Système cardiaque
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Rôle des récepteurs GPVI et GPIbalpha dans les fonctions des plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
288 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ces souris, modifiées pour exprimer des récepteurs plaquettaires humains, reçoivent une injection d'anticorps puis un prélèvement de sang terminal à l'aorte, pour tester deux approches contre la thrombose artérielle. Le porteur indique que l'anesthésie peut perturber la respiration et que l'injection peut provoquer un saignement au point d'injection. Il décrit l'étape sur sang de souris comme un préalable "nécessaire" avant de passer aux essais in vivo.
Objectifs
Lorsqu'on se blesse, notre corps a un système pour arrêter les saignements, appelé hémostase. Les plaquettes sanguines jouent un rôle important dans ce processus. Lorsqu'un vaisseau sanguin est endommagé, les plaquettes se collent au vaisseau et ensemble, s'activent et forment une sorte de bouchon qui arrête le saignement. Cependant, ce processus peut également se produire de manière exagérée dans les artères malades, entraînant une thrombose artérielle qui désigne ainsi la formation d’un caillot sanguin dans les vaisseaux sanguins. Cela peut causer des problèmes graves tels qu'un accident vasculaire cérébral (un caillot au niveau du cerveau). Actuellement, il existe trois classes de médicaments utilisés en clinique pour traiter la thrombose artérielle, mais ils ont comme effet secondaire d'augmenter le risque de saignement. Dans ce projet, nous souhaitons tester deux nouvelles approches thérapeutiques pour réduire la formation de caillot. Elles consistent à cibler spécifiquement des récepteurs avec des anticorps, en utilisant des souris dans lesquelles ces récepteurs ont été remplacés par leurs équivalents humains. En utilisant ces modèles de souris spécialement conçus, nous espérons découvrir de nouvelles options de traitement pour prévenir la formation de thrombose sans augmenter le risque de saignement. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouveaux médicaments plus efficaces et plus sûrs pour les patients.
Bénéfices attendus
L'objectif est de trouver des traitements antiplaquettaires qui soient à la fois efficaces pour prévenir les caillots, mais qui aient également moins de risques de provoquer des saignements, ce qui pourrait être le cas de nos anticorps . Cela pourrait aider à améliorer le traitement des patients atteints de thrombose artérielle et à leur offrir des options thérapeutiques plus sûres et efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection (animal anesthésié) qui prend environ 1 minute. Après l’injection, il faudra attendre environs 10 minutes pour que celle-ci fasse effet et après le prélèvement de sang terminal (animal anesthésié) prend quant à lui environ 10 minutes. Ainsi, la durée totale de la procédure d’injection et de prélèvement est d’environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang. Enfin, l’injection des anticorps anti-GPIbalpha et de l’antiGPVI aux souris pourrait entrainer un saignement au site d’injection.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’anticorps spécifique sur la thrombose artérielle. C’est un processus complexes impliquant l’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes. Nous avons besoin de faire nos tests sur du sang de souris pour vérifier l’efficacité de nos approches thérapeutiques avant de pouvoir passer à des études in vivo chez la souris
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées. Nous avons ajouté des matériaux tels que des carrés de cellulose, des bâtonnets de coton et des morceaux de papier froissé pour qu'ils puissent organiser leur environnement comme ils le souhaitent. Nous avons également veillé à ce qu'ils ne se sentent pas seuls en les plaçant par groupes de 2 à 5 dans chaque cage. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure). De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entraîné. Les procédures sont sans réveil et l’animal sera anesthésié pendant la totalité des procédures.
Choix des espèces
L’utilisation de sang de souris pour évaluer la formation de caillot sanguin dans un contexte simplifié (in vitro) est un modèle bien maitrisé au sein du laboratoire et qui permet une évaluation précise de la formation d’un thrombus. Nous souhaitons aller vers le développement clinique d’anticorps dirigés contre nos récepteurs d’intérêts. Ainsi, la première étape consiste à étudier l’effet de nos anticorps in vitro avant de passer dans des modèles de thrombose artérielle réalisés dans la souris (in vivo). Il est donc nécessaire d’évaluer leurs efficacités sur sang de souris avant de démarrer les études in vivo. Ainsi, pour étudier nos récepteurs d’intérêt, nous utiliserons des souris spéciales modifiée génétiquement et exprimant ainsi des récepteurs humains. Ceci nous permettra de mieux comprendre les effets sur l’homme des molécules que nous souhaitons tester. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Etude de l’impact de la surexpression de ABI1 dans le développement de cardiomyopathies hypertrophiques dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, génétiquement modifiées pour surexprimer la protéine ABI1, reçoivent une injection intrapéritonéale et jusqu'à cinq échocardiographies sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'elles pourraient développer une insuffisance cardiaque avec oedèmes pulmonaires, des troubles du rythme et des morts subites, et que l'anesthésie sur un cœur défaillant accroît le risque de mort. Il précise avoir d'abord étudié des cardiomyocytes issus de cellules souches de patients mais conclut qu'un "modèle in vivo" est requis pour analyser la fonction cardiaque globale.
Objectifs
Les cardiomyopathies hypertrophiques (CMH) sont des atteintes du muscle cardiaque conduisant à des insuffisances cardiaques d’apparition progressive. Dans certains cas, les CMH augmentent le risque de trouble du rythme cardiaque et de mort subite. Les CMH peuvent avoir une originie génétique. Le plus souvent, ce sont des gènes codant pour des protéines musculaires. Nous avons identifié une mutation conférant à phénotype dominant négatif de la protéine ABI1 chez les patients présentant une CMH. Notre projet a pour objectif d’étudier deux modèles de surexpression de ABI1 pour comprendre la physiopathologie de ces CMH et identifier d’éventuelles voies pour développer des approches thérapeutiques ciblées.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des cardiomyopathies hypertrophiques associées aux mutations de ABI1 et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
Les animaux vont être soumis à: - une injection intrapéritonéale unique (environ 1 minute) - entre 1 et 5 échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes chacune). Ils peuvent être amenés à présenter des signes d'insuffisance cardiaque, des troubles du rythme et des morts subites.
