Système cardiaque

Le retrait des ovaires sous anesthésie, l'implantation d'une capsule hormonale sous la peau et, pour 64 d'entre elles, une lésion chirurgicale de l'artère carotide attendent 928 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs vaisseaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si un traitement à base d'œstrogènes protège encore les vaisseaux après la ménopause, que la souris ne connaît pas naturellement, d'où l'ablation des ovaires. Le porteur annonce cette ablation pour les 928 animaux du projet, tout en précisant que l'étude porte sur des souris mâles et femelles. Il attribue par ailleurs au prélèvement de sang à la queue "une douleur légère au niveau de l'œil".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause mondiale de décès. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins placées entre le sang et les tissus sont en première ligne face aux altérations métaboliques associées aux facteurs de risque cardiovasculaire. L’incidence de ces maladies est modulée par le sexe et le statut hormonal. En particulier, les hommes, ainsi que les femmes ménopausées — en raison de la baisse des œstrogènes — présentent un risque plus élevé de développer des maladies cardiovasculaires que les femmes non ménopausées. Ce projet vise à déterminer l’interaction entre les hormones sexuelles et un gène impliqué dans le maintien de la fonction endothéliale afin d’évaluer si certains traitements à base d’oestrogènes peuvent continuer à protéger les vaisseaux sanguins après la ménopause. Pour cela, des souris mâles et femelles chez qui un gène impliqué dans la réparation des vaisseaux spécifiquement dans les cellules endothéliale a été désactivé seront étudiées. En parallèle, afin de reproduire la baisse hormonale observée chez les femmes (puisque la souris ne présente pas de ménopause naturelle), les ovaires seront retirés à un groupe de femelles chez qui l’effet d’un traitement hormonal sera évalué. Nous allons étudier comment les différences entre hommes et femmes, ainsi que la présence ou non d’œstrogènes, influencent la forme des vaisseaux sanguins, leur capacité à se réparer et leur rôle de protection et de régulation dans le corps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir les acteurs moléculaires qui pourraient être une cible thérapeutique pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires en prenant compte le dimorphisme sexuel existant dans le développement de ces pathologies et le risque accru chez la femme au moment de la ménopause.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1-Gavage (1min) 256 animaux 2-Chirurgie de retrait des ovaires (10-15min) 928 animaux 3-Incision de la peau pour placer une capsule d'hormone à libération prolongée (5min) 928 animaux 4-Injection de molécule permettant l’évaluation de la perméabilité endothéliale (5min) 480 animaux 5-Mise à jeun : maximum 1 fois pour 12 heures effectives (phase active) (2min) 384 animaux 6-Incision de la peau et lésion superficielle de l'artère carotide (20min) 64 animaux 7-Prélèvement sanguin à la veine caudale maximum 3 fois espacé de 24h (3min) 384 animaux

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées dans ce projet sont peu invasives et indolores (pesée, jeûne) ou de classe légère (gavage, prélèvement à la veine caudale) et modérée (chirurgie de retrait des ovaires, incision de la peau pour placer une capsule d'hormones à libération prolongée et chirurgie de lésion superficielle de l'artère carotide). Elles peuvent être associées aux nuisances suivantes : Le prélèvement de sang à la veine caudale peut engendrer une douleur légère au niveau de l'oeil et un stress de la manipulation. Les chirurgies modérée peuvent entrainer une douleur localisée aux sutures, une perte de poids et un stress lié à l'opération.

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus prélevés (vaisseaux) afin de regarder leur capacité à se réparer en présence ou non d'hormones.

