Système cardiaque

56 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un capteur cardiaque implanté sous anesthésie, puis subit échocardiographies, mesures de pression artérielle et prélèvements sanguins répétés, et vingt-quatre d'entre eux une ligature de l'artère coronaire gauche que le porteur reconnaît potentiellement létale. L'intoxication par la ciguatoxine peut provoquer diarrhées, troubles neurologiques et cardiovasculaires, les rats perdant plus de 15 % de leur poids étant alors mis à mort. Le porteur revendique de vouloir "exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole" et prévoit le prélèvement des tissus cardiaques, neuronaux, adipeux et musculaires après la mise à mort.

Objectifs

La ciguatera (CG) est une maladie induite par les ciguatoxines (CTXs), naturellement prduites par certaines algues (microscopiques). Elles sont responsables d'intoxication alimenatire non bactérienne aux fruits de mer la plus courante dans le monde. L'explosion du trafic maritime, s'accompagnant de l'augmentation du volume des eaux de ballast transportées et mélangées, contribue considérablement à la propagation du plancton des zones tropicales contaminées, plus particulièrement d'Asie et d'Asie du Sud-Est, vers les côtes tempérées sujettes au réchauffement climatique. La CG, pourrait largement se propager, nottamment en méditérranée et prendre la forme d'une pandémie. L'absence de tests de détection rapide augmente l’exposition à la CG. De plus, aucun traitement ciblé n'est actuellement disponible en raison d'un manque d'identification précise des mécanismes moléculaires, physiologiques et pathologiques associés. La CG se manifeste par de multiples symptômes indéfinis (gastro-intestinaux, cardiaques, neuronaux, cutanés et inflammatoires), accentués en cas d'antécédents cliniques. Plusieurs cibles de canaux ioniques (canaux sodiques, potassiques et calciques), protéines essentielles au bon fonctionnement des cellules sont suspectées dans la CG. Les CTXs seraient capables de moduler l’activité de ces protéines canal pour modifier, notamment, les flux ioniques responsables du fonctionnement cardiaque et neuronal. Notre objectif est de caractériser le mode d’action et conséquences des CTXs sur la fonction cardiaque/vasculaire et le système nerveux in vivo. Nous souhaitons savoir si les effets liés à une intoxication aux CTXs et nottament à la Ciguatoxine 1B (CTX1B), peuvent être modulés par différents traitements préventifs et curatifs. Dans un second temps, ceci pourrait permettre de déterminer de nouveaux outils de diagnostic de la CG ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser in vivo la nature des effets induits par une intoxication à la Ciguatoxine 1B (CTX1B). En particulier, nous determinerons la nature des altérations cardiaques (structurelle et/ou fonctionnelle) et vasculaires ainsi que le rôle des atteintes du système nerveux autonome dans ces conséquences délétères. A partir ders pélèvements sanguins, nous determinerons si certains marqueurs sanguins sont augmentés/diminués après une contamination à la CTX1B. De récentes études cliniques ont montrées une augmentation de lactate dans le sang évoquant une hypoxie tissulaire en rapport avec une insuffisance cardiovasculaire. Le suivi ECG nous permettra de voir si la CTX1B module le rythme cardiaque chez les sujets contaminés. Les prélèvements post-mortem permettrons de faire une exploration plus approfondie des tissus cardiaques et neuronaux, afin de voir les effets directs de la CTX1B, mais aussi sur les tissus adipeux et du muscle squeletiques pour détecter le site de stockage de la CTX1B dans l’organisme.

