Système cardiaque
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Impact de la température corporelle sur les complications cliniques du choc infectieux chez la souris 2/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
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- Système cardiaque
- Système immunitaire
496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un choc septique leur est provoqué par injection de contenu intestinal ou par ligature et perforation du caecum, avec pose d'une sonde thermique et prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, une prostration et une activité sociale fortement altérée, l'hypothèse testée étant que la fièvre serait bénéfique. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité d'un organisme et présente ce contrôle fin de la température comme inédit.
Objectifs
Le choc septique est le dysfonctionnement des organes à la suited'une infection, impliquant une atteinte des vaisseaux sanguins et un changement de la température corporelle. Malgré les recherches et les travaux publiés ces dernières années, le rôle de la température sur ce dysfonctionnement est encore mal connu. Notre hypothèse est que la fièvre est bénéfique chez des souris atteintes d'infections. Dans ce projet, nous souhaitons contrôler la température pour étudier finement la dysfonction des organes lors d'un choc septique chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle que joue la température dans l'évolution du choc septique, et pourrait aider les cliniciens à mieux prendre en charge la température chez les patients en choc septique.
Procédures
Les souris seront implantées avec des sondes thermiques en sous-cutanée sous anesthésie (2 minutes par souris). Un modèle de septicémie sera induit chez ces souris au niveau du péritoine, soit par injection de contenu caecal dans le péritoine (simple injection péritonéale), soit par ligature et perforation du caecum par chirurgie (3 minutes par souris). Puis les souirs seront placées sous surveillance. Un prélèvement sanguin quotidien sera réalisé durant les 48 premières heures après une courte anesthésie gazeuse, afin de suivre les paramètres sanguins au cours du temps. Les souris subiront une échographie cardiaque (5 minutes par souris) avant la chirurgie et 7 et 28 jours post chirurgie. Les souris subiront une échographie cardiaque avant la chirurgie et 7 et 28 jours post chirurgie. Les souris seront euthanasiées par excès d'anesthésie gazeuse lors de la fin de l'expérience, et les organes seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les deux modèles sont associés à un un changement important de la température corporelle des souris, à une perte de poids, à des diarrhées possibles, à une prostration et à une activité sociale fortement alterée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés « afin de prélever les organes et le sang nécessaires pour l'étude que nous menons
Remplacement
Afin de tester les mécanismes moléculaires, des expériences in vitro seront menées indépendamment. Néanmoins, le remplacement total par la culture cellulaire n'est pas possible à ce jour car les expériences in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des intéractions moléculaires et physiologiques qui ont lieu dans un organisme comme l'homme ou la souris. Nous utilisons les modèles de péritonite afin de nous rapprocher au plus près des causes du choc septique chez l'homme, qui représentent la 1ere cause de mortalité dans le monde. A cet égard, aucune étude expérimentale chez l'animal n'a permis de contrôler finement la température corporelle dans un modèle de sepsis.
Réduction
Pour minimiser le nombre d'animaux, nous nous sommes basés sur des études préalablement publiées dans la littérature ainsi que sur des tests statistiques. Des résultats antérieurs fournissent des informations importantes concernant la mortalité, les modalités de modèles de sepsis, les temps d'étude etc. Ainsi, nous proposons d'utiliser 496 animaux au total. Cet effectif permettra d'approfondir les mécanismes de la septicémie en réponse à la température, tout en limitant l'étude.
Raffinement
Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d’enrichissements comme des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement. La mise en place de nourriture humidifiée dans la cage sera faite une semaine avant le début du protocole pour éviter le stress. Nous mettrons en place une grille d'évaluation de la souffrance des souris pour suivre l'évolution de la maladie. Le poids, l'apparence, la conscience, l'activité physique, la réponse aux stimuli, les yeux, la respiration seront évalués pour suivre l’évolution de la maladie et intervenir par euthanasie lorsque les points limites seront atteints.
Choix des espèces
Pour notre étude, nous avons choisi la souris car les modèles de choc septique que nous utilisons sont largement décrits dans la littérature scientifique chez la souris. De plus, de nombreux souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes pathologiques sont largement développés. Age adulte (2 à 3 mois). Nous utiliserons des souris adultes car les données de la littérature scientifique montrent que l'incidence de la péritonite est beaucoup plus importante chez l'adulte que chez l'enfant.
Caractérisation anatomique et fonctionnelle de la connectivité et de la physiologie des neurones de contact du Liquide cérébrospinal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 877 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance déclarés du léger au sévère. Jusqu'à 1 096 subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, d'autres des injections intra-utérines qui séparent les petits de leur mère, et plus de 300 une craniotomie suivie de la pose d'une fenêtre optique sur le crâne en deux chirurgies. L'objectif est de décrire l'anatomie et la fonction d'une population de neurones peu connue, une recherche fondamentale menée sur un effectif élevé. Le porteur indique vouloir ensuite transposer l'approche au primate non humain et affirme qu'aucun autre modèle ne reproduit le réseau neuronal du mammifère.
Objectifs
Un nombre croissant de résultats expérimentaux et cliniques supportent l’idée que le liquide cérébrospinal (LCS) représente un acteur majeur du système nerveux central (SNC). Malgré la présence d’une barrière contrôlant la diffusion de molécules du LCS, il existe au niveau du tronc cérébral et de la moelle épinière des cellules spécialisées, notamment des neurones au contact du LCS (Nc-LCS), qui permettent l’intégration des signaux circulant dans le LCS. Ces neurones présentent une morphologie et des propriétés fonctionnelles conservées chez tous les vertébrés. Ils expriment de manière sélective un canal appelé PKD2L1 qui confère aux Nc-LCS des propriétés sensorielles : il leur permettrait de détecter des variations de la composition et du flux du LCS, ainsi que de la courbure de la colonne vertébrale. Les Nc-LCS représenteraient ainsi un système sensoriel interne capable d’informer le SNC de son état physio-pathologique. Pour caractériser les propriétés de ces neurones et en comprendre la fonction, il est nécessaire de réaliser une analyse anatomique exhaustive de leur morphologie, de leur distribution et de caractériser leur connectivité le long de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Le projet déposé vise à caractériser au niveau anatomique et fonctionnel une population neuronale peu connue chez les mammifères. L’ensemble des données recueillies par notre étude permettra de caractériser les réseaux neuronaux dans lesquels les Nc-LCS sont insérés, ce qui est une étape cruciale pour mettre en évidence leur fonction chez le mammifère et démontrer si effectivement ils représentent un nouveau système sensoriel permettait au système nerveux central d’être informé de son état physio-pathologique. Les résultats ainsi obtenus ouvriront potentiellement de nouvelles pistes de recherche pour des voies thérapeutiques alternative via le LCS, lors de perturbations de l’état interne (position axiale, locomotion, inflammation, ou potentielle pathologie). Par ailleurs, nous souhaitons générer des modèles de souris génétiquement modifiée par l'utilisation d'infection virale. Cette approche permettra de nous affranchir de la génération de modèles animaux par croisement de plusieurs lignées génétiquement modifiées et par conséquent de limiter le nombre d'animaux devant être produits. D’autre part, nous anticipons également des bénéfices au niveau technologique puisque la validation de l’approche transgénique via le LCS développé dans notre modèle de souris pourra être transposée au modèle de primate non-humain pour lequel très peu d’information sur les propriétés anatomo-fonctionelle des Nc-LCS est disponible. Enfin, de manière plus large, ces mêmes approches d’infection via le LCS pourront être utilisées pour mener des analyses similaires pour d’autres projets et structures cérébrales.
