Système cardiaque
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Amélioration de la longévité et de la régénération tissulaire par un court traitement de reprogrammation tardive
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
56 souris âgées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée pour prélever des organes, l'autre suivie jusqu'à la fin de sa vie pour mesurer sa longévité. Elles reçoivent soit une reprogrammation cellulaire par un composé dans l'eau de boisson, soit des injections de plasma de jeunes souris deux fois par semaine pendant deux mois, avec des prises de sang mensuelles. Le porteur décrit des nuisances mineures, une douleur possible aux points d'injection et lors des prises de sang, et fixe un point limite à 20 % de perte de poids. Il affirme que l'effet du plasma jeune et de la reprogrammation sur le vieillissement ne peut s'étudier ni chez l'humain ni in vitro.
Objectifs
Une avancée importante a été réalisée en 2006 avec la capacité de reprogrammer des cellules somatiques adultes en exprimant une combinaison de facteurs de transcription pour les ramener à un état pluripotent (c'est-à-dire qu'elles peuvent se différencier en cellules des trois couches embryonnaires). Les cellules reprogrammées de cette manière sont appelées iPSC (cellules souches pluripotentes induites). Ces cellules présentent les mêmes caractéristiques qu'une cellule souche embryonnaire, à savoir l'autorenouvellement et la pluripotence. Ce projet est basé sur ce concept de reprogrammation cellulaire et vise à étudier l'impact de la reprogrammation courte sur le vieillissement et la régénération des tissus au cours du vieillissement. Pour ce faire, nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifié pour induire une reprogrammation cellulaire transitoire in vivo. Pour aborder le vieillissement, nous avons travaillé dans notre laboratoire sur un phénotype dommageable du modèle de souris accéléré du vieillissement, la progéria, classée comme sévère. À la suite des résultats obtenus avec la progéria, la nouvelle procédure vise à effectuer le même traitement de reprogrammation à l'aide de la doxicycline sur des souris naturellement âgées sans phénotype dommageable (classées comme légères). Sur un autre lot de souris âgées, des injections de plasma jeune acheté seront réalisées pour tester l'effet des facteurs circulants dans le plasma de jeunes souris sur la reprogrammation cellulaire (classée comme légère), qui a été démontrée comme ayant un impact rajeunissant sur les cellules sénescentes.
Bénéfices attendus
Créer des opportunités nouvelles pour la prévention et le traitement des maladies associées au vieillissement. Cette étude aidera les chercheurs à mieux comprendre les changements biologiques typiques qui accompagnent le vieillissement et à améliorer la régénération métabolique des tissus des personnes âgées.
Procédures
Pour la reprogrammation avec la doxicycline dans l'eau du biberon, les souris seront traitées pendant 16 jours seulement, sans aucune autre intervention. Pour l'injection de plasma, les souris seront injectées deux fois par semaine pendant deux mois, la première IP: 15 secondes, contention comprise, et la deuxième injection IV : 1 minute, contention comprise. Les prélèvements sanguins seront effectués une fois par mois pendant la durée du traitement et dureront 1 minute par souris, contention comprise.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables mineurs peuvent survenir, tels que le stress lors de la manipulation. Les animaux doivent donc être familiarisés avec l'environnement, la contention physique et l'interaction avec le personnel. Il est possible que les injections de plasma provoquent une douleur au point d'injection. La prise de sang peut être douloureuse. Il ne devrait pas y avoir d'effets secondaires douloureux suite au traitement.
Devenir
Quelques animaux seront euthanasiés à la fin du traitement doxicycline et les organes seront prélevés pour fournir des groupes homogènes de tissus de souris âgées à des fins d'analyse et de comparaison avec nos résultats précédents, tandis que les animaux restants seront utilisés pour l'étude de longévité afin d'étudier l'effet sur la prolongation de la durée de vie. De même pour le plasma, les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour fournir des groupes homogènes de tissus de souris âgées afin de les analyser et de les comparer.
Remplacement
L’étude de l’influence de la reprogrammation transitoire et l'effet du plasma jeune sur le vieillissement d’un organisme ne peut être mise en place chez l’homme ou in vitro, d’où la nécessité d’avoir recours à des animaux pour mener de telles études. Cette approche permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents et d'évaluer les effets potentiels de ces interventions sur le vieillissement et la santé.
Réduction
Le projet approuvé a commencé avec un nombre de souris progeria qui a été réduit et non atteint. Pour confirmer les résultats obtenus sur des souris naturellement âgées, un groupe plus petit sera utilisé. Afin de respecter la règle des 3Rs et de réduire autant que possible l'utilisation de souris. Nous utiliserons les deux sexes, mâles et femelles. En outre, nous avons décidé de considérer un premier groupe d'induction à la doxicycline de 20 souris pour la longévité et de 16 souris pour la collecte d'organes, comme cela a été publié dans la littérature. Pour l'injection de plasma, 20 souris est le minimum requis, 10 étant le groupe de contrôle et 10 pour le groupe traité.