Procédures

La totalité des animaux (soit 56 animaux) seront tous soumis aux mêmes gestes techniques : échocardiographie (environ 15 min/ animal), électrocardiogramme (ECG, recueil des données pendant 24h/animal de façon non invasive) par télémétrie, prélèvement de sang (quelques secondes/animal), mesure non invasive de la pression artérielle (environ 15 minutes/animal). Ces gestes techniques seront chacun réalisés à 3 reprises sur la durée du protocole expérimental (19 jours pour 32 animaux et 24 jours pour 24 animaux). Vingt-quatre animaux seront soumis à ces gestes techniques à 4 reprises ainsi qu'à une chirurgie via la ligature de l'artère coronaire gauche. Il existe un risque que cette chirurgie nécessaire à l'induction d'une sensibilisation aux arythmies cardiaques soit léthale. Cette chirurgie, d'environ 1 heure/ animal, nécessitera une anesthésie générale des animaux. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire. De plus, la totalité des animaux sera soumise à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale pour l'implantation du capteur permettant le recueil des paramètres ECG d'une durée d'environ 25 min/ animal. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire afin d'éviter toute douleur de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront d'une part ressentir les symptômes classiques de la CG chez l’Homme, tels que : - Troubles gastro intestinaux (48-72h post infection) - Troubles neurologiques (48-72h post infection) - Troubles cardiovasculaires. (48-72h post infection). Ces troubles, notamment gastro intestinaux, peuvent induire des phénomènes de diarrhées pouvant mener à une perte de poids de l’animal. Si une perte de poids > 15% du poids initial est constatée, alors le point limite de l’expérimentation sera atteint et nécessitera la mise à mort de l’animal. Les groupes d'animaux sensibilisés pour les arythmies cardiaques via la ligature d'une artère coronaire ont un risque élevée de mortalité inhérent à la procédure. Le projet necessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique uniquement pendant l'enregistrement de l'ECG (24h/ acquisition).

Devenir

A la fin des protocoles expérimentaux tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires).

Remplacement

La CG est une pathologie syndromique incluant de nombreux effets systémiques. Il n’existe pour l'heure pas de modèle in vitro sur lequel ont été relevés les effets cardiaques, effets vasculaires et effets sur le système nerveux autonome grâce à un modèle capable de mimer les conditions physiopathologiques induites par la Ciguatoxines 1B (CTX1B). .

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux via l'utilisation d'outils statistiques et en couplant plusieurs approches (echocardiographie, ECG par télémétrie, prélèvement de sang, mesure non invasive de pression arterielle), compatibles entre elles, et effectuables sur un même animal. Un suivi dans le temps sera également éffctué. L'ensemble des animaux sera prélevé post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires) pour exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole.

Raffinement

Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés par groupes de 3 par cages dans un environnement calme, sous contrôle de luminosité, de l'hygrométrie et de la température, de manière appropriée avec un enrichissement du milieu (barre de bois, cabane, carré de ouate) permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Après chirurgie pour mise des télétransmetteurs, les animaux seront placés en couveuse thermorégulée et surveillés pendant un minimum de 3 heures. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites établis dans ce projets seront appliqués. Nous allons fournir les soins per- et post-opératoires appropriés via l'administrations d'anesthésiques et d'analgésiques. Nous évaluerons entre autres les critères de souffrance animale communément utilisés (rythme cardio- respiratoire, reprise de mouvement, un état de prostration, l’hydratation). En cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, après analgésie.

Choix des espèces

Le modèle de rat Wistar est un modèle largement caractérisé sur le plan cardio-vasculaire, dont un nombre important de travaux est décrit dans la littérature (inculant ceux du laboratoire). La physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme (régulations et structure morpho-fonctionnelle, régulation par le système nerveux autonome). Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo selon les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les animaux entreront dans le protocole à un stade mature pour éviter tout problème lié au développement.

Une injection sous la peau chaque jour pendant sept semaines, de la septième à la quatorzième semaine de vie : 96 souris subissent ce traitement, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est anesthésiée, reçoit de l'insuline en intraveineuse, puis est mise à mort cinq minutes plus tard. Le porteur reconnaît que la répétition des injections est "le point critique" du protocole, la faible stabilité de la molécule empêchant l'usage de pompes implantables, et il annonce des seringues fines et des points d'injection variables. Il qualifie les autres procédures de "classe légère" et parle d'un "modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique", sans dire comment ce diabète et cette atteinte du cœur sont obtenus.

Objectifs

Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être impliquée dans la prolifération et le remodelage cellulaire, la beta caténine, dans le développement de la cardiomyopathie diabétique. A l’aide d’un modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique (hypertrophie et dysfonction diastolique), nous allons déterminer si l’inhibition de la beta caténine avec un inhibiteur pharmacologique (ICG-001) améliore les paramètres cardiaques. Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant au développement de la cardiomyopathie chez les patients présentant un diabète de type deux et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.