Impact sur les animaux
Les animaux devraient développer une cardiomyopathie hypertrophique dont nous ne connaissons pas les vitesses d’évolution ou l’impact sur le bien-être. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer) , des troubles du rythme et des morts subites. Les points limites mis en place permettront de limiter au strict miminum la durée de ces effets. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique par voie intra péritonéale. L'injection sera faite par une personne expérimentée et la principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement du coeur et analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier les cellules souches induites des patients porteurs de la mutation ABI1 et de les redériver en cardiomyocytes pour analyser la morphologie et la electrophysiologie des cellules du muscle cardiaque. Malheureusement, le développement de l’insuffisance cardiaque ne peut être modélisé avec des cultures cellulaires car le fonctionnement cardiaque est dépendant de nombreux facteurs autres que la contraction des cellules musculaires cardiaques (flux et pression sanguine, système nerveux autonome...). Afin de comprendre l'impact du dysfonctionnement des cellules cardiaques sur la fonction cardiaque globale, nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons différentes approches : - approche séquentielle : nous étudierons les animaux à différents temps de développement et âges croissants. Si nous constatons un phénotype trop sévère aux plus jeunes âges, nous ne produirons pas les animaux les plus âgés. - étude longitudinale : nous avons prévu de réaliser un suivi par échocardiographie des animaux afin d’analyser leur phénotype et son évolution au fil du temps sans sacrifier les animaux pour lesquels ce n’est pas nécessaire. - approche statistique : nous analyserons les données (morphologie et fonction) en utilisant des tests statistiques adaptés. En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe.
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe (jusqu’à 5 dans une cage). L’environnement sera enrichi en fonction des préférence des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batonnets à ronger. Si des animaux venaient à être isolés (mâles reproducteurs, agressivité au sein du groupe…), la cage contiendra systématiquement deux enrichissements. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels). Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractériser d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussée des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure Chargée du Bien Etre Animal (SBEA). Au cours du projet, des échocardiographies seront réalisées sur les souris. Bien que cette technique d’imagerie soit indolore, elle nécessite que l’animal soit immobilisé. Afin de réduire le stress et limiter la contention des souris, l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse.
Choix des espèces
L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des maladies cardiaques (cardiopathies), de leurs conséquences hémodynamiques (sur le flux sanguin) et de leurs causes génétiques. Dans la première partie de l'étude, les souris auront une surexpression de ABI1 dès les stades précoces du développement cardiaque. Afin de réaliser un suivi au cours du temps de l'apparition de la cardiomyopathie, l'atteinte cardiaque sera analysée dès que le cœur à 4 cavités sera bien formé (13.5 jours post fécondation), juste avant la naissance (18,5 jours post fécondation) ainsi qu’à différents stades en post natal (30 ; 60 ; 90 ; 120 ; 150 ; 180 jours après la naissance). Pour la seconde partie de l'étude, la surexpression de ABI1 sera induite dans le muscle cardiaque chez des souris âgées de 8 semaines et la cinétique sera réalisée jusqu’à l’âge de 6 mois.
Rôle de protéines régulatrices du cytosquelette dans les plaquettes murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
3 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. Les procédures expérimentales, courtes, se déroulent sous anesthésie générale et les souris sont tuées avant tout réveil pour prélever leurs organes, 1 228 relevant d'une souffrance sans réveil et 1 852 d'une souffrance déclarée légère liée à l'élevage et au génotypage. Le projet vise à comprendre le rôle de deux protéines du cytosquelette des plaquettes sanguines comme cibles thérapeutiques éventuelles. Le porteur indique que les plaquettes ne peuvent être mises en culture et affirme qu'il est "nécessaire" de disposer de plaquettes issues de sang frais, ce qui l'a conduit à générer deux lignées de souris.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des cellules vitales par la formation d'un bouchon qui vient colmater les vaisseaux pour arrêter le sang de couler après une blessure. Dans des conditions pathologiques, de part leur implication prépondérante en hémostase, des déficites plaquettaires peuvent aboutir aussi bien dans des troubles hémorragiques (saignement) que thrombotiques (gros caillots). Le fonctionnement correcte dans la circulation des plaquettes nécessite une série de changements en interne de la cellule, le squelette de la plaquette (appelé cytosquelette). Des anomalies dans ces processus peuvent conduire à des défauts de fonctionnalité. Récemment, il a été montré que des défauts chez l'homme de ce squelette touchant certaines molécules des plaquettes avaient une répercussion sur la capacité du sang à coaguler. Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de deux protéines de ce squelette, présentes dans les plaquettes, et de finir si elles peuvent représenter de futures cibles thérapeutiques chez l'homme.
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et les fonctions plaquettaires, et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies hémorragiques et thrombotiques liés aux plaquettes sanguines.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales se feront après une anesthésie générale. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience. Quatre procédures expérimentales seront mises en place d'une durée courte: de 10 à 60 minutes maximun.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. Le projet ne comporte que des procédures expérimentales sans réveil sous anesthésie générale. Il n'y a donc pas de contraintes pour les animaux lors des procédures expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure (sans réveil). Des prélèvements d'organes post-mortem seront alors effectués.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur de la culture cellulaire. Ces modèles cellulaires sont essentiels pour orienter nos recherches mais ces lignées ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mise en culture car elle ne possèdent pas de noyau et peuvent donc pas se multiplier. Par ailleurs, hors d'un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang fraichement collecté. Nous avons alors généré deux modèles de souris pour comprendre le rôle de protéines multifonctionelles dans les plaquettes. Ces souris permettront d'étudier les plaquettes sanguines dans un organismes vivant, d'évaluer les interactions entre toutes les composants du sang et d'évaluer les risques de saignement ou d'occlusion thrombotique des vaisseaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire dans les procédures expérimentales est de 1228 pour deux lignées de souris différentes. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques (GPower3.1).
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitement analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d'hébergement de l'animalerie juste avant la procédure exprérimentale. Les souris sont anesthésiées et analgésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris aussi bien mâles que femelles, seront agées entre 3 semaines et 1 an.