Raffinement
Les deux procédures ne nécessitent aucun type d'anesthésie ou d'analgésie. L’examen journalier des souris sera effectué pour détecter et renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux de la douleur ou d’éventuelles anomalies (isolement, absence de mobilité, perte d’appétit, hérissement des poils, dos voûté…). L’état de santé des animaux sera évalué par les tests de réflexe du retournement et de la capacité d'agrippement qui constitueront un point limite entrainant la mise à mort de l’animal. Si une perte de poids de 20% du poids maximal est observée, les animaux seront mis à mort et sortis du lot expérimental. Si une réhydratation ou un enrichissement est nécessaire, de la nourriture, de l'eau gélifiée et de l’enrichissement seront ajoutées à la cage.
Choix des espèces
Les génotypes complexes nécessaires à cette étude ne sont accessibles que chez la souris. La souris que nous avons utilisée dans la première partie de ce projet présente un état vieillissant au bout de 6 mois et décède au bout de 9 mois environ. Les résultats obtenus seront comparés à ceux de souris naturellement âgées. Afin de suivre l’impact de l’action tardive d’une reprogrammation transitoire sur le vieillissement, les souris sont traitées à 94 semaines puis suivies tout le long de leur vie pour suivre l'impact sur leur longévité. Un groupe d'animaux sera euthanasié à 102 semaines afin de disposer de groupes homogènes de tissus de souris âgées pour analyse et comparaison avec nos résultats précédents. Parallèlement, afin de tester la possibilité d'une reprogrammation et d'un rajeunissement cellulaires dus à des facteurs circulatoires juvéniles, des souris sauvages âgées de 94 semaines seront injectées puis euthanasiées à 102 semaines afin de disposer de groupes homogènes de tissus de souris âgées pour analyse et comparaison avec nos résultats précédents. Les périodes utilisées sont en accord avec les résultats précédemment obtenus au laboratoire.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
62 764 souris vont être utilisées dans une procédure d'identification et de génotypage impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit un tatouage aux doigts et une amputation du bout de la queue sans anesthésie, la contention constituant la principale source de stress. Le devenir dépend du génotype, une partie rejoignant d'autres protocoles ou l'élevage, une autre étant tuée dès le sevrage faute d'utilisation possible ou une fois trop âgée pour la reproduction. Le porteur affirme que les prélèvements salivaires ou pileux ne sont pas assez fiables et présente le tatouage et la biopsie de queue comme les seules méthodes "aussi performantes".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par tatouage aux doigts et caractérisés à l’aide du prélèvement du bout de la queue. Cette DAP d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres DAP) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour • la formation, • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de DAP).
Bénéfices attendus
Le génotypage est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le génotype est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure, puis leur devenir est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation (hors champs DAP) d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite (par décapitation ou dislocation cervicale selon l'âge)
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours selon la règlementation européenne.
Etude des mécanismes de l’inflammation dans le poumon de souris atteintes de vascularite
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
1 497 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour étudier l'inflammation pulmonaire des vascularites auto-immunes. Elles subissent des prises de sang dans le sinus rétro-orbitaire, une instillation intranasale d'un composé pro-inflammatoire et une injection rétro-orbitaire d'anticorps, une partie recevant en plus une chirurgie thoracique de 30 minutes à une heure. Le porteur indique que cette chirurgie engendre des 'douleurs importantes' respiratoires et que les dommages pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et inactivité. Les organes sont prélevés après mise à mort.
Objectifs
Les vascularites regroupent un ensemble de maladies auto-immunes qui affectent les vaisseaux sanguins. Il existe un sous-type de vascularite lié à la présence d’auto-anticorps dirigés contres des protéines spécifiques exprimées par les globules blancs. Ces vascularites engendrent des conséquences néfastes au niveau pulmonaire notamment avec une inflammation des vaisseaux menant à de graves atteintes respiratoires. Il n’existe à ce jour aucune donnée sur la physiopathologie des atteintes pulmonaires associées aux vascularites. Il existe un modèle de souris transgénique qui exprime une protéine spécifique d'origine humaine qui permettrait de reproduire la pathologie humaine. Certaines modifications des protéines pourraient participer au developpement de la maladie ainsi que les protéines impliqués dans la production de médiateurs de l'inflammation, qui pourraient également participer aux mécanismes physiopathologiques de la maladie. Ce projet permettrait d’établir un modèle reproduisant la pathologie des vascularites autoimmunes chez la souris et ainsi mieux comprendre quels sont les mécanismes intervenant dans le développement des atteintes respiratoires de la maladie.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet in vivo permettront de comprendre plus précisément le rôle de certains globules blancs dans la réaction inflammatoire des vascularites et d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet permettra d’établir comment les cellules sanguines participent aux dommages vasculaires dans les poumons des souris et de developper de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins au début avant induction de la maladie et au jour de la mise à mort des animaux. Ces prélèvements s'effectueront dans le sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Chaque prélèvement se fera en moins de 30secondes. Ils recevront une instillation intranasale de composant pro-inflammatoire sous anesthésie gazeuse, l'instillation est une manipulation qui ne prend pas plus d'une minute à réaliser, ainsi qu'une injection rétro-orbital d'anticorps sous anesthésie qui ne prendra pas plus de 30secondes. Certains animaux recevront une chirurgie thoracique qui durera environs 30min-1h sous anesthésie gazeuse et analgésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sur ce projet sont des douleurs respiratoires liées aux dommages pouvant avoir lieu dans les poumons. Cela pourrait entrainer une perte de poids et une inactivité des animaux impactés. De plus les injections en intraveineuse et prélèvements sanguins effectués sous anesthésie pourraient être source de stress pour l’animal. La chirurgie thoracique engendrera également des douleurs importantes respiratoire sur l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer en post-mortem les organes pour des analyses moléculaires, biochimiques et histologiques ultérieures.