Bénéfices attendus

Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux maladies cardiovasculaires, les complications cardiaques ont été largement étudiées dans une multitude de contextes physiopathologiques. Les publications sur le rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie cardiaque liée au diabète de type deux sont quasi inexistantes dans la littérature scientifique. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer avec a la clé de nouveaux traitements. Nos résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin de cette pathologie montrent que la voie de la beta-caténine est augmentée dans les cœurs malades comparé aux cœurs sains. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité de la beta-caténine pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer le risque cardiaque chez les patients présentant un diabète de type 2. Une telle approche sera bénéfique pour les patients diabétiques mais aussi pour la population générale en promulguant des recommandations pour les personnes à risque.

Procédures

Dans les deux procédures de cette saisine, une dose journalière de l’inhibiteur de la beta-caténine ou du véhicule sera délivrée par injection en sous cutané et ce pendant sept semaines, de 7 à 14 semaines d’âge. Pour le groupe dédié au test de résistance à l’insuline, les animaux seront anesthésiés et injectés avec de l’insuline en intraveineuse et seront euthanasiés 5 min post injection.

Impact sur les animaux

Le point critique est la répétition des injections en sous-cutané. La stabilité faible de l’ICG ne permet pas d’utiliser des pompes alzet. Afin de limiter la souffrance liée à la répétition des injections, nous utiliserons des seringues microfine pour insuline, nous ferons varier les points d’injection et utiliserons un volume d’injection faible injecté. Les autres procédures sont de classe légère, il y a peu d’effets indésirables attendus.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.

Remplacement

Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des cardiomyocytes en culture. Ce modèle de culture permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie des cardiomyocytes et également de la détermination des mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu . L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 96 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de l’apparition des complications cardiaques associées dans notre modèle murin de cardiomyopathie diabétique, et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance chez les animaux, un suivi clinique quotidien des animaux est réalisé par du personnel formé. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux et avec un enrichissement adapté à leur besoin. Pour les expérimentations, les gestes invasifs sont réalisés sous une couverture anesthésique analgésique adaptée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (diabète de type 2 et cardiomyopathie pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence cardiaque d’une dysfonction adipocytaire à l’origine dans notre modèle murin en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. De plus, la délétion du gène causant la cardiomyopathie diabétique, n’a été réalisé que dans le modèle murin. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition de la beta-caténine. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur à 7 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition sur le cœur au cours du développement de l’organisme.

Nourries d'un régime gras pendant vingt semaines à partir de l'âge de 4 semaines, des souris peuvent grossir au point de ne plus atteindre leur nourriture ni leur eau, et développer un état dépressif et de l'anxiété. 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin de tester l'association de deux traitements contre la fibrose du foie liée à l'obésité et au diabète. Elles reçoivent ces traitements par gavage et subissent 14 incisions de la veine de la queue sous anesthésique local, chaque test de glycémie étant précédé de six heures d'isolement à jeun. Pour décrire les actes, le porteur compte en secondes : 30 secondes de pesée par semaine, "soit un total de 12 minutes par souris", 10 secondes de contention par gavage, 3 à 4 secondes par incision, sans y faire figurer le régime.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 24 semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 12 minutes par souris sur l’ensemble du projet. L’administration des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes à chaque administration. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour les tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un isolement de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même durent 2h.

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (5 animaux par cages) avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline (total de 8h par expérimentation). Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifie par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 24 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 28 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

95 brebis de sept à dix ans vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant de deux à quatre heures sous imagerie avant une heure d'opération. L'ovariectomie par laparotomie sur une dizaine de centimètres leur crée un état de ménopause, puis un stimulateur cardiaque implanté sous le muscle du cou pendant deux heures déclenche une fibrillation auriculaire, les procédures d'imagerie invasive et non invasive étant répétées chaque mois pendant six mois sous anesthésie générale. Le porteur signale une hernie possible après la laparotomie et des cicatrisations prolongées autour des implants, et affirme que la fibrillation reste asymptomatique, les brebis saines et celles en fibrillation étant selon lui indiscernables. Toutes sont tuées pour que le remodelage cardiaque soit caractérisé à l'échelle des tissus, des cellules et de la biochimie.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que la fibrillation auriculaire (FA) diffère entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA et la prise en charge est plus complexe et moins efficace. Parmi les rares études disponibles, nous observons qu’ un âge ménopausique plus jeune et un traitement hormonal limité ont été associés à un risque accru de FA et de maladies corrélées. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Par conséquent, afin d'améliorer le diagnostic et la thérapeutique de la maladie, nous devons mieux comprendre comment le rôle des hormones sexuelles influence le développement, la progression et le traitement de la FA. L'objectif de ce projet est la validation et caractérisation d’un modèle ovin de femelle ménopausée et son impact sur le remodelage atrial au cours de la fibrillation auriculaire