Développement d’une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose artérielle et l’AVC ischémique EU ½
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
860 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 240 menées sans réveil. Un accident vasculaire cérébral ou une thrombose leur est provoqué par chirurgie, suivi d'IRM à 24 et 72 heures, avec au réveil des atteintes de la motricité, du comportement et de la nutrition, pour tester un anticorps ciblant le caillot afin de limiter les saignements des traitements actuels. Le porteur situe les bénéfices au conditionnel, réduction des lésions et élargissement de la fenêtre thérapeutique de l'AVC. Il affirme que ces pathologies, trop complexes, ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
Le projet se fera dans deux établissements utilisateurs. L’hémostase regroupe les processus biologiques assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui se développe dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à l’érosion ou la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un thrombus pouvant entrainer des pathologies graves comme l’AVC ischémique suite à l’obstruction d’une artère cérébrale. Il existe aujourd’hui en clinique 3 classes d’agents antiplaquettaires pour traiter efficacement la thrombose artérielle, mais leur principal effet indésirable est qu’ils induisent des saignements. Concernant les AVC ischémiques, le traitement de référence est basé sur une approche pharmacologique activant la destruction du thrombus (fibrinolyse), combiné ou non à une approche chirurgicale permettant de retirer de manière mécanique le thrombus. Cependant, à cause du risque hémorragique, ces deux approches doivent être réalisée respectivement dans les 4h30 ou 6h après l’apparition des premiers symptômes, ce qui limite fortement le nombre de patients pouvant être traités, puisque que passé ces délais, ils ne peuvent plus recevoir les traitements. Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée qui permettrait de limiter le risque hémorragique lié à ce type de traitement. Cette approche est basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, le rtPA, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de ces anticorps sur la thrombose artérielle et l’AVC ischémique, ainsi que leur risque hémorragique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur 2 aspects : • La thrombose artérielle : on pourrait mettre en évidence une réduction de la thrombose dans les modèles expérimentaux et ce potentiellement en réduisant les risques de saignement, que l’on sait importants avec les traitements actuellement disponibles. • L’AVC ischémique : on pourrait mettre en évidence une réduction de la taille des lésions post-AVC couplée à une potentielle réduction des saignements par rapport au traitement rtPA du fait du ciblage spécifique du thrombus. Cette réduction des saignements pourrait également conduire à une augmentation de la fenêtre thérapeutique des traitements de l’AVC : à ce jour, la rtPA ne peut être administrée que 4.5 heures après l’AVC. L’identification de tels résultats pourraient déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ou un AVC ischémique ainsi qu’à une réduction des séquelles à long terme de ces pathologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale (animal vigile), sous-cutané, intra-veineux et intranasal (animal anesthésié). Certains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celles-ci seront de maximum 60 min. Des IRM de 30 min à 1h seront réalisés 24 et 72h après avoir induit l’AVC.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site chirurgical. Si le saignement observé est trop important la souris sera sacrifiée afin de limiter toute douleur ou inconfort. Pour les modèles d’AVC, on s’attend au moment du réveil à un impact sur le comportement (activité réduite), sur l’apparence physique (apparence des poils, paupières), sur la nutrition et sur la motricité (rotation). Pour le modèle de saignements pulmonaires, au moment du réveil on s’attend à un impact sur le comportement (baisse d’activité) et la respiration (accélération).
Devenir
Modèles de thrombose Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Temps de saignement Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure. Modèle d’inflammation pulmonaire induite par LPS Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements au niveau des poumons après leur mort. tMCAO Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort. Modèles d’AVC Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure pour pouvoir faire des prélèvements de leur cerveau après leur mort.
Remplacement
Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique ciblée basée sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine venant consolider l’agrégat ; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose et de l’AVC, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. Les deux pathologies étudiées étant des processus particulièrement complexes faisant intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par une habituation au gel nutritif 2 jours avant l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’injection d’un analgésique pendant et après chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé pour évaluer la formation de thrombus. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Etude des effets d’une d’irradiation sur l’évolution d’une hématopoïèse clonale.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
720 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées et greffées de moelle osseuse, elles subissent des irradiations du corps entier et locales, jusqu'à dix-sept prélèvements de sang, des gavages pour induire une mutation et des imageries cardiaques sous anesthésie, pour déterminer si de faibles doses d'irradiation favorisent leucémies et maladies cardiovasculaires. Le porteur relie ces résultats au suivi des populations exposées et à la radiothérapie, bénéfices présentés comme préalables à un essai clinique. Il affirme qu'aucune méthode ne permet de modéliser ces effets à l'échelle d'un organisme entier et complexe.
Objectifs
Les cellules souches à l’origine de l’ensemble des cellules du sang sont localisées dans la moelle osseuse. La présence d’une modification de l’ADN (mutation) dans ces cellules souches peut aboutir à la production d’un ensemble de cellules mutées, appelé clone, détectable dans le sang sans pathologie associée. On parle alors d’hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé. Chez l’humain, cette anomalie est détectable dès 30 ans et devient très fréquente avec l’âge. Chez ces individus, une fraction des globules blancs, appelés cellules myéloïdes, est pro-inflammatoire et augmente le risque de développement de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires. Notre projet a pour objectif d’étudier une des mutations les plus fréquentes associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé : la mutation du gène Tet2 (Ten-eleven-translocation 2). Cette mutation, qui conduit à la perte de fonction de la protéine, a pour conséquences une multiplication plus active des cellules souches et une augmentation de la production des cellules myéloïdes. De plus, l’exposition à une inflammation chronique favorise l’expansion de ces clones mutés et leur évolution en cancers du sang ou en maladies cardiovasculaires. L’exposition à de faibles doses d’irradiation pouvant provoquer une inflammation chronique, notre projet vise à déterminer si une irradiation à faible dose peut favoriser l’apparition d’une leucémie et/ou d’anomalies cardiovasculaires dans un organisme présentant une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2. Cette recherche permettra de déterminer si cette mutation augmente les risques sanitaires pour les populations exposées à de faibles doses d’irradiation (travailleurs du nucléaire ou professions médicales) et d’identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin transgénique dans lequel le gène Tet2 est inactivable dans une fraction de cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques de façon contrôlée après traitement médicamenteux et donc de mimer une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé associée à la mutation du gèneTet2.