Remplacement

L’utilisation de souris comme modèle de recherche nous permettra d’observer et de mesurer, de façon précise, les changements qui touchent les cellules des vaisseaux sanguins selon le sexe et après un traitement hormonal. Les modèles en culture cellulaire ne permettent pas de reproduire ces variations hormonales, d’autant que les cellules endothéliales cultivées perdent rapidement le récepteur aux œstrogènes. Par ailleurs, les différences liées au sexe impliquent de nombreuses hormones, organes et types de cellules qui ne peuvent pas être simulés en laboratoire dans une simple boîte de culture. C’est pourquoi l’expérimentation animale est aujourd’hui la seule méthode qui permet de mener à bien ce projet.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Les études statistiques antérieures et publiés ont montré que des groupes de 8-10 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques. En effet les chirurgies étant difficiles et minutieuses, une variabilité plus grande dans les résultats est attendue.

Raffinement

Afin de limiter le stress et d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des mesures de raffinement spécifiques sont mises en place concernant les conditions de logement. Les souris seront hébergées en groupes compatibles dans des cages contenant du matériel de nidification (papier, coton). Les manipulations seront effectuées de manière douce et rapide, en privilégiant les techniques de contention peu stressantes. L’ensemble du personnel est formé aux pratiques de bien-être animal et à la reconnaissance des signes de douleur ou de mal-être, permettant une prise en charge rapide en cas de besoin. Les chirurgies sont réalisées dans une salle différente de celles où ont lieu l’euthanasie et l’hébergement, afin de réduire le stress. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie. Les animaux se verront donc administrés des analgésique (morphinique) après chaque chirurgie. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement par les expérimentateurs du projet. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle permettant une modification génétique aboutissant à une délétion du gène DLL4 spécifiquement dans les cellules endothéliales. Les animaux seront utilisés à l’age adulte (après la puberté) à partir de 7 semaines d’âge pour l’étude des hormones sexuelles et de la ménopause.

Choisies à six à dix semaines parce que la graisse et le tissu fibreux des animaux plus âgés gêneraient la visibilité sous échographie, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un marqueur neuronal leur est injecté à la microseringue près de la crosse aortique sous anesthésie, geste dont le porteur reconnaît le risque de pneumothorax, puis un régime enrichi en adénine leur provoque pendant vingt-huit jours une maladie rénale accompagnée d'une altération de l'état général et d'une perte de poids. Cinq à six semaines après l'injection, elles sont tuées pour prélever leurs organes et mettre leurs neurones en culture. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives non animales n'existent pas pour étudier la communication entre le sang et le cerveau.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de la maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Il a été montré que la maladie rénale chronique, à la fois chez les patients et dans les modèles murins de cette maladie, entraîne des dysfonctionnements des mécanismes de régulation de la pression artérielle. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du coeur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser les spécificités fonctionnelles et moléculaires des neurones aortiques chez la souris en conditions physiologique, et leurs modifications dans le modèle de la maladie rénale chronique. Nous pourrons ainsi évaluer si ces modifications participent à l’hypertension observée dans la maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la pression artérielle. L’utilisation du modèle de maladie rénale chronique nous permettra de mieux comprendre comment les neurones à l’origine de la régulation de la pression artérielle sont affectés au cours de la maladie et de déterminer si ceux-ci peuvent être à l’origine de l’hypertension qui accompagne les maladies rénales chroniques. De là, pourra être envisagé le développement de nouvelles stratégies pharmacologiques.

Procédures

1) Injection guidée par échographie de marqueurs dans la crosse aortique. Les souris seront anesthésiées pour être positionnées sous l'échographe. Pour éviter toute douleur liée à l’injection, nous administrerons préalablement un analgésique par voie sous-cutanée. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi de paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure. A l'aide d'une microseringue, nous injecterons aux environs de la crosse aortique 1 microlitre d'une solution contenant un marqueur neuronal. La procédure durera 15 à 20 minutes maximum. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage de la crosse aortique. 4 à 5 jours après l’injection, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage au niveau de la crosse aortique grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). 4) 5 à 6 semaines après l’injection, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones et prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids ; 2) à l'injection bien que celle-ci soit guidée par échographie : risque de pneumothorax (douleurs diffuses et intenses dans la région du thorax, difficultés à respirer, respiration très rapide, faiblesse générale) et risque d’infection au point d’injection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées. L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses et des cultures neuronales.