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de créer un modèle d’ovin pour mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la progression des maladies cardiaques, notamment de la FA. Les résultats de ce projet nous aideront à identifier les mécanismes spécifiques favorisants cette arythmie, et ils nous fourniront une base pour mieux prendre en charge les soins des patients atteints ou a risque de développer la FA à cause de leur sexe.

Procédures

Dans ce projet, 95 animaux seront traités. Ces animaux subiront des analyses d’imagerie (120-240 mins), suivies par une procédure chirurgicale pour l’induction de la ménopause par ovariectomie (60 mins). Ensuite, ils recevront un stimulateur cardiaque pour le déclanchement de la FA (120 mins). Au long de leur suivi de maximum 6 mois, nous répèterons, avec une cadence mensuelle, les procédures d’imagerie non-invasive et invasive. Des prélèvements de fluides biologiques auront lieu mensuellement afin d’étudier les changements hormonaux et le bila métabolique. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale et monitorage des paramètres vitaux.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). L’ovariectomie par laparotomie médiale sur la ligne blanche d’une dizaine de centimètres pourrait éventuellement provoquer une hernie. Pour éviter ce type de complications, des points séparés et rapprochés seront réalisés afin d’éviter les tensions. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de fa fibrillation atriale. Ces données sont fondamentales pour prouver si et comment les hormones sexuelles jouent un rôle de protection contre la fibrillation atriale, et finalement envisager des thérapies ciblées et appropriée aux spécificités de la population féminine des patients.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, des modèles animaux de pathologies humaines et des tissus animaux sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible pour cette étude. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal. S’y ajoute, qu’il n'existe pas à ce jour de modèles numériques ou même cellulaires pour répondre aux objectifs.

Réduction

Pour la première phase, nous avons estime une taille de 20 animaux en total, divisée entre un groupe ménopause et groupe ménopause + remplacement hormonale. Cela nous permettra d’avoir un nombre de 10 par groupe suffisant pour les observations des changements des niveaux hormonaux et ceux de type anatomique et électrophysiologique plus évidents. Pour la deuxième phase, nous avons fixé un nombre de 75 animaux max au long des 5 ans. Il s’agit du nombre minimal d’animaux nécessaire en se basant sur notre expérience antérieure dans l’utilisation d’autres modèles au cours de divers projets menés jusqu’à présent. Pour les deux phases, une attention sera portée à la réduction du nombre de ces animaux en recalculant le nombre statistiquement relevant après les premiers 5 et 10 animaux par groupe. Dans cet objectif de réduction, nous ferons également en sorte que chaque animal soit son propre contrôle dès que cela sera possible. Cela nous aidera dans le but d’obtenir des résultats plus robustes en utilisant moins d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet et le respect du bien-être animal reposent sur plusieurs mesures, d’une part lors de l’hébergement dans des locaux agréés, les animaux bénéficient de soins quotidiens dispensés par du personnel compétent et soucieux du bien-être animal. Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels et ils disposent d’enrichissements adaptés (i.e. foin, pierre à sel, etc.). Afin de minimiser les risques amenés par la chirurgie, nous les habituerons à porter des gilets médicaux. D’autre part, lors de l’intervention chirurgicale et implantation de dispositifs de stimulation, la procédure est réalisée sous anesthésie générale (mise en œuvre et surveillance par du personnel dédié) et une analgésie adaptée est mise en place. Des critères d’alerte précis et effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adaptées seront mises en place dans le plus court délai (administration d’une thérapie analgésique ou bien augmentation des doses si déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire délégué seront contactés.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (ovin, porc, chèvre, chien), l’ovin a été identifié comme le plus adéquate car : •Les équipes possèdent une très grande expérience sur la création des modèles dans cette espèce ; •Ce modèle animal est bien décrit et caractérisé, et constitue une référence dans la communauté scientifique ; •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie dans la gestion de cette espèce ; •Les moutons fournissent également les dimensions et les propriétés physiologiques comparables à celles de l'homme. Nous utilisons des Femelles matures de 7 à 10 ans d’âge pour reproduire la ménopause et la susceptibilité à la FA chez la femme.