Bénéfices attendus
Les objectifs sont ici de déterminer si, et à quelle(s) dose(s), l’irradiation corps entier d’un individu porteur de la mutation du gène TET2, de type hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé, augmente les risques de survenue de cancers du sang et de maladies cardiovasculaires, et identifier les mécanismes impliqués dans un modèle murin transgénique porteur de la mutation du gène Tet2. Les résultats de cette étude pré-clinique sont nécessaires pour envisager l’initiation d’un essai clinique chez l’humain. La recherche de mutations associées à une hématopoïèse clonale à potentiel indéterminé dans le sang pourrait être un paramètre important à prendre en compte : 1) dans le suivi médical des populations exposées à des doses faibles/modérées d’irradiation, notamment dans un cadre professionnel ; 2) pour la personnalisation des traitements des patients porteurs de cancers et traités par radiothérapie.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - identification des animaux de génotype d’intérêt (1fois - 30 secondes) ; - des irradiations locales (2 fois – maximum 10 minutes sur animaux anesthésiés) - des irradiations corps entier (3 fois - maximum 15 minutes sur animaux vigiles) ; - prélèvements de sang (un maximum de 17 prélèvements/animal – 2 minutes par prélevement) ; - injections pour l’anesthésie des animaux avant les irradiations locales (2 fois - 2 minutes/animal) ; injection pour la transplantation des cellules de moelle osseuse nécessaire pour établir le modèle murin transgénique (1 fois -2 minutes) - gavage avec un médicament permettant d’induire la mutation du gène Tet2 (5 fois - 2 minutes) - anesthésie gazeuse (4 fois maximum - 30 minutes/animal), rasage/dépilation (4 fois maximum– 4 minutes/animal) pour les imageries du cœur par écho-doppler
Impact sur les animaux
L’irradiation corps entier sera susceptible de générer un stress, en raison de la contrainte physique de l’animal dans un compartiment de la boîte à irradiation, des transports allers-retours à l’irradiateur et pour les imageries écho-doppler et les anesthésies permettant la répétition de ces analyses au cours du temps. L’injection de cellules de moelle osseuse, la section de l’extrémité de la queue pour le génotypage, les prélèvements de sang pourront induire une douleur brève. Une altération physique et du comportement sont possibles en cas d’apparition de leucémies ou d’anomalies cardiaques.
Devenir
A l’issue des expériences, tous les animaux seront euthanasiés et les organes, notamment le cœur, la moelle osseuse et la rate seront collectés à des fins d’études histologiques, cellulaires et/ou moléculaires. Ces analyses sont nécessaires pour caractériser de manière la plus complète possible les effets différentiels de l’irradiation sur le groupe contrôle et sur le groupe de souris transgéniques.
Remplacement
L’objectif même de notre projet étant d’étudier les effets physiopathologiques d’une irradiation corps entier à faible dose, il n’existe actuellement aucune méthode de substitution à l’utilisation d’animaux vivants permettant de modéliser ce type d’effet à l’échelle d’un organisme entier et complexe. D’autres modèles murins, dans lesquels le gène que nous étudions est inactivé soit dans toutes les cellules de l’animal soit dans toutes les cellules hématopoïétiques, ont montré des caractéristiques physiopathologiques similaires à celles observées chez l’humain. Ces travaux justifient l’utilisation de souris transgéniques pour répondre aux questions scientifiques décrites dans notre projet.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum mais doit être suffisant pour prendre en compte la possibilité, bien que peu fréquente, d’absence de transplantation efficace des cellules de moelle osseuse (prise de greffe). Les données issues d’expériences précédentes et la bibliographie montrent que 6 animaux par groupe contrôle et 12 animaux par groupe test sont nécessaires pour réaliser les analyses statistiques et s’assurer d’une différence significative entre les différents groupes. De plus, pour une même condition, 2 expériences indépendantes doivent être réalisées pour s’assurer de la robustesse des conclusions scientifiques établies à partir des résultats. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet pourra également être réduit en fonction des résultats obtenus lors des toutes premières expériences. Ainsi, le nombre de dose d’irradiations corps à tester pourra être revu à moins des 5 maximum estimées.
Raffinement
Afin de favoriser le bien-être animal, les animaux seront hébergés en groupe selon la règlementation en vigueur dans un environnement enrichi composé de tunnels en carton et de boules de coton. Les irradiations locales et les analyses par échographie sont réalisées sous anesthésie générale. L'évaluation de la souffrance éventuelle des animaux est basée sur l'observation quotidienne, par le personnel animalier ou l’expérimentateur, des signes cliniques (aspect, comportement spontané, comportement alimentaire, comportement dans le groupe social). En cas de douleur, une analgésie adaptée sera mise en place après concertation avec le vétérinaire. Si à tout moment de l’étude, les animaux présentent des signes d’affaiblissement, une cupule d’aliment riche gélifié sera placée au fond de la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation et réhydrater les animaux. Dans un cas extrême de déshydratation, a priori très peu probable dans le cas de cette étude, les animaux pourront être traités avec des injections sous cutanées de liquide physiologique. Des points limites précoces ont été définis.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier le système de production des cellules du sang. En effet, ce modèle présente des similarités physiologiques et génétiques avec l’humain, et permet l’obtention de lignées transgéniques pour cibler un ou plusieurs gènes d’intérêt, et dont l’activation ou l’invalidation peut être réalisée de façon contrôlée (par traitement médicamenteux des animaux), cette dernière caractéristique étant cruciale pour notre projet. De plus, l’utilisation de lignées de souris exprimant exclusivement certains marqueurs à la surface des cellules hématopoïétiques nous permettra d’étudier parallèlement, après transplantation, les cellules donneuses et receveuses. Pour ce projet, nous utiliserons des animaux âgés de plus de 8 semaines, considérés comme adultes et avec une hématopoïèse stable.
Mise au point d’un dispositif expérimental externe et non-invasif pour la mesure de paramètres physiologiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes réutilisées à l'issue. Rasées et anesthésiées à plusieurs reprises, elles sont équipées d'un textile connecté porté jusqu'à vingt-quatre heures, parfois isolées, pour mettre au point un dispositif de mesure cardiorespiratoire présenté comme une alternative aux capteurs implantés par chirurgie. Le porteur reconnaît que les souris peuvent chercher à retirer le dispositif et se blesser en se grattant, que l'isolement les stresse et que le rasage provoque hypothermie et inflammation. Il affirme que des modèles 3D précèdent la phase animale mais que le recours à la souris reste un "passage obligé" pour évaluer le comportement et la tolérance.
Objectifs
Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.
Bénéfices attendus
L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.
Procédures
Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.
Impact sur les animaux
Une fois équipé du dispositif, il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène qui a été décrit avec d’autres dispositifs externes et pour d'autres espèces, peut conduire à une irritation et des lésions dues à des grattages excessifs. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.
Devenir
À l’issue de ces procédures légères, à condition que leur santé et leur bien-être ne soient pas compromis, tous les animaux pourront être réutilisés dans d’autres projets, contribuant à réduire le nombre d’animaux requis à des fins scientifiques.
