Système cardiaque
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Utilisation de modèles murins pour étudier du rôle de l’acide rétinoïque dans le développement cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
7986 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent un traitement modifiant la voie de l'acide rétinoïque, leurs embryons et foetus pouvant présenter des malformations cardiaques, tandis que les souriceaux subissent une biopsie de l'oreille et certains adultes des échocardiographies sous anesthésie. Le porteur indique que ces défauts peuvent conduire à une insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. Il présente cette recherche fondamentale comme un "prérequis essentiel" au développement futur de thérapies, sans application immédiate annoncée.
Objectifs
Les malformations cardiaques congénitales sont les anomalies congénitales les plus fréquentes puisqu'elles représentent environ 1% de toutes les naissances. Ces malformations peuvent être d'origine génétique mais peuvent aussi être dues à un problème de développement pendant la grossesse. Plusieurs études ont montré que la voie de l’acide rétinoïque (AR), dérivé de la vitamine A, est impliqué dans le développement du cœur et en particulier celui des populations cellulaires à l’origine de la formation du cœur. Des dérégulations de la voie de l'AR (excès ou carence) durant le développement embryonnaire se traduisent par de graves malformations congénitales structurelles du cœur telles que les anomalies des gros vaisseaux (ainsi que de la séparation des oreillettes et des ventricules. Il a également été montré que l’AR est nécessaire à la formation des valves cardiaques qui assurent une circulation unidirectionnelle du sang à chaque cycle cardiaque. Les défauts de fonctionnement des valves (valvulopathies) peuvent également avoir une origine génétique et développementale. Dans ce projet, nous souhaitons utiliser des modèles murins génétiquement modifiés pour mieux comprendre comment la voie de l’AR contrôle le développement du cœur et celui des valves cardiaques.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu’il augmente nos connaissances sur le rôle essentiel de l’AR dans le développement du cœur pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent à des malformations cardiaques congénitales. La compréhension de ces mécanismes est un prérequis essentiel pour le développement de thérapies dans le futur.
Procédures
Les femelles gestantes seront soumises à une administration unique soit par voie orale soit par voie intrapéritonéale (contention et administration durant environ 1 minute). Les embryons et foetus peuvent présenter des malformations congénitales. A l'âge de 3 semaines, les souriceaux subiront une biopsie à l'oreille permettant de réaliser simultanement l'identification et le prélèvement d'ADN pour identifier les animaux mutants (génotypage). Les souris adultes peuvent être amenées à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. Certaines d'entre elles auront deux échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes chacune). Ils peuvent être amenés à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites. En cas d'apparition de signes cliniques, les animaux pourraient recevoir des injections d'antiinflammatoire (une injection sous cutanée, une fois par jour, maximum 3 jours) ou de diurétiques (une injection intra péritonéale, deux fois par jour, maximum 3 jours).
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, des femelles gestantes recevront des traitements par voie orale et voie intra péritonéale. Aux doses administrées, les traitements n’auront pas d’impact sur les femelles. Les embryons et les fœtus étudiés pourront avoir des malformations congénitales avec des degrés de sévérités variables. Sur les lignées étudiées après la naissance, les défauts développementaux, (principalement cardiaques) pourront conduire à l'apparition d'insuffisance cardiaque avec des difficultés respiratoires (oedème pulmonaire)
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet consiste en l’étude de la morphogénèse du cœur durant le développement embryonnaire qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. De plus, le cœur humain comme celui de la souris est un organe complexe composé de quatre cavités. Nous allons étudier la séparation des quatre cavités cardiaques, ce qui rend l’utilisation d’autre modèle comme le poisson (contenant un seul ventricule) incompatible avec nos recherches.
Réduction
Par une approche statistique nous réduirons au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet et défini qu'il nous faut au moins 17 souris/embryons par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris/embryons par groupe. Pour l'analyse de la fonction cardiaque, nous avons choisi une méthode d'analyse longitudinale (échographie cardiaque) permettant d'analyser un même animal à différents temps, premettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des rongeurs. Certains des modèles que nous allons utiliser n’ont pas été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations poussées des animaux et identifier, de la manière la plus précoce, l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure Chargée du Bien Etre Animal.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences sur la circulation sanguine et de leurs causes génétiques. Les femelles utilisées pour les accouplements seront utilisées durant les fenetres de fertilité des rongeurs: entre 2 et 8 mois. Au cours de l'étude, nous nous intéresserons à différents stades développementaux: le début du développement cardiaque (jours 8, 8.5, 9.5 et 10.5 post fécondation), au moment de la séparation des chambres cardiaques et du début de formation des valves cardiaques (jours 13.5 et 15.5 post fécondation) et juste avant la naissance (jours 18.5 post fécondation / mise bas naturelle prévue entre autour de 20 jours post fécondation dans nos modèles) Pour les individus de la procédure 3, nous analyserons leur phénotype à 1,5 et 3 mois correspondant aux stades de début et de fin de maturation des valves cardiaques.
Etude de l’inhibition de l’ARN ribosomique dans un modèle murin immunocompétent de greffe d’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACCP)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une greffe de cellules tumorales dans le pancréas sous anesthésie, ou une injection intraveineuse, puis des traitements répétés, et développent des tumeurs pancréatiques et des métastases pulmonaires pouvant causer perte de poids et difficultés respiratoires. Le porteur teste des inhibiteurs de l'ARN ribosomique, seuls ou combinés à la chimiothérapie, sur un cancer qu'il décrit comme très agressif et de mauvais pronostic. Il indique développer des modèles cellulaires en trois dimensions mais affirme qu'ils ne reproduisent pas la complexité de l'organe, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
Les carcinomes canalaire pancréatique sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec la chimiothérapie standard. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.
Bénéfices attendus
A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.
Procédures
Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intrapéritonéales (durée : 20 sec) ou intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).
Impact sur les animaux
La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés.
Remplacement
Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.
Réduction
Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.
Effet d’actifs d’origine 100% naturel sur l’homéostasie du cholestérol chez des souris mâles Ldlr KO
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée hypercholestérolémique, elles reçoivent jusqu'à 42 gavages, une injection intraveineuse et plusieurs prélèvements sanguins, un lot subissant une chirurgie terminale sans réveil, pour tester l'effet d'extraits végétaux sur le cholestérol. Le porteur présente ces extraits comme des actifs "100% naturels" et attend une amélioration sans effets indésirables. Il affirme être "contraint" d'utiliser le modèle animal, le métabolisme du cholestérol ne pouvant selon lui être étudié in vitro.