552 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 504 femelles gestantes tuées pour que leurs embryons soient prélevés à treize jours et demi puis seize jours et demi de gestation, tandis que 24 mâles et 24 femelles reproducteurs sont gardés vivants et réutilisés jusqu'à la fin du projet. Le geste infligé aux mères tient en trente secondes, un gavage unique. Les souriceaux, eux, sont anesthésiés par le froid pendant dix minutes puis décapités. Le laboratoire développe en parallèle des organoïdes cardiaques humains en trois dimensions qui reproduisent déjà le début de la trabéculation, et le bénéfice annoncé pour les patients tient en une ligne, comprendre le mécanisme "permettra d'agir pharmacologiquement".

Objectifs

Le syndrome de non compaction cardiaque est une malformation congénitale d’origine diverse. La non compaction s’observe souvent dans les maladies métaboliques. Le cœur en développement forme à partir des parois ventriculaires et auriculaires des trabécules se projetant dans les chambres afin d’augmenter la surface d’échange entre les cardiomyocytes et le sang avant que le système coronaire ne soit mis en place. On parle alors de trabéculation Vers le stade embryonnaire E13.5 (milieu de la gestation) chez la souris, les trabécules régressent et les parois ventriculaires s’épaississent. On parle alors de compaction. Nous connaissons assez bien les mécanismes cellulaires de la trabéculation mais très mal l’origine incluant le signal de la compaction. Nous avons déjà des nombreuses données incluant des données d 'expression génique montrant que la régression des trabécules est due à une sénescence des cellules cardiaques bordant le trabécules puis par leur élimination par des macrophages. De plus, le changement du métabolisme cardiaque au mileu de la gestation semble impliqué dans le processus de sénéscence. Pour valider ces données, nous délèterons un gène essentiel pour la sortie des cellules du cycle prolifératif et un gène impliqué dans le changement métabolique preferentiellement dans les cardiomyocytes embryonnaires et étudierons le phenotype des cœurs à différentes étapes du développement cardiaque.

Bénéfices attendus

La non compaction impacte l’hémodynamique cardiaque et est à l’origine de défaillance cardiaque. Elle ne peut pas contrairement aux autres malformations cardiaques être réparée par chirurgie. Comprendre ce mécanisme permettra d’agir pharmacologiquement

Procédures

gavage 30 s une seule fois dans leur vie. Anesthésie par le froid pour les souriceaux (10 min) avant mise à mort par décapitation

Impact sur les animaux

Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Il permet la diffusion de la molécule à chaque embryon et sera appliqué qu’une seule fois pour chaque souris.

Devenir

504 animaux femelles utilisés dans le projet seront mis à mort au moment de la collection d 'embryons à E13.5 et E16.5 . Les mâles (24) et les femelles (24) ayant donné naissance aux souriceaux seront conservés et pouront être réutiilisés juque la fin du projet .

Remplacement

Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro. Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle humain montre des trabecules naissant mais requiert encore une optimisation pour mimer la trabéculation et la compaction.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d un phénotype lié à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique. il existe une variabilité inter-portée c'est pourquoi il nous faut 6 portées par condition expérimentale. Nous effectuerons un test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes . Les données acquises sur le modèle cellulaire d'organoides cardiaques humains en 3D in vitro validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum , cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle de développement cardiaque reflétant les étapes du développement cardiaque humain y compris les phénomènes étudiés dans ce projet ( trabéculaton et compaction). Les stades de développement E13.5, E16.5 et nouveau-nés ont été choisis de part les phenomènes biologiques se déroulant à ces stades (trabéculation versus compaction et changement de métabolisme cardiaque, respiration de l 'O2...)

Greffées de cellules leucémiques prélevées chez des enfants, par voie intraveineuse ou directement dans le fémur sous anesthésie générale, 3 842 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à douze prises de sang, trois ponctions de moelle osseuse, une irradiation sub-létale de sept minutes et un gavage quotidien pendant quatre semaines. Les souris développent une leucémie qui provoque perte de poids et affaiblissement général, et toutes sont tuées, pour analyse post-mortem ou parce qu'elles sont transgéniques. Le projet se donne pour objectif d'identifier des approches alternatives à l'utilisation d'animaux non-humains pour l'étude des leucémies pédiatriques, tout en prévoyant 3 842 souris sur sa durée.