Remplacement
Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.
Réduction
Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.
Choix des espèces
La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.
Effet d’un inhibiteur de Janus kinases (JAK) sur la fonction plaquettaire, l’hémostase, et la thrombose artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Gavées une fois ou pendant sept jours avec un inhibiteur de JAK, elles subissent ensuite soit un prélèvement de sang terminal à l'aorte, soit la provocation d'une thrombose de la carotide sous anesthésie, pour confirmer que ce médicament de la polyarthrite favorise la formation de caillots. Le porteur signale que le gavage peut perforer l'œsophage ou provoquer une fausse route avec du sang dans la bouche, et que l'anesthésie peut perturber la respiration. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer la souris par des modèles in vitro pour étudier la thrombose.
Objectifs
La famille JAK (Janus Kinase) comprend 4 membres (JAK1, JAK2, JAK3 et TYK2) qui sont liés à des récepteurs appelés tyrosine kinases. Ce sont des enzymes qui sont responsables de la régulation de nombreuses fonctions cellulaires liées au système immunitaire. Les inhibiteurs de JAK ont un impact sur les maladies auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, l'utilisation d'inhibiteur universel de JAK, qui ciblent tous les membres de la famille, dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, pourrait présenter un risque de formation accrues de caillots sanguins. L'objectif de ce projet est de confirmer l'effet d’augmentation de formation des caillots sanguins d'un inhibiteur universel de JAK à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet seront de mieux comprendre l’effet de l'inhibiteur universel de JAK afin de permettre une meilleure prise en charge des patients atteints d’arthrite rhumatoïde i) sur la fonction des plaquettes,ii) l’hémostase qui est un processus qui permet au corps de stopper un saignement. L’hémostase « colmate » une blessure par exemple en formant un caillot qui va arrêter le saignement et iii) la thrombose artérielle qui va correspondre à la formation d’un caillot dans un vaisseau sanguin. Ce caillot peut obstruer partiellement ou complétement le vaisseau et ainsi entrainer des problèmes de circulation sanguine et des complications médicales.
Procédures
Ils seront soumis à un gavage en administration unique ou répété sur 7 jours sur animal vigile. Le gavage d'un animal prend environ 2 minutes, un prélèvement de sang terminal à l’aorte abdominale sous anesthésie qui dure environ 10 minutes ou à une thrombose à la carotide sous anesthésie qui dure environ 1 heure.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie (nécessaire au prélèvement de sang à l’aorte abdominale et au modèle de thrombose) sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Il existe également un risque de saignement au site d’incision lors du prélèvement de sang à l’aorte et du modèle de thrombose .L’insertion de la canule lors du gavage présente des effets indésirables tel qu’un risque de perforation. Un autre effet indésirable possible est le risque de fausse route lors de l'administration de l'inhibiteur universel par voie orale se manifestant par des difficultés respiratoires et/ou la présence de sang dans la bouche.
Devenir
Le prélèvement à l’aorte est un prélèvement terminal car la quantité de sang prélevée est très importante donc il est nécessaire après prélèvement de mettre les animaux à mort. La formation d’une thrombose sur la carotide altère la circulation sanguine et donc la fin de la procédure nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
Le but de ce projet est de confirmer l'effet pro-thrombotique du pan-inhibiteur de JAK en évaluant son impact sur la thrombose et les caillots sanguins à l'aide de modèles expérimentaux in vitro, ex vivo et in vivo. La formation de thrombose est un processus complexe car il implique différents types de cellules et des conditions spécifiques liées à la circulation du sang (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin). En raison de cette complexité, il est impossible de remplacer l'utilisation de souris par des modèles in vitro ne nécessitant pas de recours à la souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans cette étude est réduit au minimum, avec un nombre de 10 souris par groupe pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont plusieurs par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’étude in vivo y sont largement répandus et maîtrisés. Des souris WT C57BL/6J seront utilisées dans ce projet. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
PhotoBioModulation (PBM) : Évaluation préclinique de Sécurité, de Performance et d’Efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter par PBM l’ischémie/ reperfusion cardiaque aigue sur un modèle porcin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
95 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chez 75 d'entre eux une ischémie cardiaque est provoquée puis reperfusée, avec suivi par IRM et prélèvements sanguins, pour évaluer un dispositif médical de photobiomodulation, les 20 autres étant utilisés pour en tester la sécurité. Le porteur indique que l'instabilité peut déclencher des arythmies et estime à 30 % le risque de décès malgré la réanimation. Il présente le porc comme le "modèle le plus pertinent" du fait d'une anatomie cardiaque proche de l'humain, et destine les données au marquage CE et à la FDA.