Objectifs
Notre projet s’inscrit dans le cadre de la lutte contre les maladies cardiovasculaires (infarctus, Accident Vasculaire Cérébrale) et en particulier dans la détermination de nouvelles pistes thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des dyslipidémies. L’objectif de notre programme de recherche est de caractériser d’extraits végétaux sur les niveaux de cholestérol sanguins et de comprendre l'impact sur les voies métaboliques impliquées.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d’identifier le pouvoir hypolipémiant d’extraits végétaux administrés 1) par voie orale ; 2) ou dans un régime. En outre, il permettra de valider son intérêt thérapeutique en démontrant que les extraits exercent des effets anti-athérogéniques.
Procédures
Deux lots de souris recevront 42 gavages oraux (environ 5-10 secondes par gavage), une injection intraveineuse (environ 5-10 secondes par injection) et des six prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement). Un dernier lot de souris sera soumi à 10 prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement) et subira une chirurgie terminale sans réveil (environ 1 heure/ souris).
Impact sur les animaux
Nous utilisons une lignée de souris présentant une hypercholestérolémie. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie du cholestérol s’améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus. Nos expérimentations impliquent des gavages oraux, des prélèvements sanguins et des injections intraveineuses susceptibles d'induire en dépit de nos précautions une altération du bien-être, du stress et des douleurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. Nous récolterons du sang et des organes afin finaliser le phénotypage métabolique des souris et caractériser les altérations moléculaires induites.
Remplacement
Le métabolisme du cholestérol est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du cholestérol d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Nous utiliserons des souris mâles adulte agés de 8 semaines au moment de l'initiation de l'étude. A cet age, l'état hormonal et le métabolisme des lipoprotéines sont matures et stabilisés et permettent de réaliser nos mesures en limitant l'hétérogénéité des données.
Investigation sur la contractilité des cardiomyocytes et sur la composante calcique dans un modèle de dysfonction cardiaque chez le rat zucker et ZSF1
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de lignées obèses et diabétiques, ils reçoivent une charge quotidienne de sel qui aggrave leur insuffisance cardiaque, subissent des échographies, des prises de pression à la queue et des prélèvements sanguins pendant un mois, puis sont mis à mort par décapitation pour prélever le cœur. Le porteur indique surveiller les effets délétères de ces interventions par des contrôles quotidiens. Il affirme que l'étude systémique de la fonction cardiaque ne peut être simulée autrement et qu'il est "vital" de disposer de ces animaux pour isoler les cardiomyocytes.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) et son précurseur, l'insuffisance cardiaque, sont un problème médical en croissance rapide qui présente le taux de mortalité le plus élevé après le cancer du poumon dans les pays développés. Lors d'épisode d' insuffisance cardiaque et en particulier d'un dysfonctionnement diastolique, un remodelage cardiaque se produit, provoquant un dépôt excessif de tissu cicatriciel conduisant à une rigidité accrue de la matrice extracellulaire (MEC), diminuant la capacité à se détendre et à se remplir. Hormis l’hypertrophie des cardiomyocytes, cet effet sur la structure des cardiomyocytes est actuellement relativement inconnu. De plus, les études mécanistiques approfondies du cœur sont limitées par l’accès aux tissus cardiaques sains et malades. L'objectif est d' évaluer les mécanismes métaboliques présents et l'étendue du remodelage de la MEC qui sera en corrélation avec la raideur, lors du remodelage dans un modèle de rongeur de syndrome métabolique et d'insuffisance cardiaque; ensuit d'étudier l'effet de ce remodelage sur la morphologie et la fonction des cardiomyocytes; de d'analyser les protéines transmembranaires responsables de la mécano-transduction des cardiomyocytes et d'étudier l'effet de toute différence dans les protéines transmembranaires mécano-transductrices des cardiomyocytes résultant du remodelage cardiaque et métabolique.
Bénéfices attendus
Nous espérons que les résultats de ce travail aideront à déterminer les mécanismes de l'insuffisance cardiaque et du dysfonctionnement diastolique en ce qui concerne le remodelage métabolique et ce développement d'une progression précoce et légère à une progression plus sévère pour aider à identifier les cibles thérapeutiques potentielles. De plus, ce projet fournira un aperçu de la réponse et de la fonction des cardiomyocytes isolés en ce qui concerne ce remodelage. Cela permettra de cibler de nouveaux domaines de recherche potentiels en matière de recherche mécaniste et thérapeutique.
Procédures
Aucun animal ne subit un acte chirurgical. Chaque animal subira 3 interventions. Les animaux seront évalués par échocardiographie (durée : 20 min/animal), plethysmographie (prise de pression artérielle par brassard sur la queue – durée 15 min/animal) et prélèvement de sang (durée : 10 min/animal) au niveau de la queue pendant 1 mois. Certains animaux recevront du sel dans l'eau de boisson pour les 2 groupes décompensés. Concernant l’euthanasie ; entre le début de l’anesthésie, la mise à mort par décapitation et l’ablation du cœur, nous comptons un délai de 15 min par animal.
Impact sur les animaux
Les animaux obèses ZSF-1 et Zucker présentent déjà un syndrome métabolique et un diabète qui seront exacerbés par divers degrés d'insuffisance cardiaque et/ou de remodelage cardiaque avec la charge quotidienne de sel et l'IDAC (stade final) avec la charge de sel de lavage gastrique. Nous surveillerons de près tout autre effet délétère de ces interventions avec des contrôles quotidiens par le chercheur.
Devenir
Les animaux doivent être euthanasiés, dans le but de récupérer le cœur indemne, afin de procéder à l’analyse des cardiomyocytes.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas remplacer les informations qui seront générées dans ce projet. Le but est d'étudier l'effet systémique des cardiomyocytes, de la fonction cardiaque et du remodelage et ne peut donc pas être simulé d'une autre manière. Sur cette note, les rats représentent les caractéristiques physiopathologiques présentées chez les humains aux stades précoces et tardifs de l’insuffisance cardiaque. Cependant, nous avons conçu ce projet pour tenter de remplacer certaines des investigations in vitro en cultivant les cardiomyocytes isolés ex vivo. Nous pouvons effectuer une partie de l'analyse et de la réponse à la rigidité sans ajouter plus d'animaux, ce qui permet d'avoir plus de points d'investigation sur ce nombre de animaux. Cela signifie qu’il est vital que nous disposions de ces animaux pour l’isolement des cardiomyocytes.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous avons développé une nouvelle méthode d'isolement des cardiomyocytes qui permet d'utiliser un morceau de tissu cardiaque, laissant le reste pour d'autres analyses biochimiques, ce qui a considérablement réduit notre nombre d’animaux. De plus, sur la base de données antérieures obtenues chez des rats et de nos propres simulations pour chaque paramètre étudié chez des rats sains témoins non traités, nous avons un taux de réussite minimum de 90%, de plus par une approche statistique, nous estimons que le nombre d'animaux sera de 90 rats dans total.