Remplacement
La multiplicité des types cellulaires impliqués dans la réaction inflammatoire nécessite des études sur des animaux vivants qui sont complémentaires des études in vitro portant sur des cellules inflammatoires isolées, des cultures de lignées cellulaires et des cellules humaines isolées du sang de donneurs sains ou de patients. De plus cette étude permet d’intégrer les intéractions des cellules sanguines au sein d’un organe, le poumon au cours du temps. Cela n’est actuellement pas possible même avec l’apport de systeme de culture mimant les fonctions de certains organes. Les renseignements apportés par ces études animales permettant de les valider à l’échelle d’un organisme entier ne peuvent être obtenus par des techniques alternatives qui ne portent que sur un type cellulaire.
Réduction
Une analyse de puissance statistique préalable a été menée afin de determiner le nombre optimal d'animaux requis pour cette étude. La création de deux nouvelles lignées de souris necessitera l'utilisation de 112 souris pour vérifier que celles-ci se developpent correctement et ne présente pas de caractéristiques qui pourraient leur être dommageables. L’usage d’un total de 1260 souris permettra d’avoir des groupes de 10 souris par génotype et par conditions (basal, instillés avec du LPS, injecté ou non avec anticorps de patients ou anticorps controle) pour le modèle de vascularites. Cela nous permettra de pallier à la mortalité eventuelle et d’obtenir des résultats statisitiquement significatifs. L’étude d’imagerie intravital se limitera à des groupes de 6 souris par groupe pour un total de 125 souris utlisées.
Raffinement
Les mesures prises en compte pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux dans le cadre de ces procédures seront notamment l’utilisation d’une anesthésie pour chaque intervention necessitant une injection et/ou un prélèvement afin de minimiser le stress de l’animal. Une échelle de points limites a été mise en place. Un traitement avec un analgésique pourra être administré pour soulager une souffrance identifiée. De plus le modèle de vascularite se limitera à 7jours suivi d’une mise à mort afin de limiter toute souffrance de l’animal. Un traitement préanalgésique sera également administré aux souris soumises à la chirurgie thoracique. La chirurgie thoracique se fera également sous anesthésie et analgésique et les animaux seront mis à mort à la suite de l'acquisition au microscope pour éviter et limiter toute souffrance de l'animal. Les souris seront placées avec leur congénères dans la même cage, afin de respecter les interactions sociales propres à l'espèce, avec nourriture et eau ad libitum en présence de matériel de nidification.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle car elle est aujourd’hui la seule espèce possédant les mutations capables de reproduire la pathologie humaine. Le stade de développement sera adulte car le developpement de la pathologie necessite un système immunitaire et pulmonaire adulte. Des souris agées (>18mois) seront également etudiées afin d’évaluer l’effet du vieillissement sur le developpement de la pathologie.
Mise en place d’un modèle murin de prééclampsie pour le développement de médicaments dans le cadre des pathologies hypertensives spécifiques de la gestation
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
216 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de médicament et trois prises de sang sous anesthésie entre le 11e et le 15e jour de gestation, puis sont tuées au 15e jour pour analyser les placentas et les fœtus. Le projet cherche une preuve de concept qu'une classe de médicaments ralentirait la prééclampsie. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et qualifie le modèle d'animal gestant d'"indispensable".
Objectifs
La prééclampsie est une malade spécifique de la grossesse potentiellement mortelle et pour laquelle il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. L'objectif de ce projet est de faire la preuve de concept qu'un type de médicament est potentiellement intéressant pour ralentir l'évolution de la prééclampsie, en prouvant qu'il fonctionne sur les marqueurs de la maladie et qu'il n'est pas toxique pour le foetus. C'est une étape indispensable à nos travaux de recherche.