Objectifs
L'infarctus du myocarde se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque, lorsque cette zone n'est plus irriguée par les artères coronaires qui lui apportent l'oxygène véhiculé par le sang. La prise en charge de l’infarctus du myocarde consiste à rétablir le flux sanguin en débouchant l’artère (reperfusion) le plus rapidement possible après le début des symptômes. Bien que cette reperfusion soit obligatoire pour la survie du patient, elle engendre par elle-même des répercussions que l’on associe aux problèmes d’ischémie/reperfusion qui peuvent induire des phénomènes de mort tissulaire jusqu’à plusieurs jours après la reperfusion. La thérapie par Photobiomodulation (PBM) se définit comme une irradiation lumineuse athermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge, pour stimuler la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie ou stimuler la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et en réduire l’inflammation. Nous développons un nouveau dispositif médical (DM) innovant utilisant les principes de la PBM, véritable rupture technologique avec les approches thérapeutiques proposées actuellement. Nos travaux préliminaires sur la première version de notre dispositif médical ont montré des résultats pertinents en termes d’efficacité de notre dispositif médical pour améliorer la fonction myocardique après reperfusion. L’objectif de cette étude préclinique est d’évaluer une version améliorée de notre dispositif médical et de notre thérapie par PBM avec preuve statistique. Pour cette étude en phase aiguë, sans réveil, 95 porcs seront nécessaires pour fournir les informations suffisantes pour aller vers un projet de phase clinique chez l'homme : - Étude de sécurité et de performance sur 20 porcs sains - Étude d’efficacité sur 75 porcs présentant une pathologie induite (ischémie cardiaque suivie d’une reperfusion) : 25 témoins, 25 traités par PBM dose 1 et 25 traités par PBM dose 2. Le modèle utilisé est le porc adulte de taille réduite qui présente une anatomie coronaire et cardiaque très semblable à l’homme et cela fait du porc le modèle le plus pertinent pour étudier les mécanismes de l'ischémie reperfusion. Tous les animaux seront profondément endormis sous anesthésie générale, avec une prise en charge de la douleur. En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour les prélèvements histologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra : - pour l’étude sur la sécurité et la performance du dispositif médical, DM (20 porcs sains) : • de fournir les éléments pour instruire une partie de l'analyse de risque de notre DM. Étudier et, si besoin, modifier des points faibles rencontrés sur notre DM lors de sa mise en place et lors de son utilisation. Cette étude doit aussi nous permettre de fournir des informations pour instruire nos dossiers réglementaires (dossier technique pour le marquage CE) • de valider et de disposer d'éléments tangibles et quantifiables de la capacité de notre DM à délivrer la dose photonique déterminée de façon fiable et reproductible. - pour l’étude sur l’efficacité du DM (75 porcs présentant une pathologie cardiaque induite): • de démontrer que le traitement par PBM à 2 doses différentes améliore la fonction myocardique et diminue la lésion d’ischémie et de reperfusion cardiaque comparativement au groupe Témoin non traité. Nous voulons développer un produit qui permet d’irradier le cœur in situ par PBM pour pallier significativement les effets de la reperfusion lors de la prise en charge de l’infarctus aigu du myocarde. Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons soumettre une étude préclinique d’efficacité en phase chronique et dans les circonstances de non-risques potentiels (sécurité, performance et efficacité du dispositif médical), un essai pilote d’étude clinique sera proposé afin d’évaluer notre traitement par PBM chez des patients présentant une ischémie cardiaque. Cette nouvelle approche thérapeutique pourrait réduire significativement les lésions et la perte de la fonction cardiaque suite aux phénomènes délétères de la reperfusion suivant l’ischémie.
Procédures
La procédure est sans réveil et sera réalisée sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les animaux seront prémédiqués, intubés et anesthésiés durant toute l’intervention. L’oxymétrie sera contrôlée par un capteur approprié qui vérifiera la saturation en oxygène. Durant l’intervention, les porcs seront sous un mélange O2/air et sous perfusion d’un agent anesthésique et sous perfusion lente d’antalgique. Cette anesthésie permettra à l’animal d’être en anesthésie profonde et sans souffrance. - La procédure chirurgicale sera réalisée sur tous les animaux, 1 seule fois, avec un suivi pendant 5h de la procédure, puis euthanasie (animal toujours placé sous AG) - Le suivi par imagerie IRM sera réalisé sur tous les animaux sous AG - Prélèvements sanguins (via le cathéter veineux central) sur tous les animaux, 3 fois, durant la procédure. - Prélèvements du cœur après euthanasie.
Impact sur les animaux
Cette procédure en phase aiguë est sans réveil. Tous les animaux seront placés sous anesthésie générale durant toute la procédure, avec une prise en charge continue de la douleur. Le stress éventuel auquel l’animal pourrait avoir été induit avant son arrivée au bloc, ainsi que son état général sont controlés par un suivi des marqueurs que nous utilisons lors de la mise sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus pourraient survenir lors de l’étude d’efficacité du DM, pendant la phase d’ischémie cardiaque et lors de la phase de reperfusion : une trop forte instabilité hémodynamique pourrait entraîner des arythmies et des fibrillations auriculo-ventriculaires. Des manœuvres de réanimation (massages cardiaques et défibrillation par électrochocs) ainsi qu’une médication appropriée (anti-arythmiques, vasoconstricteurs, protecteur membranaire…) sont prévues afin de minimiser les risques. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un décès de l’animal qui sera prononcé après 50 minutes de réanimation non efficace. Selon notre expérience, ce risque s’élève à 30% des cas.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux (toujours placés sous anesthésie générale) seront euthanasiés par injection veineuse de barbiturique afin de prélever le cœur qui sera observé macroscopiquement lors de l’explantation. Des échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique et biologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires, de quantifier la zone à risque et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Les effets de la PBM ont été testés au préalable sur des cellules cardiaques en cultures et sur des embryons de poulet. Ils se poursuivent encore actuellement sur des études in vitro de respiration mitochondriale de cardiomyocytes humains soumis à la PBM. Cependant, afin d’évaluer notre dispositif médical (DM) à taille réelle (similaire à celui qui sera utilisé chez l’homme) et dans un cadre réglementaire, nous avons besoin d’utiliser un modèle animal pour étudier sa sécurité et son efficacité et pour évaluer les risques de première utilisation.
Réduction
Pour cette étude, le nombre total d'animaux a été défini pour permettre de disposer d'éléments suffisants pour passer chez l'homme. Pour l’étude d’efficacité, cet effectif permettra de réaliser des statistiques sur les groupes traités par PBM comparativement au groupe témoin. Après expérimentation, du matériel biologique (organes, tissus) pourra être prélevé. Dans le cadre d’une collaboration dans la même structure d’expérimentation avec une autre équipe travaillant sur le sujet de l'ischémie/reperfusion, les données et tissus issus du lot témoin et des prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole et ainsi éviter d’utiliser des animaux supplémentaires. L'ensemble des informations recueillies chez l'animal "proche de l'homme" seront utilisées pour le dossier de demande de marquage européen (CE) et pour les autorités Américaines (FDA). .
Raffinement
Pour réduire le mal être et la souffrance de l’animal lors de nos interventions : - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention, avec un enrichissement du milieu). - Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire - Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie à proximité de ses congénères la veille de son départ (pour la mise a jeun), est tranquillisé par un sédatif - Les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant toute la procédure, avec une prise en charge de la douleur (perfusion continue et lente d’antalgique durant toute la procédure d’ischémie et de reperfusion) - Durant la procédure sous anesthésie générale, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à une couverture chauffante ou des bouillottes d’eau chaude (dont l’eau chaude sera régulièrement renouvelée). - Pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite (âgés de >24 mois, 55-70kg). Ce stade physiologique et cette taille "adulte" est nécessaire pour tester notre dispositif médical et être au plus près des conditions humaines. L'anatomie vasculaire est à ce stade plus proche de l’homme, ce qui en fait un modèle parfaitement adapté pour nos essais précliniques. Cette lignée nous permet de faire notre étude sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les accidents vasculaires cardiaques. Selon notre expérience, le porc charcutier (de type Large White) est moins intéressant, car pris à un âge très jeune (de 3 à 4 mois et pesant de ce fait 40/60 kg) pour avoir un poids manipulable, il présente une anatomie vasculaire plus éloignée et moins prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. . Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 2 ans, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur la lignée elle-même et sur ce type d’expérimentation nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser un dispositif médical qui sera l’exacte copie du dispositif médical utilisé en clinique humaine (exigence réglementaire) - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation en clinique humaine.
