Système cardiaque

Tatouées et biopsiées de la queue avant huit jours, puis injectées quatre jours de suite dans la cavité abdominale, 688 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses post-mortem. Le tamoxifène injecté peut provoquer chez les mâles un œdème testiculaire, voire une hernie inguinale. Deux à cinq prises de sang et jusqu'à deux ponctions de moelle osseuse au genou suivent l'apparition d'une leucémie lymphoblastique aiguë, dont le porteur écrit ignorer le délai, et qui dégrade l'état des souris en quelques jours: perte de poids, détresse respiratoire, anémie, masses sous la peau, prostration. Il présente ces prélèvements comme respectant "les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux", tout en indiquant que la ponction du genou peut léser le cartilage et perturber les déplacements.

Objectifs

Sur la base de données scientifiques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints de leucémies aiguës lymphoblastiques B d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus leucémogène de cette hémopathie, de deux protéines retrouvées dans les cellules leucémiques de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle murin dans lequel ces deux protéines sont exprimées dans les cellules lymphoïdes pour voir si elles sont à l’origine de la maladie. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsable de l’émergence de ce type de leucémie chez l’Homme. Notre projet a pour but : (1) de caractériser les anomalies morphologiques, cellulaires et moléculaires dans le système hématopoïétique des souris qui expriment les deux protéines dans leurs cellules lymphoïdes, (2) de comparer ces anomalies aux anomalies décrites pour ce type de leucémies chez l’Homme, (3) d’étudier expérimentalement la pathogénicité de ces deux protéines. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intégre dans une projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence un sous-type particulier de patients atteints de leucémies lymphoblastique B de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de leucémogenèse de ce type particulier de leucémies permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autre, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.

Procédures

Les souris transgéniques seront tatouées et une biopsie de queue sera réalisée avant 8j. Les animaux au génotype d'intérêt seront soumis à quatre injections dans la cavité abdominale de produits chimiques (1 injection par jour pendant 4 jours sur animal vigile) au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de la leucémie attendue, 2 à 5 prises de sang, à raison d’une prise par ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse réalisés sur animal anesthésié), avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements, pourront être réalisés sur ces souris. Les souris immunodéprimées seront soumises à une injection de cellules de moelle osseuse murine (sur animal vigile en contention). Deux à quatre prises de sang, à raison d’une prise par mois (sur animal anesthésié ou vigile selon la voie de prélèvement choisie pourront être réalisées pour suivre l’évolution de la leucémie.

Impact sur les animaux

Le tatouage et la biopsie de queue induiront une douleur légère de courte durée. Les animaux transgéniques recevront une dose définie de tamoxifène par injection intra-péritonéale. Ceci peut s’accompagner d’une inflammation au site d’injection et de douleur abdominale au moment de l’injection. Chez les mâles, un œdème testiculaire peut apparaître secondairement, voire une hernie inguinale. De même, l’injection intra-veineuse de cellules de moelle osseuse murines dans les souris immunodéprimées peut s’accompagner d’inflammation au site d’injection. Etant donné l’immunodépression des souris , il ne devrait pas y avoir de réaction de rejet. Sur le plus long terme, notre hypothèse de travail est que les souris développeront des leucémies aiguës lymphoblastiques. Nous ne connaissons pas le délai d’apparition des symptômes. Lorsque la maladie se déclare, l’état de santé des souris se dégrade rapidement (quelques jours). Les cellules leucémiques se propagent, se multiplient et envahissent la moelle osseuse. Ceci entraine une forte perturbation de la production de cellules sanguines. Les souris perdent généralement du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de détresse respiratoire, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, et leur pelage n’est plus bien entretenu. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui perturbent ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection au niveau du point de ponction.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La fonction des deux protéines dans la cancérogénèse sera étudiée sur les modèles animaux, en les exprimant dans leur environnement médullaire complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo. Les études mécanistiques seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires humaines exprimant ou non les deux protéines en culture. Nos collaborateurs disposent également de lignées de B-LAL du sous-type CDX2/UBTF. Mais ces lignées ne permettent pas répondre aux questions concernant l’émergence des leucémies dans une moelle saine.

