Système cardiaque
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Etude de la biodistribution et du clivage des activateurs tissulaires du plasminogène (tPA) recombinants
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
96 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Placées dans un cadre stéréotaxique, elles reçoivent une injection dans le cerveau, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien puis un prélèvement sanguin terminal, pour comparer deux formes d'une enzyme impliquée dans le traitement de l'AVC. Le porteur indique employer une analgésie pour limiter la douleur liée à la chirurgie et au cadre stéréotaxique. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes sans animaux "ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information" et retient la souris comme espèce la plus étudiée dans l'ischémie cérébrale.
Objectifs
Cette étude vide à comprendre l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans l’interaction sang-cerveau. Le tPA est une enzyme sécrétée par les cellules endothéliales et par les neurones. Il intervient principalement dans la fibrinolyse et la plasticité cérébrale en tant que neuromodulateur. Le tPA peut être sous 2 formes actives (monomère (sc-tPA) ou hétérodimère (tc-tPA)). Cependant, leurs rôles sont souvent confondus et peu de données physiologiques sont disponibles quant à leur proportion dans les tissus ainsi que leurs éventuels passages entre les différents tissus (sang, cerveau et liquide cephalo-spinal (LCS)). Le tPA possède également un rôle dans le traitement de patients. En effet, lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, les patients peuvent être traités par thrombolyse par injection de tPA. Or, l’activité enzymatique ainsi que l’activité neuromodulatrice ne seraient pas les même selon la forme du tPA (études in vitro). Ainsi, nous voulons développer un tPA comme outil pour pouvoir comparer ses formes afin de comprendre l'impact des formes du tPA lors de la thrombolyse.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur la forme majoritaire du tPA dans les tissus de l’organisme. Nous pourrons comprendre et analyser sa biodistribition, sa demi-vie et son passage dans les tissus.
Procédures
Une procédure chirurgicale divisée en 3 interventions: 1) Injection (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 15 minutes) 2) Prélèvement de Liquide Cérébro-Spinal (LCS) (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 10 minutes) 3) Prélèvement sanguin et Mise à mort (animaux anesthésiés + analgesie, durée de la procédure : 5 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre sont des douleurs post-injection et liées à l’utilisation du cadre stéréotaxique ainsi que le stress à la suite de l'anesthésie. Afin de limiter toute douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés.
Devenir
A l’issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 96 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 96) a été évalué par une analyse statistique.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n = 5) avec un enrichissement minimum (un rouleau cartonné + une feuille de papier essuie-tout), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h). Afin de limiter toute douleur ou inconfort occasionnée par la chirurgie, les animaux recevront une injection d'un analgésique avant le début du protocole pour prévenir toute douleur occasionnée. De plus les animaux seront thermorégulés par un système de couverture chauffante.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine pré-clinique de l’étude de molécules fibrinolytiques et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier du tPA. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Implication du canal potassique TREK1 dans les arythmies ventriculaires chez la souris mâle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
165 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent, sous anesthésie, des séances d'imagerie, une mesure de pression par une aiguille insérée jusque dans le ventricule droit, et une stimulation cardiaque destinée à déclencher des arythmies, une partie étant en plus placée trois semaines en atmosphère appauvrie en oxygène. Le porteur indique que cette stimulation peut provoquer une fibrillation ou une tachycardie ventriculaire et le décès de certains animaux, et que l'hypoxie entraîne une baisse d'activité et une perte de poids. Sur le remplacement, il affirme que l'étude chez l'animal est "essentielle" et "ne peut être remplacée", un seul patient porteur du déficit ayant été identifié.
Objectifs
Les arythmies ventriculaires, correspondant à un défaut de contraction des ventricules, est la forme d’arythmie la plus mortelle. En effet, elle représente la moitié des décès d’origine cardiaque et environ 30 % des décès totaux en France. Ces arythmies résultent principalement d’un dysfonctionnement acquis ou inné de protéines exprimées dans les cellules du cœur appelées canaux ioniques. Des arythmies provenant du ventricule droit hypertrophié/dilaté sont décrites chez les patients souffrant d’hypertension pulmonaire et notamment dans le contexte de maladies hypoxémiantes qui peuvent être liées à la pollution. A travers ce projet, nous proposons d’étudier le rôle que pourrait jouer le canal ionique TREK1 dans ces arythmies, à l’aide d’un modèle de souris dans lequel son expression a été invalidée. Sa sensibilité à l’étirement en fait une cible particulièrement attractive dans le ventricule droit étiré suite à une hypertension pulmonaire. Une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des canaux ioniques, ici TREK1, permettra de mieux appréhender le mécanisme de déclenchement des arythmies ventriculaires et d’adopter des stratégies thérapeutiques plus efficaces dans le contexte des pathologies du ventricule droit.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction contractile, l’activité électrique cardiaque mais surtout dans le déclenchement d’arythmies au niveau du ventricule droit, région du cœur dans laquelle il est fortement exprimé. Ce projet est renforcé par une approche expérimentale multi-niveaux : -Celui de l’animal (ECG/IRM/stimulation transoesophagienne), -Celui de l’organe (cartographie optique), -Celui du tissu (histologie), -Celui de la cellule cardiaque, de la cellule musculaire lisse -Celui de la protéine/de l’ARNm Ce projet permettra une meilleure compréhension du rôle du canal TREK1 et par conséquent de mieux appréhender le(s) mécanisme(s) de déclenchement des arythmies ventriculaires qui peuvent conduire à la mort subite. Des stratégies thérapeutiques visant TREK1 pourraient alors s’avérer efficaces dans le traitement d’arythmies ventriculaires chez l’Homme.
Procédures
Les souris seront soumises à deux types d’interventions non invasives sous anesthésie générale puis une mesure invasive avant euthanasie: • Examens d’imagerie par IRM non invasif (environ 1h30) • Enregistrement ECG non invasif (environ 15 min) • Mesure de pression intraventriculaire droite invasive (20 min) Ces trois expérimentations seront réalisées sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal: 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 (3 semaines). Un autre groupe d’animaux sera aussi soumis à une intervention invasive sous anesthésie générale, la stimulation cardiaque transoesophagienne (environ 15 min). Cette intervention sera réalisée sur 80 animaux répartis en 2 conditions : • Milieu normal : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1 • Milieu appauvri en oxygène : 20 souris saines et 20 souris déficitaires en TREK1. Les trois procédures seront réalisées une seule fois sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les anesthésies répétées lors des différentes procédures du projet peuvent induire des effets indésirables. Elles seront espacées au minimum de deux jours et une surveillance accrue aura lieu lors du réveil de l'animal (signes de désorientation, apathie). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux et liés aux différentes techniques utilisées sont principalement de classe modérée : • Imagerie à résonance magnétique, Electrocardiogramme et mesure de pression au niveau du ventricule droit: anesthésie générale pouvant entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. •Mesure de pression au niveau du ventricule droit : geste invasif avec une incision de la couche musculaire au niveau de l’abdomen en dessous du diaphragme et insertion d’une aiguille fine reliée à un capteur de pression à travers celui-ci jusque dans le ventricule droit. •L’hypertension pulmonaire n’induit pas de souffrances élevées chez l’homme mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. •Lors de l’exposition à l’hypoxie dans un caisson, un stress est généré aux souris se traduisant par une baisse d’activité et d’appétit dans les premiers jours (perte de poids de 5 à 10%) avant un retour à la normale. •L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation des ventricules pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin des procédures et le cœur sera prélevé pour réaliser la cartographie optique sur cœur isolé, les études histologiques ou les études électrophysiologiques et de biologie moléculaire sur cardiomyocytes isolés.