Programme d’immunisation de poules pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.
Procédures
5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole
Raffinement
Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).
Choix des espèces
La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.
Rôle de la protéine kinase A de type I dans la compartimentation de l’AMP cyclique dans les cardiomyocytes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent une biopsie de la queue pour le génotypage et des injections, dont une dans la veine caudale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever le cœur et d'autres organes, afin d'étudier les mécanismes de toxicité de l'adrénaline sur le cœur dans l'insuffisance cardiaque. Le porteur indique que les biopsies et injections provoquent une douleur légère et que la manipulation stresse les animaux. Sur le remplacement, il affirme le recours "incontournable" à l'animal, les cellules cardiaques adultes ne survivant pas au-delà de deux à trois jours en culture.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque est une maladie grave et fréquente (1 à 2 % de la population des pays développés) dont l'espérance de vie à 5 ans est de seulement 50% malgré les traitements actuels. Quelle que soit son étiologie, l'insuffisance cardiaque est associée à une augmentation chronique d’adrénaline et de noradrénaline dans la circulation et ceci a des conséquences néfastes pour le cœur. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes de toxicité de ces hormones sur le coeur, dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour de futurs traitements de l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de la toxicité de l'adrénaline et de la noradrénaline pourrait permettre de trouver à terme de nouveaux traitements pour améliorer la contraction du cœur dans l’insuffisance cardiaque et donc la survie des patients atteints de cette maladie.
Procédures
Un prélèvement sur animaux vigiles, durée 30 secondes. 2 injections, durée 3 secondes/injection, 1 injection caudale, durée 30 secondes, sous anesthésie. 1 injection pour euthanasie.
Impact sur les animaux
Le prélèvement d'une biopsie de queue (1 mm) pour le génotypage et les injections occasionnent une douleur légère. L'injection à la queue est réalisée sous anesthésie mais est susceptible d'entraîner une douleur passagère au réveil. La manipulation des animaux pour effectuer ces opérations, bien qu'effectuée par du personnel formé, provoque un stress.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvement du coeur et des autres organes majeurs, ce qui sera indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques conduisant à l'insuffisance cardiaque.
Remplacement
Le recours incontournable à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la répartion de l’AMPc dans les cardiomyocytes. Il se justifie par l’impossibilité d’obtenir des lignées de cellules cardiaques adultes possédant les mêmes caractéristiques que les cardiomyocytes primaires, par le fait que les cellules cardiaques adultes ne conservent pas un phénotype stable en culture et ne survivent pas au delà de 48 à 72h.
Réduction
Des souris des deux sexes seront utilisés dans ce projet car il n'existe pas d'évidence que le sexe modifie la répartition de l'AMPc et ceci permettra de réduire le nombre d'animaux produits. Une planification minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et en conservant une puissance statistique suffisante pour observer un effet. Dans la mesure du possible, les cardiomyocytes et les tissus seront partagés afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Des expériences d’imagerie, de biochimie et de biologie moléculaire seront effectuées à partir du même isolat de cardiomyocytes afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer qu’ils ne subissent aucun stress. Au quotidien, l’aspect des souris sera examiné (aspect général, état du pelage, prostration éventuelle) et des pesées seront effectuées une fois par semaine afin de mettre en œuvre les points limites appropriés. Afin d’améliorer leurs conditions d’hébergement de l’enrichissement sera ajouté dans leurs cages. Les rats sont mis en cage et observés tous les jours. Les cages sont changées 2 fois par semaine afin de minimiser une éventuelle infection. L’injection dans la veine caudale est réalisée sous anésthésie à l'isoflurane.
Choix des espèces
La souris est un mammifère comme l’Homme dans lequel il est possible d’étudier la fonction d’un gène pour mieux comprendre son rôle dans le développement des maladies. Dans ce projet, nous utilisons des souris dont un gène est modifié uniquement dans le cœur dans le but de mieux comprendre son rôle dans l’insuffisance cardiaque ce qui pourrait permettre à terme de trouver de nouveaux traitements de cette maladie. Nous utilisons des animaux adultes car l’insuffisance cardiaque touche principalement des sujets adultes.
Mécanismes cellulaires et moléculaires de la calcification valvulaire aortique dépendante de Pou5f1/ERRalpha et d’une dyslipidémie
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras sans vitamine D pendant quatre mois, ces souris ApoE-/- reçoivent un gavage de tamoxifène et des échographies cardiaques sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les valves aortiques. Le porteur reconnaît que le régime gras apporte un inconfort mais affirme qu'il n'affecte pas la mobilité des animaux. Il présente la souris comme "un des très rares modèles" de calcification des valves et attend des données extrapolables à l'humain.
Objectifs
Environ 500 millions de personnes dans le monde souffriront de calcification de la valve aortique (CVA) d’ici 2050. La CVAest une maladie progressive caractérisée par une inflammation, une fibrose et finalement une calcification de la valve. Cela conduit à un retréssissement aortique, une maladie grave précipitant le patient vers une insuffisance cardiaque. Le seul traitement pour la CAVD, le remplacement de la valve , n’est pas disponible pour 85% de la population mondiale. En France, 10000 remplacements valvulaires aortiques sont effectués chaque année sans toujours un bon résultat et avec des suites à la chirurgie ou même au protocole sans chirurgie . Il n’existe aucun médicament pour cette pathologie. La dyslipidémie joue un rôle majeur dans la CVA. Cependant, les cellules valvulaires (unités biologiques composant la valve) spécifiquement impliquées dans la maladie sont encore en débat. De plus, les femmes, même atteintes de dyslipidémie, sont beaucoup moins sujettes à la CVA que les hommes. Fait intéressant, le microbiote intestinal masculin et féminin diffère. Notre projet propose : 1. Le suivi et l'identification des cellules et de leur profil de gènes à l’origine de la CVA dans un modèle murin de dyslipidémie- 2. L 'analyse du microbiote des souris mâles et femelles atteintes de dyslipidémie au cours de la CVA et après dérégulation de la voie dépendante de des hormones oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux cibler une thérapie anti calcification valvulaire par une connaissance plus précise du mécanisme pathologique notre étude devrait apporter des informations sur la différence de pathologie valvulaire ches les hommes et les femmes et des pistes de médicaments pour la maladie. Comme le microbiote de l'intestin de la souris est fonctionnellement similaire à plus de 90 % à celui de l'homme, nous nous attendons à ce que les données soient extrapolables à la situation des patients humains.