Procédures
Selon les différentes expérimentations, les animaux pourront subir une injection intracérébroventriculaire sous anesthésie générale (environ 20 minutes d’anesthésie) pour un maximum de 1096 souris adultes ; ou une injection sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse pour un maximum de 289 animaux vigiles (procédure unique de 5 minutes) ; jusqu’à 15 souris gestantes pourront subir une injection intra-utérine ou intraveineuse (procédure de 5 minutes sur animal vigile), sur un maximumde 3 à 4 cycles de reproduction avec un délai de 4-5 semaines entre les interventions ; enfin jusqu’à 316 animaux anesthésiés seront soumis à une première intervention d’implatation d’un guide canule nécessitant une craniotomie (anesthésie générale de 30 minutes) suivi, après une période de récupération de 15 jours, d’une seconde intervention pour poser une fenêtre optique sur le crâne (anesthésie générale de 30 minutes) le jour de l’expérimentation, avec seuls 6 animaux réveillés mener une analyse comportementale.
Impact sur les animaux
Les interventions menées sur les animaux (injections sous-cutanées, intrapéritonéales, intraveineuses intracérébroventriculaires ou intra-utérine) sont susceptibles de générer des douleurs et stress post-opératoires qui conduiront à des modifications de l’apparence des animaux (facies, vibrisses, œil, poil et propreté) et de leur comportement (interactions sociales, posture, locomotion, alimentation, toilettage). Par ailleurs la séparation des petits de leur mère pendant la procédure et la chirurgie réalisée sont susceptibles de perturber le retour des petits à la mère et les soins qu’elle leur porterait. Enfin concernant les implantations de canule dans le crâne, il existe un risque de douleur intra- et post-opératoire accompagnées de possible déficit moteur voire paralysie lors de la préparation.
Devenir
L'objectif du projet est de caractériser au niveau anatomique et fonctionnel la connectivité de Nc-LCS et leur fonction chez la souris. Une grande partie de cette étude nécessite une approche histologique et d'enregistrements électrophysiologiques. Ces deux approches nécessitent le prélèvement des tissus neuronaux et par conséquent la mise à mort des animaux. Pour ce qui est des enregistrements réalisés in vivo chez l'animal anesthésié, ces-derniers nécessitent de vérifier en fin d'expérience la bonne localisation des canules d'injection et des lentilles optiques. Le animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation pour permettre ces vérifications.
Remplacement
L'étude que nous souhaitons mener vise à caractériser la physiologie et la connectivité d'une population neuronale peu connue chez le mammifère. Elle se base sur le développement de modèle de modèles transgéniques afin d’identifier spécifiquement nos neurones d’intérêt ou leurs partenaires, et ne peut pas être réalisée à l'aide de modèle alternatif dans la mesure où aucun autre modèle ne peut reproduire le réseau neuronal spinal physiologique du mammifère.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été estimé au plus juste pour permettre d’aboutir à des résultats fiables, tout en limitant le nombre d’animaux par la réalisation d’études préliminaires qui permettront de déterminer la procédure la plus efficace permettant le moins de perte. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l’effet obtenu, si la puissance obtenue est suffisante avec un effectif inférieur. Par ailleurs, l’objectif de l’une des procédures est de valider une technique de génération d’animaux transgéniques, qui permettrait de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires à la production des animaux d’expérimentation par rapport à ceux obtenus par croisement.
Raffinement
Nous veillons à développer des procédures d'expérimentation limitant le stress, l'angoisse, toute souffrance animale et ainsi assurer le bien-être des animaux. Les animaux sont donc manipulés dans des endroits calmes, par des manipulateurs expérimentés, dans des cages contenant de la litière de leur cage d’hébergement. La stimulation de leur curiosité et le maintien des relations sociales sont également pris en compte (animaux maintenus en groupe, enrichissement de l’environnement avec des morceaux de bois, du carton, des tunnels). Chaque fois que possible, afin de réduire au minimum les répercussions individuelles sur le bien-être animal, nous réaliserons des études pilotes qui permettront d’optimiser les gestes chirurgicaux et les approches expérimentales. Pour les protocoles de chirurgie, un traitement analgésique préopératoire sera réalisé pour anticiper toute douleur. Ils recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique post-opératoire et nous veillerons à leur assurer des conditions de réveil et de récupération optimales. Une observation journalière permettra de définir les points limites qui sont basés notamment sur l’apparence, la posture et le comportement. Le raffinement de nos procédures est basé sur des points limites établis à partir d'une grille de score. Enfin le génotypage sur prélèvement pileux a été développé pour éviter toute nuisance d’une biopsie de queue.
Choix des espèces
Nous disposons de modèles de souris transgéniques permettant de cibler les populations neuronales d’intérêt. Grâce à ces lignées, il est possible de générer un ensemble de modèles transgéniques chez la souris qui permettront de visualiser, de manipuler ou d’enregistrer l’activité sélectivement dans ces populations. L’utilisation d’un modèle de souris est la seule permettant de mener à bien le projet proposé. D’une manière générale, les jeunes animaux de moins de 2 semaines sont les plus adaptés pour la survie in vitro des populations neuronales étudiées. Mais pour certaines procédures, du fait des périodes d’incubation nécessaires après les injections et parce que techniquement plus facile, les injections devront être réalisées in utéro pour que les études finales puissent être menées sur des animaux jeune-adultes (environ 4 semaines).
Méthotrexate pour le traitement de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B – Projet Multi-établissement EU 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
21 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance est déclarée pour partie légère et pour partie sévère. Une arthropathie leur est provoquée par trois ponctions dans l'articulation du genou, suivies de six semaines de traitement, de prises de sang, d'une IRM des genoux de deux heures et d'un transfert entre deux animaleries. Le porteur ne décrit comme seule nuisance qu'une gêne locomotrice après induction de la maladie et justifie la mise à mort par le prélèvement d'un millilitre de sang total, incompatible avec le maintien en vie. Il teste sur ces souris hémophiles un anti-inflammatoire déjà utilisé contre la polyarthrite rhumatoïde, en vue d'un éventuel essai clinique.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX) et dont la sévérité est définie par la quantité de FIX restant dans le sang. La forme la plus sévère, où le taux de FIX est in détectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Ces saignements spontanés peuvent se répétés au niveau des articulations et conduire à la présence de sang dans le liquide articulaire, induisant une inflammation et une dégradation de l’articulation qui est handicapante pour le patient. Cette atteinte répétée porte le nom d’arthropathie hémophilique (AH) et est une complication grave de la maladie. L'AH partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) dont une inflammation importante au stade précoce de la maladie. A ce jour, le traitement de l’hémophilie comprend des injections de facteur manquant pour éviter tous saignements donc ceux responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire qui apparait au stade précoce de l’AH. Dans le cadre du traitement de la PR, le méthotrexate est largement utilisé en tant que médicament de première intention. Le méthotrexate est un médicament visant à contrôler l’inflammation qui à montrer 34% de rémission et 50% d’amélioration de la PR dans des études conduites chez des patients atteints de PR. Nous avons fait l’hypothèse que le méthotrexate pourrait réduire l’inflammation de l’articulation chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la PR. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité du méthotrexate pour traiter l’AH et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B. l'étude s'effectue dans deux animalerie distincxtes avec : l'induction de la maladie et le traitement qui se font à l'UE1 (animalerie 1) et l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qui se font à l'UE2 (animalerie 2).
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par facteur de coagulation et le méthotrexate, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ce médicament dans le contexte d’arthropathie hémophilique. le méthotrexate est un médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montre une efficacité suffisante du méthtrexate dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité du méthotrexate chez des patients hémophiles.
Procédures
Au sein de l'UE1 Au sein de l'UE1, l’arthropathie hémophilique est induite chez des souris hémophiles B par 3 ponctions articulaire (J1, J15 et J30) avec une surveillance et mesure du diamètre du genou les 15 premiers jours. Par la suite, le premier groupe reçois un traitement anti-hémophilique de référence tous les 4 jours et ce durant 6 semaines. Le deuxième groupe reçois également le traitement anti-hémophilique de référence (même durée et fréquence) mais également un traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde une fois par semaine. Une prise de sang est réalisée à J0, J15 et J30 pour surveiller la possible toxicité du traitement de référence utilisé dans la polyarthrite rhumatoïde. Après 6 semaines de traitement, les souris sont transférées à l'EU2 où elles bénéficieront d’une IRM des genoux pour évaluer l’atteinte articulaire. Ensuite, une prise de sang sera réalisée pour la mesure des marqueurs inflammatoires ainsi que les marqueurs d’atteinte cartilagineuse et osseuse. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale après administration d’un médicament anti-douleur. Les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min) (UE1), une prise de sang (1 min) (UE1), la mesure du genou (30 sec) (UE1), une injection seule ou double (1-2 min)(UE1), une IRM du genou (120 min)(UE2), un prélèvement total de sang et mise à mise à mort (3-5 min)(UE2).