Réduction

Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Comme il s’agit d’études exploratoires, il est difficile de prévoir exactement l’impact des de l’expression des deux protéines étudiées sur la leucémogenèse. Sur la base de notre expérience et de la littérature, et en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, un nombre d’animaux minimum et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été estimé à n=4 à 20 animaux par groupe expérimental en fonction de l’étude. Le nombre d'animaux nécessaire par expérience a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés. Dire seulement qu’une partie du projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (baton, coton et frisure pour faire un nid). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et garantir le bien-être animal en évitant des souffrances inutiles.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

2 816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer de huit à vingt-quatre semaines sous régime gras pour développer obésité et diabète, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, d'autres placées seules en cage sept jours, immobilisées deux à cinq minutes dans un tube pour mesurer leur graisse corporelle, ou laissées une nuit sur une grille pour récupérer leurs fèces. Le porteur reconnaît que les injections intrapéritonéales répétées pourraient provoquer une péritonite et que les gavages peuvent causer des microlésions. Le projet ne teste aucun traitement et vise à comprendre le rôle des macrophages du foie, quand l'atteinte des souris, elle, est acquise dès la mise au régime.

Objectifs

Les macrophages sont des cellules du système immunitaire présents dans tous les tissus. Ils participent au maintien de l’organisme en éliminant notamment les cellules mortes ou bien des pathogènes (bactéries, virus). Ces cellules ont toutefois été aussi fortement impliquées dans un grand nombre de maladies dites chroniques, où on leur prête bien souvent un rôle délétère, et notamment dans la maladie du foie gras (NAFLD), l’athérosclérose (maladie des artères à l’origine des infarctus du myocarde) ou bien dans le tissu adipeux chez les individus avec surcharge pondérale (obésité) et diabète. Les macrophages sont des cellules très diverses qui sont fortement influencées par le tissu où elles résident et leur environnement, notamment en conditions pathologiques. Notre projet vise à mieux définir le rôle des macrophages du foie dans le développement des pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras (NAFLD), obésité). Pour reproduire les différents contextes pathologiques, des modèles animaux seront nourris avec différents types de régimes alimentaires qui favoriseront la survenue d'obésité, de la NAFLD ou bien encore de l'hypercholestérolémie (facteur de risque majeur de l’athérosclérose). Certains traitements pourront aussi être conduits sur les animaux pour modéliser un aspect bien précis de l’évolution pathologique de la NAFLD, à savoir la fibrose du foie. En modifiant, la fonction de ces macrophages, leur capacité à survivre ou bien même en éliminant ces cellules du foie de manière momentanée ou durablement, nous essaierons de comprendre leurs rôles et l’importance de leur diversité (origine, activation) dans le contexte de la pathologie et comment ces cellules peuvent influencer le développement des maladies cardio-métaboliques.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies métaboliques, comme l’obésité, a augmenté à un rythme exponentiel au cours des dernières décennies. Il est important de noter qu'en plus d'avoir ses propres comorbidités, l'obésité a un impact considérable sur la santé d'un patient et augmente sa susceptibilité à d'autres conditions, comme le cancer. Les comorbidités reconnues depuis longtemps de l’obésité comprennent la résistance à l’insuline et le diabète de type 2, l’hypertension, la dyslipidémie, les maladies cardiovasculaires et la stéatose hépatique. Il est à noter que la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) soit également un facteur de risque indépendant majeur pour le développement de maladies cardiovasculaires, notamment l’athérosclérose. Il existe de plus en plus de preuves d’une association étroite entre l’obésité et la NAFLD, et une attention considérable de la recherche est désormais portée sur cette association en raison de la prévalence croissante de la NAFLD et de sa capacité à évoluer vers un dysfonctionnement et une insuffisance hépatique. Le fardeau de la NAFLD devrait augmenter et les projections actuelles estiment que, d’ici 2030, plus de 300 millions de personnes développeront la NAFLD en Chine, plus de 100 millions aux États-Unis et 15 à 20 millions dans les principaux pays européens. Les coûts économiques actuels associés à la NAFLD et à ses comorbidités sont extrêmement élevés. Ainsi, de gros efforts sont en cours pour développer des traitements innovants pour lutter contre cette maladie, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement approuvé. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le rôle et l’importance que jouent les macrophages (origine, quantité tissulaire, activation) dans le développement de ces pathologies dites cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras ou NAFLD, obésité).