Remplacement
Il est connu que TREK1 est exprimé dans le cœur et impliqué dans une pathologie cardiaque, la tachycardie ventriculaire. A ce jour, un seul patient avec un déficit en TREK1 au niveau du cœur a été identifié empêchant l’étude du rôle de ce dernier dans l’activité électrique du cœur chez l’Homme. L’utilisation d’animaux sains et déficitaire en TREK1 est donc la seule façon de répondre à cette question et de reproduire la situation pathologique présente chez l’Homme. Cette étude chez l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Le caractère non invasif de l’électrocardiogramme et de l’imagerie à résonance magnétique permettra de réaliser d’autres expériences telles que les mesures de pression au niveau du ventricule droit mais aussi l’étude à l’échelle du cœur entier ou de la cellule cardiaque sur les mêmes animaux. Ce projet permettra d’évaluer avec fiabilité le rôle du canal TREK1 dans l’activité du cœur ainsi que dans les arythmies du ventricule droit. Dans ce projet, 160 souris sont prévues et réparties dans les 2 conditions suivantes (2 groupes avec n=80/groupe): - Normoxie: (milieu avec un taux d’oxygène normal) 40 Wild-type: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit 40 Knock-out: •20 stimulation transoesophagienne •20 imagerie à résonance magnétique / électrocardiogramme / pression ventricule droit -Hypoxie: (milieu appauvti en oxygène). Le nombre d’animaux est répartit comme la condition Normoxie. A ça s’ajoute 5 souris supplémentaires utilisées pour la formation d’un expérimentateur à la stimulation transoesophagienne au début de l’étude. Concernant la partie sur l’animal entier, 5 échecs par groupe sont considérés pour chaque protocole (imagerie à résonance magnétique, électrocardiogramme, stimulation transoesophagienne et pression ventricule droit) pour les motifs suivants : - Arrêt de l’examen pour le bien-être animal - Valeurs aberrantes des données collectées - Mort de l’animal. Concernant la partie sur cœur entier, les animaux sont divisés en 3 : imagerie sur cœur entier (15 animaux par groupe), mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées (50 animaux par groupe) et biologie moléculaire/histologie (15 animaux par groupe). De manière similaire à la partie sur l’ animal entier, des échecs (3 pour l’imagerie optique et la biologie moléculaire/histologie et 5 pour la mesure de l’activité électrique sur cellules cardiaques isolées) sont considérés pour les motifs suivants : - Ischémie du cœur isolé - Mort des cellules cardiaques après isolement - Valeurs aberrantes des données collectées. Une analyse descriptive (moyenne, percentile, écart standard de la moyenne) sera effectuée ainsi que la vérification que chaque groupe suit la loi normale (test de Shapiro-Wilk). Dans le cas attendu que les données collectées ne suivent pas la loi normale (échantillon de n
Raffinement
Les mesures de RAFFINEMENT sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adapté). Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés quand nécessaire et des points limites seront déterminés afin de réduire la souffrance et/ou d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse. L’atteinte d’un point limite entraîne une ou plusieurs des actions suivantes : • Augmentation des fréquences d’observation des animaux : mise en place d’un suivi deux fois par jour (visites, signes cliniques relevés). • En cas de perte de poids, du gel diet riche en énergie ou des pellets humides seront mis à disposition. Si l’animal est hébergé en groupe, il sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler son alimentation et son hydratation. • En cas de perte de poids continue (entre 10% et 20%), une surveillance accrue sera effectuée et les soins renforcés. En cas de perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal enregistré pour cet animal et pour une durée de 48 heures, l’animal sera mis à mort immédiatement sur décision du responsable du projet et/ou du vétérinaire désigné. • En cas de réduction de la mobilité, des pellets humides seront mis à disposition. • En cas de plaies, des soins seront administrés (désinfection avec un antiseptique, nettoyage de la plaie). • En cas de persistance du pli cutané, une réhydratation sera mise en place (injection intraperitonéale de NaCl 0.9% tiède, gel diet). L’animal sera isolé en cage individuelle afin de pouvoir contrôler sa réhydratation. Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum, une décision d’interruption d’expérimentation sera prise.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des espèces classiquement utilisées pour étudier les effets de la suppression d’un gène d’intérêt. Dans ce projet, il s’agit d’un modèle de souris n’exprimant plus le canal ionique TREK1 et qui a l’avantage d’avoir été déjà utilisé à des fins de recherche scientifique. L’activité électrique cardiaque variant en post-natal et jusqu’à l’adolescence, nous travaillerons sur des souris adultes de 15 semaines. Ce modèle de rongeurs va permettre de mettre en évidence le rôle du canal TREK1 dans la fonction du cœur mais également dans le dysfonctionnement électrique et mécanique du cœur par ECG, IRM et stimulation transoesophagienne (S.T). Les résultats obtenus dans ce projet pourront être transposés chez l’Homme et ainsi permettre le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant directement TREK1.
Etude de l’hypoxie chez un modèle de souris mutante
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur et leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix d'entre elles sont privées du gène ELK3 et dix sont des témoins sauvages, et toutes passent deux semaines dans un air appauvri à 10 % d'oxygène, ainsi que trois prises de sang à deux ou trois semaines d'intervalle et une échographie du cœur d'une vingtaine de minutes, sous anesthésie gazeuse. Le porteur dit que l'hypoxie peut entraîner "un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées", et cherche à savoir si ELK3 intervient dans la réponse au manque d'oxygène, pour traiter à terme des pathologies liées à l'hypoxie. Le prélèvement sanguin est limité à 25 % du volume sanguin total de la souris, compensé par l'injection sous la peau d'un volume équivalent de solution saline, sans que le texte précise si ce plafond vaut pour chacune des trois prises.
Objectifs
Nos cellules utilisent l'oxygène pour générer de l'énergie efficacement et, lorsqu'elles manquent soudainement d'oxygène, en cas d'hypoxie, des dommages irréversibles et rapides peuvent survenir aux organes. L'hypoxie chronique a également des conséquences, plus particulièrement dans les tumeurs, qui peuvent contribuer à des métastases et au décès. Il existe des mécanismes qui permettent aux cellules de s'adapter à l'hypoxie, dont l'élément-clé est la voie sensible à l'oxygène qui implique le facteur de transcription HIF-1. Ce mécanisme de base est une découverte fondamentale et un élément central dans la compréhension de la détection de l'oxygène dans le corps. Plusieurs composantes supplémentaires ont été découvertes plus récemment, notamment des modificateurs de la structure de l'ADN, des régulateurs des signaux de dégradation, et des facteurs impliqués dans la détection aiguë de l'oxygène. Cependant, il reste de nombreuses autres composantes qui interviennent dans le traitement des conséquences de l’hypoxie et qui restent à étudier, dont le facteur de transcription ELK3. ELK3 intervient dans des voies de signalisation conduisant à la transcription de l'ADN, et joue un rôle dans la migration cellulaire, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (l'angiogenèse) et l'intégrité vasculaire. De plus, il a été démontré qu'il joue un rôle dans la régulation des gènes sensibles à l'hypoxie, la protéine ELK3 étant elle-même dégradée dans des conditions de faible teneur en oxygène. La plupart des mécanismes de signalisation induits par l'hypoxie impliquant les deux protéines ELK3 et HIF-1 sont distincts, mais liés. On s'attend ainsi à ce que ELK3, tout comme HIF-1, soit impliqué dans l'angiogenèse, des études in vitro en culture cellulaire ayant notamment montré qu'ELK3 est préférentiellement exprimé dans les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins, mais aussi dans le mélanome. Cependant, il reste à élucider si ELK3 est impliqué dans la réponse physiologique à l'hypoxie. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier les conséquences de la perte totale d’ELK3 dans le modèle souris, dans des conditions d’hypoxie, sur la fonction cardio-vasculaire et le remodelage vasculaire pulmonaire.