Bénéfices attendus
Il n’existe à ce jour aucun traitement de la prééclampsie en cours de grossesse. Cette maladie est pourtant potentiellement mortelle pour la mère et pourvoyeuse de grande prématurité. Le développement de médicament est une priorité de la recherche en médecine périnatale. C’est le bénéfice attendu de nos recherches : apporter la preuve de concept qu’une classe médicamenteuse permet de ralentir potentiellement l’évolution de la prééclampsie sans effets secondaires indésirables pour la grossesse.
Procédures
Durant le protocole expérimental, les animaux recevront une injection quotidienne de médicament. L’injection est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 11e et le 15e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 11e, 13e et 15e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux, et seront réalisées par un opérateur expérimenté.
Impact sur les animaux
Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. De plus, les médicaments utilisés ont déjà été testés chez la souris pour d’autres applications et n’ont pas d’effets indésirables. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l’euthanasie. Une grille de suivi quotidien sera mise en place afin d’évaluer le bien-être animal.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 5ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 15e jour de gestation. Cette euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et pour l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyse ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées, puisque nous apportons une attention toute particulière au placenta.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de modèle permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments en cours de gestation. De plus, cette étape expérimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la grossesse de classes médicamenteuses.
Réduction
Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable testé nos hypothèses de travail et l’ensemble des molécules (leur efficacité et leur toxicité) sur des placentas humains. Le nombre de souris nécessaire dans l’étude, c’est-à-dire le nombre de souris dont nous avons besoin pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. Ce nombre a été réduit à son maximum en tenant compte de la variabilité du nombre de fœtus par portée, de la variabilité des dosages sanguins et du fait que l’établissement éleveur ne nous assure pas de la gestation des animaux lors de la livraison (ce qui peut représenter 1/3 de l’effectif total des animaux qui se trouvent être non gestant). De plus, dans notre projet, nous avons prévu de tester 3 doses croissantes d’un médicament. Nous commencerons par tester la dose la plus faible et si celle-ci est suffisante pour observer des effets nous ne testerons pas les 2 doses plus fortes sur les souris afin de limiter au maximum leur utilisation.
Raffinement
Les animaux seront surveillés quotidiennement et ont à leur disposition des maisons en carton et du coton pour se créer des nids. Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués à l’aide d’une grille de suivi. Si une souffrance et/ou détresse est observée chez les animaux, des mesures seront mises en place (prise en charge médicamenteuse etc). Si malgré les mesures mises en place, l’animal atteint un point limite, c’est-à-dire que sa souffrance et/ou sa détresse dépasse un certain seuil défini au préalable, l’expérimentation sera interrompue pour cet animal immédiatement.
Choix des espèces
Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’espèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont fiables et commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé en toxicologie de la reproduction pour étudier de potentiels effets délétères de classes médicamenteuses sur le developpement embryologique et fœtal.
Caractérisation structurelle et fonctionnelle des cœurs infarcis ovins
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
34 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur des cœurs déjà infarcis. Ils subissent sous anesthésie des examens d'imagerie, une angiographie, une cartographie de contact et une stimulation interventriculaire, cette dernière pouvant déclencher une tachycardie ventriculaire évoluant en fibrillation. Le cœur est prélevé après mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur affirme que le remplacement des tissus 'n'est pas possible' et présente ce protocole comme 'essentiel' à la compréhension de l'infarctus.
Objectifs
L’ischémie cardiaque est la principale cause des troubles du rythme ventriculaire dans le monde. Afin de mieux comprendre son mécanisme d’action, il est indispensable d’avoir une description détaillée de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le myocarde sain, notamment, dans les zones de transition entre ces deux types de tissus. Pour cela, le développement et l’optimisation de nouvelles méthodes d’imagerie cardiaque, d’analyse de signaux électriques et optiques sont indispensables. Dans ce projet nous utilisons une procédure pluridisciplinaire permettant donc une étude approfondie qui permet une analyse détaillée in vivo et ex vivo. Afin d’arriver à ce but, le développement de nouvelles techniques applicables dans le monde clinique, seront mises au point, montrant donc le versant translationnel du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’optimiser l’imagerie cardiaque de l’infarctus afin de caractériser le tissu sain à l’intérieur ou autour de la zone de cicatrice. Ces informations sont essentielles en clinique afin d’améliorer le diagnostic des patients et de déterminer la meilleure approche thérapeutique. Une cartographie électrique de contact permettra la visualisation de la transmission électrique dans la cicatrice de l’infarctus et dans le tissu sain. De plus, cette technique permettra d’observer les zones de jonctions entre le tissu sain et la cicatrice. La stimulation des cœurs infarcis à différents fréquences donnera des informations sur les risques des troubles du rythme cardiaque. Toutes ces techniques enrichiront les bases de données numériques afin de créer et améliorer les études de modélisation cardiaque préventive.