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaire handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments anti-hémophiliques et d’étudier l’arthropathie hémophilique. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins analogues à nos facteurs anti-hémophiliques est un prérequis pour l’induction de l’hémarthrose et pour la mesure de l’activité des molécules prophylactiques testées. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette altération génétique, n’est pas victime de saignement spontané et tout saignement provoqué sur la souris hémophile est résolutif sans prise en charge particulière. Souris matures (8-9 semaines) de 25-30g. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car les cartilages sont en cours de maturation durant la croissance et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible des taux de certains facteurs de coagulation avec l’âge, comme le fibrinogène, facteur Willebrand et le FVIII qui peuvent modifier la capacité hémostatique globale du modèle et par conséquent la tendance hémorragique.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.
Procédures
Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Rôle thérapeutique de la voie hème oxygènase/monoxide de carbone (HO-1/CO) au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 64
256 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque d'environ 90 minutes reproduisant un infarctus, avec un risque de mort accru les trois premiers jours, puis reçoit les composés à tester avant que son cœur ne soit prélevé. Le projet évalue des molécules libérant du monoxyde de carbone censées protéger le cœur après un infarctus, retombées présentées comme des informations "nouvelles et importantes". Le porteur justifie le choix de la souris et du rat par la comparaison avec les nombreuses études antérieures utilisant les mêmes modèles.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité. Les lésions tissulaires au cours de l'IM provoquent la libération de molécules toxiques connues sous le nom de "Danger Associated Molecular Pattern". (DAMP), qui aggravent les lésions cardiaques et stimulent l'inflammation. Nous faisons l’hypothèse que l’hème agisse comme un DAMP important dans l'IM car des quantités importantes d'hème présentes dans le tissu cardiaque, peuvent être libérées pendant l’infarctus, et pourraient favoriser les dommages cardiaques s'il n'est pas correctement neutralisé ou dégradé. Bien que le tissu cardiaque ait la capacité de neutraliser l'hème dans des conditions normales, ces systèmes de protection intrinsèques ne suffisent pas lorsque la quantité d'hème devient excessive comme dans le cas de l’IM. Cependant, une stratégie thérapeutique nécessite de nouvelles approches pharmacologiques car les mécanismes responsables des lésions myocardiques après un infarctus sont multiples et encore mal définis. Le but principal de ce projet est donc d’étudier non seulement le rôle de l'hème en tant que DAMP mais également de vérifier si l'hème peut stimuler certains facteurs de protection dans le cœur pendant l'infarctus du myocarde. De plus, nous évaluerons l'effet pharmacologique de nouvelles molécules (HYCOs) qui pourraient être très efficaces pour neutraliser les effets délétères de l'hème et favoriser la protection contre l'inflammation et les lésions tissulaires pendant l’IM. Pour ce projet, la plupart des expériences sur l'IM seront réalisées sur des souris afin que nous puissions 1) comparer nos résultats avec des données antérieures publiées dans la littérature avec le même modèle et 2) avoir la possibilité de tester l'effet spécifique des HYCOs. Néanmoins, certaines expériences clés seront répétées dans le modèle du rat comme "preuve de concept", une étape essentielle pour vérifier que l'efficacité de nos molécules est reproduite dans différentes espèces. Les objectifs finaux seront de déterminer le rôle de l'hème et les effets bénéfiques des HYCO dans l'IM.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du monoxyde de carbone (CO) et capables de protéger contre l'infarctusl'infarctus du myocarde. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique du CO dans les maladies ischémiques.
Procédures
Dans le modèle d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat, chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie complète. La procédure chirurgicale complète nécessite environ 90 minutes et après l'infarctus les animaux seront traitées avec les composés à tester et chaque administration ne durera pas plus de 5 secondes. A 7 ou 30 jours après l'infarctus, l’effet thérapeutique sera monitoré au niveau fonctionnel par échographie qui durera qui ne durera pas plus de 30 min. A la fin des expériences les animaux seront placés sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera effectué et le coeur sera excisé.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont principalement ceux liés à la chirurgie (modèle d’insuffisance cardiaque postischémique), pouvant dans les trois premiers jours suivant l’opération conduire à une atteinte aigue cardiaque et une mortalité accrue des animaux les plus atteints. Les effets indésirables seront la perte de poids (de 10 à 20%), une diminution de la température corporelle et besoin d’oxygène après la chirurgie, une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une thoracotomie, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les coeurs pour une analyse metabolique, génique et biochimique à la fin de chaque protocole expérimental, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur les cardiomyocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO mais seulement 2 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires . Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur les souris traité par l'hémopexine et la déféroxamine, ces deux composés ont déjà été testés in vivo et les meilleurs dosages et mode d'administration ont été rapportés dans des articles précédents. Cela évitera l'utilisation inutile de plus d'animaux pour optimiser l'efficacité de ces deux composés.
Réduction
Les tests in vitro (Remplacement) nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés et nous a ainsi permis de réduire significativement le nombre de composants qui seront testés in vivo. Pour chacun des groupes étudiés dans les 3 procédures proposées, nous utiliserons 8 animaux en raison de leur variabilité, pour obtenir des données significatives et afin d'avoir une puissance statistique suffisante. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d'autres molécules aux mêmes propriétés. Après avoir collecté des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. A noter que nous nous sommes efforcés de réduire le nombre total d'animaux puisque la procédure 1 nous permettra de définir le mode d'administration le plus efficace des composés à utiliser ensuite dans la procédure 2. Un nombre réduit de protocoles et donc les expériences les plus nécessaires seront répétées en utilisant des rats dans la procédure 3.
Raffinement
Pour minimiser la douleur et la souffrance des animaux, nous mettrons en place les points limites décrits dans chaque procédure. Pendant leur séjour à l’animalerie, les animaux auront à leur disposition des balles de coton pour nidifier ainsi que des feuilles de kraft pour jouer/se cacher et des bâtons de bois pour jouer/se cacher et feront l'objet d'une surveillance quotidienne. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (induction de l’infarctus et examens à J7 ou J30). La douleur chirurgicale est prise en charge par des antalgiques. Un antalgique sera administré avant la chirurgie ainsi q’un anti-inflammatoire après la chirurgie. En cas de fortes hémorragies ou de troubles cardiaques, l’animal sera mis à mort sous anestesie.
Choix des espèces
Les modèles animaux que nous utiliserons sont largement utilisé pour étudier l'effet de nouveaux composés thérapeutiques et leur efficacité dans les maladies cardiovasculaires. De manière analogue, les modèles d'infarctus du myocarde (IM) chez la souris et le rat ont été établis et bien décrits dans la littérature. Le choix de ces espèces de souris et rat se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles de IM.
Traitement de la fibrose cardiaque (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une chirurgie d'ouverture de la cage thoracique pour poser une constriction sur l'aorte et déclencher une insuffisance cardiaque, parfois suivie d'une seconde intervention pour la retirer, avec des échographies hebdomadaires sous anesthésie avant le prélèvement du cœur. Le porteur indique que l'ouverture de la cage thoracique peut causer une douleur sévère au réveil. Il décrit des travaux in vitro et in silico préalables et affirme qu'aucune méthode ne permet aujourd'hui de suivre l'évolution de l'insuffisance cardiaque hors de l'animal.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque est un problème de santé publique majeur. Les fibroblastes cardiaques sont un type cellulaire qui produit une quantité excessive de matrice extracellulaire, contribuant à la progression de l'insuffisance cardiaque chez les patients. Actuellement, il n'y a pas de traitement permettant limiter l'activité excessive des fibroblastes. A l'aide d'outil in vitro, nous avons identifié un gène potentiellement responsable du développement de la fibrose. Nous voulons désormais valider in vivo cette cible thérapeutique et soumettre des souris qui possèdent le gène d'intérêt inopérant à un Protocol d'induction d'une fibrose cardiaque.