Procédures
régime riche en acide gras (42% matière grasse, ENVIGO MD.88137 sans vitamine D3) :24 4 mois echocardiographie sous anesthésie isoflurane 30 min: 48 gavage tamoxifène: protocole de 1 min: 6
Impact sur les animaux
L’obésité des souris ApoE-/- en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie . Le gavage au tamoxifène
Devenir
tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la dernière étape (Echocardiographie) du projet. Cela permetra de plus de collecter les valves aortiques pour les experience de transcriptomique.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous avons au laboratoire et utiliserons des cellules valvulaires aortiques de patients CVA VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et avons dérivé à partir de ces cellules des cellules iPS spécifiques ; nous les re-différencions en cellules valvulaires et faisons des co-cultures 3D de VEC / VIC pour suivre le processus de fibrose et de calcification et identifier les cibles médicamenteuses.
Réduction
Les mêmes souris serviront à nos deux objectifs analyse clonale et micobiote intestinal . Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une signification statistique
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage. Le tamoxifène est donné en présence de progestérone pour éviter les effects néfastes de blocage des récepteurs endogènes. L’anesthésie est utilisée pour l’échocardiographie qui se réalise en positionant l'animal sur un tapis chauffant et une sonde rectale pour controller sa température pendant les 20-30 min du protocole d’ échocardiographie.
Choix des espèces
la souris ApoE-/- est un des très rares modèles animal de calcification des valves les souris seront adultes, seul stade pour observer la pathologie
Etude du rôle des Facteurs de Transcription de la famille Ikaros dans la mégacaryopoïèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales de tamoxifène cinq jours de suite et subissent jusqu'à six prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour étudier le rôle de la famille de protéines Ikaros dans la formation des plaquettes. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des lésions cutanées ou une surinfection au point d'injection. Il affirme que les cellules souches humaines ne parviennent pas encore à maturer suffisamment en culture pour ce type d'étude.
Objectifs
Les thrombopénies constitutionnelles sont un groupe de maladies rares d’origine génétique caractérisées par un faible nombre de plaquettes sanguine ce qui est à l’origine de l’apparition de troubles hémorragiques. Récemment, des mutations dans la protéine PEGASUS (Ikzf5), appartenant à la famille IKAROS (IKZF), ont été identifiées chez des patients présentant une thrombopénie modérée, des plaquettes de grande taille et une absence de granules. La famille de protéines Ikaros est composée de 5 membres, Ikaros (Ikzf1), Hélios (Ikzf2), Eos (Ikzf3), Aiolos (Ikzf4) et Pegasus (Ikzf5) qui n’avaient jusqu’ici qu’été impliqués dans le contrôle de la production des globules blancs. Dans ce contexte, nous souhaitons mieux comprendre le rôle des différents membres de la famille Ikaros dans la biogénèse des plaquettes sanguines et identifier les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Bénéfices attendus
La compréhension des thrombopénies constitutionnelles a bénéficié ces dernières années d’une amélioration des connaissances des étapes de formation des plaquettes (mégacaryopoïèse). Cependant, ces maladies restent encore largement incomprises et sous-diagnostiquées. Etudier le rôle de facteurs de transcription comme ceux de la famille Ikaros permettra d’accroître nos connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent les différentes étapes de maturation des plaquettes (extension du cytoplasme, biogénèse des granules, capacité des mégacaryocytes à produire des plaquettes). Ce projet nous permettera d’améliorer notre compréhension de l’étiologie des saignements observés chez les patients et leur prise en charge.
Procédures
Des injections intra-péritonéales d'une durée de quelques secondes seront réalisées sur 72 animaux vigiles à raison d'une injection par jour pendant 5 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins de moins d'une minutes seront toujours faits sur animaux sous anesthésie générale. 72 souris auront un prélèvement unique de sang de quelques microlitres à la queue puis une semaine plus tard un prélèvement de sang terminal (grand volume), toujours sous anesthésie générale. 72 souris auront 6 prélèvements de sang à la queue espacés d'une semaine chacun. Après les 6 semaines de prélèvements, un prélèvement de sang terminal (grand volume) sera effectué, toujours sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des lignées - possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (environ 30s avant l’endormissement). -possibilité et/ou difficulté de mobilité/engourdissement au réveil des suites de l’anesthésie gazeuse, durée maximale estimée à 3min. - prélèvements de sang à la queue : possible apparition d’inflammation ou de douleur au site de coupure - Apparition de lésions cutanées ou à des surinfections au site d’injection du tamoxifène en intra-péritonéale.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort à la fin des procédures car un grand volume de sang est prélevé afin de compter et analyser différents composants du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes).
Remplacement
Les différentes étapes de la biogénèse des plaquettes sanguines ne sont pas suffisamment caractérisées chez l'humain alors qu’elles le sont dans les modèles murins. En effet, si les cellules iPS (cellules pluripotentes induites) peuvent être utilisées pour reproduire des mutations retrouvées chez l'Homme, les techniques de culture cellulaires actuelles ne leur permettent pas encore de maturer de manière suffisamment efficace pour réaliser des études approfondies de la biogénèse des plaquettes.
Réduction
Nous avons estimé la taille des groupes selon nos expériences du modèle le but étant de réduire le plus possible le nombre d’animaux utilisés tout en assurant la robustesse statistique de notre étude.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours jusqu’à la mise à mort et les observations seront consignées dans une fiche de suivi. A la moindre apparition d’un signe de souffrance, un score sera calculé et des mesures seront prises. Tous les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le laboratoire possède une expérience éprouvée de l’étude de la biogénèse des plaquettes dans les modèles murins. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubères âgés de 8 à 20 semaines maximum, tranche d’âge où il y a un intérêt à observer et analyser la biogénèse des plaquettes au stade adulte afin d’avoir des groupes représentatifs.