Procédures

Les animaux seront nourris avec différents types de régimes riches en graisses de 8 à 24 semaines pour les faire grossir et développer un diabète. Ils pourront également être nourris en alternance avec un régime riche en graisses ou avec un régime normal. Ils pourront être mis à jeun pendant quelques heures, recevoir un gavage ou une injection et subir 1 ou 2 tests de 2 heures avec quelques petites prises de sang sur animal vigile pour évaluer leur diabète. Les animaux pourront être anesthésiés et recevoir une injection en intra-veineux (durée de quelques minutes) une seule fois. Certains animaux pourront avoir deux prises de sang (vigile, une minute de contention) à quelques jours ou quelques semaines d’écart. Certains animaux pourront être placés dans un tube ou dans un compartiment d’une boite avec restriction de mouvements pendant 2 à 5 mins pour mesurer leur graisse corporelle. Certains animaux pourront être placés seuls dans une cage de dimension normale pendant 7 jours (isolement des animaux avec contact visuel et olfactif avec ses congénères) pour évaluer leur état général et leur niveau d’activité. Certains animaux recevront des traitements par injection de molécules (une seule fois ou deux fois par semaine pendant 6 semaines) ou par addition de molécules dans la nourriture pour induire des perturbations hépatiques. Certains animaux pourront être irradiés quelques minutes et subir une greffe de moelle osseuse immédiatement après par injection sous anesthésie (durée quelques minutes) pour étudier les cellules de leur moelle osseuse. Certains animaux pourront être placés sur une grille déposée sur le sol de leur cage pendant une nuit pour récupérer leur fèces. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les prélèvements pour génotypage pourront induire une douleur légère et de courte durée. Les animaux nourris avec les régimes riches en graisses présenteront une prise de poids importante pouvant modifier leur mobilité avec diminution de leur activité quotidienne. La composition de ces régimes riches en graisses les rend plus mous et pourrait favoriser une pousse des dents plus importantes. Les contentions de courtes durées, les administrations par gavage, les injections et les prélèvements sanguins sur animal vigile nécessaires aux différents tests pourront être sources de stress et d’inconfort pour l’animal. Les injections intra-péritonéales répétées pourraient induire un risque de péritonite. De façon rare, les gavages pourront induire des microlésions ou des irritations. Certains tests pourront également induire un stress pour les animaux en raison d’une courte période de mise à jeun. Les mesures de composition corporelle (mouvements limités dans un tube pendant 2 mins) pourront être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Les courtes anesthésies gazeuses pour les injections intra-veineuses pourront engendrer un stress thermique et les injections une douleur temporaire au réveil. Certaines injections ou administration de molécules pourront induire une inflammation temporaire, être source d’inconfort pendant 1 à 2 jours, et s'accompagner parfois d'une perte de poids. L’isolement (une nuit) sur grille pour la récupération des fèces pourront induire un stress. Les animaux irradiés (doses modérées) pourront être stressés au cours de l’irradiation par restriction de leur mouvement (durée 5 mins) dans une petite boîte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser l'analyse de leurs tissus post-mortem.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs cellulaires pouvant orienter le développement des pathologies cardio-métaboliques (hyperlipémie, maladie du foie gras, obésité). Nous avons besoin d’étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de certains gènes dans nos cellules d’intérêt, et d'étudier les conséquences dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires qui rentrent en jeu et la répercussion de leur activité sur le fonctionnement du tissu.