Remplacement

Le marquage des neurones de la crosse aortique ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas. Nous étudions une communication entre organes : le système sanguin et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro ou à l'aide de modèles informatiques. Cette étude ne peut pas être faite chez l'humain.

Réduction

Comme évalué dans des études préliminaires concernant l’injection guidée sous échographie et le modèle murin de maladie rénale chronique, des lots de 35 et de 20 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots.

Raffinement

Les injections sous échographie se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons deux analgésiques par voie sous cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. Le gel d’échographie sera chauffé préalablement à son application sur l’animal. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum. Suite à la chirurgie, nous utiliserons une grille d'évaluation du bien-être des animaux tous les jours pendant 3 jours puis 2 fois par semaine. L'évaluation sera dépendante de plusieurs critères dont chaque modification sera cotée. En fonction du score total, les animaux pourront être placés sous traitement analgésique et/ou il y aura arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal. L’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes autoclavables, des morceaux de bois à ronger et des nids à base de coton.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle souris car le marquage des neurones de la crosse aortique par injection sous échographie est une méthode que nous avons validée au sein du notre laboratoire. De plus, nous maîtrisons le modèle de maladie rénale chronique par régime riche en adénine validé chez la souris. Enfin, cette espèce permet également le recours à des techniques validées de quantification moléculaire, permettant de répondre à nos hypothèses. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire à la visibilité des structures sous échographie.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis des injections quotidiennes pendant quatre semaines et une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, pour tester des molécules censées protéger le cœur de la doxorubicine sans réduire son effet antitumoral. Le porteur signale une nécrose possible au point d'injection, une intolérance à l'effort et une respiration accélérée, et transporte les souris à pied entre deux établissements, en cage placée dans un sac opaque. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever le cœur, la tumeur, le foie et les reins, prélèvements qu'il qualifie d'"indispensables".

Objectifs

La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.

Procédures

Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.

Raffinement

Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.

Des souris femelles reçoivent des lentivecteurs porteurs de mutations humaines pour développer un lymphœdème, cette accumulation de lymphe et de graisse dans un membre. 1 050 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, presque toutes des femelles parce que le lipœdème ne touche que les femmes. Elles subissent jusqu'à cinq injections quotidiennes d'affilée, une chirurgie de moins de vingt minutes et une mesure de composition corporelle, et le porteur écrit que la formation de l'œdème, la chirurgie et les injections engendrent des douleurs modérées. Une partie est transférée dans un second établissement pour y recevoir une anesthésie, une lymphographie et la mort, toutes finissant tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Le lymphœdème est une pathologie chronique résultant d’une accumulation massive de lymphe et de tissu adipeux dans un membre. Il existe deux sortes de lymphœdème : primaire et secondaire. Le lymphœdème primaire est d’origine héréditaire, lié à des mutations génétiques. Plus de 30 gènes ont été identifiés comme étant associés au lymphœdème primaire. Le lymphœdème secondaire survient à la suite d’une lésion du système lymphatique, souvent après une chirurgie, une radiothérapie ou une infection. Bien que cette maladie affecte 250 millions de patients, il n’y a à ce jour aucun traitement disponible. Notre équipe a développé une thérapie pour le traitement du lymphœdème secondaire qui passera en clinique en fin d’année. Notre objectif est maintenant d’évaluer son efficacité sur le lymphœdème primaire. Environ 30 mutations génétiques ont été identifiées comme responsables du lymphœdème primaire. Nous nous concentrerons sur les mutations les plus fréquentes. Dans un deuxième temps, nous allons étendre l’application de la thérapie au lipœdème. Le lymphœdème et le lipœdème sont des affections distinctes, mais partagent plusieurs caractéristiques cliniques communes. Tous deux se caractérisent par un gonflement persistant des membres, affectant généralement les membres inférieurs. Il est important de noter que le lipœdème ne touche que les femmes et qu’il n’existe à ce jour aucune thérapie curative. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative pour le lymphœdème primaire et le lipœdème. Cette étude permettra d’évaluer la possibilité d’étendre l’application de l’Apernavec au traitement de ces pathologies. Le lymphœdème primaire étant causé par différentes mutations, évaluer l’efficacité sur plusieurs d'entre elles permettra un champ d’application de la thérapie plus large.

Procédures

Dans l’EU 1/2, les animaux seront soumis à des injections en vigile ou sous anesthésie gazeuse qui auront une durée maximale de 2 minutes chacune. Les injections vigiles pourront être ponctuelles ou sur une semaine à raison de 1 injection par jour (soit 5 jours d’injections au total), chaque injection ne durera pas plus d’une minute. Les injections sous anesthésie seront au maximum de 2 tout au long du projet pour chaque animal. Ils pourront être aussi soumis à une intervention chirurgicale d'une durée inférieure à 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Une analyse de la composition corporelle serait faite par imagerie et aura une durée maximale de 6 minutes. Dans l’EU 2/2, les animaux recevront une injection intrapéritonéale d’anesthésie en vue d’une lymphographie ainsi que la mise à mort.

Impact sur les animaux

La formation d’œdème, la chirurgie, le minispec ainsi que les injections vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, certains animaux seront envoyés dans l’EU 2/2. Tous les animaux de la procédure seront mis à mort afin de prélever les organes nécessaires au projet.

Remplacement

Bien qu’il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant fidèlement la réponse immunitaire et tissulaire à une injection intradermique de l’Apernavec ainsi que des lentivecteurs codant pour les mutations, une phase préliminaire a été conduite sur des cultures cellulaires (kératinocytes et fibroblastes murins) pour évaluer la transduction et la cytotoxicité, limitant ainsi le recours aux animaux. Le choix s’est orienté vers l’espèce animale car il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico reproduisant les paramètres physiologiques de la pathologie (réponse immunitaire, inflammation, formation d’œdème) nécessaires à la bonne évaluation de l’efficacité de l’Apernavec. Ces données permettront une étude plus fiable.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car ces pathologies touchent essentiellement les femmes. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le nombre de souris a été calculé par une analyse statistique rigoureuse afin de garantir la significativité des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Les groupes expérimentaux sont restreints au strict nécessaire. Un lot contrôle (vecteur vide) est inclus afin d’évaluer l’effet de l’administration du vecteur indépendamment du gène muté qu’il contient. Toute mutation n'induisant pas d'effet pas d'effet pathologique ne sera pas retenue pour les tests d'efficacité de la thérapie afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. L’injection est réalisée sous anesthésie afin de réduire la douleur. Toute souffrance anormale entraînera une euthanasie immédiate. Les techniques d’injection et de manipulation sont assurées par du personnel expérimenté afin de limiter le stress. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car les précédentes études menées sur l’Apernavec dans le lymphœdème secondaire ont été réalisées sur ces dernières. De plus, des lignées sur le même fond génétique précédemment établies dans l’équipe seront aussi utilisées pour les études sur le lipœdème en raison de leur pertinence scientifique. Le lymphœdème primaire et le lipœdème se caractérisent par une accumulation de tissus adipeux fibrotique dans les membres touchés. Ainsi, le modèle utilisé doit posséder un tissu adipeux suffisamment développé. Le choix s’est alors orienté vers des souris âgées de 10 à 12 semaines pour le lymphœdème primaire et de 5 à 12 semaines pour le lipœdème.

Une chirurgie d'une heure et demie sous anesthésie interrompt puis rétablit l'irrigation du cœur de chaque animal, suivie de six injections d'analgésique sur trois jours. 144 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cœur soit récupéré et analysé. Le projet cherche à préciser le rôle des macrophages dans la cicatrisation du muscle cardiaque après un infarctus, et notamment dans la résorption de la cicatrice. Le résumé décrit jusqu'à sept injections d'un "produit non douloureux" sans dire lequel, et justifie les effectifs par l'expérience antérieure de l'équipe sans donner de calcul ni de nombre d'animaux par groupe.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier la phase de cicatrisation du muscle cardiaque à la suite d’un infarctus du myocarde en s’intéressant plus particulièrement au rôle des macrophages, une population de cellules immunitaires impliquée à la fois dans l’élimination des cellules lésées et dans les mécanismes de réparation tissulaire. Si la cicatrisation constitue, en principe, un processus bénéfique visant à restaurer l’intégrité tissulaire, elle peut également avoir des effets délétères sur l’organe concerné. Dans le contexte de l’infarctus du myocarde, la formation initiale de la cicatrice permet de contenir les dommages ; toutefois, à long terme, elle peut évoluer vers une fibrose pathologique, caractérisée par le remplacement progressif du tissu musculaire par un tissu fibreux non contractile. Ce remodelage fibrotique altère la fonction cardiaque et peut conduire à une insuffisance cardiaque. Plus l’étendue de la fibrose est importante, plus la perte de fonction myocardique est sévère. On sait que les macrophages jouent un rôle essentiel, généralement bénéfique, à la fois dans les premières étapes de la cicatrisation, mais aussi dans la phase de résorption du tissu cicatriciel et dans la limitation de la fibrose. Notre objectif est de mieux comprendre, dans le détail, le rôle exact de ces cellules et leur mécanisme d’action. + Quelle est l’importance réelle des macrophages dans la cicatrisation du myocarde à la suite d’un infarctus ? + Les macrophages ne formant pas une population parfaitement homogène, quelles sont les caractéristiques de ceux impliqués dans la résorption de la cicatrice ? + Quels sont les mécanismes cellulaires intervenant dans la résorption de la fibrose par les macrophages ? Ces connaissances fondamentales pourraient, à terme, être appliquées à des objectifs médicaux comme la mise au point de traitements des séquelles cicatricielles de l’infarctus du myocarde.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous approfondirons notre compréhension du rôle des macrophages dans la cicatrisation cardiaque post-infarctus. Nous nous attacherons notamment à distinguer les fonctions spécifiques des macrophages adultes par rapport à celles des macrophages résidents d’origine embryonnaire. Cette étude nous permettra de préciser leur implication non seulement dans le processus de cicatrisation initiale, mais également dans la résorption de la cicatrice, la revascularisation des tissus lésés, ainsi que dans la modulation de l’hypoxie cellulaire associée. Bien que ce projet relève, pour l’instant, principalement de la recherche fondamentale, il s’inscrit clairement dans une perspective médicale. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la guérison du cœur après un infarctus pourrait, à long terme, nourrir des approches plus appliquées en recherche clinique. Actuellement, l’intervention médicale post-infarctus repose essentiellement sur une prise en charge rapide, visant à limiter les lésions aiguës. Cependant, si la cicatrisation qui s’ensuit est indispensable à court terme, elle peut engendrer des effets délétères à long terme, notamment par l’excès de tissu fibreux non contractile. Notre étude pourrait ainsi contribuer, à terme, au développement de stratégies thérapeutiques destinées à contrôler l’extension du tissu cicatriciel et à favoriser la régénération d’un myocarde fonctionnel.

Procédures

1) Injection de produit non douloureux (quelques secondes par animal) entre une et 7 fois (sur une période de 10 jours) 2) Injection de produit non douloureux (une minute par animal) 2 injection 30 mn et 5 mn avant la mise à mort 3) Intervention chirurgicale sous anesthésie provoquant un infarctus cardiaque transitoire. Fréquence et durée :intervention unique, d’environ 1 heure 30 minutes par souris 4) Injections d’analgésie : 6 injections sur 3 jours (toutes les 12 heures) en post-opératoire sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les injections même lorsqu’elles sont répétées, n’entraînent qu’une gêne légère et de courte durée pour les animaux, les produits administrés n’étant pas douloureux. Concernant les interventions chirurgicales, l’ischémie induite au cours de l’intervention est transitoire, et les animaux récupèrent rapidement, généralement dans les 24 heures suivant la chirurgie, sans signes de pathologie ni de souffrance post-opératoire. En conclusion, l’ensemble des procédures envisagées n’induiront qu’un inconfort modéré et transitoire, maîtrisé par des mesures adaptées d’analgésie et de soins post-opératoires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer et analyser le cœur.

Remplacement

L’étude du fonctionnement du cœur et des mécanismes de cicatrisation après un infarctus ne peut être réalisée que sur l’animal vivant, aucun modèle in vitro ne permettant, à ce jour, de reproduire de façon fiable la complexité de ces processus. Il n’existe pas non plus de système artificiel capable de refléter fidèlement le fonctionnement global du système immunitaire d’un organisme adulte. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour cette recherche. Il permet de reproduire de manière réaliste l’interruption de l’irrigation cardiaque, le microenvironnement tissulaire post-lésionnel, ainsi que la réponse immunitaire, à la fois locale et systémique, impliquant le recrutement cellulaire via la circulation sanguine. Ce modèle offre également la possibilité d’étudier directement les interactions entre les macrophages et d‘autres cellules cardiaques.

Réduction

Les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en s’appuyant sur notre expérience antérieure ; - en fonction de la nature des expériences et des paramètres à mesurer, - en tenant compte de la variabilité attendue de ces paramètres. En particulier, les résultats obtenus lors d’un précédent projet ont montré que les différences observées entre les lots contrôles et expérimentaux étaient importantes et permettaient l’utilisation d’un nombre relativement restreint d’animaux pour chaque lot. Ceci permettra de produire des résultats fiables et interprétables, avec une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Pour la chirurgie, outre l’anesthésie, une analgésie sera effectuée par injection juste avant l’opération et durant les 72 heures suivant l’opération pour limiter au maximum les douleurs post-opératoires. Le réveil se déroulera en cages individuelles, au calme. La cage sera munie d’un tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie post-opératoire. Du gel alimentaire sera ajouté dans la cage pour faciliter la prise alimentaire durant les premiers jours suivant la chirurgie. Les animaux seront suivi de manière régulière pour évaluer leur état de santé. Des points limites spécifiques et précoces seront estimés (apathie, perte de poids, aspect du pelage) pour permettre une intervention rapide afin d’éviter ou de minimiser la douleur, si nécessaire.

Choix des espèces

- Les souris sont des petits mammifères qui partagent de nombreuses similarités avec l’homme. - Elles constituent un modèle très maîtrisé par l’ensemble des équipes de recherche - Leur temps de génération est court et les effectifs des portées élevés, ce qui permet d’avoir rapidement accès à un grand nombre d’animaux - On peut utiliser des individus de lignées consanguines, ce qui permet une meilleure homogénéité dans nos populations, et on peut trouver d’énormes bases de données (ex : génétiques) et utiliser de nombreux réactifs spécifiques de cette espèce (ex : anticorps). - De nombreuses lignées existent (souris génétiquement modifiées) pour étudier les macrophages. - Les procédures chirurgicales, y compris les médicaments les plus efficaces (anesthésiques et analgésiques) et les doses à injectées, sont parfaitement connus. L’étude des effets de l’infarctus dans les différentes conditions expérimentales se fera à l’âge adulte (après 6 semaines). Le but est de produire un modèle proche de la pathologie humaine qui est une maladie de l’individu adulte. Chez la souris, la maturité sexuelle est atteinte à environ 6 semaines, cet âge est donc considéré comme le début de l’âge adulte.