Bénéfices attendus
L'hypoxie joue un rôle important dans les causes de mortalité, notamment le cancer, l'ischémie myocardique et les maladies métaboliques, du cœur et des reins, ainsi que dans les maladies de la reproduction telles que la prééclampsie et l'endométriose. Il existe de nombreuses preuves provenant de systèmes in vitro selon lesquelles un ou des facteur(s) de transcription, joue(nt) un rôle essentiel dans la réponse hypoxique. Pour utiliser ces connaissances pour comprendre et finalement traiter les pathologies liées à l’hypoxie, nous devons étudier les rôles de ces facteurs dans un modèle animal. Les expériences prévues devraient apporter une preuve convaincante de son importance physiologique dans l’hypoxie, et nous permettre d’exploiter notre boîte à outils, notamment les molécules que nous avons développées ciblant l'un de ces facteurs de transcription, pour traiter à terme les pathologies associées à l’hypoxie.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins, à 2-3 semaines d'intervalle et à une échographie (durée environ 20 minutes). Ils seront soumis par ailleurs à des conditions hypoxiques (10% oxygène) pendant 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, ainsi que l'échographie pour explorer la fonction cardiaque peuvent entrainer un léger stress ou une douleur chez les animaux. Ils seront effectués sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les souris seront exposées à des conditions hypoxiques pouvant également entrainer un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées.
Devenir
A la fin de la procedure, toutes les souris seront mises à mort pour réaliser une nécropsie et prélever des organes (coeur, poumons) en vue des analyses post-mortem
Remplacement
Le rôle de la protéine d'intérêt ELK3 dans le processus d'hypoxie a été étudié par des approches cellulaires dans notre laboratoire, mais pour analyser les effets globaux de cette protéine sur le muscle cardiaque, les vaisseaux sanguins et les poumons, le modèle souris nous semble nécessaire pour nous rapprocher au mieux de la pathologie humaine.
Réduction
Pour chacun de nos tests, nous comparerons le groupe contrôle sauvage et le groupe mutant Homozygotes ELK3. Approche statistique: grâce aux études précédentes et les données collectées sur les animaux contrôles sur plusieurs années, et en tenant compte des tests réalisés au cours de cette étude, nous savons que le nombre de 10 animaux par génotype est suffisant pour détecter des phénotypes spécifiques s’ils existent.
Raffinement
Durant toute l'étude, y compris en cages d'hypoxie, les souris sont hébergées à raison de 3 souris par cage afin d'éviter le stress lié à l'isolement et de maintenir les interactions sociales. Afin de limiter la gêne qui pourrait survenir suite à la baisse de la concentration d’oxygène celle-ci se fera progressivement (en 3 heures). L’exploration cardiaque est indolore, mais une anesthésie sera mise en oeuvre chez la souris afin d'éviter le stress lié à la manipulation, en particulier lors de l'épilation et de l'échographie. L'anesthésie facilitera en outre l'exploration en limitant les mouvements de l'animal. En cas de ralentissement du rythme cardiaque sévère lié à l'anesthésie, la procédure sera arrêtée et les animaux surveillés jusqu'au réveil dans les minutes suivant la procédure Si les animaux présentent une faiblesse trop marquée suite à l'anesthésie, une euthanasie pourra être pratiquée. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sera limité à un volume de 25% du volume sanguin total de l'animal. Pour compenser la perte de volémie, nous injecterons par voie sous-cutanée un volume équivalent de solution saline (NaCl 0.9% chauffé à 37°C) après le prélèvement sanguin.
Choix des espèces
La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette espèce ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt specifiquement. Les souris auront 10-12 semaines environ (stade adulte), où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures.
Détermination du temps de demi-vie et de l’efficacité de molécules permettant de développer une stratégie thérapeutique ciblée pour traiter la thrombose artérielle et l’AVC ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 120 en souffrance modérée. Elles reçoivent des injections et un cathéter, des prises de sang répétées et un modèle de thrombose artérielle, certaines subissant en plus une chirurgie. Le porteur indique que les souris sont tuées sous anesthésie à la fin, les lésions étant trop importantes pour envisager un réveil sans souffrance. Il teste des anticorps censés cibler le caillot, renvoie l'amélioration de la prise en charge de l'AVC au "long terme" et juge impossible de remplacer la souris par des modèles in vitro.
Objectifs
L’hémostase permet l’arrêt des saignements suite à une blessure. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui vont former un agrégat pour limiter le saignement. Ce processus peut aussi être pathologique dans une artère malade, conduisant à la formation d’un caillot dans le vaisseau, appelé thrombose artérielle. Ce caillot peut aller jusqu’à boucher le vaisseau. Ce type de pathologie peut induire un AVC ischémique par exemple. Concernant les AVC ischémiques, un des traitements consiste à injecter une molécule en intraveineux pour dissoudre le thrombus. Cependant, à cause des risques hémorragiques, cette approche doit impérativement être réalisée très rapidement après l’apparition des premiers symptômes de l’AVC, ce qui limite fortement le nombre de patients pouvant être traités. Le but de ce projet est de tester un nouveau traitement ciblé qui permettrait de limiter le risque de saignement. Il est basé sur le développement d’anticorps qui vont apporter les molécules nécessaires à la destruction du caillot, en ciblant spécifiquement celui-ci, limitant ainsi les effets indésirables. Ce projet vise à déterminer le temps que ces nouvelles molécules mettent pour être éliminées complètement du sang chez la souris. Il vise également à évaluer l’efficacité de ces molécules sur la thrombose artérielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet portent sur 2 aspects : • La cinétique de ces molécules : on déterminera le temps que ces molécules mettent pour être éliminées. Elles pourraient avoir une cinétique similaire aux molécules de référence, mais être plus efficaces ou induire moins d’effets indésirables puisqu’elles ciblent spécifiquement le thrombus. • La thrombose artérielle : on pourrait mettre en évidence une réduction de la taille du caillot dans ce modèle expérimental. L’identification de tels résultats pourraient déboucher à long terme sur une amélioration de la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle ou un AVC ischémique ainsi qu’à une réduction des impacts à long terme de ces maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections et la pose de cathéter réalisées sur animal anesthésié. Des prises de sang répétées seront effectuées (maximum 3 d’une durée de 1 minutes) et un prélèvement sanguin terminal (durée 5 minutes). Les animaux seront soumis à un modèle de thrombose artérielle. Certains modèles nécessitent des procédures chirurgicales, celles-ci seront de maximum 15 min.