Réduction

Un total de 2816 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de notre d’expérience utilisant des approches similaires et à l’aide d’un calcul de puissance, nous estimons que 2 lots de 8 animaux par condition seront suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour certaines expériences mâles et femelles seront étudiés séparément car les réponses tissulaires peuvent différer selon le sexe de l’animal. Toutefois, pour certaines études les mâles seront préférentiellement utilisés. Les femelles générées seront alors utilisées pour d'autres expériences, permettant de réduire le nombre d’animaux. A l'issue des expérimentations, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans les conditions standard d'animaleries EOPS (exempte d'organismes pathogènes spécifiques) avec hébergement en portoirs ventilés, avec respect des cycles jour et nuit de 12h, un contrôle de l’hygrométrie et de la température comprise entre 20 et 24 degrés. Les changes litière et de nourriture sont effectués de façon hebdomadaire avec surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie. Les souris disposeront de lanières de papier kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des males se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur. Une solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux sera recherchée (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Après transfert des animaux des zones d’élevages, les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 1 à 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Pour toutes les procédures, les injections, les administrations de molécules ou les prélèvements sanguins seront réalisées par une personne en charge de l'étude, habilitée à réaliser les expérimentations sur ce modèle, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Pour les procédures où une douleur est attendue, les animaux seront suivis quotidiennement. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et,ou le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant. Si des points limites définis en amont sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle des invalidations géniques et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont déjà été développées et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. L’expression des maladies cardio-métaboliques est par ailleurs assez bien reproduite dans le modèle murin avec un recul expérimental de plusieurs décennies à travers le monde. Les animaux utilisés devront avoir atteint la maturité sexuelle et être de jeunes adultes au début des expérimentation. Ils seront donc utilisés à partir de l’âge de 8 semaines.

Sur 418 souris, 400 sont tuées à l'issue d'expériences terminales et 18 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée pour ne plus produire une protéine dans les cellules qui fabriquent les plaquettes. Selon les groupes, 270 souris reçoivent des traitements et trois prises de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, puis un prélèvement de sang à l'aorte, 30 subissent ce seul prélèvement, 100 sont opérées du crâne sous une anesthésie de trois heures au plus, sans réveil, et 18 passent une mesure du temps de saignement à la queue. L'équipe veut comprendre comment se forme le réseau de membranes internes de ces cellules, et le porteur renvoie les retombées pour les patients manquant de plaquettes "à plus long terme". Il affirme que ces expériences demandent "un animal adulte vivant", parce que ces membranes se développent mal dans les cellules en culture.

Objectifs

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme la membrane plasmique des futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes internes et dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membrannes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi répétée de la numération à la queue (x3), puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 270 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 418 souris

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Lors de ce projet, sur les 418 animaux : 400 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo

Réduction

A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.

Irradiées puis greffées de cellules humaines, 1 530 souris subissent quatre injections, une injection dans le fémur, une prise de sang et la section du bout de la queue pour mesurer leur temps de saignement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue, une partie par laparotomie sans réveil, pour prélever tissus et organes. Le projet vise à tester l'effet de mutations rares sur la coagulation et la sécurité de plaquettes produites à partir de cellules souches, en vue de transfusions. Le porteur affirme être "contraint" de travailler sur la souris et indique que la thrombose ne peut s'étudier qu'in vivo, l'espèce étant retenue parce qu'elle tolère les greffes de cellules de patients.

Objectifs

Ce projet a pour objectif 1) étudier l’effet de différentes mutations trouvées dans les pathologies très rares sur la coagulation, évènement qui est impossible d’étudier in vitro, et tester l’effet des drogues identifiées dans une étude sur la coagulation réalisée en parallèle in vitro à partir de cellules souches de patients. 2) étudier la fonctionnalité des plaquettes générées à partir des plaquettes dérivés de cellules souches adultes, notamment leur capacité à participer à la formation de caillot ; et tester la sécurité de ces plaquettes dans le but de leur utilisation pour la transfusion (pas de développement d’hémopathies malignes).

Bénéfices attendus

1) Identification et validation de drogues permettant l’arrêt de saignement dans les maladies rares conduisant à des thrombopénies/thrombopathies 2) Développement de stratégie de production de plaquettes in vitro dans le but de transfusion, notamment test de fonctionnalité et sécurité des plaquettes produites in vitro à partir des cellules souches adultes plaquettaires.