Raffinement
Une fois que les rats auront atteint l'âge d'environ 15 semaines, ils seront autorisés à s'acclimater pendant une semaine et maintenus pour permettre au remodelage cardiaque de commencer à se produire naturellement avec l'âge avant l'intervention à 20 semaines lorsque l'expérimentation commence. Ils resteront en cage par groupes de trois pour la socialisation avec du carton pour la construction du nid et les enrichissements. Pour les conditions générales de soins, ils resteront dans une pièce ventilée avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures, une surveillance quotidienne de la nourriture et de l'eau et un nettoyage hebdomadaire de la cage. Pour les conditions de soins en ce qui concerne les méthodes utilisées dans le projet, le plus grand soin sera pris pour garantir qu'il y ait un minimum, voire aucun, de douleur, de détresse ou de souffrance par une surveillance quotidienne tout au long du protocole pour détecter l'un de ces signes. Pour évaluer, les animaux seront observés pour leur comportement (mouvement, vigilance et toilettage), leur état physique et émotionnel (état de la peau, position du pelage, posture de l'animal, yeux et profondeur de la respiration). Le poids et la température seront surveillés chaque semaine et si une fluctuation de la perte de poids se produit de 2 à 5 % par rapport à une température de 2 à 4 °C, l'animal sera surveillé quotidiennement au cas où des seuils seraient atteints de 10 % pour la perte de poids et une fluctuation de température de 5 °C. quand l'animal sera euthanasié. En présence d'une légère détresse, l'animal peut recevoir une prémédication à base de buprénorphine par voie sous-cutanée et sous une anesthésie (gazeuse, afin de ne pas causer de détresse supplémentaire à l'animal par contention.
Choix des espèces
L'insuffisance cardiaque est plus fréquente chez les individus obèses et se manifeste généralement chez ceux qui souffrent du syndrome métabolique. C'est pourquoi le rat obèse Zucker (FA/FA) (ZF) est utilisé comme modèle pour l'obésité, le syndrome métabolique et le diabète de type 2, ce qui rend ce rat sensible à l'hypertension. et le remodelage lorsqu'il est exposé à une consommation accrue de sel et en utilisant Zucker maigre comme contrôle sain. Le rat ZFS-1 est un modèle de syndrome métabolique plus sévère et de dysfonctionnement diastolique (insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée) qui est affecté par la charge de sel pour induire "l'DAIC". Ces deux modèles démontreront différents niveaux d’insuffisance cardiaque et de progression. Les rats Zucker Lean control, Zucker FA/FA (Met-S), Lean control ZSF-1 et ZSF-1 obèses seront âgés de 15 semaines à l'âge d'arrivée et gardés jusqu'à 20 semaines ayant donc un syndrome métabolique au moment de l'inclusion dans l'étude. L'âge d'arrêt sera de 24 semaines après soit une charge quotidienne de sel pendant 4 semaines. Le choix de l'âge et des types de rats est justifié par les données publiées et l'expérience en laboratoire sur différents modèles de syndrome métabolique au cours des 15 dernières années, montrant le développement du remodelage cardiaque à cet âge et l'effet de la charge saline provoquant une insuffisance cardiaque.
Impacts précoces d’une suralimentation postnatale sur le métabolisme et sur la prolifération cellulaire cardiaque chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Une partie subit une chirurgie cardiaque d'ischémie-reperfusion d'environ 1h15 sous anesthésie et des tests glycémiques avec injections, puis est tuée pour analyser le tissu cardiaque, tandis que douze femelles allaitantes sont replacées ou données à d'autres équipes après prélèvement de lait. Le projet cherche à relier suralimentation juste après la naissance et maladies cardiaques à l'âge adulte. Le porteur affirme qu'apprécier la fonction cardiaque impose de travailler sur "l'organisme entier" et qu'aucun modèle cellulaire ne reflète l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
L’environnement au cours des premières étapes de la vie, pendant les périodes fœtales et postnatales, joue un rôle important dans la détermination de la santé d’un individu. Dans ce cadre, on sait désormais que l’alimentation avant et après la naissance peut influencer non seulement le poids corporel et le pourcentage de masse grasse, mais aussi favoriser à long terme le développement de maladies cardiaques et métaboliques. Un modèle rongeur permettant l’étude des conséquences d’une suralimentation juste après la naissance à été développé et est pertinent car il rassemble plusieurs des critères d’une maladie très commune chez l’Homme : le syndrome métabolique. Le syndrome métabolique est une maladie complexe regroupant plusieurs facteurs de risque très répandus chez l’Homme comme : un tour de taille trop important, des taux élevés de glucose, de lipides et de « mauvais » cholestérol dans le sang, mais aussi une tension artérielle trop importante. Une des originalités du modèle rongeurs de suralimentation postnatale repose sur l’apparition à l’âge adulte d’une diminution de la fonction contractile du cœur qui serait due à une diminution de la capacité des cellules contractiles du cœur, appelées cardiomyocytes, à battre correctement et à permettre au cœur d’envoyer une quantité de sang suffisante à tout l’organisme. Ces cardiomyocytes ont la capacité de se multiplier, c’est-à-dire de proliférer, juste après la naissance et pendant quelques jours encore. Mais cette capacité disparait 10 jours après la naissance, et le nombre de cardiomyocytes est fixe pour le reste de la vie. Notre hypothèse est que des changements au niveau des cardiomyocytes pendant les premiers jours de la période postnatale, aient une répercussion à long terme sur le fonctionnement du cœur et sur sa capacité à faire face à une privation en oxygène. Notre objectif sera de déterminer si la suralimentation postnatale peut altérer la capacité de prolifération des cardiomyocytes dans les jours qui suivent la naissance et quelles voies de signalisation cellulaires sont impliquées.
Bénéfices attendus
En termes de santé publique, ce travail permettra de confirmer que des perturbations nutritionnelles périnatales, c’est-à-dire pendant la grossesse et juste après la naissance, ont un impact à long terme sur la santé cardiovasculaire et métabolique des individus, et que des mesures de prévention appropriées appliquées précocement seraient utiles et nécessaires. Les résultats de nos travaux pourraient apporter de nouveaux messages afin d’accroitre la prise de conscience du Grand Public sur la nécessité de prévenir précocement les maladies cardiovasculaires par des mesures préventives adaptées. D’un point de vue socio-économique, l’impact du surpoids sur des maladies cardiovasculaires est clair, et la prévention du surpoids infantile pourrait aussi améliorer les conditions dans le domaine économique et sociétal.