Bénéfices attendus
La fibrose cardiaque étant une composante centrale de l'insuffisance cardiaque, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques est un enjeu majeur. En testant la fonction d'une cible thérapeutique potentielle, et en permettant de réaliser de nouvelles analyses par des techniques de pointe comme le séquençage en cellules unique, ce projet pourrait apporter de nouvelles informations sur la fonction des fibroblastes cardiaques dans l'insuffisance cardiaque. Cela permettrait de mieux orienter la recherche fondamentale et clinique portant sur la fibrose cardiaque. Les données générées seront publiées, et ainsi seront à la portée de la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie permettant de placer une constriction au niveau de l'aorte, ce qui a pour effet d'induire une insuffisance cardiaque. Pour certains animaux, la constriction sera par la suite retirée, nécessitant une intervention mini-invasive sous anesthésie, pour évaluer leur capacité à retrouver une fonction cardiaque normale. L'état de santé des animaux sera suivi au quotidien. Des analyses hebdomadaires par échographie, sous anesthésie mais non invasives, permettront d'analyser la fonction cardiaque (4 analyses/souris). L'intervention permettant de placer la constriction aortique dure environ 25 minutes. L'intervention permettant de retirer la constriction dure environ 5 minutes. Les analyses échographiques durent environ 10 minutes. A la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le cœur et réaliser des analyses histologiques et moléculaires. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, les animaux seront identifiés / génotypés dans l’EU1
Impact sur les animaux
Les effets indésirables lies au génotypage (EU1) seront liés à une biopsie pouvant causer une douleur légère et passagère. L’intervention chirurgicale, impliquant l’ouverture de la cage thoracique, le placement de la constriction aortique et la fermeture de la cage thoracique, peut causer une douleur sévère suite au réveil de animaux. Le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution est une approche non invasive et non douloureuse. Le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15min/animal).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de procéder au prélèvement du cœur pour des analyses histologiques et moléculaire.
Remplacement
Nous avons précédemment utilisé des méthodes alternatives pour la découverte et la validation de cibles thérapeutiques (screening moléculaire et pharmacologique in vitro et in silico), ce qui nous a permis de limiter notre champs d'investigation à une cible thérapeutique spécifique et unique. Nous avons ensuite utilisé des modèles murins ayant cette modification génétique ciblée permettant de tester l’implication physiopathologique de cette région génomique d'intérêt. L'étiologie humaine de l’hypertrophie cardiaque, ainsi que la récupération, sont reproduites chez l’animal par deux interventions chirurgicales successives. Malgré le caractère délétère, ces interventions sont nécessaires pour reproduire dans un système intégré, l’animal, les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent. Malheureusement, il n'existe actuellement aucune méthode (in vitro ou in silico) permettant de suivre l'évolution de l'insuffisance cardiaque. Les modèles cellulaires existantes ne reproduisent pas la complexité de l’environnement cardiaque, notamment les interactions entre de multiples types cellulaires, ainsi que les forces biomécaniques et conditions métaboliques observées chez les patients. En effet, il n’y a actuellement pas de modèle permettant d’obtenir une fibrose équivalente à celle observée chez les patients, et notamment pas de fibrose réversible. Nous avons réalisé des études complémentaires avec des fibroblastes cardiaques humaines (in vitro), ce qui permet de vérifier la présence et activité des cibles thérapeutiques potentielles dans les cellules humaines. De plus, notre consortium développe un modèle de fibrose cellulaire, en construisant du « tissue cardiaque humain » à partir de plusieurs types cellulaires dérivées in vitro. Cette approche, qui dépend de données générées in vivo pour sa validation, permettra plus tard de proposer une alternative aux études animales.
Réduction
Lors de cette étude et dans un souci de réduction, chaque animal est utilisé comme son propre contrôle pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie. nous avons déterminé pas une analyse statistique que des groupes comprenant 16 animaux sont nécessaires Lors de cette étude et dans un souci de réduction, chaque animal est utilisé pour mesurer plusieurs caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires) du développement de la pathologie. Des tests statistiques) seront employés pour comparer les groupes. En effet, les études longitudinales en échographie vont notamment permettre de s'assurer de la qualité des hypertrophies, chaque souris pouvant être compare dans des tests paramétriques aux différents étapes des procédures. Les souris seront assignées aux groupes et analyses à l'aveugle.
Raffinement
Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score quotidien pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus importants, la mise à mort. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés sont installés dans les cages (mouchoir en papier, rouleau en carton…). Pour le transfert des animaux, le transport sera bref et réalisé en début de journée, et des enrichissements seront inclus via une navette dédiée.
Choix des espèces
La constriction aortique chez la souris adulte est un excellent modèle de développement de la fibrose cardiaque, qui a été employé par de très nombreuses études. Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal qu'in vitro. Par exemple, le développement de l’insuffisance cardiaque met en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, neuro-humoraux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénaux, centraux si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique. Ces études sont indissociables des approches complémentaires in vitro, notamment sur cellules humaines.
Le rôle de la protéine C activée dans le développement de l’arthropathie hémophilique chez des souris hémophiles A sévères – Projet Multi-établissement EU 1/2
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 56 dans des procédures classées sévères. Ces souris hémophiles reçoivent deux ponctions du genou provoquant des saignements articulaires, des injections, une IRM du genou de deux heures sous anesthésie, puis une exsanguination par la veine cave incompatible avec la survie. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'une gêne locomotrice et écrit n'attendre aucun autre effet secondaire ou douleur, alors que la moitié des procédures sont classées sévères. Il indique mettre au point les techniques in vitro au maximum avant d'utiliser les souris, tout en conservant ce modèle qu'il juge éprouvé et fiable.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de la destruction articulaire induite par l’hémophilie permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques mais également de disposer de nouveaux outils de diagnostic précoce. Pour cela, l’étude du rôle de l’APC nous semble intéressante puisque cette protéine régule d’autres qui sont chargées de la dégradation et du remodelage du cartilage articulaire. Si notre hypothèse est confirmée, alors un inhibiteur de l’APC peut être un candidat thérapeutique pour l’atteinte articulaire chez les hémophiles.
Procédures
Afin de mimer la maladie chez l’homme, les souris vont développer une atteinte articulaire suite à des saignements articulaires répétés. Le rôle de la protéine C activée (APC) va être étudié 7 et 30 jours après 2 ponctions du genou induisant un saignement articulaire. Cette atteinte articulaire va être étudiée en utilisant des méthodes complémentaires : mesures de marqueurs d’inflammation, de dégradation cartilagineuse, l’étude de modification des ARN au niveau des tissus articulaires et du sang, étude histologique avec marquage de molécules responsables de la dégradation articulaire. L’APC sera bloquée par un inhibiteur spécifique et les conséquences de cette inhibition seront comparées à la situation où l’APC est active au niveau du sang et du liquide synovial. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et si douloureux après administration d’un médicament anti-douleur. Après anesthésie et antalgie, les souris seront mises à mort sans réveil et les pattes arrières seront disséquées pour l’étude histologique après marquages et colorations spécifiques. Les animaux pourront être soumis, sous anesthésie générale, à une ponction articulaire (2-3 min), la mesure du genou droit (30 sec), une injection (1-2 min), une IRM du genou (120 min), une prise de sang et mise à mort (3-5 min). Les temps exprimé ne comptent pas l’induction et la vérification de la profondeur de l’anesthésie, compter 5min. Afin d’éviter de multiple anesthésie générale, le maximum de geste est groupé comme suit • Anesthésie générale + mesure du genou droit + ponction articulaire à J0, J15 et J30 : temps estimé : 9 min • Injection seule tous les 4 jours: temps estimé : 7 min • Injection d’inhibiteur tous les 4 jours: temps estimé : 9 min • Imagerie par IRM à J42 : temps estimé : 125 min • Prise de sang : 10 min. tous les gestes sont effectués dans l'UE1 à l'exception de l'IRM, la prise de sang et la mise à mort qsui sont réaisée dans l'UE2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet la seule nuisance attendue concerne une gêne locomotrice après induction de la maladie articulaire. Nous n’attendons aucun autre effet secondaire ou douleur.