Impact sur les animaux
Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Une autre est le risque de saignement au site d’injection, de pose de cathéter, de prélèvement ou au site chirurgical. Si le saignement observé dure trop longtemps la souris sera sacrifiée afin de limiter toute douleur ou inconfort.
Devenir
Pour toutes les procédures de cette saisine, les souris sont mises à mort sous anesthésie à la fin de la procédure du fait des lésions qui sont trop importantes. Les souris seraient en souffrance si nous devions les réveiller.
Remplacement
Le but de ce projet est de tester un nouveau traitement ciblé basé sur le développement d’anticorps anti-fibrine couplés : i) à l’hirudine, connue pour inhiber les plaquettes et la synthèse de fibrine; ou ii) à l’activateur de fibrinolyse, permettant la destruction du thrombus. L’utilisation d’un anticorps anti-fibrine permet ici de cibler l’action de ces molécules spécifiquement au lieu de la thrombose, la fibrine étant produite uniquement dans le thrombus. La pathologie étudiée étant un processus particulièrement complexe, il est impossible de substituer la souris par des modèles in vitro.
Réduction
Un des modèles (prise de sang au niveau des jugulaires) a été spécifiquement pensé pour diminuer le nombre d’animaux utilisés puisque plusieurs prises de sang à des temps différents sont possibles pour un même animal. De plus, nous ferons les procédures expérimentales de prise de sang par étape, pour déterminer s’il est nécessaire ou pas de passer à l’étape suivante. Pour évaluer l’efficacité de la molécule dans la thrombose artérielle, le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison des résultats obtenus entre les différents groupes d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures expérimentales. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’administration d’un anti-douleur pendant chaque procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal facilement disponible et les modèles d’études in vivo y sont largement répandus et maitrisés. La souris est un modèle couramment utilisé pour évaluer la formation de thrombus. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Rôle des plaquettes sanguines dans le développement anormal de tissu, la fibrose, lors de la pathologie rénale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie abdominale avec ligature de l'uretère ou l'injection d'un composé, puis des prélèvements de sang et d'urine avant d'être tuées à sept ou vingt et un jours pour analyser les reins. Le porteur signale une douleur possible à la cicatrice et une perte de poids, et prévoit un analgésique si la douleur est avérée. Sur le remplacement, il affirme que la fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro et qu'il est "nécessaire" de travailler sur un animal vivant.
Objectifs
Un développement anormal de tissu, ou fibrose, dans le rein est fréquent dans de nombreuses pathologies rénales. Le rôle des plaquettes sanguines dans ce processus a été montré dans différents modèles mais dépend des tissus et des lésions. Ainsi, nous avons découvert un rôle critique de deux facteurs plaquettaires dans des pathologies présentant une fibrose dans le poumon et dans le coeur. Cependant, rien n'a été étudié dans le rein. Notre objectif est donc d'étudier le rôle de ces deux facteurs plaquettaires dans le développement de la fibrose rénale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'étudier l'implication de deux protéines plaquettaires sur le développement de la fibrose rénale et ses conséquences sur le fonctionnement du rein. Il permettra de définir si cibler ces protéines pourrait être pertinent en thérapeutique chez l'homme.
Procédures
Deux modèles seront utilisés. Dans le premier, les animaux subiront une chirurgie (incision abdominale) qui permet la ligature de l'uretère, d'une durée totale de 30 minutes environ, sous anesthésie et analgésie. Dans le deuxième modèle, une injection d'un composé est réalisé en une fois au niveau de l'abdomen (voie intraperitoneale) et dure moins d'une minute. Dans les deux modèles, les animaux auront un à deux prélèvements sanguins intraveineux sous anesthésie et pour le deuxième modèle, deux prelèvements d'urine, émise spontanément en pressant la vessie pour évaluer la fonction rénale. A la fin des procédures, après 7 et 21 jours ,un prélèvement de sang intraveineux sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale, l'urine sera prélevée directement dans la vessie et les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines, et un gonflement du ventre (oedeme rénal) modéré peut apparaitre avec le temps. La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation au niveau de la cicatrice qui seront cependant attenués par les analgésiques. Les animaux sont également anesthésiés une à deux fois pour le prélèvement sanguin qui peut générer une douleur modérée. Ils peuvent également perdre du poids au cours des procédures et être moins actifs.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour pouvoir analyser les reins.
Remplacement
La fibrose rénale ne peut pas être modélisée in vitro en raison de la complexité des mécanismes mis en jeu. Il est donc nécessaire de travailler sur un modèle animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score et l'évaluation de la fonction rénale. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. La chirurgie et les prélèvements sanguins seront effectuées sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, les modèles utilisés sont bien établis chez la souris adulte. Les souris de 8-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier les facteurs plaquettaires impliqués, avec de surcroit la disponibilité de souris génétiquement modifiées pour les facteurs plaquettaires étudiés.
Méthotrexate pour le traitement de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
21 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. L'arthropathie est provoquée par trois ponctions du genou, puis les souris reçoivent des traitements pendant six semaines, subissent une IRM des genoux de deux heures sous anesthésie et des prises de sang, avant d'être tuées et disséquées. Le porteur justifie la mise à mort par un prélèvement d'un millilitre de sang "non compatible avec le maintien en vie". Il fonde le recours à l'animal sur le "besoin d'un modèle vivant" et présente la souris comme un modèle "éprouvé et fiable".
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX) et dont la sévérité est définie par la quantité de FIX restant dans le sang. La forme la plus sévère, où le taux de FIX est in détectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Ces saignements spontanés peuvent se répétés au niveau des articulations et conduire à la présence de sang dans le liquide articulaire, induisant une inflammation et une dégradation de l’articulation qui est handicapante pour le patient. Cette atteinte répétée porte le nom d’arthropathie hémophilique (AH) et est une complication grave de la maladie. L'AH partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) dont une inflammation importante au stade précoce de la maladie. A ce jour, le traitement de l’hémophilie comprend des injections de facteur manquant pour éviter tous saignements donc ceux responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire qui apparait au stade précoce de l’AH. Dans le cadre du traitement de la PR, le méthotrexate est largement utilisé en tant que médicament de première intention. Le méthotrexate est un médicament visant à contrôler l’inflammation qui à montrer 34% de rémission et 50% d’amélioration de la PR dans des études conduites chez des patients atteints de PR. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de l’articulation chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la PR. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité du méthotrexate pour traiter l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B. l'étude s'effectue dans deux animalerie distincxtes avec : l'induction de la maladie et le traitement qui se font à l'UE1 (animalerie 1) et l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qui se font à l'UE2 (animalerie 2).
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique. le méthotrexate est un médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montre une efficacité suffisante du méthtrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Au sein de l'UE1 Au sein de l'UE1, l’arthropathie hémophilique est induite chez des souris hémophiles B par 3 ponctions articulaire (J1, J15 et J30) avec une surveillance et mesure du diamètre du genou les 15 premiers jours. Par la suite, le premier groupe reçois un traitement anti-hémophilique de référence tous les 4 jours et ce durant 6 semaines. Le deuxième groupe reçois également le traitement anti-hémophilique de référence (même durée et fréquence) mais également un traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde une fois par semaine. Une prise de sang est réalisée à J0, J15 et J30 pour surveiller la possible toxicité du traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde. Après 6 semaines de traitement, les souris sont transférées à l'EU2 où elles bénéficieront d’une IRM des genoux pour évaluer l’atteinte articulaire. Ensuite, une prise de sang sera réalisée pour la mesure des marqueurs inflammatoires ainsi que les marqueurs d’atteinte cartilagineuse et osseuse. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale après administration d’un médicament anti-douleur. Les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min) (UE1), une prise de sang (1 min) (UE1), la mesure du genou (30 sec) (UE1), une injection seule ou double (1-2 min)(UE1), une IRM du genou (120 min)(UE2), un prélèvement total de sang et mise à mise à mort (3-5 min)(UE2).
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments anti-hémophiliques et d’étudier l’arthropathie hémophilique. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins analogues à nos facteurs anti-hémophiliques est un prérequis pour l’induction de l’hémarthrose et pour la mesure de l’activité des molécules prophylactiques testées. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette altération génétique, n’est pas victime de saignement spontané et tout saignement provoqué sur la souris hémophile est résolutif sans prise en charge particulière. Souris matures (8-9 semaines) de 25-30g. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car les cartilages sont en cours de maturation durant la croissance et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible des taux de certains facteurs de coagulation avec l’âge, comme le fibrinogène, facteur Willebrand et le FVIII qui peuvent modifier la capacité hémostatique globale du modèle et par conséquent la tendance hémorragique.
Rôle de l’inflammation dans l’obtention d’un modèle animal pertinent du Moyamoya, une maladie vasculaire cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 087 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Porteuses de mutations liées à la maladie de Moyamoya, elles reçoivent dès l'âge de huit jours, sur animal vigile, des injections mimant une infection, puis des prélèvements sanguins avant mise à mort et prélèvement des organes. Le porteur décrit un stress de séparation, une douleur transitoire et des tremblements possibles si la maladie se développe, et ajoute vingt souris pour la formation de deux expérimentatrices. Il cherche à obtenir le premier modèle animal de cette maladie et juge l'étude "envisageable qu'in vivo".
Objectifs
L’angiopathie de Moyamoya (MMA) est une maladie rare des vaisseaux du cerveau. Cette maladie se définie par : 1/une diminution progressive du diamètre des gros vaisseaux qui apportent le sang au cerveau (artères localisées à la base du cerveau) qui peut atteindre l’occlusion et qui provoque un manque d’oxygène dans le cerveau, 2/la présence d’un réseau de petits vaisseaux fins et anormaux à la base du cerveau, qui se sont probablement formés pour compenser le manque d’oxygène cérébral entrainé par l’occlusion des artères cérébrales atteintes d’anomalie de MMA. Les patients MMA peuvent avoir des accidents vasculaires cérébraux. Les mécanismes de développement de la maladie sont encore largement inconnus aujourd’hui et aucun modèle animal n’existe. Une vingtaine de gènes ont déjà été identifiés comme responsables du MMA chez l’homme. En parallèle de ces données génétiques, de récentes études suggèrent qu’une infection virale ou bactérienne pourrait être un élément déclencheur du MMA chez les patients. Pour avancer dans la compréhension des mécanismes responsables du développement du MMA, l’obtention d’un modèle animal est cruciale aujourd’hui. L’objectif de ce projet est d’obtenir un modèle de MMA chez des souris qui porteront des mutations dans deux gènes déjà identifiés chez des patients MMA. Une infection bactérienne ou virale sera mimée (pour provoquer une inflammation) chez ces souris mutées pour comprendre si cela déclenche ou non le développement du MMA comme suggéré dans les études cliniques chez l’homme. Ce projet propose de caractériser les vaisseaux cérébraux chez ces souris mutées et soumises à une inflammation à la recherche d'une anomalie des vaisseaux du cerveau qui ressemblerait à celle qui se développe chez les patients atteints de MMA. La définition de ce qui serait alors le premier modèle animal de MMA permettrait de faire avancer la compréhension des mécanismes responsables du développement de cette maladie et d’envisager de nouvelles approches pour stopper l’évolution de la maladie chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les mécanismes responsables du développement de la maladie sont largement inconnus aujourd’hui. Il n’existe aucun modèle animal de MMA. L’obtention d’un modèle de MMA chez la souris permettrait : 1-d’étudier comment se développent des lésions MMA au niveau des vaisseaux du cerveau en suivant leur évolution au cours du temps et 2-de mieux comprendre les mécanismes responsables du développement de la maladie. Il est par exemple important de comprendre si l’inflammation provoquée par une infection virale ou bactérienne peut déclencher la maladie. A plus long terme, comprendre comment se développent les lésions des artères du cerveau chez les patients MMA permettra d’envisager des approches médicamenteuses pour limiter voire stopper le développement de la maladie chez les patients.
Procédures
L’ensemble des animaux du projet sera soumis à deux injections en intra-péritonéale (c’est-à-dire dans la cavité abdominale) d’un composant mimant une infection virale ou bactérienne à 8 jours et 15 jours de vie. L’injection est rapide (30 secondes/souriceau) et réalisée sur animal vigile (c’est-à-dire conscient, en éveil) et sans anesthésie. Les animaux analysés au 15ème jour après la naissance seront euthanasiés et le sang et les organes seront prélevés en post-mortem. Les autres animaux seront analysés à 1, 2, 4 et 6 mois. Un à 3 prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés entre l’âge de 1 et 6 mois, au niveau de la veine faciale (manipulation totale d’1 min/animal). A la fin de l’expérimentation, l’ensemble des animaux sera soumis à une analgésie et à une anesthésie générale. Un petit groupe de souris recevra une injection dans le sinus veineux situé à côté de l’œil, d’un marqueur fluorescent de l’intérieur des vaisseaux après l’anesthésie. Puis, une surdose d’anesthésie sera administrée. Le sang sera récupéré dans la cage thoracique avant de débuter une perfusion intracardiaque de liquide pour éliminer le sang contenu dans les vaisseaux. Les organes seront prélevés post-mortem.
Impact sur les animaux
La séparation des petits de leur mère au 8ème et au 15ème jour après la naissance pour procéder à leur injection peut entrainer un stress transitoire. Les injections réalisées chez ces souriceaux peuvent causer une douleur transitoire et locale. L’inflammation induite peut entraîner une déshydratation transitoire des petits. Si la maladie de moyamoya se développe, les animaux atteints pourraient présenter des tremblements.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort à l’issu de la procédure, soit au maximum 1067 animaux. 20 animaux supplémentaires ont été ajoutés pour permettre la formation de deux expérimentatrices au prélèvement sanguins en sous-mandibulaire. Ces 20 animaux seront euthanasiés à l’issu de la réalisation du prélèvement sanguin.
