Système cardiaque

272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ischémie cérébrale provoquée, une injection dans le cerveau, la pose d'un cathéter, des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés à la queue, une hyperglycémie étant induite par injections de streptozotocine, pour étudier le rôle de certaines cellules dans les hémorragies cérébrales après un AVC. Le porteur mentionne un déficit moteur ou cognitif possible et un test comportemental dont il ne précise pas la nature. Les retombées pour les patients sont renvoyées à un horizon lointain, et le porteur affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information.

Objectifs

Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Une hyperglycémie est présente chez environ 28 à 40 % des patients souffrant d'un AVC. Le plus souvent, cette hyperglycémie est la cause d'un diabète pré-existant chez le patient. Or, l'hyperglycémie augmente le risque de HT ce qui est associé à une aggravation de l'issue de l'AVC et une augmentation de la mortalité. En effet, l'hyperglycémie potentialise l'inflammation, et entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et donc une augmentation des HT. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié et d'autant plus dans des conditions avec comorbidité. Ce projet vise donc à caractériser le rôle des PVM dans la physiopathologie des HT en présence d'un facteur de comorbidité qu'est l'hyperglycémie. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT et pourraient être affectés par l'hyperglycémie. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs rôles.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques, et notamment dans un contexte de comorbidité, permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prises en charge des patients victimes d'un AVC.

Procédures

#Procédure 1 et 2 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale et pose d'un cathéter veineux (40min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et à J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16, J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17 , J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min). #Procédure 3 et 4 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle de transformation hémorragiques (35min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (11 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16 , J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17, J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min).

Impact sur les animaux

Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont du stress lié à la contention (test fonctionnel, prélèvements sanguins), l'induction et le maintient de l'anesthésie (imagerie IRM, procédures chirurgicales). Des douleurs eventuelles liées à la chirugie (pose de cathéter, injection intracérébroventriculaire, ischémie thromboembolique), un déficit moteur ou cognitif (ischémie thromboembolique). De plus le modèle d'hyperglycémie via injection multiple de streptozotocine peut entrainer de la glucosurie, de la polyurie, de la polydipsie.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus pour réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA (activateur tissulaire du plasminogène) au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés, la littérature et un test de puissance statistique. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Une habituation aux gestes et dispositifs de contention sera réalisée au préalable afin de réduire le stress des animaux lors de ces manipulations. Le réveil des animaux post-chirurgie se fera au calme, dans une enceinte chauffée ventillée individuelle avant leur retour dans la cage. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale et placées dans une armoire chauffée ventilée. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture sera mis en place. Du fait des effets indésirables induit par l'hyperglycémie, une attention particulière sera portée sur l'hydratation (turgescence cutanée) et l'hygiène de la cage des animaux avec des changements de biberons et de cages plus fréquement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’humain. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’humain et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT dans le cadre d'une hyperglycémie. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Une inflammation cérébrale leur est induite par injection intracérébrale d'une protéine bactérienne, et un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivis de la pose d'un cathéter et d'une imagerie moléculaire, avant mise à mort pour immunohistochimie. Le porteur indique que l'AVC peut entraîner un affaiblissement transitoire de la patte avant et que la pose du cathéter provoque une douleur modérée. Il affirme que la biodistribution des particules d'imagerie doit être étudiée dans un organisme complet et que l'expérience ne peut être totalement remplacée par des études in vitro.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Notre étude sera basée sur l’expression de molécules d’adhésions qui sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires au sein du parenchyme cérébral. Il a été montré dans la littérature que l’inflammation post-AVC jouait un rôle dans la physiopathologie de la maladie, c’est pourquoi il nous apparait pertinent de caractériser l’expression de ces molécules d’adhésion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication des molécules d'intérêts lors d'une inflammation