Procédures
Le prélèvement de lait sera réalisé sur des femelles allaitantes anesthésiées à l’isoflurane et suite à une injection intrapéritonéale d’ocytocine (injection de 2 UI par souris, dans un volume de 100 µL, à l’aide d’une aiguille de 26 gauge). Une chirurgie cardiaque conduisant à une ischémie (privation en oxygène et nutriment d’un tissus) reperfusion du tissu cardiaque sera réalisée sur des souris âgées de 6 mois. La durée moyenne d’anesthésie pour ce type de chirurgie est de 1h15, avec une durée d’ischémie de 45 mins, suivi de 24 h de reperfusion. Les tests glycémiques représentent deux sessions de 2h15 chacune avec le prélèvement d’une faible quantité de sang par souris (20µL approximativement au total) précédés d’une injection intrapéritonéale de glucose ou d’insuline (100µL de solution diluée pour 10g de souris). Une semaine est nécessaire entre les deux tests glycémiques, ce qui représente deux injections IP à une semaine d’intervalle.
Impact sur les animaux
La préhension des animaux lors de l’induction de l’anesthésie pour les chirurgies cardiaques pourrait causer un certain stress. La chirurgie peut provoquer des douleurs per et post opératoires qui seront maitrisées par l’utilisation d’un anesthésique local ainsi que deux injections intrapéritonéales d’analgésique général. De plus, La chirurgie cardiaque peut engendrer chez les souris des difficultés d’accès à l’alimentation pouvant entrainer une perte de poids. Pour faciliter l’accès à la nourriture, de la nourriture en gelée ainsi que des croquettes seront placées dans la cage. Les souris peuvent avoir froid pendant et après la chirurgie par conséquent les animaux se réveilleront en couveuse chauffée et seront ensuite placées dans des cages thermorégulées grâce à l’utilisation de tapis chauffant. Enfin, la chirurgie peut induire une perte modérée du poids corporel des animaux qui sera méticuleusement suivi et toute perte de poids égale à 20% entrainera l’euthanasie des animaux. Toutes les pièces de manipulation sont dédiées à l’expérimentation animale et sont tempérées et calmes.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 seront replacés (utilisation pour des mises au point, don à d’autres équipes), soit 12 femelles allaitantes. Les animaux issus de la procédure 2 seront euthanasiés afin d’analyser les caractéristiques du tissu cardiaque pour mieux comprendre les altérations cardiaques induites par une Suralimentation postnatale, reflet de la cardiomyopathie induite par le surpoids et l’obésité chez l’Homme.
Remplacement
Le syndrome métabolique est une pathologie multifactorielle. Pour apprécier son incidence sur la fonction cardiaque, il est indispensable de travailler sur un organisme entier mais aussi sur des cardiomyocytes fraichement extraits. De plus, l’étude de la fonction et du métabolisme cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal entier. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes. Le nombre de 9 animaux par groupe est suffisant pour obtenir des résultats statistiques.
Raffinement
Les souris seront constamment hébergées en groupe avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. L’évaluation de la douleur se fera à l’aide d’une grille de score et sa prise en charge sera faite par l’utilisation d’anesthésiques locaux et généraux. Enfin, des points limites ont été définis et seront respectés pour l’ensemble des procédures.
Choix des espèces
La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques des souris sont semblables à ceux de l’Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Des femelles allaitantes seront nécessaires pour le prélèvement et l’analyse du lait maternel, elles seront âgées au minimum de 8 semaines de vie, âge à partir duquel les animaux sont matures sexuellement et peuvent se reproduire. Pour l’étude de l’impact à plus long terme d’une suralimentation post natale sur le risque cardiométabolique, les animaux auront 6 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris et à l’âge d’apparition des maladies cardiaques chez l’humain.
Rôle de la coagulation et de l’inflammation dans l’ischémie intestinale chez la souris et évaluation de l’efficacité de différents traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
720 souris femelles vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Leur abdomen est ouvert et l'artère irriguant l'intestin est clampée pendant une heure pour provoquer une ischémie, suivie d'une reperfusion et de prélèvements sanguins, certains animaux recevant un anticoagulant ou un anti-inflammatoire. Le porteur indique que la pathologie provoque des lésions de l'intestin et une contamination du sang par des bactéries, ce qui justifie selon lui l'euthanasie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne simule la circulation complexe en jeu et juge la simulation informatique "peu prédictive".
Objectifs
L’ischémie mésentérique aigue est une affection grave provoquée par une obstruction des vaisseaux irriguant l’intestin, diminuant le flux sanguin et l'apport d'oxygène dans ce dernier et entraînant une détresse intestinale. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes de la formation de caillots et de l’inflammation dans les vaisseaux sanguins irriguant l’intestin dans cette pathologie. En effet, l’intervention chirurgicale permettant la désobstruction des vaisseaux sanguins, induit une réoxygénation trop rapide du tube digestif, et conduit paradoxalement à des lésions des vaisseaux et de l’intestin importantes. Certaines études expérimentales animales ont montré́ que les lésions intestinales étaient initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus de l’intestin qui n’étaient plus irrigués. Cela est appuyé par certaines études, utilisant des modèles expérimentaux animaux, qui suggèrent l’idée qu’une réoxygénation progressive du tissu réduiraient les lésions intestinales. Notre hypothèse de recherche est que les mécanismes associés à la formation des caillots obstruant les vaisseaux et l'inflammation sont impliqués dans les lésions vasculaires et intestinales observées dans la pathologie. Nous avons également émis l'hypothèse que l'inflammation dû à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin pouvait être un facteur aggravant, qui pourrait participer à l'amplification des phénomènes observés. Deux objectifs sont décrits pour ce projet : 1) Caractériser les mécanismes conduisant à la formation d’un caillot et à l’inflammation contribuant à l’obstruction des vaisseaux sanguins irriguant l’intestin. 2) Explorer l’intérêt de différents traitements (Anti-coagulants, anti-inflammatoires) dans la limitation des lésions intestinales en thérapeutique expérimentale chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les vaisseaux irriguant l’intestin après l’élimination de caillots obstruant ces derniers et empêchant l’apport d’oxygène au niveau de l’intestin. Nous étudierons également, l'intérêt d’utiliser des traitements anti-coagulants et anti-inflammatoires dans cette pathologie. En effet, l’évaluation de nouveaux traitements susceptibles de contrôler les phénomènes responsables des lesions des vaisseaux et de l’intestin est primordiale afin d’améliorer le pronostic des patients atteints d’ischémie intestinale. La perfusion d’anti-thrombotiques tels que l'héparine, d’anti-inflammatoire comme l’aspirine ou des agents limitant les phénomènes d’inflammations dus à la contamination du sang par des bactéries provenant de l’intestin, pourraient diminuer la mortalité des patients atteints d’ischémie intestinale dans toutes ces applications cliniques encore insuffisamment comprises et efficacement traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Ils seront opérés sur une table chauffante à 37°C, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, un clamp sera posé sur l'artère principale permettant l’irrigation de l’intestin (artère mésentérique supérieur) induisant l’interruption temporaire de la circulation sanguine au niveau intestinal. Le clamp sera maintenu en place pendant 1 heure avant d’être retiré afin de rétablir la circulation sanguine intestinale. Nos observations commenceront dès la pose du clamp (ischémie) et jusqu’à 1 heure après le retrait du clamp (reperfusion). Un prélèvement sanguin sera effectué en début et en fin de procédure. Afin d'évaluer l'efficacité de différentes molécules thérapeutiques, certains animaux se verront administrer par injection intra-veineuse un traitement anti-coagulant ou anti-inflammatoire au cours de la procédure. Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de la pathologie attendus sont des dommages de l’intestin et une contamination du sang par les bactéries provenant de l’intestin, justifiant l'euthanasie sous anesthésie générale en fin de procédure. Les effets indésirables liés à la procédure sont : une douleur liée à l’injection de l’analgésique et une douleur liée à la procédure chirurgicale en cas de réveil de l’animal (évité avec une surveillance continue et un maintien de l’anesthésie tout au long de la procédure).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour des analyses des tissus biologiques et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie intestinale et les lésions associées à la reperfusion intestinale sont une maladie grave, d'une mortalité extrême (80% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes et encore très mal connue. L'utilisation d'un modèle non animal n'est pas réalisable et pas pertinent pour cette pathologie. En effet, aucun modèle non animal ne permet de simuler le circuit complexe de circulation et les nombreuses interactions impliquées dans le développement de la pathologie. Ces multiples paramètres et l’hétérogénéité de la pathologie en font un modèle difficilement reproductible en milieu artificiel et peu prédictif via l’utilisation de logiciel informatique.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux a été déterminé d’après une analyse statistique. Nous avons estimé qu’il faut inclure 10 animaux par groupe au minimum pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Une revue bibliographique nous a permis de sélectionner les doses pour les traitements ciblés les plus pertinentes afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Avant les procédures expérimentales, les animaux sont dans une cage spacieuse qui permet aux souris de se déplacer librement et d'adopter des comportements naturels, en groupe pour permettre une interaction sociale entre les souris et avec litières (copeaux de bois) et boites pour encourager les comportements de nidification. Les souris seront opérées sur une table chauffante à 37°C sous anesthésie générale. Après une analgésie pour réduire les douleurs durant la procédure, les animaux seront anesthésiés à l'aide d'un gaz (induction dans une chambre dédiée et maintien à l’aide d’un masque). Les effets de l’anesthésie et l’analgésie seront suivis tout au long de la procédure. En cas de signe de réveil, la quantité d’agent anesthésiant sera augmentée. Si les signes persistent ou d’autres signes indiquant une souffrance de l’animal apparaissent, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de l’ischémie mésentérique aigue chez la souris est déjà décrit dans la littérature et notre équipe est déjà formée à la procédure qui a montré des résultats applicables à ce qui peut être observé chez l’homme. Des souris femelles adultes (7 à 9 semaines) seront utilisées pour que les vaisseaux irriguants l'intestin puissent être facilement visualisés sous loupe. Des souris plus âgées ou un autre modèle animal risqueraient de présenter des zones grasses autour des vaisseaux, compromettant leur observation. De plus, notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie.
Réponse moléculaire de l’endothélium vasculaire à l’irradiation chez la souris : intérêt pour la prédiction du risque de toxicité pulmonaire après une irradiation localisée du thorax à forte dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
452 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Leur thorax est irradié à forte dose sous anesthésie, puis elles sont gardées une semaine, trois mois ou six mois avant l'euthanasie et le prélèvement des poumons. Le porteur reconnaît qu'au-delà de trois mois les animaux peuvent développer une détresse respiratoire, voire mourir. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier la réponse des cellules des vaisseaux, tout en présentant le projet comme une étape vers un futur modèle in vitro.
Objectifs
L’irradiation localisée à forte dose engendre des lésions tissulaires d’origine plurifactorielle suite à l’altération de nombreux types cellulaires. Pour améliorer les traitements, il faut développer des moyens de limiter ces toxicités tout en conservant/augmentant le contrôle tumoral. Avec les nouvelles pratiques qui utilisent des débits de doses plus importants et des faisceaux de particules de plus grandes énergies, il faut comprendre les mécanismes conduisant aux lésions tissulaires, limiter les toxicités et développer des moyens de prédire la toxicité tissulaire. Un des programmes a pour objectif de concevoir des outils de prédiction des risques de complications liés aux nouvelles pratiques de radiothérapies, en se basant sur la réponse moléculaire à l’irradiation de cellules des vaisseaux sanguins cultivées dans des boites de culture. Nous nous appuierons sur les mesures de paramètres biologiques dans ces cellules (activité des cellules, vieillissement prématuré ou capacité à se multiplier) pour comparer différents rayonnements ionisants. Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons collecter et utiliser des données provenant des cellules des vaisseaux irradiées au sein d’un organisme vivant, car le comportement des cellules étudiées est dépendant de leur environnement tissulaire mais aussi de la physiologie de l’organisme dans son ensemble. Jusqu’à présent, la difficulté d’isoler les cellules vasculaires à partir d’organes rendait difficile l’étude de leur réponse moléculaire. Dorénavant, les études sur cellules isolées sont réalisables. Il est aujourd’hui possible d’étudier des milliers de gènes et des ensembles de protéines d’intérêt dans des cellules isolées les unes des autres par des techniques de pointe. La phase 1 (projet précédent) a permis de choisir le poumon comme organe d’étude. Dans la phase 2 (projet précédent et celui-ci), il s’agit d’exposer le poumon à différentes modalités d’irradiations pour étudier la réponse des cellules des vaisseaux et des cellules immunitaires car elles jouent également un rôle prépondérant. Ainsi nous pourrons comprendre comment les cellules vasculaires répondent à l’irradiation au sein d’un organisme au niveau moléculaire et comment elles communiquent avec les cellules immunitaires, de comparer les résultats obtenus à ceux produits par les études sur les cellules vasculaires cultivées dans des boites de culture, et enfin d’étudier la toxicité de ces modalités d’irradiation chez la souris.
Bénéfices attendus
L’objectif global de ce projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues des poumons irradiés in vivo chez la souris afin d’améliorer notre modèle de prédiction du risque de séquelles tardives radio-induites dues à la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est d’une part une meilleure compréhension de la réponse des cellules endothéliales in vivo, et d’autre part un renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles sur des cellules en culture en comparant les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle aura pour but d’évaluer les risques in vitro sans recourir à l’expérimentation animale. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : (i) par une meilleure compréhension de la réponse à l’irradiation et à différentes modalités d’irradiation des cellules endothéliales in vivo, nous pourrons mieux comprendre comment les séquelles radio-induites sont initiées et comment elles se développent ; (ii) par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous souhaitons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Certains animaux seront imagés au micro-CT sous anesthésie volatile (isoflurane) juste avant l’euthanasie (durée max de 10 minutes). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation localisée du thorax est bien caractérisé dans notre laboratoire. Aux temps les plus tardifs (supérieurs à 3 mois après l’irradiation), les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux seront donc attentivement surveillés et devront être euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques sur les analyses histologiques, des groupes de 10 à 12 animaux sont nécessaires. Pour les analyses moléculaires en cytométrie de flux, des groupes de 6 à 8 animaux sont nécessaires. Pour les analyses du matériel génétique des cellules, des groupes de 4 à 6 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). Nous utiliserons des souris mâles afin d’avoir des animaux de poids suffisamment important. Nous avons fait le choix scientifique de ne travailler que sur des mâles dans un premier temps, car nous avons au laboratoire un recul conséquent de ce modèle sur des souris de sexe mâle. Nous envisageons un futur projet sur des femelles pour étudier les conséquences de la dose d’irradiation choisie à une modalité d’irradiation. La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour ce modèle.