Procédures
Les animaux utilisés pourront subir des examens d’imagerie, d'angiographie, de cartographie de contact et de stimulation interventriculaire. Toutes ces analyses seront effectuées sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée. Les techniques d’imagerie utilisées sont de types non invasives (IRM, scanner et/ou échocardiographie, 180 min au total). Le protocole d’angiographie est prévu afin de déterminer la présence ou pas d’irrigation sanguine dans l’infarctus (environ 90 min). Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. La cartographie électrique du cœur pourra être effectuée pour évaluer les effets de l’infarctus in vivo (environ 90 min). Une stimulation interventriculaire pourra être effectuée pour déterminer la fonctionnalité ventriculaire à différentes fréquences de stimulation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesurer l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.
Impact sur les animaux
La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impactées légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasif (échocardiographie, IRM) ou mini-invasif (cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters: au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact ou de stimulation interventriculaire peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire qui peuvent déborder en fibrillation.
Devenir
Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études fonctionnelles (cartographie optique) et structurales ex vivo (histologie, micro-scanner, etc.), qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Dans le contexte actuel, malheureusement, le remplacement de tissus obtenus via l’expérimentation animale n’est pas possible pour répondre à l'objectif du projet. Le manque de connaissance au niveau de la structure et de la fonction de l’infarctus et sa relation avec le tissu normal ne le permet pas. L’intérêt clinique de l’étude, dû à la prévalence de la pathologie au niveau mondial, rend ce protocole essentiel pour la compréhension du fonctionnement de la maladie et le développement de nouveaux traitements pour les patients. De plus, les résultats obtenus avec les techniques d’imagerie, les mesures électriques et la cartographie optique vont nous permettre d’enrichir la base de données pour la modélisation cardiaque, permettant de s’affranchir dans de nombreuses études, du modèle animal.
Réduction
Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux, nous avons effectué un calcul de puissance statistique pour déterminer le minimum d’animaux nécessaires afin d’avoir des résultats avec une différence statistique. Nous avons également intégré dans le même projet de recherche différents équipes: le pôle d’imagerie, le pôle physiopathologique, le pôle de traitement de signaux et le pôle de modélisation cardiaque. Ce regroupement interdisciplinaire au sein de notre projet, permet le développement et l’utilisation d’un maximum de techniques compatibles avec la quantité minimale d’animaux possible, permettant donc son optimisation.
Raffinement
Pendant les procédures, les animaux reçoivent un protocole antidouleur approprié et ils sont maintenus sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et surveillés par un ECG de surface et un capteur pression sanguine invasive. Cela nous permet d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur diphasique est toujours disponible en salle d’ablation pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités définies.
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme, les ovins ont été retenus car : •Ces modèles sont une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles. Chez l’Homme, la plupart des infarctus se produisent à l’âge adulte. Pour cette raison, des ovins adultes ont été choisis pour ce projet.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux suite à une injection unique
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.
Procédures
1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Nouvelles stratégies thérapeutiques dans L’accident vasculaire cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles étant maintenues sous anesthésie sans réveil pour une imagerie de six heures. Chaque animal subit une occlusion d'une artère cérébrale pour provoquer un accident vasculaire cérébral, souvent doublée d'une hyperglycémie induite par injection de glucose, avec administration d'agents thérapeutiques et prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'ischémie cérébrale provoque une douleur et une perte de mobilité, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cérébraux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de l'efficacité d'un traitement à la phase aiguë d'un AVC associé à une hyperglycémie.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral, soit un dispositif médical permettant de le retirer chirurgicalement. Ces 2 traitements présentent des limites qui font que seule une minorité de patients peut en bénéficier. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients. Par ailleurs, l’une des principales complications des accidents vasculaires cérébraux et de leurs traitements actuels est la survenue d’une hémorragie cérébrale qui peut aggraver le pronostic des patients. Pour cette raison, lors de l’évaluation de nouveaux traitements des accidents vasculaires cérébraux, il est donc important de s’assurer qu’ils n’entrainent pas de risque hémorragique. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité mais aussi la sûreté de nouveaux agents thérapeutiques visant à protéger le cerveau au cours des accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.
Procédures
Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion transitoire, réalisée sous anesthésie et analgésie, d’une artère cérébrale moyenne chez la souris. La procédure chirurgicale dure environ 20 minutes. Ce modèle sera combiné à une injection de glucose par voie intrapéritonéale pour provoquer une hyperglycémie aiguë 20 min avant le début de la procédure chirurgicale. Les différents agents thérapeutiques testés seront administrés 30 min après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. La durée d’injection chez la souris est d’environ 10 secondes. Au total, 1390 souris seront utilisées. 1270 souris dont 1040 seront soumises à une occlusion de l’artère cérébrale pendant une heure avec ou sans hyperglycémie aiguë et 230 souris contrôles sans occlusion de l’artère cérébrale subiront différents examens (dosages biologiques et suivi neurologique) visant à déterminer la sévérité de l’accident vasculaire cérébral. 120 souris subiront également un accident vasculaire cérébral pour étudier les différents acteurs cellulaires impliqués dans la formation du caillot sanguin par imagerie intravitale (au maximum 6 heures). Sur la totalité des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps (jour 7 avant la chirurgie, 6 heures et 24 heures après l’accident vasculaire cérébral). La durée maximale pour effectuer les prélèvements chez la souris est d’environ de 2 minutes. Toute procédure invasive sera faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront mis à mort en fin d'étude et les tissus seront prélevés et stockés pour les analyses biologiques.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux injections de différents agents thérapeutiques et anesthésiques ainsi qu’aux prélèvements sanguins effectués avant et après ischémie cérébrale. L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur chez l’animal et un comportement anormal (perte de mobilité). L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.