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Nous allons injecter une protéine bactérienne inactive dans une région du cerveau spécifique afin d’induire une inflammation du cerveau (durée : inférieure à 30min). Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) Induction du modèle d'AVC par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (durée : 1h30) Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) Imagerie moléculaire avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. De plus, l’injection de LPS en intra-striatale peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le LPS est un PAMP, motif moléculaire associé à un agent pathogène, qui active la voie NF-κB par l'intermédiaire du TLR4 et induit l'expression de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IL-1β. Enfin, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée. Des analgésiques sont prévus afin de limiter et minimiser autant que possible la gêne occasionnée. Concernant les souris ayant eu un AVC, il est possible de voir apparaitre un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l’AVC.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses en immunohistochimie

Remplacement

Avant toute étude in vivo nos particules ont été testées in vitro afin de vérifier leur bon fonctionnement et spécificité. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux en ne leur injectant pas de particules inefficaces. Les expériences in vivo ne peuvent être totalement remplacée par des études in vitro car nous avons besoin de mettre en évidence l’affinité de nos particules pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires dans un organisme complet. En effet ; l’étude de leur bio-distribution in vivo est un point essentiel à notre projet de recherche. Après les expérience d’imagerie, les animaux sont perfusé afin de récupérer les tissus. Des études de microscopie sont réalisées par la suite sur ces tissus afin de confirmer nos observations réalisées in vivo. Cela nous permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cage standards répondant aux normes européennes actuelles (directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des molécules d’adhésion cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine dans une artère cérébrale, avec pose d'un cathéter et IRM sous anesthésie, avant prélèvement du cerveau pour séquençage. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un affaiblissement transitoire d'une patte antérieure correspondant à la zone lésée. Il affirme que les techniques sans animaux ne fourniraient pas le même niveau d'information et revendique une première mondiale de séquençage sur ce modèle.

Objectifs

Nous proposons ici de caractériser les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans les différents sites d’inflammation survenant dans un modèle d'accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) pertinent et original développé dans notre laboratoire. Pour cela, nous allons nous tourner vers une approche non biaisée basée sur l’utilisation du séquençage de cellules uniques. Le transcriptome obtenu va nous fournir de nouvelles informations sur la diffusion spatiale et temporelle de la réponse inflammatoire survenant à la suite d'un AVCi. Les résultats de cette étude pourraient mener au développement d'outils de diagnostic et de traitements efficaces dans la prise en charge des patients touchés par un AVCi.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous prévoyons d’être la première équipe de recherche à séquencer les différents sites d’inflammations dans un modèle pertinent d’AVCi. Le séquençage de cellules uniques est une technique innovante permettant de générer un atlas de l’expression des gènes pour chaque cellule d’un échantillon. Ainsi, cette technique nouvelle permet d’étudier les changements transcriptomiques survenant dans une pathologie avec un niveau de résolution inégalé. Ce projet pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant le développement de nouveaux médicaments pour traiter les AVCs.