Rôle d’EZH2 dans le rétrécissement aortique calcifié
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1026 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. La moitié subit une électrocautérisation des cinq sixièmes d'un rein et l'autre l'ablation du rein gauche sous anesthésie, induisant de façon certaine une insuffisance rénale chronique, complétée par un régime riche en phosphate, des prélèvements sanguins et des échocardiographies. Le porteur cherche à mettre au point un modèle de calcification de la valve aortique et à évaluer une cible pharmacologique, un traitement chez l'humain étant présenté comme un espoir conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro fiable ne reproduit cette pathologie.
Objectifs
L’objectif central de ce projet est de comprendre le rôle d'Ezh2 (Enhancer Zeste Homologue 2), enzyme épigénétique responsable de la triméthylation de la lysine 27 sur l'histone 3 (H3K27me3), dans le développement du rétrécissement aortique calcifié (RAC). De plus, pour répondre à cet objectif principal nous avons un sous objectif qui est de développer un modèle de calcifications valvulaires suite à l’induction d’une insuffisance rénale chronique supplémentée avec un régime alimentaire riche en phosphate chez la souris. Ce même modèle a précédemment été mis au point chez le rat au sein du laboratoire. La mise au point de ce modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de cette pathologie et l'implication d'Ezh2.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra, d’une part, de mettre au point un modèle de calcifications valvulaires aortiques chez la souris, permettant par la suite d’être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes associés au développement du RAC in vivo. D’autre part, d’étudier l'implication de notre cible thérapeutique, Ezh2 dans le développement du RAC induit par différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaire, cellules inflammatoires etc…) grâce à l’utilisation de modèle de souris génétiquement modifiées. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, créer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de Ezh2 spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant faire l’objet d’un traitement innovant de la progression du RAC chez l’Homme.
Procédures
1. Electrocautérisation des 5/6ème du rein droit sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 2. Néphrectomie, c’est-à-dire exérèse, du rein gauche sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour la moitié des souris soit n=478. La chirurgie dure environ 20 minutes. 3. Pour s’assurer de l’induction de l’IRC, un prélèvement sanguin sera réalisé au niveau du sinus sous mandibulaire au niveau de la veine mandibulaire d’une durée de 1 à 2 minutes, la 4ème semaine post-chirurgie afin de mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) pour toutes les souris n=956. De plus, pour toutes les souris un prélèvement sanguin comme décrit ci-dessus sera effectué avant toute chirurgie et lors de la mise à mort. 4. Echocardiographie, d’une durée maximum de 20 minutes par souris, (imagerie in vivo) menée sous anesthésie gazeuse et sous couverture analgésique pour toutes les souris. 5. Au total chaque souris (n=956) subira 2 prélèvements sanguins au niveau du sinus sous-mandibulaire, d’une durée de 1 à 2 minutes et un prélèvement sanguin via l’aorte abdominale lors de la mise à mort. La couverture analgésique totale pour la procédure durera 6 heures.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, les administrations d’analgésique et le traitement avec l'inhibiteur pharmacologique de Ezh2, ainsi que l’exérèse du rein gauche pourront occasionner des effets secondaires. De manière certaine, les animaux, après néphrectomie des 5/6ème (procédure classée sévère) développeront une insuffisance rénale chronique (IRC). Nous nous attendons, si notre modèle fonctionne, à voir des signes de dysfonction cardiaque et plus particulièrement de la valve aortique évalués par échocardiographie.
Devenir
Afin de vérifier si notre modèle d’IRC a induit des calcifications valvulaires, différents types de prélèvements seront effectués : - Prélèvements sanguins 4 semaines après chirurgie et lors de la mise à mort. - Prélèvements de tissus (cœur, rein, poumon, foie) afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques. Ces prélèvements seront réalisés sur les animaux précédemment anesthésiés de manière gazeuse lors de l’échocardiographie correspondant aux analyses fonctionnelles.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro car nous avons pour but dans cette étude de mettre au point un modèle d’insuffisance rénale chronique (IRC) associée à un régime riche en phosphate induisant de la calcification valvulaire chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de traitements pharmacologiques inhibant l'activité de Ezh2. Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro fiable récapitulant la physiopathologie du RAC.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. Suite à la procédure de mise au point du modèle animal nous ajusterons le nombre d'animaux nécessaires aux procédures suivantes à l'aide du logiciel G*power version 3.1.9.7 qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus pour réduire le nombre d'animaux nécessaire. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre et d'utiliser l'intégralité des animaux OGM produits dans notre animalerie. Une stratégie de reproduction par backcross complémentée par une analyse du génotype de chaque animal nous permettra de nous limiter à l'unique production d'animaux pour les procédures expérimentales. Afin d'éviter la production d'animaux servant au maintien de la lignée OGM dans notre animalerie, une stratégie de cryopréservation de sperme sera mise en place.
Raffinement
Pour raffiner, les animaux seront hébergés en groupes de 5 individus maximum aux normes requises incluant un enrichissement des cages (des plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) dans des portoirs ventilés. Des points limites adaptés grâce à notre grille de score (poil ébouriffé, perte de poids ≥ 20%, hypoactivité, prostration, paralysie, dyspnée) associés à une stratégie de réhydratation des animaux par injection sous cutanée de sérum physiologique à 37°C pour une diffusion plus lente et une meilleure hydratation et en cas de besoin, une injection de glucose 5% par voie intrapéritonéale. Un traitement analgésique en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie, ou une fois par jour sur les 48h qui suivent l’opération, est prévu. Si un des points limites est atteint ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score de 3, l’animal sera mis à mort. Un suivi quotidien du bien-être animal sera mis en place. Dans le but de réduire la douleur tous les animaux inclus dans cette étude (sauvages et OGM) seront identifiés par puçage.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, l’utilisation d’animaux pour lesquels un gène est invalidé de manière spécifique dans différents types cellulaires comme cela est le cas dans cette demande concernant la délétion de Ezh2 dans les cellules myéloïdes, qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat (modèle développé au sein de notre laboratoire). Ces modèles sont particulièrement intéressants pour mieux comprendre les mécanismes de la pathologie. Dans notre laboratoire nous avons, depuis de nombreuses années, une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. La souche de souris (C57Bl/6j) sera utilisée dans cette étude. Nous allons inclure des animaux adultes de 16 semaines et pesant 20-24g pour cette étude. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée de la chirurgie.