Remplacement
Ce projet consiste à étudier les liens potentiels existants entre la présence de mutations dans certains gènes, l’inflammation et le développement de la maladie cérébro-vasculaire de MMA. Il requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet possédant à la fois un système immunitaire et des vaisseaux sanguins dans le cerveau dans un environnement physiologique normal. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux total nécessaire a été prévu pour être limité au maximum. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs statistiques appelés tests de puissance, issus des résultats déjà connus d’études précédentes. Deux petits d’intérêt seront obtenus par portée et les autres petits des mêmes portées seront tous considérés comme des animaux contrôles. Afin de pallier l’éventuelle mortalité induite par le protocole d’inflammation chez le souriceau, 10% d’animaux supplémentaires sont ajoutés par groupe. Ce taux ne sera sans doute pas atteint dans ce projet puisque le protocole d’induction d’inflammation est plus modéré et réalisé à un stade de développement plus tardif que ceux utilisés pour calculés ces 10% dans des travaux déjà publiés. La caractérisation des vaisseaux cérébraux et rétiniens sera réalisée en priorité dans les groupes de 1 mois et 6 mois. Si aucune anomalie vasculaire n’est observée à 6 mois, les autres groupes ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les mères gestantes sont isolées avant la mise-bas, des mouchoirs en papier sont mis à leur disposition pour la confection du nid. Avant chaque manipulation des petits, la mère est isolée dans une cage le temps strictement nécessaire à la procédure. Les gants des expérimentateurs sont passés dans la litière sale pour atténuer leur odeur avant la manipulation des petits. Le nid confectionné par la mère n’est pas détruit, les petits sont manipulés un par un sont tous redéposés dans le nid avant réintroduction de la mère. Le sevrage est effectué après 21 jours de vie, avec un maximum de 6 animaux du même sexe par cage. L’identification des animaux d’intérêt et des animaux contrôles se fait par la technique de génotypage (technique permettant de déterminer la présence ou l’absence de mutations dans les gènes étudiés) réalisée sur des poils prélevés au moment du sevrage des animaux. L’enrichissement de chaque cage est systématique avec du papier absorbant et la présence de petites maisons. Tous les animaux concernés par les procédures sont observés quotidiennement. Ils feront également l’objet d’un examen détaillé hebdomadaire par une personne responsable du projet. L’aspect général (qualité du pelage, absence de larmoiements des yeux, gonflement de l’abdomen), le comportement de l’animal (déplacement, prostration, agressivité) et le poids seront analysés pour déceler précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (suivi définit en fonction de l’âge). En cas de signes de souffrance décelés, un traitement antalgique sera administré. Dans le cas d’une persistance au-delà de 2 jours, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Choix des espèces
Les vaisseaux du cerveau chez la souris sont très proches de ceux trouvés dans le cerveau humain. Par ailleurs, différentes lignées de souris mutées dans l’un des gènes responsables du moyamoya chez l’homme sont disponibles. Les animaux seront utilisés à différents âges au 8ème et 15ème jours de vie (pour correspondre au moment de la naissance et au jeune enfant chez l’homme) pour l’induction et la caractérisation de l’inflammation et à 1, 2, 4 et 6 mois pour la caractérisation des vaisseaux cérébraux/rétiniens pour pouvoir suivre le développement au cours du temps des anomalies vasculaires. Les groupes 1 mois et 6 mois seront réalisés en premier. En l’absence d’anomalie des vaisseaux ressemblant aux anomalies vasculaires des patients Moyamoya les autres points ne seront pas réalisés.
Un nouvel outil pour la thrombolyse ciblée de l’AVC ischémique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
459 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Elles subissent une chirurgie d'induction d'un accident vasculaire cérébral ischémique, une pose de cathéter et une perfusion de traitement, avec pour une partie une IRM. Le porteur décrit des douleurs postopératoires, une perte de poids et des déficits fonctionnels liés à l'ischémie, et juge qu'il n'est pas éthique de garder ou réutiliser ces animaux, dont les tissus alimentent une biobanque. Il cherche à tester des microbulles censées cibler le caillot et affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer l'étude in vivo de l'ischémie.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (r-tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (< 10%) peut être traitée, du fait des effets secondaires de l’injection de r-tPA (risques d’hémorragie cérébrale et de mort neuronale excitotoxique) et de la relative difficulté d’accès à la thrombectomie. L’investissement de la recherche et la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques semblent indispensables, dans ce cadre où l’AVC représente un enjeu de santé publique avec de forts impacts au niveau des populations, et où trop peu de patients ont accès à un traitement. Lors de la thrombolyse intraveineuse, une dose élevée de r-tPA est injectée dans toute la circulation générale afin de pouvoir thrombolyser le caillot lors de son passage au niveau de l'artère occlue. L'objectif de ce projet est de tester et caractériser différentes techniques de thrombolyse et de mettre en évidence leurs avantages et leurs inconvénients. Ce projet s’axera aussi surtout autour d’un outil prometteur de thrombolyse ciblée associé ou non à une sonothrombolyse (thrombolyse par ultrasons). L’outil de thrombolyse ciblé se présente sous la forme de microbulles de fucoïdane, ayant la particularité d’avoir une affinité naturelle pour la P-sélectine, une protéine d’adhésion exprimée lors d’un processus inflammatoire, comme un AVC. Ces microbulles une fois injectées se fixeraient au niveau du caillot où la cascade d’inflammation se déroule. En les chargeant de r-tPA, il serait alors possible d’acheminer directement le traitement au niveau du caillot, et donc de diviser la quantité totale injectée par 10 (vu in vitro). Cette réduction de la dose administrée permettrait de réduire le risque de survenue d’effets secondaires, afin d’élargir la fenêtre thérapeutique. Les bulles peuvent être éclatées à distance par des ondes ultrasonores, ce qui permettrait possiblement de libérer le r-tPA autour du caillot, et d’aider à la thrombolyse. Elles sont également fluorescentes ce qui permet de suivre leur parcours dans la circulation ainsi que leur recapture par les différents organes en charge de les éliminer.
Bénéfices attendus
L'objectif du projet étant de proposer une nouvelle modalité de traitement thrombolytique ciblé, les bénéfices seraient de pouvoir réduire la dose de r-tPA actuellement administrée en clinique, et d'ainsi réduire le risque de survenue des effets secondaires (transformation hémorragique et mort neuronale excitotoxique) directement liés au r-tPA, et ainsi élargir la fenêtre thérapeutique, ce qui permettrait l'accès à la thrombolyse intraveineuse à plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie comprenant une pose de cathéter (5 minutes) et une induction d'ischémie (20 minutes), à une infusion de traitement par voie intraveineuse (40 minutes), et pour certains à une acquisition en IRM avec ou sans injection intraveineuse d'agent de contraste (8 à 20 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraients : Des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'induction de l'ischémie ou à la craniotomie, une perte de masse corporelle après l'anesthésie et l'induction de l'ischémie, des déficits fonctionnels à la suite de l'ischémie, une gêne ou une douleur occasionnée par l'injection du traitement (changement de volémie, réaction au traitement), perte de l'intégrité de la Barrière Hémato Encaphalique (BHE) et donc hémorragie liée à la sonothrombolyse, une gêne liée au site d'insertion du cathéter après le réveil.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure. Cependant, un degré de sévérité a été fixé pour les procédures 1 à 16, car les animaux seront réveillés en cours de procédure (entre la chirurgie et l'imagerie). Même si l'on observe une bonne récupération chez les souris après l'induction d'une ischémie, et que chaque douleur potentielle est prise en charge avant même sa survenue, il n'est pas jugé éthique de replacer ou faire adopter ces animaux, pour leur bien-être. La réutilisation dans d'autres procédures n'est également pas souhaitée, car ces animaux auront déjà subit une ischémie avant la mise à mort. Enfin, les tissus de chaque animal seront prélevés post-mortem afin d'alimenter une biobanque, et pourront être réutiliser pour des études ultérieure. Cela permet de respecter le principe de réduction et de raffinement des 3R.