Procédures

Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne sera réalisé grâce à une chirurgie. De plus, la pause d'un cathéter veineux et l'IRM de l'inflammation seront réalisés. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale et avec une couverture analgésique adaptée. Les interventions chirurgicales ainsi que les examen IRM ne dépasseront pas une heure de durée et seront réalisés une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparait dans la première semaine après l'AVC. De plus, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie et de séquencage.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action de traitements des AVC. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. La technique de séquençage de cellules uniques présente un intérêt dans le séquençage de tissus fraichement prélevés sur des modèles in vivo. En effet, cette technique permet l'étude de l'expression des gènes de chaque cellule d'un tissu, permettant ainsi d'apprécier la diversité des types cellulaires cérébraux, diversité que l'on ne peut pas atteindre avec des techniques de cultures in vitro ou des approches in silico.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilise est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilises.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant a ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pre et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la réponse inflammatoire survenant lors des AVC ischémiques. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines, correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur déclenche une myocardite auto-immune par injection d'extraits de muscle cardiaque de porc, ce qui provoque une insuffisance cardiaque grave pouvant aller jusqu'à la mort, avant des traitements quotidiens et des séances d'IRM avec un nouvel agent de contraste. Le porteur indique que ce modèle a été retenu parce que le rat serait "l'espèce la plus utilisée" pour cette maladie. Les retombées annoncées, un diagnostic plus précoce de l'inflammation cardiaque chez l'humain, restent attendues.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester chez l'animal la capacité d'une nouvelle technologie d'imagerie par résonance magnétique (IRM) à diagnostiquer de manière précoce l'inflammation cardiaque. Nous allons tester un nouvel agent de contraste, une substance qui augmente artificiellement le contraste de l'IRM, qui a la particularité de cibler des molécules exprimées spécifiquement lors de l'inflammation. Ainsi, une étude menée au sein de notre laboratoire a d'ailleurs démontré dans un modèle d'inflammation générale chez la souris que cet agent de contraste était capable de cibler l'inflammation au niveau du coeur. Nous souhaitons donc tester l'efficacité de cet agent de contraste de pouvoir imager l'inflammation cardiaque dans un modèle plus précis d'atteinte cardiaque tel qu'un modèle de myocardite auto-immune chez le rat. Cela permettrait d'améliorer le diagnostic et la prise en charge des myocardites chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce nouvel agent de contraste a montré une sensibilité et une spécificité élevées pour détecter l'inflammation cardiaque chez l'animal. De plus, nous savons que dans des modèles de myocardite auto-immunes, les molécules spécifiques de l'inflammation sont sur-exprimées au niveau du coeur. Il est donc attendu que cette nouvelle technique d'imagerie IRM dans un modèle de myocardite auto-immune chez le rat puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation cardiaque par rapport aux animaux contrôles.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Mise en place d'un modèle de myocardite auto-immune par immunisation avec une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Traitement anti-inflammatoire quotidien en intrapéritonéal avec contention o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie IRM avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min)

Impact sur les animaux

Le modèle de myocardite auti-immune par immunisation peut induire des effets indésirables sur les animaux. Les rats seront immunisés avec une solution contenant des extraits de muscles cardiaques de porc. Ce modèle induit une insuffisance cardiaque grave et dans certains cas au décès.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (coeur), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisés avec l'agent de contraste en imagerie par résonance magnétique permettant de confirmer leur à donner un signal IRM. Des tests in vivo chez la souris ont été réalisés pour tester l'efficacité à détecter l'inflammation cardiaque et des résultats positifs ont été observés avec une prise de contraste en IRM au niveau du myocarde confirmée par l'étude histologique des tissus.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé le même agent de contraste. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Les animaux auront le temps d'acclimation et un enrichissement de leur milieu. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle afin de vérifier que les animaux s'alimentent correctement. La douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir les différents temps d'études par une analgésie. Différents point limites ont été définis afin de ne pas poursuivre l'étude si les animaux présentent des signes de souffrance ou de douleur.

Choix des espèces

Le rat est l'espèce animale la plus utilisée dans ce modèle de myocardite expérimentale auto-immune et parmis les espèces animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine du rat sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un infarctus du myocarde par deux techniques présentées comme moins invasives, puis on suit leur cœur par échographie, pour réduire la variabilité des modèles chirurgicaux existants. Le porteur indique que la douleur liée à l'infarctus est maximale pendant vingt-quatre heures et qu'un analgésique est alors administré. Les bénéfices annoncés, des thérapies plus efficaces contre l'infarctus chez l'humain, restent à démontrer.

