Système cardiaque

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une chirurgie pour greffer des cellules d'adénocarcinome pancréatique directement dans le pancréas, une autre reçoit ces cellules par voie intraveineuse, et le porteur indique que des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons, pouvant entraîner des difficultés respiratoires, ainsi que dans le foie, la rate et les ganglions. Il annonce une perte de poids liée aux tumeurs pancréatiques et un stress lié aux contentions multiples, puis décrit un dispositif de confort, tapis chauffant et protection des yeux sous anesthésie, sans détailler les points limites qui déclencheraient une mise à mort anticipée. Le laboratoire développe des modèles cellulaires en trois dimensions et ne teste chez la souris que les molécules déjà actives in vitro, ce qui n'empêche pas de classer l'ensemble du projet au niveau de souffrance le plus élevé.

Objectifs

Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, le rôle d’une nouvelle voie oncogénique dans le développement de ces tumeurs. Dans un deuxième temps, nous étudierons le rôle de cette voie sur la dissémination métastatique des tumeurs.

Bénéfices attendus

A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min).

Impact sur les animaux

La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.

Réduction

Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.

Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, 192 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'acte chirurgical dure une heure et s'accompagne d'injections intraveineuses, de sept mesures de pression artérielle dont certaines sur animal éveillé, et de mesures de température par voie rectale. Le porteur annonce pour l'ensemble des animaux une mobilité réduite, des douleurs post-opératoires et un stress lié aux manipulations, et prévoit un isolement en cage individuelle pendant les 24 heures suivant l'opération. Il décrit une surveillance de la douleur par score de grimace, orbites rétrécies, renflement du nez, oreilles rejetées en arrière, et affirme que la procédure a un caractère de "stricte nécessité" parce que la réponse immunitaire mobilise l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires constituent l’une des premières causes de décès dans les pays développés. L’infarctus du cœur est déclenché par l’obstruction des artères coronaires qui alimentent le cœur en sang et donc en oxygène. Sans l’oxygène, les cellules du muscle cardiaque (myocarde) meurent rapidement et le cœur ne réussit pas à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins du corps, ce qui peut conduire à l’arrêt du cœur. La restauration de l'apport sanguin au niveau des artères obstruées est essentielle pour réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. Une approche thérapeutique permettant la reperfusion est de favoriser la dilatation des artères coronaires. Nous avons démontré que l’utilisation de petites vésicules naturelles, appelées microvésicules (MV), portant à leur surface une protéine spécifique, sont capables d’améliorer la fonction vasculaire dans des modèles cellulaires. Cependant, ces modèles d’étude sont limités pour évaluer l’efficacité de ces MV dans l’amélioration de la fonction cardiaque. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si les MV sont capables de réduire les conséquences associées à l’obstruction des artères coronaires en les injectant après l’infarctus du myocarde dans un modèle de ligature d’artère coronaire chez le rat. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour mieux comprendre les mécanismes protecteurs des MV ainsi qu’envisager leur utilisation comme un outil thérapeutique potentiel chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Démontrer l’innocuité et efficacité in vivo du traitement avec MV et valider leur participation dans la préservation ou l’amélioration de la fonction des cellules cardiaques lors d’un infarctus de myocarde. En plus, la confirmation des effets in vivo aidera dans la validation de ces MV comme un nouvel outil thérapeutique pour le traitement des conséquences de l’infarctus de myocarde chez l’Homme.

Procédures

Quatre interventions impliquant tous les animaux : induction d’un infarctus de myocarde (durée acte chirurgical : 1 heure), injection intraveineuse réalisée pendant l’anesthésie (durée de chaque injection < 5 minutes), mesure de la pression artérielle (5 minutes, 7 mesures), mesure de la température corporelle (< 1min, 2 mesures).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les rats seront les suivants : 1) Mobilité réduite dans des cages à cause de l’acte chirurgical après l’induction de l’infarctus de myocarde ; 2) Douleurs post-opératoires à cause de l’acte chirurgical ; 3) Stress lié aux manipulations (prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de la température au niveau rectal). Les effets indésirables concernent l’ensemble des animaux.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux euthanasiés. Il est nécessaire d'analyser la réduction de la taille de l'infarctus par études d'histologie dans le cœur pour valider les doses plus efficaces des MV.