Devenir
Les animaux ne ressortent vivant de cette procédure car l’exsanguination par la veine cave n’est pas compatible avec la survie de l’animal.
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Les mesures radiologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures biologiques et histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie préalables. Au cours de l'étude, les points limites sont appliqués avec comme limite stricte une perte de poids de plus de 20% due à une gêne locomotrice, gravité d'un hématome au point d'injection si les actions de corrections ne sont pas suffisantes.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Caractérisation des lésions vasculaires induites par l’infection de SARS-CoV-2 dans un modèle murin humanisé et nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur humain ACE2, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale ou intraveineuse, reçoivent des injections intrapéritonéales et subissent des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, pour étudier les atteintes vasculaires de la Covid-19. Le porteur indique que l'infection peut provoquer microthromboses, perte de poids de 10 à 20 pour cent et anomalies de comportement, les souris perdant plus de 20 pour cent de leur poids étant mises à mort. Il présente les retombées thérapeutiques comme des pistes et reconnaît utiliser en parallèle des cultures de cellules humaines, tout en affirmant que l'étude ne peut être menée sans administration du virus à l'animal vivant.
Objectifs
La COVID-19 est une maladie virale aiguë causée par le coronavirus de type 2 du syndrome aigu respiratoire sévère (SARS-CoV-2). Le premier site d'infection chez les patients atteints de la COVID-19 est l'appareil respiratoire. Le SARS-CoV-2 infecte les cellules de la muqueuse nasale en se liant à une enzyme appelée ACE2. Outre le poumon, une atteinte multi-organes a été décrite dans les formes graves de la COVID-19, témoignant d’une diffusion du virus dans l’ensemble de l’organisme. Les examens anatomiques après le décès des patients atteints de la COVID-19 ont mis en évidence une atteinte isolée ou prédominante des cellules endothéliales (cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux en contact avec le sang). Cette atteinte se caractérise par l’apparition de petits caillots sanguins, perturbant l’apport sanguin dans les tissus en aval. Bien que mal comprises, ces observations impliquent fortement les cellules endothéliales dans les atteintes multi-organes sévères de la COVID-19. Plusieurs études scientifiques attestent de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection SARS-CoV-2, la compréhension des mécanismes responsables de la COVID-19 et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. La souris n’est naturellement pas sensible à l’infection SARS-CoV-2 car l’ACE2 murine ne reconnait pas le SARS-CoV-2. Afin d’étudier l’infection SARS-CoV-2 chez la souris, un modèle murin de souris humanisée pour l’ACE2 humaine a été développé permettant d’exprimer l’ACE2 humaine en lieu et place de l’ACE2 murine dans un tissu que nous choisissons. Deux modèles de souris transgéniques ACE2 humanisées ont ainsi été générées : 1. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine dans toutes les cellules de l’organisme et 2. une souris humanisée exprimant l’ACE2 humaine uniquement dans les cellules endothéliales vasculaires de la souris. En utilisant ces deux modèles, notre projet a pour objectifs : 1) d’établir les conditions expérimentales de l’infection au SARS-CoV-2 en utilisant des doses croissantes de virus à court terme, 2) de caractériser les atteintes des petits et gros vaisseaux par le SARS-CoV-2 à long terme, et 3) d’évaluer l’efficacité d’un traitement visant à diminuer les atteintes vasculaires liées à l’infection SARS-CoV-2 à long terme.
Bénéfices attendus
L’étude chez le rongeur des infections à SARS-CoV-2 est déterminante pour l’élaboration de stratégies de lutte contre la COVID-19 et de ses formes graves. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt d’urgence et de priorité nationale du gouvernement et des organismes publiques de recherche en regard de la pandémie mondiale de la COVID-19. Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’infection SARS-CoV-2 altère la fonction endothéliale, conduit à une atteinte vasculaire multi-organes et offrira de nouvelles pistes de traitements pour lutter contre les atteintes vasculaires graves de l’infection SARS-CoV-2.
Procédures
Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthesiés sous anesthesie générale et soumis à des injections intranasales ou intraveineuses du SARS-CoV-2. Les administrations des molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront réalisées par voie intrapéritonéale chez la souris vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés au sinus rétroorbital sous anesthésie générale et collyre anesthésique. La durée de chaque intervention décrite est inférieure à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : 1. Anesthésie à l'isoflurane pour l'infection SARS-CoV2 (variant français du Wuah, D614G ou variant Omicron B.1.1.529) = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le reveil) 2. Administration du virus par voie intranasale = stress et inconfort légers de l'animal 3. Administration du virus par voie intraveineuse = stress et douleur légère de la piqure de l'aiguille 4. Prélèvement de sang au niveau du sinus rétro-orbital de l'animal anesthésié sous isoflurane = stress léger de la contention et de l'anesthésie (dont le réveil), douleur légère possible au reveil 5. Atteintes macro- et micro-vasculaire du SARS-CoV-2 = douleur legère à modérée notamment en cas de microthrombose vasculaire et d'altérations locales de l'apport sanguin pouvant conduire à une perte de poids (de 10 à 20%), une altération de l'apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité) de l'animal.
Devenir
La mise à mort des animaux à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
L’étude de l’infection SARS-CoV-2 ne peut être menée sans avoir recours à l’administration du virus à l’animal vivant. De plus notre projet s’intéresse à l'évolution des atteintes tissulaires sur le long terme (2 mois post-infection) de la COVID-19 et aux variations de sensibilité de l’infection SARS-CoV-2 avec l’âge (souris jeunes vs âgées) qui ne peuvent être mimées in vitro. En revanche, des résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que le récepteur ACE2 (porte d'entrée du virus dans l'organisme) est fortement exprimé à la surface des cellules endothéliales qui bordent l'intérieur des vaisseaux à l'échelle des petits et des gros vaisseaux chez la souris. La culture cellulaire de cellules endothéliales humaines restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests viraux et fonctionnels préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
Réduction
Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et de protocoles publiés. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériels biologiques pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Dans notre expérience, des groupes infectés de 6 animaux pour les études virologiques à court terme et de 10 animaux pour les études histologiques et moléculaires à long terme sont suffisants pour répondre à nos questions scientifiques. De le même façon, un nombre d’animaux de n=4 est amplement suffisant pour les groupes non infectés contrôles.
Raffinement
Pour minimiser le stress des animaux, l'inoculation intranasale ou intraveineuse du virus sera réalisée sur des souris anesthésiées. Après l'infection, une surveillance quotidienne effectuée par une personne compétente sur le projet nous permet de savoir si un animal souffre et ainsi de pouvoir envisager une mort anticipée. La mort anticipée sera envisagée sur l'animal a une perte de poids de plus de 20% et présente également une altération de son apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) et/ou un comportement anomal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h post-infection, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation de lignées génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes responsables des effets délétères de l’infection SARS-CoV-2. Elle constitue également un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille et ses cycles de reproduction courts. Les souris transgéniques humanisées pour l'ACE2 humaine développées pour ce projet seront sensibles à l’infection SARS-CoV-2 du fait de l’expression du récepteur humain du SARS-CoV-2 et permettront de mieux comprendre les atteintes vasculaires multi-organes de l’infection SARS-CoV-2. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris mâles agées de 6 semaines ou de 8 mois pour répondre à la question de l’influence de l’âge sur le risque accru d’atteintes vasculaires de l’infection SARS-CoV-2.