Objectifs

Malgré les progrès des traitements interventionnels et pharmacologiques des infarctus du myocarde (lorsqu’une artère coronaire irriguant la paroi cardiaque se bouche), les cardiopathies qui en résultent restent la principale cause de décès dans le monde. Il y a donc nécessité à continuer la recherche dans ce domaine pour optimiser les traitements et sauver des vies. Étant donné la complexité du cœur qui assure une fonction de pompe pour le système circulatoire qui s’adapte à la demande de l’organismes et la pression artérielle et dont la régulation du rythme est contrôlée par un système neuro-hormonal complexe, les modèles animaux sont indispensables pour cette recherche, aucun système in vitro ne pouvant reproduire cette complexité. Le modèle rongeur est le plus utilisé. Le modèle actuel est basé sur la technique chirurgicale sous anesthésie qui induit un infarctus du myocarde. De multiples variables affaiblissent le pouvoir translationnel de la méthode. Bien que de nombreuses tentatives aient été faites pour améliorer cette technique en réduisant au minimum la taille de l'incision, la variabilité dans un même groupe d'animaux et entre différents groupes est restée significativement élevée. Cette incohérence est probablement attribuée aux détails techniques de la procédure chirurgicale, ce qui entraîne une diminution de l'efficacité et un manque de reproductibilité des résultats. L'étude présente vise à produire deux modèles non invasifs. Ces deux méthodes utiliseront des souris de type sauvage.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est de développer des techniques innovantes et transposables à l’homme pour étudier le remodelage indésirable du tissu du cœur après infarctus. Ce projet améliorera les méthodes conventionnelles en améliorant la qualité de la chirurgie effectuée pour induire un infarctus en limitant l'intubation, les saignements, la taille de la plaie, l’inflammation et d'autres facteurs. Les techniques proposées réduiront considérablement la variabilité dans un seul groupe d'animaux et favoriseront des résultats plus applicable à la situation clinique chez l’homme ou la femme. Ces techniques moins invasives aideront les scientifiques à développer des thérapies efficaces pour l'infarctus du myocarde.

Procédures

L'électraucotérisation : 22 souris SHAM et 22 opérées; durée de l'opération 10 minutes. La magnétisation de nanoparticules: 34 SHAM et 34 opéréés; durée de l'opération 30 minutes. Procédure d’échocardiographie: pour tous les animaux; analyses réalisées en 30 minutes en moyenne.

Impact sur les animaux

L’infarctus du myocarde peut entrainer plusieurs effets indésirables chez la souris. La douleur attribuable à l'infarctus du myocarde est maximale jusqu'à 24 h chez la souris. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir une légère déshydratation.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure afin récupérer les différents tissus pour des analyses de biologie moléculaire et biochimiques ultérieures.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. L'utilisation d'animaux se justifie également par l'incapacité d'obtenir une lignée cellulaire stable de cardiomyocytes.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux par groupe une analyse statistique poussée a été réalisée. Le calcul du nombre d'animaux nécessaires pour pouvoir conclure définitivement sur les résultats, est très important car il serait aussi grave de limiter de façon excessive le nombre d'animaux à inclure que d'en inclure un trop grand nombre. Utiliser des animaux pour une expérience qui ne sera pas conclusive par manque d'animaux et donc par manque de puissance statistique est aussi grave qu'en utiliser trop. Pour rentabiliser l’utilisation des animaux à des fins expérimentales, les organes sont prélevés, partagés et congelés pour des expériences de biochimie et de biologie moléculaire ultérieures.

Raffinement

L'opération chirurgicale est induite en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre sous lampe chauffante. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage. La douleur propre à l’infarctus étant observé 24 h après opération les souris seront traitées avec un analgésique au cours de cette période. Les yeux sont protégés du dessèchement par un onguent ophtalmique et de la lumière par une compresse humidifiée. Pour faciliter l’accès à la nourriture des boites de gels ou une litière surélevée seront mises en place afin que les souris ne perdent pas trop de poids.

Choix des espèces

Le protocole d'éléctrocoagulation de l'artère coronaire a été publié originalement sur la souris et requiert en effet une sonde ultrasonore de haute fréquence pour la visualisation qui est adaptée à la souris plutôt qu'au rat. Les souris seront opérées à l'âge de 1 ou 2 mois pour avoir la taille minimum pour procéder à la ligature de la coronaire.