Procédures

Irradiation par rayonnements ionisants à faible dose, pas d'effet délétère. Injections (n=4, durée 1 minute sous anesthésie locale). Injection intra-fémorale (n=1), durée 5 minutes sous anesthésie générale puis analgésie bi-modale., Prise de sang (n=1, durée 1min) .Mesure de temps de saignement : par section de l'extrémité de la queue sous anesthésie générale (durée maximale 10 minutes). Laparotomie sous anesthésie générale en procédure terminale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Nous n’anticipons aucun effet indésirable après l’injection de MKs ou plaquettes dérivées de cellules souches. Les principales nuisances seront celles dues aux interventions. Injections simples, de contrainte légère sous anesthésie locale. L'irradiation a faible dose n'a pas d'effet délétère. L'injection intra-fémorale peut entraîner une gêne modérée transitoire. La section d'une petite partie de la queue pour étudier le temps de saignement entraîenra une contrainte légère et de courte durée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur tissus et organes, certains à l'issue d'une procédure terminale sans réveil.

Remplacement

Bien que les plaquettes soient étudiées chez les patients, il est rarement possible d’étudier toutes les étapes dérégulées et aboutissant à la pathologie. Ainsi, il est difficile de les étudier chez l’homme. Nous sommes donc contraints de travailler sur souris afin de comprendre le dysfonctionnement dans la production plaquettaire dans les thrombopénies héréditaires qui sont des maladies rares. Cela est possible uniquement sur un modèle animal avec un suivi sur une durée prolongée. Par ailleurs, pour bien comprendre les mécanismes sous-jacents à la pathologie, il est important de les valider sur un nombre de sujets valable sur le plan statistique, possible uniquement sur le modèle animal. De plus, nous nous intéressons, dans chaque pathologie étudiée, à la dérégulation de la thrombose qui peut être étudiée uniquement in vivo.

Réduction

Les effectifs des lots par condition ont été déterminés grâce à l'expérience antérieure du laboratoire et en tenant compte du taux de prise de greffe. Si nous nos résultats obtenus avec les cellules souches contrôles sont reproductibles entre trois expériences indépendantes, nous ferons les expériences uniquement avec les cellules souches mutées sans et avec la drogue ce qui permettra de réduire le nombre de souris greffées avec les cellules souches contrôles. Si certaines drogues sont inefficaces sur les souris greffées avec les cellueles souches mutése, elles ne seront pas re-testées dans les 2 autres expériences pour valider le résultat négatif. Les résultats seront analysés par analyse de variance.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Un régime énergétique adapté sera ajouté dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...). Dans un souci de bien-être animal, les souris greffées, sous traitement ou non, seront suivies quotidiennement, les injections et prélèvements sanguins seront réalisés sous analgésie ou anesthésie et des points limites définis afin de limiter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris car nous voulons étudier l’impact de certaines mutations humaines sur un modèle animal tolérant les greffes de cellules de patients. Ainsi, les techniques de transgénèse et greffes sont bien documentées et maîtrisées chez la souris. De plus, en vue de nombreuses publications sur les modèles murins, cette dernière constitue un modèle pertinent pour les projets que nous menons. Les souris sont également adaptées à l’étude d’inhibiteurs que nous testons dans un but thérapeutique. Enfin, la souris semble plus adaptée à l’étude de la formation d’une thrombose in vivo car une étude similaire a déjà été publiée. Cette dernière est à approfondir sur certains aspects, ce que nous souhaitons faire. De plus, nous possédons l’expertise et les moyens techniques nécessaires (vidéomicroscopie chez le petit animal) pour apporter les réponses aux question posées. Pour certaines études, des contraines physilogiques (masses graisseuses autour des vaisseaux chez les animaux plus âgés empêchant la visualisation en vidéomicroscopie) nous imposent d’utiliser des souris âgées de 3 à 5 semaines (jeunes). Pour les autres études nous utiliserons des souris de 8 à 15 semaines (adultes).