Dymorphisme sexuel associé à la maladie des petits vaisseaux et à l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection preservée
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
2 650 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. En surpoids ou diabétiques, elles subissent des injections intrapéritonéales répétées, une à deux chirurgies pour les castrer ou leur implanter une pompe, un test d'effort et une échocardiographie sous anesthésie. Le projet étudie le rôle des hormones sexuelles dans une insuffisance cardiaque touchant surtout les femmes ménopausées, avec des cibles thérapeutiques annoncées à long terme. Le porteur affirme que cette pathologie complexe ne peut s'étudier in vitro et requiert "un organisme vivant proche de l'homme".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque dite « à fraction d’éjection préservée » représente la moitié des insuffisances cardiaques et sa prévalence est en constante augmentation compte tenu du vieillissement de la population et de l’explosion des facteurs de risques cardiovasculaires. Il s’agit d’une pathologie associée à une mortalité élevée et pour laquelle il n’existe pas de traitement efficace. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie ce qui est primordial pour identifier des cibles thérapeutiques. Plus précisément nous nous attacherons à mieux comprendre, d’une part le rôle de la maladie des petits vaisseaux qui est souvent associée à cette maladie et d’autre part le dimorphisme sexuel associé à cette maladie. En effet cette maladie touche surtout les femmes ménopausées suggérant un rôle des hormones sexuelles.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment les hormones sexuelles interagissent avec les facteurs de risque cardiovasculaire pour protéger ou altérer le phénotype des petits vaisseaux et la fonction cardiaque. A plus long terme, il devrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques personnalisées pour les patients atteints d’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. En effet, l’insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée est une maladie hétérogène possiblement induite par des mécanismes multiples.
Procédures
Les souris subiront 1 à 2 séries de 4 à 5 injections intrapéritonéales (chaque injection incluant la contention ne dure que quelques secondes), une à deux chirurgies de 10 minutes visant à les castrer ou à implanter une micro-pompe en sous cutané et un prélèvement sanguin inférieur à 50 µL dans la veine caudale. Finalement ces souris seront soumises à un test d'effort (12 minutes par jours pendant 3 jours habituation) puis 5 à 30 minutes pour le test à proprepemnt dit) et une anesthésie de 15 minutes pour subir une échocardiographie.
Impact sur les animaux
Ce projet utilisera des souris en surpoids ou diabétiques dont les nuisances sont comme chez l'homme, un surpoids, une polyurie et une polydipsie. D'autre part les animaux ressentiront des douleurs post-chirurgicales et un stress occasionné par des administrations intrapéritonéales répétées.
Devenir
Toutes les souris seront sacrifiées pour pouvoir faire des prélévements d'organes. Les géniteurs seront sacrifiés lorsque le nombre d'animaux nécessaires aux expérimentations aura été produit.
Remplacement
L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types cellulaires locaux (cardiomyocytes, cellules endothéliales, péricytes notamment) et circulants (cellules hématopoïétiques diverses). Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’homme est donc necessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à l'aide d'un logiciel informatique: Pour avoir 90% de chance de mettre en évidence des différences significatives entre 2 groupes (concernant, la pression télédiastolique du ventricule gauche notamment), le nombre de souris par groupe et par analyse doit être 10. Il faut noter cependant que nous ne pourrons pas faire toutes les analyses sur une seule souris, il nous faudra donc 2 souris. Le nombre de souris par groupe sera donc 20. Ce chiffre est conforté par notre propre expérience et à celle de la communauté scientifique s'intéressant aux pathologies cardiovasculaires, 10 animaux par lot sont nécessaires pour obtenir des résultats exploitables statistiquement aussi bien pour les mesures de la fonction cardiaque et les analyses histologiques. Pour réduire le nombre d'animaux, aucune expérience déjà publiée ne sera reproduite. Les manipulations seront réalisées par du personnel technique entrainé de façon à réduire la variabilité des résultats donc le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux des groupes "contrôles", traités de façon identiques, mais inclus dans différentes procédures seront dès que possible utilisé dans plusieurs "expériences ou procédure". Le nombre de souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera ainsi réduit.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des conditions qui limiteront le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement enrichi avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). La souffrance des animaux sera réduite par l'usage d'anesthésiques et d'antalgiques adaptés pour la réalisation des gestes douloureux et la mise en place de points limites. D'autre part, les animaux seront surveillés quotidiennement par le zootechnicien, le responsable du bien-être animal ou l'expérimentateur. Dès le début des expérimentations, une fiche de suivi « bien-être » sera créée. Le bien-être des animaux sera alors gradé ce qui permettra d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau vasculaire a de forte ressemblance avec celui de l'homme. Par ailleurs, il existe dans cette espèce des individus présentant des mutations spontanées prédisposant au diabète de type 2 (facteur de risque cardiovasculaire). Des souris adultes âgées d'au moins 6 semaines seront utilisées, En effet, notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques.
Rôle du facteur de croissance des nerfs dans l’inflammation associée à l’hypertension artérielle pulmonaire idiopathique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
280 rats vont être utilisé·es, tous tués à l'issue sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte de la monocrotaline pour déclencher une hypertension artérielle pulmonaire, puis un anticorps anti-NGF, avant des mesures échographiques et de pression cardiaque sous anesthésie. Le porteur veut confirmer que bloquer le facteur de croissance NGF freine la maladie, avec des retombées thérapeutiques annoncées à terme. Il soutient que la maladie induite reste peu douloureuse faute d'effort imposé aux rats, et affirme que ces interactions complexes ne peuvent être reproduites in vitro.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire ou HTAP est une maladie grave qui touche les artères pulmonaires conduisant le sang du cœur vers les poumons pour y être réoxygéné. Dans cette maladie, la pression augmente de manière anormale dans ces artères, et le cœur doit alors travailler plus fort pour envoyer le sang dans ces artères. A force de travailler plus, il finit par fonctionner mal, entrainant le décès des patients. Aucun médicament actuellement sur le marché ne permet de guérir cette maladie, et il faut donc essayer de développer des nouveaux médicaments plus efficaces. Nous pensons que développer un médicament qui bloquerait le facteur de croissance des nerfs NGF pourrait avoir un grand intérêt dans cette maladie. En effet, nos expériences sur cultures de cellules humaines suggèrent que le NGF participe à l’inflammation présente dans l’HTAP. Le NGF pourrait notamment attirer des cellules inflammatoires à proximité des artères pulmonaires, et ces cellules inflammatoires libèreraient alors des substances qui contribuent aux altérations de ces artères pulmonaires qu’on observe dans la maladie. Nous souhaitons à présent valider cette hypothèse dans un modèle plus intégré d’HTAP, en utilisant le modèle monocrotaline (MCT). Ce modèle d’HTAP chez le rat est classiquement utilisé dans la littérature et déjà en place au laboratoire. L’utilisation de ce modèle est nécessaire car nous ne pouvons pas modéliser en culture les interactions complexes qui existent entre les cellules inflammatoires et les cellules des artères pulmonaires, afin de déterminer quel est le rôle du NGF dans ces interactions. Ainsi, ce projet va nous permettre de traiter les rats avec un anticorps qui bloque le NGF et voir si ce traitement empêche le développement de la maladie, en modifiant l’inflammation et ses conséquences sur les artères pulmonaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer les conséquences du blocage in vivo du NGF sur le développement de l’HTAP, et en particulier sur sa composante inflammatoire. Ainsi, l’effet d’un traitement à l’aide d’anticorps bloquants anti-NGF sera évalué sur l’élévation des pressions ventriculaires droites et de la pression artérielle pulmonaire, sur le débit cardiaque et sur l’hypertrophie ventriculaire droite pour apprécier les effets bénéfiques sur les paramètres qui définissent l’HTAP. Puis l’effet de ce traitement sera évalué ex vivo sur l’infiltration des monocytes et leur activation dans le poumon, sur la sécrétion de substances inflammatoires et leurs conséquences sur les artères pulmonaires. Les résultats obtenus dans ce modèle nous permettront ainsi de mieux comprendre le rôle physiopathologique du NGF dans l’inflammation associée à l’HTAP, et ainsi de contribuer à confirmer que le NGF est une nouvelle cible thérapeutique d’intérêt dans cette pathologie.
Procédures
Dans la 1ère partie de la procédure, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales. Ils en recevront au maximum 6 sur la durée totale du protocole (28 jours), réparties de la manière suivante : Jour 0 (Anticorps), Jour 1 (solvant ou monocrotaline), Jour 8 (Anticorps), Jour 15 (Anticorps) et Jour 22 (Anticorps). Les volumes injectés sont faibles à chaque injection (200 ou 500µl) et la durée d’injection est très courte (quelques secondes par animal). 240 animaux seront concernés par ces injections (groupes 3 à 14). Dans la 2ème partie de la procédure, les animaux seront soumis à des mesures in vivo, sous anesthésie gazeuse et analgésie complémentaire, afin de réaliser des mesures échographiques (durée : une dizaine de minutes par animal), puis des mesures de débit cardiaque et de pressions ventriculaires droites et artérielles pulmonaires (durée : une vingtaine de minutes par animal). L’ensemble des animaux seront concernés par ces mesures, soit 280 animaux.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale est peu douloureuse lorsqu’elle est bien réalisée. Les injections de monocrotaline, de son solvant seul, des anticorps non pertinents ou des anticorps bloquants anti-NGF n’est pas décrite comme provoquant des douleurs post-injection dans la littérature. Toutefois, les signes cliniques de souffrance seront surveillés quotidiennement pendant la suite du protocole. Concernant le développement de la maladie en elle-même, chez l’homme, l’HTAP n’induit pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme légère dans ce type de protocole d’induction d’une maladie.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux, toujours sous anesthésie gazeuse, seront euthanasiés (sans réveil) et les expérimentations suivantes auront lieu sur tissus prélevés après euthanasie.
Remplacement
Ce projet a pour but d’identifier des mécanismes in vivo pour valider la pertinence des résultats obtenus in vitro. En effet, nous recherchons à identifier un lien entre NGF, monocytes, IL-1b et altérations des artères pulmonaires. Nous avons réalisé des expériences in vitro qui nous ont permis notamment de montrer que le NGF stimule la libération d’une substance inflammatoire qui induit in vitro différents effets sur les cellules artérielles pulmonaires humaines en culture. Pour montrer que le blocage du NGF et de ce mécanisme conduit à des effets bénéfiques sur le développement de l’HTAP, ce projet nécessite à présent l’utilisation d’animaux pour modéliser cette pathologie in vivo (pathologie impossible à modéliser in vitro de manière complète pour le moment) et pour valider l’utilisation d’anticorps bloquants anti-NGF comme traitement possible de l’HTAP.
Réduction
L’estimation du nombre d’animaux à utiliser est basée sur les analyses des études déjà menées au laboratoire sur ce même modèle compte-tenu de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche. De plus, cette estimation tient également compte des données de la bibliographie et du fournisseur qui décrivent un effet variable de la monocrotaline en fonction des lots commandés. Pour optimiser le nombre d’animaux utilisés : (1) le plan d’expériences a été optimisé afin de pouvoir réaliser les expériences in vivo et ex vivo sur les mêmes animaux et afin d’utiliser les deux poumons de chaque animal (utilisation par exemple du poumon gauche pour les expériences de contraction et utilisation du poumon droit pour l’étude de l’expression de différentes protéines d’intérêt) (2) parallèlement à ce protocole, des études continueront à être réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines en culture afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans les effets observés. Ainsi, nous optimiserons l’utilisation des animaux et les remplacerons par des cellules humaines autant que possible. Au final, cette démarche nous a conduit à un protocole utilisant 14 groupes comptant chacun 20 animaux, soit un total de 280 animaux (140 mâles et 140 femelles, puisque nous souhaitons également explorer les différences éventuelles des effets observés en fonction du sexe). Ce nombre sera réduit si les résultats obtenus sont statistiquement significatifs (ou résolument non significatifs) avant la fin de la totalité des séries prévues. Les expérimentations sont planifiées pour obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur un nombre d’animaux le plus faible possible (mesures échographiques, de débit cardiaque et de pression artérielle pulmonaire puis expériences ex vivo ultérieures après euthanasie réalisées sur les mêmes animaux, une seule procédure).
Raffinement
À leur arrivée, les animaux sont hébergés en cages collectives, pourvues d’enrichissement du milieu (litière : copeaux de peuplier ; enrichissement : papier tressé, morceaux de bois, tunnels et maisons en carton). 2 à 3 animaux seront hébergés dans chaque cage. La nourriture et l’eau seront données à volonté, et le change effectué une fois par semaine (cage, litière, biberon). Un suivi quotidien (week-ends, vacances et jours fériés inclus) des animaux sera effectué par le personnel de l’animalerie pour prévenir tout inconfort, souffrance ou comportement anormal des animaux. Au moment de cette procédure expérimentale, les animaux seront observés et cette surveillance portera sur le suivi du poids des animaux, sur leur apparence, et sur des paramètres comportementaux (mobilité, interaction avec ses congénères, peur, agression, vocalisation, automutilation, activité diminuée ou augmentée, prostration). Une feuille de suivi des animaux, sur laquelle sont précisées les conduites à tenir en cas de problème de santé de l’animal, sera complétée. L’expérience des personnels de l’animalerie nous garantit un bon suivi des animaux. Si le suivi du poids fait apparaitre une perte de poids des animaux supérieure à 5% par rapport à leur poids initial, une mise à disposition de nourriture humidifiée posée directement au fond de la cage sera effectuée, jusqu’à ce qu’une amélioration de l’état de l’animal soit observée. Les animaux seront sacrifiés en cas de perte de 20% de poids par rapport à leur poids initial, ou si l’animal perd 10% de son poids par rapport à la dernière pesée. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée, et l’animal en souffrance sera alors surveillé toutes les demi-heures pendant deux heures. En cas de souffrance ou de détresse persistante au-delà de cette période malgré l’administration d’antalgique, une procédure d’euthanasie sera mise en œuvre.
Choix des espèces
Le rat est une espèce classiquement utilisée pour le développement de modèles d’hypertension pulmonaire. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le modèle monocrotaline est le modèle que nous souhaitons utiliser dans cette DAP pour compléter des expériences déjà réalisées avec ce modèle. Le choix du rat est d’autant plus justifié par le fait que le modèle monocrotaline ne fonctionne pas chez la souris. En effet, pour être active et induire le développement d’une hypertension pulmonaire, la monocrotaline doit être métabolisée en un dérivé, appelé monocrotaline pyrrole, par des enzymes présentes dans le foie. Or ces enzymes nécessaires à cette réaction n’existent pas chez la souris. Ce modèle monocrotaline ne fonctionne donc pas chez la souris, et nécessite forcément l’utilisation du rat. Nous utiliserons des rats jeunes de 200g. Le protocole utilisé se déroule sur 4 semaines et les données de la littérature ainsi que les résultats précédents obtenus au laboratoire préconisent d’utiliser des rats de ce poids pour ce type de protocole. En effet, au-delà de 200g en début de protocole, l’injection de monocrotaline est décrite comme moins efficace pour entraîner le développement d’une hypertension artérielle pulmonaire.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Développement d’un traitement innovant de la drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
486 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses d'une drépanocytose, elles reçoivent des injections sous anesthésie et, pour une partie, sont placées trois heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène afin de déclencher des crises d'occlusion des vaisseaux, avant une mise à mort sans réveil. Le porteur reconnaît que ces crises provoquent douleur, perte de poids et baisse de mobilité, atténuées par un antidouleur puissant. Il affirme que la complexité des crises vaso-occlusives ne peut être reproduite in vitro et que seule cette souris génétiquement modifiée reproduit fidèlement la maladie.