Réduction
Les modèles d’accident vasculaire cérébral développés chez la souris, sont parfaitement connus et maîtrisés par les expérimentateurs. Les groupes ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste de manière à avoir une puissance suffisante pour l’analyse statistique pour toutes les évaluations réalisées dans les différents groupes au cours du temps. Ces calculs ont été possibles grâce aux résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentés, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. le déficit neurologique sera également évalué à l’aide d’une grille de score bien définis.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés
Rôle du stress oxydant mitochondrial et de la sénescence dans l’insuffisance cardiaque post-ischémique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque de 70 minutes avec ligature d'une artère coronaire pendant 30 minutes pour provoquer un infarctus, puis un traitement pharmacologique et une échocardiographie à 28 jours. Le porteur indique des risques d'hypotension, de refroidissement et de douleurs postopératoires aux nerfs intercostaux, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cardiaques. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative ni de modélisation possible" pour l'ischémie-reperfusion myocardique et décrit un "besoin" urgent de nouveaux traitements.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la seconde cause de mortalité en France (environ 150 000 morts/an). Elles ont le plus souvent pour origine une atteinte ischémique (déprivation en oxygène) du myocarde, pouvant évoluer à plus long terme vers une insuffisance cardiaque (IC), ou le cœur n’est plus capable d’assurer la perfusion des tissus. Alors que l'incidence de l’IC augmente continuellement du fait du vieillissement de la population, les traitements demeurent insuffisants. Une meilleure connaissance des mécanismes à l’origine du développement de l’IC pourrait ainsi permettre de proposer des nouvelles thérapies. La recherche dans ce domaine demeure un enjeu majeur de santé publique. Notre projet vise à identifier des nouvelles interventions pour contrer le développement de l’IC, dans des modèles murins expérimentaux mimant la pathologie humaine. L’équipe s’intéresse en particuliers au stress oxydant qui est augmenté suite à un infarctus du myocarde. Cela entraine des effets délétères sur le coeur, pouvant altérer sa fonction de contraction. Notre projet consistera donc à évaluer le rôle préventif de l’inhibition des voies du stress oxydant, sur un modèle d’IC induit de manière chirurgicale chez le rat mimant un infarctus du myocarde. Nous étudierons ainsi les effets protecteurs de plusieurs composé sur le développement de l’IC par échocardiographie et analyse des tissus.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une IC dans à long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, l’IC post-infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’ischémie-reperfusion myocardiaque (ligature coronaire). La durée totale de l’intervention est de 70 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. Pour les groupes traités, un traitement pharmacologique sera mis en place 24 h après la chirurgie. A l’issue des 28 jours, les rats seront soumis à une échocardiographie non invasive et non douloureuse.
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel. Après la chirurgie thoracique, d’éventuelles douleurs post-opératoires au niveau des nerfs intercostaux pourront être réduites par injection d’analgésiques. A plus long terme, le développement d’une insuffisance cardiaque sera surveillé (au vu des points limites).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour récupérer les tissus cardiaques pour analyser les effets bénéfiques des traitements sur le développement de l’insuffisance cardiaque.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, le développement de l’insuffisance cardiaque met en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
La stratégie d’expérimentation repose sur l’hypothèse d’une modification du développement de la pathologie par les interventions pharmacologiques. Pour calculer le nombre d’animaux utilisés pour chaque expérimentation nous utilisons nos résultats d’expériences préliminaires. D’après l’ensemble de nos estimations, chaque groupe (malade, sain, traité) comportera 15 rats. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur un même rat: fonction cardiaque par échocardiographie, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Les animaux seront élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l’état général). Les manipulations seront réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésiques avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les rats sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez le rat est bien maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l’évaluation de l’insuffisance cardiaque. Nous utiliserons des rats de 8-10 semaines pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la mortalité liée au vieillissement.
Rôle des oestrogènes dans le microenvironnement tumoral: angiogenèse et lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois chirurgies, ovariectomie, implantation d'un comprimé d'hormonothérapie, injection de cellules tumorales ou curage ganglionnaire, précédées d'injections de tamoxifène, pour étudier l'effet des œstrogènes sur le microenvironnement d'une tumeur mammaire et sur le lymphœdème. Le porteur qualifie de modérées les douleurs liées aux chirurgies et au développement des tumeurs, et prélève les organes en fin de vie. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement ne permet d'étudier ces processus et que la souris est le seul modèle disponible.