Remplacement
Dans ce projet, il n'est pas possible de remplacer le modèle animal. Il s'agit d'étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés survenant lors d'une ischémie. Les effets des molécules pharmacologiques sur l'ischémie et sur la lésion associée, ainsi que leur parcours in situ ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé en reprenant les données antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques sur les souris, et ayant montré des effets significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire, dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. En prenant en compte les paramètres physiopathologiques attendus sur la base d'études antérieures et pour un seuil de significativité à 95% et une puissance de 80% (beta = 20%), 31 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe, d'autant plus que le nombre de groupes étant élevé, il est nécessaire d'avoir suffisamment d'animaux dans chaque groupe pour espérer voir un effet.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. La grégarité sera respectée en plaçant les souris par groupe de 5 dans des cages enrichies (maisonette, coton, craft, briquette de bois à ronger), avec de l'eau et de la nourriture ad libitum. Durant l'induction de l'ischémie, les souris seront sous anesthésie générale couplée à une analgésie, et sous anesthésie locale, adaptées à l'espèce et à l'intervention réalisée . Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux de la souris durant chaque anesthésie générale afin d'éviter le dessèchement oculaire et la cécité. La température corporelle des souris sera assurée durant chaque anesthésie générale par un tapis chauffant rétrocontrôlé par sonde rectale, et les règles d'aseptie et d'antisepsie durant les chirurgies seront respectées. Après la chirurgie d'induction de l'ischémie, les souris disposeront de croquettes humides en purée dans une coupelle au sol afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort en accord avec la réglementation dans les 24 heures suivant l'observation d'un ou de plusieurs des points limites prévus. Si des signes de douleur modérées sont observés, un rappel d'analgésique adapté sera réalisée dépassé 6h de chirurgie. Avant ce délai, il sera observé si les souris s'alimentent et s'abreuvent correctement, et pourront être re placée en enceinte chauffante à 32°C si prostration.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l'espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L'ensemble des connaissances et des acquis à disposition au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce pertinente pour étudier l'efficacité d'un nouveau traitement dans le cadre de la recherche sur l'AVC ischémique. L'étude se déroulera sur une souche de souris (Swiss), qui est peu coûteuse et dont la maintenance et la manipulation est simple. Les souris utilisées seront de jeunes adultes entre 5 et 8 semaines (5 semaines lors de l'arrivée dans l'animalerie, et 8 semaines lors de la fin du protocole). Le projet est réalisé avec de jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d'ischémie. De plus, l'étude du développement ou du vieillissement n'est pas l'objet de ce projet.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 2/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère. Elles subissent des ponctions du genou provoquant des saignements articulaires répétés, des injections, une IRM de deux heures et des prises de sang, avant dissection des pattes arrière. Le porteur décrit comme seule nuisance une gêne locomotrice et applique un point limite de perte de poids de 20 %. Il vise à étudier le rôle d'une protéine dans la destruction articulaire et justifie le recours à l'animal par le "besoin d'un modèle vivant, dynamique et doté d'un système vasculaire et locomoteur".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car des prélèvements terminaux pour analyses histologiques et immunohistochimies sont prévus.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Evaluation de la biodisponibilité de la curcumine et de ses métabolites à partir de différentes formulations chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage une dose unique de curcumine sous différentes formulations, puis subissent cinq prélèvements sanguins en six heures sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs organes. L'objectif déclaré est de sélectionner la formulation la plus efficace pour un complément alimentaire, dans un projet lié à un partenaire industriel et couvert par une "clause de confidentialité". Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier la biodisponibilité et fixe les groupes à trois rats.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’évaluer à partir de diverses formulations (procédés et compositions soumises à une clause de confidentialité), la biodisponibilité en molécules d’intérêts à savoir la curcumine et ses métabolites. Ces évaluations, selon les diverses formes galéniques, permettront de déterminer la meilleure formulation pour une supplémentation alimentaire en curcumine avant le passage en phase de test clinique.
Bénéfices attendus
L’évaluation de la biodisponibilité en curcumine et de ses métabolites suite au traitement oral de différentes formulations, permettra de déterminer la formulation qui pourrait être la plus efficace afin de rendre la curcumine et/ou ses métabolites biodisponibles. Cette sélection permettra ensuite à travers une étude pré-clinique puis une phase clinique d’évaluer les effets physiologiques et cellulaires de la supplémentation en curcumine.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure aigue, les rats recevront un traitement par voie orale (gavage) une dose unique des différentes formulations de curcumine ou de l’eau à l’aide d’une aiguille de gavage métallique spécifique. Un prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera effectué à T = 0 minutes (avant le traitement oral) puis à 30 minutes, 1 heure, 2 heures et 6 heures après le traitement oral. Afin de limiter le stress des animaux, les prélèvements seront effectués sous anesthésie gazeuse courte (≈ 5 minutes). Les prélèvement sont effectués à l’aide d’un cathéter placé de manière au niveau de la veine caudale. Au cours de cette procédure, la température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant . A la fin de chaque prélèvement, le cathéter est retiré et un point de compression est réalisé afin de stopper l’écoulement sanguin, puis les animaux seront replacés dans une cage individuel entre chaque prélèvement et seront surveillés.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peuvent être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Les prélèvements de sang répétés sur une période de 6 heures peuvent également être une source de stress et douleurs modérées. Néanmoins, toutes ces procédures seront réalisées par des personnels expérimentés. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. Par ailleurs, les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie légère à l’Isoflurane complété par une anesthésie locale à la lidocaine (crème) du site de prélèvement.
Devenir
Tous les animaux (n=24) seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro permettant l’étude de la biodisponibilité de différentes formulations d’un même composé. En effet, les mécanismes de digestion, d’absorption et de métabolisation sont complexes et aucune méthode ne permet de les remplacer de manière exhaustive. Il convient donc d’étudier in vivo la biodisponibilité de la curcumine et de ses métabolites à partir de différentes formulations.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe (3) a été défini en accord avec le partenaire industriel comme le nombre minimum afin d’évaluer la biodisponibilité tout en s’assurant de la répétabilité des résultats et de mettre en évidence des différences statistiques significatives sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 10 jours après leur arrivé et avant toute procédure. Les rats sont hébergés en cage de 3 individus afin de maintenir le caractère social de l’espèce. Les cages seront enrichies avec des tubes, coton et bâtons à ronger. Ils seront hébergés en animalerie dans des conditions standards d'animalerie avec un accès ad libitum à de la nourriture standard et à de l’eau. Les rats seront également suivis quotidiennement par un personnel formé contrôlant le bien-être des animaux. Au cours de la procédure expérimentale, le bien-être des animaux sera évalué par un personnel formé à l’aide d’une fiche intégrant les différents points limites. Au cours de l’’anesthésie, la température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant.
Choix des espèces
Le rat est un modèle pertinent afin d’étudier les mécanismes de digestion/absorption et métabolisation de molécules car sa son système digestion et sa physiologie présentent de grandes similitudes comparées à ceux de l’Homme. De plus, les prélèvements sanguins permettent d’obtenir des volumes suffisants afin de réaliser les dosages des différentes molécules d’intérêts (curcumine et métabolites) et sont facilement réalisable chez le rat.