Etude des approches d’inhibition de la thromboinflammation dans un modèle murin immunocompétent de greffe d’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACCP).
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Une partie subit une chirurgie de greffe de cellules tumorales dans le pancréas sous anesthésie, d'autres une greffe intraveineuse, puis des traitements par injections, avec développement de tumeurs pancréatiques et de métastases pulmonaires pouvant provoquer perte de poids et difficultés respiratoires. Le porteur étudie l'inhibition de la thromboinflammation dans ce cancer très agressif, les nouvelles combinaisons de traitements étant présentées comme un "espoir thérapeutique fort". Il indique développer des modèles cellulaires en 3D en amont, tout en concluant au recours à la souris.
Objectifs
Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de perte de fonctions des galectines sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec les traitements inhibant le recrutement des cellules thromboinflammatoires. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de cette perte de fonction et ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.
Bénéfices attendus
A ce jour, les ACCP représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale, le microenvironnement tumoral et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.
Procédures
Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).
Impact sur les animaux
La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés
Remplacement
Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.
Réduction
Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.
fourniture de produits biologiques de primates non humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Macaques à longue queue : 800
Macaques rhésus : 40
Singes vervets : 10
Prélèvements de moelle osseuse, de liquide céphalo-rachidien et d'humeurs de l'œil, biopsies de peau ou de muscle, lavages broncho-alvéolaires, collecte de sperme et de lait : 1 000 primates non-humains, dont 800 macaques à longue queue, 150 ouistitis et tamarins, 40 macaques rhésus et 10 singes vervets, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dirigés vers un tunnel de capture puis immobilisés dans un sabot de contention, ils sont anesthésiés pour la plupart des actes, la prise de sang pouvant se faire sur un singe éveillé à la demande de l'utilisateur. Pour le lait, les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures, avec une peluche à laquelle s'agripper s'ils sont seuls, et les mâles sont isolés de leur groupe jusqu'à 24 heures avant la collecte de sperme. Le porteur affirme que ces interventions "diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain" et que la démarche "suit donc parfaitement la règle des 3R". Tous restent en vie à l'issue, en hébergement standard ou réutilisés dans d'autres projets, les échantillons étant fournis sur demande de chercheurs clients.
Objectifs
L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projets diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvement biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Le nombre des interventions dépend des demande des utilisateurs mais sont toujours réalisées en respectant les procédures définissant des intervalles de prélèvements et de volume maximaux afin de préserver la bonne santé et le bien être de l'animal.
Impact sur les animaux
La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.
Devenir
Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.
Remplacement
Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.
Raffinement
La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.
Insulinorésistance associée à la dépression : une étude expérimentale sur un modèle murin de stress chronique léger imprédictible.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le protocole repose sur l'induction d'un état dépressif par stress chronique léger imprévisible, avec quatorze mesures de glycémie par animal, des jeûnes et des tests comportementaux, le porteur admettant que perte d'appétit, apathie, déshydratation et perte de poids sont probables. Il reconnaît que "le raffinement sera limité du fait de l'objectif du projet", l'induction d'une symptomatologie dépressive. L'étude vise à explorer le lien entre dépression et résistance à l'insuline, les pistes de traitement étant annoncées comme potentielles.
Objectifs
Les personnes qui souffrent de dépression majeure présentent un risque plus important de maladies cardiovasculaires, d’obésité, et de diabète de type 2. La principale hypothèse expliquant ce risque plus élevé est la perturbation de l’action périphérique de l’une des hormones qui régule l’équilibre du glucose (sucre) dans le sang, à savoir l’insuline. On parle alors de résistance à l’insuline ou insulino-résistance. Cette résistance à l’insuline est fréquente chez les personnes qui souffrent de dépression. Comme autre hypothèse, certains scientifiques ont évoqué le rôle d’un système spécifique impliqué dans la modulation de l’activité des neurones : le système endocannabinoïde (SEC). Le SEC est constitué de molécules appelés ligands (on parle de cannabinoïdes), qui se fixent sur des récepteurs (CB1R et C2BR) et qui peuvent être (les ligands) détruites par d’autres molécules appelées enzymes spécifiques. Certains travaux de recherche ont montré qu’avec l’activation du SEC, on observe les mêmes perturbations (troubles) du métabolisme que l’on rencontre chez les personnes souffrant d’obésité et/ou de diabète. Par contre, les études qui ont évalué le SEC chez les personnes avec dépression (pour savoir s’il était hyperactivé ou l’inverse), ne sont pas tombées sur des conclusions similaires, même si la tendance penche vers une faible activité des récepteurs CB1R dans le cerveau des personnes avec dépression sévère. Au vu des éléments évoqués plus haut, étudier le SEC dans la dépression semble avoir un intérêt, pour déterminer si le SEC ne constitue pas une explication du risque plus élevé de maladies cardiovasculaires / métaboliques en cas de dépression majeure. Une étude de ce type nécessite de pouvoir induire une dépression chez des animaux de laboratoire, notamment des rongeurs, et l’une des méthodes validées dans ce sens est le stress chronique léger imprédictible (SCLI). Ainsi, nous envisageons un travail ayant pour objectif de d’induire une dépression chez des souris (par SCLI), et d’explorer les paramètres métaboliques en lien avec la résistance à l’insuline. Nous pourrons ensuite étudier et modifier l’activité du SEC chez les souris avec symptomatologie dépressive et résistance à l’insuline, tout en évaluant si cette modification du SEC a un effet bénéfique sur le plan métabolique. L’idée est de savoir si en situation de dépression avec troubles cardiométaboliques, une action sur le SEC peut avoir des bénéfices sur la santé cardiovasculaire
Bénéfices attendus