Objectifs
L'hormonothérapie est un des premiers traitements du cancer du sein exprimant le récepteur des oestrogènes (dit ERα-positif) et a permis de réduire largement le nombre de récidives chez les patientes et ainsi d'augmenter la survie chez ces femmes. Or, l'impact de ce traitement sur le micro-environnement de la tumeur, de tumeurs dites ERα-négatives (n'exprimant pas le récepteur des oestrogènes), est encore mal connu, alors qu'une certaine efficacité a été observée dans les premiers essais cliniques . De plus, de nombreuses résistances apparaissent, ainsi que des lymphoedèmes secondaires qu'il reste à mieux comprendre pour mieux le traiter. Le lymphodème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer et qui est souvent associée à ces traitements d'hormonothérapie. Ce projet cherche donc à mieux caractériser l'impact de cette hormonothérapie sur le micro-environnement tumoral dans le cadre du cancer du sein, pour trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce travail est un travail qui étudie les mécanismes d'actions spécifiques du récepteur des oestrogènes ERα dans la réponse à un traitement d'hormonothérapie par les SERMS (Selective Estrogen Receptor Modulators) sur les cellules endothéliales, non seulement sur les cellules endothéliales vasculaires mais aussi sur les cellules endothéliales lymphatiques. Cette étude permettra à terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers ERα négatives , en particulier là où les autres stratégies anti-angiogéniques ont échoué. De plus, cette étude de l'impact d'ERα dans la réponse à l'hormonothérapie sur le réseau lymphatique permettra de mieux comprendre le développement du lymphoedème secondaire à la chirurgie du cancer du sein afin d’améliorer les traitements et la qualité de vie des patientes ayant subi un curage ganglionnaire.
Procédures
Les animaux pourront subir jusqu'à 3 chirurgies (ovariectomie (durée 20 min),implantation petit comprimé pour traitement par l'hormonothérapie (durée 5 min), injection de cellules tumorales (durée 5 min) ou curage ganglionnaire ( durée 30 min)) après 5 injections consécutives de Tamoxifène pour induire la Cre-recombinase sur les animaux transgéniques génétiquement modifiées. Toutes ces procédures sont espacées de 2 à 3 semaines pour laisser à l'animal le temps de récupérer des chirurgies et du stress éventuel occasionné. Tous les prélévements sont effectués en phase terminale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (tumeurs, poumons, pattes, utérus, foie) et réaliser des analyses immunohistochimiques et/ou moléculaires
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de l'hormonothérapie (anti-oestrogènes) dans le cadre du traitement du cancer du sein. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de la réponse à l'hormonothérapie . De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes a été générée. De plus, c'est le seul modèle où l'on peut avoir un suivi de la croissance tumorale avec formation de métastases.
Effet de l’exposition à de haute tension d’oxygène sur les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, jusqu'à douze pour certaines, et des prélèvements sanguins, pour étudier l'effet d'un composé libérant l'oxygène sur les cellules souches du sang dans la moelle osseuse. Le porteur signale comme atteintes des douleurs aux points d'injection et le stress lié aux manipulations. Il affirme qu'il faut mener l'étude sur des individus vivants et met à mort les souris pour analyser leurs cellules.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l'oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent dans la moelle osseuse (MO) à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH) tout au long de la vie des individus. L'ensemble des mécanismes biologiques qui gouvernent l'auto-renouvellement et la différenciation des CSH ne sont pas totalement élucidés. Chez l’homme, la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies. Une meilleure compréhension de ceux-ci permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour traiter les patients. Les CSH sont maintenues dans la moelle osseuse qui constituent leur niche. Il a été montré que le faible niveau d’oxygène présent dans cette niche est essentiel au maintien des CSH en dormance. Récemment un dérivé synthétique qui augmente la libération de l’oxygène dans les tissus et le sang a été développé. Ce dérivé est utilisé pour rétablir des niveaux d’oxygène normaux dans le traitement de cancers solides. Ce composé est actuellement en essai clinique phase II pour le traitement de patients atteint de cancer du pancréas. Notre but est de définir si des niveaux d’oxygène plus importants dans la niche des CSH, lors de traitement avec ce composé, perturbent le maintien des CSH et conduisent à des dérégulations de ces cellules.
Bénéfices attendus
Nous espérons par ces expériences mettre en évidence qu’un niveau d’oxygène plus important dans la niche perturbe la maintenance des CSH et influence leur différenciation qui peut être à l’origine d’un vieillissement prématuré du système hématopoïétique ou d’immunodéficience. Il est important de connaitre les effets de composés libérant l’oxygène dans les tissus puisque des patients atteints de cancer solides sont traités avec ces substances. Une meilleure connaissance du développement des CSH en présence de traitement augmentant l’oxygène dans les tissus permettra d’adapter plus précisément le traitement de patients atteints de cancer.
Procédures
12 souris seront injectées 4 fois, 12 autres souris 8 fois et 12 autres souris 12 fois. La durée du temps d’injection est inférieure à une minute. 12 animaux seront soumis à des prélèvements sanguins prélevés 2 fois à 4 semaines d'intervalles et 12 autres seront prélevés 1 fois. Le prélèvement de sang est de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les nuissances sur les animaux dans ce protocole sont les douleurs au niveau des sites d'injection de l'ITPP et le stress des animaux lors de ces injections et durant les prises de sang.
Devenir
Les souris injectées intrapéritonéalement seront mises à mort pour être analysées et évaluer les effets du traitement.
Remplacement
Les cellules souches hématopïétiques (CSH) se développent dans une niche de la moelle osseuse. Cet environnement particulier permet d’établir un gradient d’oxygène faible dans les zones périphériques (près de l’os) et élevé dans les zones vascularisées centrales. Les CSH sont maintenues dans les zones faibles en oxygène. Nous cherchons à définir si un traitement anti-hypoxie mené sur un individu peut affecter ces CSH dans leur environnement. Pour cela il est important de mener l’étude sur des individus vivants.
Réduction
Ces expériences seront réalisées sur 6 animaux pour les traitements avec le composé et comparées à 6 animaux contrôles pour chaque temps de traitement analysé (4, 8 et 12 semaines). A l'aide de tests statistiques utilisés nous serons en mesure de conclure.
Raffinement
Pour le raffinement : puisque les souris peuvent êtres immunodéficientes elles seront hébergées en cages ventilées et filtrées et manipulées sous -hotte pour maintenir un environnement le plus aseptique possible. Nous serons très vigilants pour être dans les conditions les plus aseptiques possibles lors des injections intrapéritonéales ainsi que lors des prises de sang.Si les animaux présentent des signes de souffrance (perte de poids supérieur à 20% ou prostration de l'animale) liées au traitement nous éliminerons ces animaux par euthanasie et chercherons à déterminer les causes de ces souffrances. Si des antibiotiques ou des analgésiques peuvent éliminer les souffrances animales détectées nous les utiliserons.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'analyse du développement des CSH dans la moelle osseuse. De nombreux réactifs (anticorps permettant d'identifier les CSH notament) pour mener à bien ces analyses sont disponibles. De plus les études visant à traiter les cancers humains à l’aide de composé favorisant la libération de l'oxygène ont été menées chez la souris, indiquant que cet animal est un modèle de choix pour l’étude de ce composé. Les animaux sont utilisés à partir 6 semaines ce qui correspond au stade de maturité adulte du système hématopoïétique et avant 6 mois pour ne pas introduire un biais dans les résultats avec des animaux vieillissants.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet jumeau d'un même protocole multicentrique impose à chaque animal deux chirurgies cardiaques espacées de quatre semaines, des séances d'imagerie sous anesthésie, des courses forcées sur tapis roulant et des prélèvements sanguins, pour caractériser la récupération du cœur après un stress pathologique transitoire. Les bénéfices avancés pour l'Homme restent formulés au conditionnel et à long terme, l'objectif immédiat étant le séquençage des gènes exprimés dans le cœur. Le porteur décrit l'insuffisance cardiaque comme une atteinte de l'"organisme entier" et affirme la "nécessité" du modèle murin.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du cœur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de cœurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront déployées dans 2 zootechnies disposant d'outils et compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbi-mortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Elles constituent les sources de douleur (chirurgies et période post-opératoire) mais toutes les mesures d’analgésie nécessaires et validées seront prises pour l'empecher. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en œuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances et techniques acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible thérapeutique identifiée lors de la réalisation du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur et l'inactiver.
Rémission de la pathologie cardiaque pour un vieillissement de qualité : recherche et validation d’acteurs moléculaires dans un modèle murin EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cardiaques, une pour induire la pathologie puis une pour la corriger quatre semaines plus tard, suivies d'échographies et de scanners sous anesthésie, de courses forcées sur tapis roulant et de prélèvements sanguins répétés, pour étudier le remodelage inverse du cœur. Les retombées annoncées pour les patients, un vieillissement en meilleure santé et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, alors que l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes moléculaires. Le porteur affirme que l'insuffisance cardiaque touche l'"organisme entier", ce qui rendrait une approche in vivo "indispensable", et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles, d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du coeur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront conduites dans 2 zootechnies disposant d'outils et de compétences complémentaires.
Bénéfices attendus
traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.
Procédures
La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.
Impact sur les animaux
L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie nécessaires pour prévenir et empecher la douleur sont prises. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.
Devenir
Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).
Réduction
L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico (modélisation informatique) et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.
Raffinement
Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.
Choix des espèces
La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible identifiée au point 1 du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur qui l'inactiverait.