Objectifs

Les leucémies aiguës myéloblastiques de l’enfant et de l’adolescent sont des cancers des cellules sanguines, dont le pronostic s’est peu amélioré au cours des 25 dernières années. Les taux de rechute et de survie sont respectivement d’environ 45% et 65%. Le traitement standard comprend une polychimiothérapie, parfois associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour les patients de haut risque ou en rechute. La greffe de cellules souches hématopoiétiques (CSH) est un traitement lourd, source de séquelles à long terme. Des progrès sont donc nécessaires pour réduire le taux de rechute, améliorer la survie et limiter les séquelles. L’objectif de nos études est de caractériser les mécanismes mis en jeu dans les leucémies l’enfant à mauvais pronostic. Pour tester l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, il est essentiel de pouvoir travailler sur les cellules tumorales les plus proches possibles de celles présentes chez les patients afin de prendre en compte la complexité génétique des tumeurs. La xénogreffe dérivée du patient développée après transplantation de la tumeur primaire humaine directement dans divers modèles murins immunodéprimés a été utilisée largement pour modéliser différents types de cancer. En effet, ces tumeurs conservent les caractéristiques histologiques des tumeurs parentales, reflètent mieux l'hétérogénéité de l'échantillon du patient et constituent une plate-forme pour évaluer les médicaments anticancéreux (molécules pharmacologiques et immunothérapies, dans des conditions physiologiques. Le projet a également pour objectif d'identifier des approches alternatives à l’utilisation de modèles animaux pour l’étude des leucémies pédiatriques. Pour cela, nous utiliserons des modèles de cellules pluripotentes induites humaines cultivées in vitro pour caractériser les propriétés tumorales des cellules exprimant les oncogènes des leucémies issues des cellules souches en comparant les cellules obtenues in vitro et in vivo à celles provenant des patients. A terme, l'utilisation de cellues souches pourrait permettre de réduire l’utilisation d’animaux pour réaliser certaines approches exclusivement in vitro. Nous utilisons des outils statistiques permettant de définir le nombre minimal d'animaux à utiliser pour obtenir des conclusions significatives pour chaque approche.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'améliorer les modèles utilisés afin d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de leucémies agressives. Spécifiquement, nous attendons du projet qu'il permette : -D'amplifier des cellules leucémiques de patients afin de réaliser leur analyse moléculaire et définir l'efficacité de réponse à plusieurs molécules pharmacologiques qui seront identifiées par les analyses moléculaires. -D'identifier la trajectoire de transformation entre une cellule normale et une cellule leucémique afin de caractériser les spécificités des cellules leucémiques exprimant différents oncogènes. -De définir si des cellules souches pluripotentes induites pourraient, à l'avenir, être utilisées à la place des cellules humaines primaires et dans les approches in vitro pour réduire l'utilisation de souris. -De caractériser l'efficacité anti-tumorale d'approches précliniques, incluant certaines immunothérapies . -D'améliorer les modèles développés dans le but de réduire le nombre de souris utilisées et de définir les prérequis pour le replacement de certains modèles murins in vivo par des approches in vitro.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: -Injection intra-veineuse sous anesthésie locale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal). Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-veineuse de molécules sous anesthésie locale: injections dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être biheddomadaires sur une durée de 4 semaines. Chaque injection prend quelques secondes. -Injection intra-fémorale sous anesthésie générale de cellules: les injections sont ponctuelles (une fois par animal) et chaque injection prend 3 à 5 minutes. -Gavage oral: dans le cadre de tests de traitements anti-tumoraux et pourront être journalier sur une durée de 4 semaines. Chaque gavage prend 10-20 secondes. -Prélèvement de sang sous anesthésie locale: jusqu'à 12 prélèvements par souris avec une fréquence ne dépassant pas 1 fois/semaine. Chaque prélèvement prend ~1 minute. -Prélèvement de moelle sous anesthésie générale : jusqu'à 3 prélèvements par souris avec une fréquence d'au moins 15 jours. Chaque prélèvement prend 2 à 3 minutes. Irradiations sub-léthale, une seule fois, durée 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont dues au développement d'hémopathies malignes. Chez les animaux qui présentent une pathologie avancée, cela se traduit par une perte de poids et un affaiblissement général. Les interventions répétées de type injection ou prélèvements de sang peuvent éventuellement occasionner rarement des hématomes ou des lésions locales. Les injections intrafémorales ou les prélèvements de moelle dans le fémur peuvent rarement occasionner des douleurs persitantes et des boîteries. Les irradiations sub-léthales n'ont aucun effet indésirables au-delà des manipulations légères pour les pratiquer.

Devenir

Tous les animaux du projet sont transgéniques et seront donc euthanasiés. De plus, beaucoup développeront des maladies de type leucémie et seront euthanasiés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux dans ce projet est incontournable pour les raisons suivantes : 1-La génération/maturation terminale des lignées hématopoïétiques à partir de cellules souches n’est actuellement pas possible par des techniques de culture exclusivement in vitro; 2-Des lignées cellulaires immortalisées et poussant in vitro ne sont pas disponibles pour la plupart des oncogènes que nous étudions. D’autre part, plusieurs études montrent que ces lignées cellulaires cultivées in vitro divergent significativement des échantillons leucémiques de patients; 3-Les approches précliniques in vivo sont indispensables pour prendre en compte la pharmacologie des composés utilisés incluant la formulation, la biodisponibilité et la détection d’éventuels effets secondaires délétères; 4-Pour mettre en place des modèles de remplacement (ex: modèles de leucémie à partir de cellules souches pluripotentes induites), il est indispensable avant tout, de démontrer que les cellules obtenues par cette approche sont capables de reproduire in vivo des leucémies proches de celles observées chez les patients.

Réduction

De nouvelles lignées de souris immunodéficientes sont développées régulièrement par d'autres laboratoires et certaines sont rapportées comme ayant un taux de greffe des cellules hématopoïétiques humaines supérieur et donc permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces approches. Nous comparerons l'efficacité de ces modèles à celui du modèle de référence pour la prise de greffe de nos échantillons leucémiques afin de sélectionner le modèle qui permettra de réduire le nombre de souris utilisées pour les greffes primaires. Des méthodes statistiques seront utilisées pour déterminer précisément le nombre d'animaux nécessaire et suffisant et pour analyser les résultats. Au cours des années passées, nous avons identifié un modèle plus réceptif aux greffes de cellules hématopoïétiques primaires ou issues de cellules souches pluripotentes induites. Nous utilisons donc maintenant régulièrement cette souche qui permet de réduire le nombre de souris utilisées. Nous poursuivrons la comparaison avec de nouvelles souches de souris immunodéficientes qui deviendraient disponibles au cours du projet. Dans le cas où elles montreraient une efficacité, nous serons donc amenés à utiliser de nouvelles lignées et à diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Afin de réduire l’invasivité des prélèvements, nous introduisons des rapporteurs luminescents dans les cellules humaines utilisées pour les approches précliniques afin de pouvoir suivre la prise de greffe et l’efficacité des traitements par des approches d’imagerie corps entier sans prélèvements (ex: sang ou moelle) permettant une meilleure quantification de l'efficacité globale du traitement.

Choix des espèces

Les souris représentent une espèce relativement facile à élever qui permet l’obtention de résultats rapides du fait de leur temps de génération réduit. Elles possèdent un système hématopoïétique proche de celui de l’homme. Pour cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, car ces souris permettent une prise de greffe efficace de cellules humaines, avec un risque de rmaladie du greffon contre l'hôte réduit et peuvent être utilisées pour les approches précliniques. Par le passé, nous avons contribué à des approches précliniques pour un composé qui ont conduit à des phases cliniques. Ces modèles sont également utiles pour le test d'immunothérapies. Nous utiliserons des souris adultes entre 6 et 10 semaines pour avoir des tests efficaces et reproductibles. Pour l'étude des pathologies de l’enfant, des article récents montrent l’importance d'utiliser des souris receveuses nouveau-nés. Ainsi, nous pourrons transplanter les cellules soit dans des receveurs nouveau-nés ou adultes pour comprendre l'importance de l'âge de l'organisme lors du dévéloppement des leucémies retrouvées chez l'enfant.