Remplacement

La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet porte sur les effets des MV sur l’infarctus de myocarde, c'est à dire sur un coeur avec une artère ligaturée puis reperfusée et leur impact dans la fonction cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les mécanismes cellulaires mis en jeu lors d'un infarctus de myocarde font participer le tissu cardiaque en hypoxie mais également une réponse immunitaire de l'organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de ligature coronaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur un même animal.

Raffinement

Nous avons raffiné nos approches afin de réduire au minimum la détresse imposée aux animaux qui seront hébergés dans un milieu enrichi permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Une analgésie pré- et post-opératoire sera réalisée et renouvelée aussi souvent que nécessaire. L’état de santé des animaux sera donc évalué de façon régulière pendant les 24 heures après l’acte chirurgicale en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des cicatrices, formation d’abcès, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores suivants (cicatrice sans saignement = score 0, cicatrice saignante = score 1, cicatrice inflammée = score 3, formation d'abcès = score 4, cicatrice nécrosée = point limite; apparence physique normale = score 0, pas de toilettage = score 1, poil ébouriffé = score 2; doleur post-opératoire = score 3, détresse cardiorespiratoire = point limite; comportement normal = score 0, prostration et apathie = point limite ). Après l’acte chirurgical, les rats seront placés pendant 24h dans des cages individuelles. Dans la cage, chaque animal aurait à disposition des tubes de carton pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser les effets thérapeutiques des MV lors d’un infarctus de myocarde. À cette fin, le choix de l'espèce Rattus norvegicus est basé sur notre connaissance de ce modèle ainsi que la disponibilité de données dans la littérature associées à l’étude de modifications dans la taille de l’infarctus. Les rats seront utilisés à l’âge de 7-8 semaines auquel les animaux sont considérés comme adultes.

Ligature de la carotide et de l'artère rénale, injection d'une molécule dans le cerveau, pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle : 1 179 souris subissent ces interventions dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur attend environ 10 % de mortalité pour chacune des deux chirurgies, et décrit des douleurs post-opératoires, des pertes de poids, et pour les souris dont l'anévrysme se rompt une hémorragie et des symptômes neurologiques. Cinq prélèvements sanguins et dix jours de sessions de mesure de pression sur animal maintenu immobile s'ajoutent aux chirurgies. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun dispositif ne reproduit tous les paramètres de la maladie et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux vivants.

Objectifs

Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs. Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.

Procédures

Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. Toutes les procédures décrites ci dessus s'effectueront dans l'établissement utillisateur EU1. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). Cette partie surveillance par imagerie s'effectura dans l'établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.

Devenir

Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.

Remplacement

La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids. Le transport entre les 2 EU dure 5 minutes à pied. Les souris sont déplacées dans leur cage qui sont placées dans un sac de transport recouvert d'un tissus pour les cacher de la vue du public.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.

Toutes tuées pour analyse histologique, 150 souris subissent une greffe de cellules tumorales dans le pancréas par chirurgie ou une injection intraveineuse de ces cellules, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les tumeurs pancréatiques entraînent une perte de poids et que des métastases apparaissent rapidement dans les poumons, avec des difficultés respiratoires, ainsi que dans le foie, la rate et les ganglions. Le projet teste l'effet de médicaments inhibant une protéine plaquettaire, seuls ou combinés à la chimiothérapie standard. Le porteur décrit ses propres modèles cellulaires en trois dimensions comme capables de remplacer "une partie" des études sur souris, et retient le recours aux animaux non-humains pour les échanges cellulaires que ces modèles ne reproduisent pas.

Objectifs

Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec la chimiothérapie standard. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.

Bénéfices attendus

A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.

Procédures

Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).

Impact sur les animaux

La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés.

Remplacement

Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.

Réduction

Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.

Raffinement

Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.

Toutes tuées pour analyse du cerveau, 1179 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour provoquer des anévrysmes intracrâniens. Elles subissent des ligatures d'artères, une injection dans le cerveau et la pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, chirurgies pour lesquelles le porteur anticipe environ 10 % de mortalité chacune. Une rupture d'anévrysme, recherchée par le modèle, entraîne une brusque perte de poids, des symptômes neurologiques et une hémorragie, suivies de la mise à mort. Le porteur présente le projet comme une voie pour remplacer un jour la chirurgie humaine par un médicament.

Objectifs

Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.

Procédures

Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. Les interventions décrites ci dessus seront réalisées dans l'établissement utilisateur EU1. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). Ce suivi par imagerie s'effectuera dans l'établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.

Devenir

Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.

Remplacement

La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids. Le transport entre les deux établissements utilisateurs dure 5 min à pied. Il se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.