Impact des polluants organiques persistants et de la signalisation AHR sur la fonction cardiaque dans un modèle prédisposé aux cardiomyopathies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
224 rats prédisposés au syndrome métabolique vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage de la dioxine TCDD, un polluant reconnu cancérigène, sont soumis à un test d'effort sur tapis roulant avec choc électrique et à des imageries, avant une intervention cardiaque terminale qui les tue tous. L'objectif est de voir si une exposition chronique à faible dose aggrave le dysfonctionnement cardiaque. Le porteur affirme que les cultures et modèles ex vivo sont "inadéquats" et que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité".
Objectifs
L'exposition aux polluants organiques persistants (POP) est un problème majeur de santé publique (OMS 2019), notamment en tant que facteur de risque de maladies cardiovasculaires. Les dioxines, et en particulier la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sont parmi les POP les plus toxiques et persistants qui sont rejetés dans les écosystèmes en tant que sous-produits de divers processus de combustion et industriels. Malgré des politiques restrictives de réduction des émissions de POP les populations humaines continuent d'être chroniquement exposées aux dioxines car elles persistent des centaines d'années dans les sols et les sédiments, contaminant ainsi la chaîne alimentaire. Les dioxines sont lipophiles, s'accumulent dans les tissus adipeux et persistent pendant de nombreuses années dans l'organisme. L'exposition aux POP a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques et de décès. Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition subchronique à une forte concentration de TCDD induit une légère hypertrophie cardiaque et une hypertension. Cependant, il est encore inconnu si l'exposition chronique et à faible dose de TCDD exacerbe le dysfonctionnement cardiaque chez l'Homme et les modèles animaux prédisposés aux cardiomyopathies, ainsi que les mécanismes sous-jacent à la cardiotoxicité induite par la TCDD. Ainsi, les objectifs de notre projet sont : 1) de déterminer si la toxicité cardiovasculaire d'une exposition chronique et une faible dose de TCDD est exacerbée dans un modèle murin prédisposé aux cardiomyopathies, 2) d'identifier les voies moléculaires affectées par l'exposition chronique à la TCDD, avec un accent particulier sur Aryl Hydrocarbon Receptor, dont l’activité est modulée par le TCDD et 3) de tester les effets d’antagonistes synthétiques de l'AHR sur les effets cardiotoxiques de la TCDD.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à ce que les résultats de ce travail permettent de démontrer puis de déterminer le rôle du récepteur AHR dans les dysfonctions cardiaques et vasculaires et endothéliale lors d’une intoxication par la dioxine. Ceci permettra ainsi de nouvelles opportunités pour le développement d’approches thérapeutiques ciblées.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 manipulations interventionnelles de classe légère non invasives : - exposition par gavage à la TCDD et à l'antagoniste des récepteurs AHR pour une durée d'environ une minute par animal par semaine - echocardiographie environ 20 minutes par animal - IRM environ 45 minutes par animal - mesure de pression à la queue environ 10 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 2 manipulations expérimentales de classe modérée : la capacité d'exercice environ 15 minutes par animal, et l'évaluation de la fonction rénale environ 3h par animal. Enfin les animaux seront soumis à une manipulatiob expérimentale de classe sans réveil d'une durée d'environ 20 minutes par animal. Les prélèvements (coeur, reins et aorte) se feront après la mise à mort de l'animal.
Impact sur les animaux
Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition à une très forte concentration de TCDD a des effets cancérigènes notamment au niveau hépatique après plusieurs semaines d'exposition. Nous nous attendons également à retrouver un effet délétère au niveau cardiovasculaire après plusieurs semaines d'exposition. Pour la MANIP 1, qui correspond à l'administration de la TCDD par gavage, aucun effet indésirable ou nuisance ne sont attendus. Pour les MANIP 2, 3 et 4 (echocardiographie, IRM et mesure de pression à la queue), la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à une table chauffante. Les animaux retrouveront conscience sur la plaque chauffante et seront ensuite replacés dans leurs cages. Pour la MANIP 5 (évaluation de la capacité d'exercice), lorsque le degré de fatigue est atteint et/ou que l'animal a des difficultés à rester sur le tapis roulant (indépendamment de la délivrance du choc électrique), l'animal sera retiré du tapis de course et le temps de course sera enregistré à la seconde près. Les rats seront habitués à cette mesure en la subissant une fois par jour pendant 3 jours consécutifs avant les mesures d’effort de base.
Devenir
Tous les animaux resteront en vie à l'issue de chaque manipulations expérimentales, excépté pour l'évaluation de l'hémodynamique intracardiaque qui sera une intervention terminale entrainant la mise à mort de tous les animaux à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier, dans le contexte pathologique du syndrome métabolique, les effets cardiovasculaires et rénaux d’une exposition à la dioxine et/ou de l’antagoniste du récepteur AHR dans des conditions de physiopathologies intégrées, autrement dit, chez des rats représentant les caractéristiques observées chez l’Homme : une hypertension artérielle, une insuffisance rénale et un diabète. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Sur la base des données historiques depuis 30 ans obtenues avec des agents pharmacologiques chez des rats atteints d'insuffisance cardiaque chronique sur le remodelage cardiaque et l'hémodynamique, nous avons effectué une simulation satistique pour chaque paramètre obtenu chez les animaux non traités. Sur ces bases nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire est de 224 rats.
Raffinement
Après leur arrivée dans l’animalerie, les rats resteront une semaine en période d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les rats seront hébergés pour groupe de 3 par cage afin de permettre des interactions avec leurs congénères. Le milieu de la cage sera également enrichi de carton pour leur permettre de réaliser des nids. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Différents paramètres seront évalués incluant le comportement (mobilité, activité normales et toilettage) ainsi que l’état physique (état de la peau, de la fourrure et des yeux, vitesse et profondeur de la respiration). Leur prise de poids sera également notée régulièrement. En présence de signes de souffrance légère une administration de buprénorphine 0,03 mg/kg par voie sous cutanée pourra être réalisée. En présence de signes de souffrance sévère ou de détresse constituant un point limite (perte de poids > 10%, paupières fermées, léthargie, comportement de retrait, vocalisations, température corporelle diminuée > 5ᵒC), l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
L'exposition aux TCDD a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques. Les rats Zucker fa/fa seront donc un modèle idéal pour évaluer les effets de la TCDD sur des individus prédisposés aux cardiomyopathies. Les rats Zucker fa/fa ou Lean (contrôle) utilisés seront des rats matures de 12 semaines ayant au moment de l'inclusion dans l’étude un syndrome métabolique. Ils auront 24 semaines au moment de leur mise à mort. La durée du protocole impliquera soit 3 soit 12 semaines d’exposition à la TCDD avec ou sans antagoniste du récepteur AHR pour pouvoir observer l’impact de la TCDD sur le système cardiovasculaire. Le choix du rat et son âge se justifie par l’expérience du laboratoire obtenue avec les différents modèles de syndrome métabolique au cours des derniers 15 années, utilisés pour évaluer les effets cardiovasculaires des nouveaux traitements pharmacologiques en collaborations avec des industries pharmaceutiques.