Objectifs
L’un des projets de recherche de notre unité de recherche consiste à développer un nouveau traitement contre la drépanocytose, une maladie génétique du sang qui touche les globules rouges et qui est associée à des complications récurrentes, graves et parfois mortelles. De plus, l’espérance de vie des patients drépanocytaires est réduite. Actuellement, cette maladie ne peut pas être guérie et elle se traite très difficilement. Ceci souligne le besoin pour les patients de pouvoir bénéficier de nouveaux traitements plus efficaces, ou qui pourraient être utilisés en combinaison avec les médicaments déjà existants, pour augmenter leur efficacité. Dans ce projet, nous nous proposons de démontrer l’efficacité de plusieurs médicaments que nous avons avons développés au laboratoire. Nous souhaitons également déterminer comment, et à quelle dose, devront être pris ces potentiels médicaments, lors de futures études cliniques chez les patients drépanocytaires. La drépanocytose étant une maladie particulièrement complexe, nous devrons tester nos molécules chez des souris drépanocytaires, qui sont les seuls animaux disponibles qui reproduisent fidèlement la maladie chez l'Homme. Si les résultats obtenus chez la souris sont convaincants, nous poursuivrons ensuite les tests de ce médicament potentiel, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Si nos résultats sont positifs, ce projet pourrait clairement avoir un bénéfice pour la qualité de vie et l'espérance des patients drépanocytaires. Nous avons, d'ailleurs, obtenu un financement par une entreprise pharmaceutique qui est intéressée pour développer nos médicaments et les tester chez les patients.
Procédures
Une partie des souris utilisées (drépanocytaires ou non) seront injectées (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis au maximum 2 prélèvements de sang (durée de 30 s chacun) seront réalisés sous anesthésie générale. Les souris seront immédiatement mises à mort, sans retour à la conscience, après le dernier prélèvement de sang. Pour une des interventions cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 2 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, puis seront placées, ou non, dans des conditions dans lesquelles l'oxygène de l'air sera diminué (de 21 à 8%), pendant 3 h, et enfin replacées à l'air ambiant pendant 1 h. Toutes les souris seront ensuite immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), le sang sera prélevé (durée d’1 minute), et les souris euthanasiées. Finalement, les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés. Pour l’autre intervention cherchant à déclencher des occlusions des vaisseaux chez les souris drépanocytaires, celles-ci seront injectées 3 fois (pendant une durée d’1 minute chacune), sous anesthésie générale, et 3 h après la dernière injection, toutes les souris seront immédiatement anesthésiées (anesthésie générale), et le sang sera prélevé (durée d’1 minute). Les souris seront finalement euthanasiées et les organes (foie, reins, cœur, poumons, rate) seront prélevés.
Impact sur les animaux
Les souris drépanocytaires développent une maladie similaire à la drépanocytose humaine, avec en particulier une anémie chronique, mais sans effet majeur chez des souris jeunes (< 10 semaines), qui ont été choisies pour notre projet. Au cours de leur 10 semaines de vie, les souris drépanocytaires pourront développer des "crises vaso-occlusives" (comme les patients), engendrant pendant quelques jours une douleur, une perte de poids, une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Ces crises sont transitoires, mais seront soulagées avec l'administration d'un anti-douleurs puissant. De même, quand nous induirons les crises vaso-occlusives chez les souris drépanocytaires, ceci engendrera une douleur d'une durée au maximum égale à la durée de l'intervention (3-4 h), ainsi qu'une inactivité/mobilité réduite, et un comportement anormal. Cette douleur sera prise en charge par administration préventive d'un anti-douleur puissant, avant le déclenchement de la crise. Dans ce projet, d'autres nuisances sont attendues pour les souris drépanocytaires ou non drépanocytaires, et sont liées à la préhension/contention des animaux, aux injections (introduction d'une aiguille sous anesthésie), ainsi qu’au prélèvement final de sang, à la perfusion intracardiaque, au prélèvement d’organes, et au sacrifice (tous sous anesthésie).
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront systématiquement euthanasiées en fin d'expériences. En effet, des analyses post-mortem sur des organes seront nécessaires pour certaines expériences. Pour le reste des expériences, les souris drépanocytaires (génétiquement modifiées), ou non drépanocytaires, ne pourront être ré-utilisées ou replacées car elles auront été injectées avec des molécules expérimentales dont les effets à long terme ne sont pas connus.
Remplacement
Les crises vaso-occlusives (CVOs) chez les patients drépanocytaires sont très complexes. Les cellules constituant les vaisseaux sanguins, mais également de nombreux types de cellules sanguines différentes, sont impliquées dans les mécanismes qui déclenchent ces crises. Ce système complexe ne peut à l'heure actuelle être remplacé par des systèmes in vitro, étant données les interactions multiples qui existent entre toutes ces cellules. L'évaluation de l'efficacité de nouveaux traitements dans la drépanocytose nécessite donc le recours à un modèle animal de cette maladie, et la souris est le seul modèle animal de drépanocytose actuellement disponible.
Réduction
Le but de notre projet est de déterminer si nos molécules pourraient être utilisées chez les patients drépanocytaires, avec des injections les moins fréquentes possibles, et si oui, à quelle dose. Dans un premier temps, nous partirons d'un dose classiquement utilisée en thérapeutique pour d'autres maladies, et nous évaluerons quelles molécules restent détectables dans le sang 96 h après l'injection, à cette dose. Seules les molécules respectant ce critère seront étudiées plus en détail dans ce projet, ce qui permettra de limiter le nombre de molécules testées, et donc le nombre de souris utilisées. Ces molécules seront ensuite testées pour savoir si elles sont efficaces pour limiter l’ampleur des crises vaso-occlusives chez des souris drépanocytaires. Pour répondre à cette question, le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé en nous basant sur des expériences similaires qui nous ont ensuite permis d’utiliser des logiciels de statistiques spécifiques pour estimer ce nombre. Au total, 360 souris devront ainsi être utilisées, mais uniquement si toutes les molécules répondent à nos critères initiaux. De plus, le maximum d’organes seront prélevés pour ne pas avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris. Il est aussi prévu, en fin de nos expériences, de prélever une quantité de sang suffisante pour pouvoir répéter les analyses sur le sang, sans avoir à recommencer les expériences ultérieurement, sur de nouvelles souris.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, un enrichissement est prévu dans les cages. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, avec un nombre d’individus par cage compris entre 3 et 5 (pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une population trop importante). Toute injection ou tout prélèvement sera effectué sous anesthésie générale. Lors des modèles d'induction des crises vaso-occlusives (CVOs) chez les souris drépanocytaires, qui sont douloureuses, les animaux resteront sous la surveillance continuelle de l'expérimentateur, et tout changement de comportement et d’apparence physique, ainsi que des signes de douleur, seront recherchés. Si ces changements et ces signes sont trop importants, l’animal sera euthanasié et l’expérience sera interrompue pour cet animal. Surtout, un médicament anti-douleur très puissant sera administré aux souris, en prévention, avant de déclencher la CVO. Il est également possible que les souris drépanocytaires élevées dans notre animalerie développent spontanément une CVO douloureuse, en raison de leur maladie. C’est pourquoi ces souris drépanocytaires seront quotidiennement surveillées, y compris pendant leur hérbergement, et elles seront traitées par un anti-douleur très puissant quand des signes évoquant des COVs seront constatés.
Choix des espèces
Seule cette espèce possède un modèle génétiquement modifié mimant la drépanocytose, et qui reproduit de façon fidèle les manifestations cliniques de la maladie. Des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines maximum seront utilisées, car les souris drépanocytaires développent ensuite des atteintes d’organes sévères au cours du vieillissement.