indétectable. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et sous médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière et des organes seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche du FIX extravasculaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une plaie vasculaire : 2-3 min 2. Observation de formation de caillots sanguins : 15 min 3. Un prélèvement sanguin : 1 min 4. Une injection: 2 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort: 3-5 min

Impact sur les animaux

Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignement spontané mais un risque d’hémorragie en cas de blessure.

Devenir

La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal

Remplacement

La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude l’étude de la diffusion du FIX dans les tissus dont les articulations. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.

Réduction

En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal.

Raffinement

Application de points limites stricts et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.