La dépression majeure (encore appelée dépression caractérisée), constitue un problème mondial de santé publique à travers sa morbidité (et le handicap psychique qu’il occasionne), mais également sa mortalité. Cette dernière est relative au suicide mais également aux évènements cardiovasculaires, eux-mêmes liés à des altérations cardiométaboliques ayant comme clé mécanistique la résistance à l’insuline. A l’heure actuelle, les éléments de physiopathologie qui associent l’insulino-résistance à la dépression ne sont pas totalement connus, ce qui pourrait expliquer l’absence de marqueurs biologiques spécifiques à l’association dépression – insulino-résistance. De plus, les axes actuels de prise en soin (pharmacologiques ou non) des perturbations cardiométaboliques (obésité, diabète, dyslipidémie, hypertension artérielle) chez les patients avec dépression majeure semblent insuffisants. L’exploration du SEC sur un modèle murin de dépression, l’analyse de l’association entre les modifications du SEC et la résistance à l’insuline, ainsi que la modulation de ce système, pourraient contribuer à renforcer les connaissances actuelles sur le sujet. Un travail de cet ordre permettrait potentiellement de compléter les notions sur les mécanismes de l’insulino-résistance dans la dépression, mais également d’ouvrir des pistes de traitements pharmacologiques destinés à réduire le fardeau des pathologies cardiométaboliques. Ces traitements seraient des inhibiteurs de l’activité du SEC notamment en périphérie (bloqueurs sélectifs du CB1R) ou alors des activateurs du SEC (agonistes CB1R ou inhibiteurs des enzymes de dégradation du SEC), en fonction des perturbations du SEC qui seront retrouvées.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, un prélèvement sanguin sera effectué afin de doser la glycémie à l’aide d’un glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour ces tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un hébergement individuel de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même dure 2h, l’hébergement individuel total sera de 8h. Pour les tests comportementaux, ceux-ci sont indispensable afin de pouvoir évaluer l’induction du syndrome dépressif. Aucun prélèvement ne sera effectué, la nuisance principale de ces tests étant l’isolement (30 minutes à 2h en fonction du test). Chaque test n’aura lieu qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Le présent travail a pour base l’induction d’une symptomatologie dépressive, à travers des stress répétés, d’intensité légère, de survenue aléatoire pour les animaux. Il est de ce fait possible voire probable que les animaux que nous enrôlerons présentent des manifestations comportementales telles qu’une perte d’envie, une diminution de l’appétit, une baisse d’énergie, une apathie, une diminution de l’élan vital. Dans le même sens, il subsiste un risque de déshydratation et de perte pondérale. Ainsi, l’état général des souris sera surveillé quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
La dépression et les maladies cardiométaboliques auxquelles elle peut être associée, peuvent être vues dans une approche systémique, avec des conséquences négatives sur de nombreux tissus et organes. Afin d’explorer au mieux cette dimension multi-systémique, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Pour réaliser ce travail, nous avons choisis la souche de souris la plus utilisée dans la littérature (dans d’autres travaux de recherche) dans le sens du SCLI. Aussi, les paramètres morphologiques et l’âge des souris, tout comme les stresseurs et la durée totale du SCLI, sont définis dans notre travail sur la base des études antérieurement publiées. Toutes ces précautions ont pour but de contribuer à réduire au maximum le nombre de souris que nous aurons à utiliser.
Raffinement
Avant la mise en application des épreuves constitutives du SCLI (mise en œuvre de la procédure de stress), et ce pendant deux semaines, les animaux seront placés par groupes de cinq dans des cages avec contrôle de la température et de l’humidité, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, et des alternances lumières/obscurité de 12h. Cependant, le raffinement sera limité du fait de l’objectif du projet, en l’occurrence l’induction d’une symptomatologie dépressive. Toutefois, nous avons mis en place une échelle de points limites adaptés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées dans la littérature scientifique, notamment en ce qui concerne les maladies mentales (dont la dépression et la schizophrénie), ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de la symptomatologie dépressive par stress chronique léger imprédictible sera réalisée chez des souris de douze semaines. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes et est idéal pour induire tout type de conditionnement chez la souris puisque d’après la littérature, ce type d’expérimentation montre son efficacité maximale chez des animaux âgés de 12 à 20 semaines. Considérant une durée de stress de six semaines, les souris CUMS et non-CUMS seront âgées de 18 semaines à la fin de la procédure de SCLI. Les tests comportementaux inhérents à la vérification de la validité du modèle seront réalisés dans les deux semaines après chez toutes les souris, et les prélèvements finals à 20 semaines de vie. De façon pratique, nous travaillerons de façon successive sur des lots de quatre souris. En résumé (pour chaque lot de souris) > Souris sélectionnées à 10 semaines > Phase pré-SCLI de deux semaines > Souris âgées de 12 semaines au début du SCLI > Souris âgées de 18 semaines à la fin du SCLI et au début des tests comportementaux pour tous les animaux > Souris âgées de 20 semaines à la fin des tests comportementaux et mise à mort
Effet métabolique du semaglutide en comparaison ou en association aux chirurgies bariatriques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
75 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie bariatrique, sleeve gastrectomie ou bypass duodéno-iléal, des injections quotidiennes de semaglutide et des prélèvements sanguins par incision de la queue, pour comparer médicament et chirurgie de l'obésité. Le porteur annonce une mortalité postopératoire jusqu'à 30 %, des douleurs sur cinq jours et un risque de désunion de la cicatrice. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble physiologique in vivo et qu'aucune méthode de remplacement n'existe en chirurgie bariatrique.
Objectifs
L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, la dyslipidémie et les maladies hépatiques. La chirurgie bariatrique apparaît comme l'alternative thérapeutique la plus efficace chez les patients souffrant d'obésité morbide. En plus de son efficacité pour diminuer le poids corporel, il améliore également les complications métaboliques associées. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces effets bénéfiques restent parfois peu clairs mais impliqueraient plusieurs facteurs, notamment des changements dans la sécrétion des hormones gastrointestinales, tels que le GLP-1. Des analogues pharmacologiques de ces hormones ont été développés par l’industrie pharmaceutique et ce projet vise à mieux comprendre l’intérêt de ces médicaments dans le cadre d’une bi-thérapie couplée aux chirurgies bariatriques ou de comparer leurs effets par rapport à des procédures chirurgicales innovantes.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets des chirurgies de l’obésité associés aux effets des analogues de GLP-1, nous permettra de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profil métabolique du patient et son environnement de vie
Procédures
Les souris recevront une injection quotidienne sous cutanée. 30μl de sang seront prélevés par micro-incision à l’extrémité de la queue à J-3, J+21 et J+35 après chirurgie (Dosage cholestérolémie, triglycéridémie, glycémie). A J+28, un test de tolérance au glucose sera réalisé et une mesure de la glycémie sera effectuée à T0, 15, 30, 60 et 120 minutes par micro-incision de la queue. Les temps opératoires moyens des chirurgies sont respectivement de 45 minutes pour la sleeve gastrectomie et de 65 minutes pour le SADI-S ((Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) ).
Impact sur les animaux
En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : -Une mortalité entre 0 (laparotomie), 10% (Sleeve Gastrectomie) et 30% (SADI-S: Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) après chirurgie -Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée -Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures afin de récolter des tissus utiles à la caractérisation métabolique et moléculaire des modifications induites par les traitements chirurgicaux et/ou médicamenteux.
Remplacement
Les chirurgies bariatriques induisent de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus tels que l’intestin, le foie, les tissus adipeux et le cerveau, etc… Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo/in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
La procédure est classée sévère. Des protocoles péri-opératoire et post-oépratoires ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal et palier les risques d'anémie et les carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques