Système cardiaque

208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour deux gènes de l'horloge biologique, elles sont gavées cinq jours par semaine pendant trois semaines et placées dans des caissons appauvris en oxygène, en continu ou par cycles reproduisant l'apnée du sommeil, avant une mesure de pression cardiaque et la mort pour prélever les organes. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une perte de poids et que les caissons génèrent stress, bruit et fatigue par mauvais sommeil. Il cherche à savoir si le rythme circadien protège de la sénescence pulmonaire et reconnaît que ce rythme s'étudie difficilement in vitro.

Objectifs

L’impact de la sénescence sur le fonctionnement du rythme circadien, et inversement, commence à être mis en évidence dans plusieurs travaux montrant des altérations de l’horloge circadienne avec l’âge, chez l’homme et chez la souris. La sénescence cellulaire correspond à l’arrêt de la prolifération et à la perte des fonctions initiales de la cellule. C’est un phénomène qui peut survenir après différents stress ou bien naturellement au cours des divisions successives. La sénescence cellulaire est aujourd’hui considéré comme un processus important dans de nombreuses maladies liées à l’âge. Les protéines p21 et p16, régulateurs du cycle cellulaire, sont deux des principaux marqueurs de la sénescence. D’autre part, le rythme circadien chez les mammifères est généré par des oscillations de l’expression de gènes spécifiques au niveau cellulaire (gènes circadiens). Rev-Erb alpha et Bmal -1, deux composants clés de l’horloge circadienne, sont capables d’interagir avec p21, indiquant un lien avec le cycle cellulaire, et potentiellement avec la sénescence. Des résultats obtenus dans un modèle d’apnée du sommeil chez la souris montrent une dérégulation de ces gènes circadiens, ainsi qu’une altération de l’expression de p21 dans le poumon. D’autre part, l’exposition de souris à l’hypoxie chronique (pour modéliser l’hypertension artérielle pulmonaire) induit une accumulation de cellules sénescentes dans le poumon. Nous cherchons à déterminer si le rythme circadien joue un rôle protecteur contre la sénescence, dans des conditions normales ou pathologiques. Nous utiliserons pour cela deux modèles de souris dans lesquels les gènes Rev-Erb alpha ou Bmal-1 sont non-fonctionnels. Ces souris seront exposées à l’hypoxie chronique, ou à l’hypoxie intermittente (modèle d’apnée du sommeil) afin de reproduire des conditions similaire à celles observées dans deux pathologies humaines affectant le poumon. Nous traiterons les souris avec une molécule permettant d’éliminer spécifiquement les cellules sénescentes (molécule sénolytique). Cette étude permettra finalement de comprendre : 1) comment est impacté le processus de sénescence cellulaire chez des souris génétiquement modifiées présentant un rythme circadien altéré. 2) comment l'élimination des cellules sénescentes par un traitement pharmacologique corrige les altérations induites par l’exposition au stress hypoxique et par le défaut des gènes circadiens.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront de décrire plus précisément le lien suspecté entre rythme circadien et sénescence, suggéré dans plusieurs travaux récents, ainsi que d’explorer les mécanismes d’interaction entre les deux processus. A terme, cette étude permettra d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour agir indirectement sur la sénescence en ciblant le rythme circadien. Comprendre les différents facteurs pouvant impacter la sénescence est important pour pouvoir envisager des traitements et/ou déterminer des facteurs de risques, dans le contexte d’une population vieillissante.

Procédures

Les animaux seront gavés 5 jours par semaine pour les traitements par la molécule sénolytique ou le placebo pendant une durée de 21 jours. Pendant cette durée, ils seront placés dans des caissons à hypoxie et hypoxie intermittente, dans lesquels est injectée de l’azote afin de réduire la concentration en oxygène soit : en continu pour l’hypoxie chronique, afin d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patient atteint de broncho-pneumopathie obstructive chronique ; de façon cyclique pour reproduire les cycles d’hypoxie/réoxygénation observés chez les patients atteints d’apnée du sommeil. A la fin de la procédure, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés pour la prise de la pression ventriculaire, suite à quoi ils seront euthanasiés pour le prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie et l'hypoxie intermittente en début de procédure. Les caissons d'hypoxie intermittente peuvent créer un stress dû au bruit généré par la machine et à l'hypoxie au début de l'expérimentation, ainsi qu'une fatigue chez les souris dû à une faible qualité de sommeil. Le gavage est aussi une source de stress pour les souris.

Devenir

L'étude nécessite le prélèvement des organes (poumons, cœur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologique (quantification des marqueurs de sénescence, expression des gènes circadiens) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon) les animaux seront donc mis a mort à la fin des procédures.

Remplacement

Le rythme circadien peut difficilement être étudié in vitro. En effet une fois mise en culture, les cellules ont tendance à perdre l’expression rythmique des gènes circadiens et à se désynchroniser entre elles, ce qui est problématique pour étudier des effets à moyen et long terme. De plus, les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire fidèlement les concentrations d’oxygène qui varient de manière complexe en fonction des organes, tissus et du métabolisme, ce qui est problématique pour étudier un modèle impliquant l’hypoxie et l’hypoxie intermittente, où les changements de la concentration d’oxygène sont récurrents. Cependant, nous utiliserons en parallèle un modèle de culture cellulaire pour étudier l’interaction entre Rev-Erb alpha et p21.

Réduction

Nous choisissons de réaliser des groupes de taille suffisante pour atteindre une puissance statistique satisfaisante, ce qui nous évitera d’avoir à recommencer l’expérience pour cette raison. Par ailleurs, les groupes ont été pensés afin de réduire le nombre d’animaux tout en ayant les contrôles nécessaires à l’analyse correcte des résultats. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même portées pour réduire au maximum la variabilité des données. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.

Raffinement

Les zootechniciens et les investigateurs du projet seront en communication concernant le bien-être et la santé des animaux qui seront surveillés quotidiennement. L'environnement des souris sera enrichi par des maisons ou tube en carton, du papier kraft et du coton. Le gavage sera effectué par un même expérimentateur afin de réduire le stress des souris. Les souris recevront une anesthésie et analgésie adaptée avant la mise à mort. Pendant la durée des procédures, des critères d’évaluation et des points limites adaptés seront utilisés afin de détecter des signes de souffrance, et de procéder si nécessaire à la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

Les modèles d'hypoxie intermittente et d'hypoxie chronique que nous souhaitons utiliser sont bien décrits dans la littérature, ils ont fait l'objet de plusieurs publications notamment dans le domaine des maladies vasculaires et pulmonaires. On utilisera des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et on considère que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour évaluer dans quelle mesure l'accumulation de cellules sénescentes altère le rythme circadien.

100 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes maintenues en vie pour être utilisées ensuite dans un second projet. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation d'un dispositif ECG et d'un stimulateur cardiaque au cours d'une chirurgie de quatre heures, puis une stimulation rapide du cœur destinée à installer une fibrillation auriculaire durable, avec examens d'imagerie et prélèvements répétés pendant trois à six mois. Le porteur indique que la fibrillation reste asymptomatique chez la brebis et qu'aucune n'est morte de complications au laboratoire. Il présente ce modèle comme destiné à la communauté scientifique et à des "partenaires industriels", et affirme qu'aucune méthode de substitution ne reproduit la fibrillation et sa réponse aux traitements.

Objectifs

L’objectif est ici de rendre ce modèle accessible à l’ensemble de la communauté scientifique et clinique de l’institut ainsi qu’à nos partenaires industriels. Ce projet vise à créer et étudier des animaux en fibrillation auriculaire (FA) chronique afin qu’ils puissent être utilisés dans d’autres projets. Ces derniers auront pour objectif d’étudier la pathologie sous différents angles, notamment pour ce qui concerne les remodelages cardiaques classiques (électrique et structurel) mais également les changements systémiques en termes biomarqueurs et d’autres organes. En parallèle, ce modelé fournira un contexte beaucoup plus similaire aux patients afin de développer des outils diagnostiques et thérapeutiques avec nos partenaires industriels.

Bénéfices attendus

La création d’un modèle de FA permet l’investigation de plusieurs mécanismes favorisant ou perpétrant la maladie. Cela peut par conséquent nous amener à l’individuation des nouvelles cibles thérapeutiques, donnant des possibilités de thérapie pharmacologiques innovants – notamment compte tenu que les courants traitements pharmacologiques sont très limités et peu efficaces. D’ailleurs les thérapies interventionnelles comme l’ablation par radiofréquence et par champs pulsés, ainsi que les outils et logiciels diagnostiques, seront validés de manière beaucoup plus similaire au contexte clinique, améliorant leur développement et validation

Procédures

Les animaux subiront primariament l’implantation, sous anesthésie générale et angiographie, d’un dispositif de monitorage ECG (télémétrie) et d’un stimulateur cardiaque, ce qui nous permet d’appliquer un protocole de stimulation atriale rapide conduisant à une fibrillation auriculaire persistante. Cette intervention aura une duree de 4 heures. Avant l’implantation et pendant le suivi les animaux subiront, tous les 15 ou 30 jours selon la typologie, des examens d’imagerie et de cardiographie cardiaque, ainsi que de prelevements de sang, urine et selles. Ces interventions seront sous anesthesia generalepour une duree de 4-6 heurs. La durée du suivi est de 3 a 6 mois apres implantation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes procédures, notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie). Cependant ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM, scanner et électrophysiologique) sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la FA mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis en FA est très bien maîtrisé au laboratoire depuis de nombreuses années et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la FA chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais à noter que l’installation de la FA est asymptomatique chez la brebis ainsi les brebis saines et en FA sont indiscernable au niveau du comportement et de l’aspect physique.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie sur avis de la responsable d'animalerie et/ou vétérinaire, pour entrer ensuite dans un second projet et en accord avec la demande de projet justifiant la création du modèle de fibrillation auriculaire chronique.

Remplacement

Aucune méthode de substitution (modèle de cœur en matériau synthétique par exemple, ou simulateur) n’est à l’heure actuelle disponible pour permette de reproduire les phénomènes physio-pathologiques de la FA et sa réponse à des méthodes thérapeutiques. D’autre part, la fibrillation auriculaire induit également une réponse systémique impossible à évaluer dans un modèle in-silico. Il n’est donc pas envisageable de s’affranchir de l’évaluation in-vivo sur un modèle animal dont les caractéristiques anatomiques et fonctionnelles sont proches de l’homme.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, toute utilisation d’un animal dans ce projet de création de modèle pathologique se fera uniquement si l’animal est prévu dans un projet ultérieur programmé ET autorisé. Aucun modèle animal FA chronique sera créé sans que cette condition ne soit remplie. De plus chaque animal sera son propre contrôle grâce aux examens complémentaires d’imagerie et de cartographie qui pourront être réalisés en ligne de base, servant ainsi de contrôle interne pour les examens réalisés ensuite.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté. L’angoisse, la douleur et la souffrance seront réduites par une prémédication incluant un analgésique. Nous allons monitorer les parametres vitaux pendant toutes les procedures et les interventions, avec des procedures mise en place en cqs d’urgence. Durant les périodes intermédiaires entre les procédures, nous allons poursuivre l’administration de medicament au besoin, et nous allons continuer une monitorage quotidian de l’etat de santé des animaux. Les observations anomales seront prise en charge par le vétérinaire de l’EU avec l’accord du responsible de projet. La télémétrie permettra de raffiner le protocole en évaluant la vitesse de progression de la FA, la complexité de l’arythmie et son impact sur la function cardiaque. La télémétrie permet de réaliser des enregistrements pendant 160 jours en mode continue ou sur plusieurs années en fonction de la gestion des enregistrements. Cela nous permet de repondre rapidement en cas de stress de l’animal. La procédure expérimentale d’implantation du boitier de télémétrie est maîtrisée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le mouton a été retenu car (i) les équipes de l’IHU possèdent une très grande expérience sur la création du modèle de FA dans cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion des ovins. Ovins : adultes à partir de 7 ans afin d'obtenir une anatomie et un modèle transposable à l'Homme.

100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.

Objectifs

Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.

Impact sur les animaux

Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.

Devenir

La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.

Remplacement

Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.

Réduction

Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.

Choix des espèces

L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.

2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie provoquant un infarctus par ligature définitive d'une artère coronaire, un quart d'entre elles ayant en plus la rate retirée, avec des injections de vésicules extracellulaires et des échographies sous anesthésie. L'objectif est de comprendre le rôle de ces vésicules dans la réparation du cœur après infarctus, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que ces phénomènes complexes ne peuvent être recréés in vitro et que le modèle murin est "absolument nécessaire et indispensable".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires et l’infarctus du myocarde en particulier sont l'une des premières causes de mortalité dans le monde. La compréhension des mécanismes impliqués dans cette maladie est nécessaire pour le développement de thérapies visant à améliorer la survie après infarctus et constitue ainsi un enjeu médical et sociétal majeur. La mort du tissu cardiaque infarci déclenche une réponse inflammatoire qui est essentielle pour la réparation cardiaque. Cette réponse inflammatoire repose sur la communication efficace entre les cellules inflammatoires et les cellules cardiaques. Lors d’un infarctus, les cellules cardiaques libèrent des fragments de leur membrane, les vésicules extracellulaires (VE). Ces VE exercent leur activité biologique par le transfert de leur contenu (protéines et acides nucléiques) vers des cellules cibles, ce qui en fait de véritables messagers intercellulaires. La composition de ces VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire et la réparation cardiaque est inconnu. Le but de notre projet est de définir les mécanismes moléculaires qui contrôlent cette communication intercellulaire par les VE cardiaques, leur rôle dans la réparation cardiaque après infarctus du myocarde. Divers modèles de souris génétiquement modifiées nous permettront d’analyser spécifiquement le rôle de ces VE. Les animaux subiront un infarctus du myocarde. L’analyse consistera à caracteriser la composition des VE cardiaques ainsi que leur rôle dans la réponse inflammatoire, la fonction et le remodelage du coeur après infarctus.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de définir les mécanismes de communication cellulaire qui controllent la réparation cardiaque lors de l’infarctus du myocarde. La caractérisation de ces mécanismes clés est essentielle au développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à favoriser la réparation du coeur infarci et ainsi favoriser la survie.

Procédures

Chaque animal va subir une procédure chirurgicale de 20 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde expérimental est réalisé par ligature permanente de l’artère coronaire antérieure gauche. Un tiers de ces animaux seront injectés avec des VE purifiées (injection intracardiaque ou intraveineuse) afin d'évaluer le rôle des VE dans la réparation cardiaque. Un quart des animaux de ce projet sera préalablement splénectomisé. La splénectomie est une procedure chirurgicale de 10 minutes. Pour chacune de ces procédures, trois injections sous-cutanées d’analgésiques (50 µL, durée inférieure à 5 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents jours après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Per-opératoire Inconfort au point d'injection. Douleur post-opératoire adequatement soulagée par des analgésiques. Post-opératoire L'etat de santé des souris sera suivi quotidiennement pour les 5 premiers jours puis de manière hebdomadaire par la suite. Toute dégradation de l'etat de santé (ex: douleur refractaire au tratiement antalgique, infections, insuffisance cardiaque) sera minutieusement evalué en rapport à une grille de points limites. Les traitements adéquats seront mis en place tant que les limites ne sont pas atteintes. Dès qu'une de ces limites est atteinte, les animaux concernés seront mis à mort immédiatement.

Devenir

Toutes les procédures de ce projet sont terminales et par consequent, les souris sont mises à mort.

Remplacement

Pour respecter le principe des 3R, nous avons évalué nos hypothèses in vitro avec des cultures de cellules cardiaques et de macrophages autant que possible avant de l’étudier dans un modèle murin. Cependant, ces modèles murins sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes, que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la complétion de ce projet a été calculé au plus juste ajusté par l’utilisation de tests statistiques déterminant la taille minimale des groupes expérimentaux. Le nombre d'animaux est ainsi calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait pour détecter un changement de 20% de la fraction d'éjection ventriculaire gauche par échocardiographie. Ces tests déterminent un nombre de 15 souris par groupe. Pour deux groupes, en supposant quelques problèmes de traitement des tissus et la mortalité inhérente à la procédure, nous estimons une taille de groupe de 15 animaux. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal : analyses échocardiographiques, anatomopathologiques, immunohistochimiques ainsi que des analyses des ARN, protéines et cellules cardiaques.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées pour les procédures et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux seront élevés en cages enrichies avec maisonnettes, batônnets en bois et coton et avec eau et nourriture ad libitum dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Après la procédure chirurgicale, les animaux sont placés dans une cage de réveil chauffée et enrichie, sous surveillance jusqu’au réveil complet. Ensuite, les animaux retournent avec leurs congénères, dans une cage d’hébergement enrichie. La stratégie antalgique sera systématiquement poursuivie en post-opératoire pendant 48 heures. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs confirmés pendant les 5 premiers jours post-opératoires, puis par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Pour l’infarctus du myocarde et l’échographie, les animaux sont placés sur une plaque chauffante thermorégulée dès l’induction de l’anesthésie.

Choix des espèces

Le choix des souris permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettront de comprendre le rôle des VE cardiaques dans le remodelage cardiaque après infarctus du myocarde. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 10 à 15 semaines, chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une injection de streptozotocine pour induire un stress oxydant, tous sont gavés d'eau ou d'extraits de tomate ou de baie de goji, puis anesthésiés pour des mesures de fonction vasculaire avant prélèvements. L'objectif déclaré est d'évaluer l'effet antioxydant de poudres alimentaires, la tomate étant décrite comme un ingrédient stratégique pour l'industrie agroalimentaire. Le porteur affirme qu'aucun modèle de substitution in vitro n'existe pour évaluer l'impact d'un aliment sur la fonction vasculaire.

Objectifs

L'objectif est d’évaluer l’effet antioxydant de poudres issues de différents lots de tomates contrastées ainsi que d'un lot de baie de goji. En effet, la tomate et la baie de goji sont des aliments dont la consommation est associée à des effets bénéfiques pour la santé, mais leur profil nutritionnel dépend du génotype et des conditions de production. La poudre de tomate est un ingrédient stratégique pour l’industrie agroalimentaire et utilisée dans diverses préparations (soupes, snacks, préparation pour bébés). Les effets santé de la tomate sont partiellement attribués aux caroténoïdes qui sont reconnus, entre autres, pour leur rôle d’antioxydants ou de précurseurs biodisponibles de la vitamine A. La tomate est la première source d’apports alimentaires en lycopène, un caroténoïde principalement accumulé dans le tissu adipeux et ayant des propriétés antioxydantes importantes. Lors de la digestion, les caroténoides sont métabolisés et distribués dans l'organisme. Peu d'études mettent en évidence un effet protecteur de ces métabolites sur la fonction cardiovasculaire in vivo. De plus, l'effet propre au génotype de tomate associé à son cocktail de micronutriments ainsi que celui de la baie de goji, au delà des caroténoides, reste à évaluer.

Bénéfices attendus

Le projet doit apporter une meilleure connaissance des mecanismes de protection apportés par les caroténoides et antioxydants présent dans notre alimentation.

Procédures

La moitié de animaux recevra une injection intrapéritonéale d'une molécule induisant une hausse de la glycémie 72 heures avant l'évaluation de la fonction vasculaire. Les animaux seront soumis à une supplémentation orale aigue (1 traitement oral) en eau ou extraits de tomate ou baies de goji (15ml/kg). Une anesthésie sera réalisée et associée à une injection d'analgésique afin de réaliser des doses-réponse de molécules vasomotrices au niveau des tissus vasculaires.

Impact sur les animaux

La supplémentation par voie orale ainsi que l’induction de l’anesthésie gazeuse pouvant être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal, les animaux seront habitués au gavage par un manipulateur expérimenté. L'injection de Streptozotocyne peut entrainer des douleurs faibles au site d'injection. De plus, l'induction de l'anesthésie et la mise en place du stress oxydant par injection de Streptozotocine se tiendront strictement en dehors du lieu d'hébergement.

Devenir

La réalisation de prélèvements sanguins et tissulaires post-mortem nécessite la mise à mort des 100 rats Wistar en fin de procédure.

Remplacement

L'impact d'un stress oyxdant et les potentiels effets compensatoires apportés par la consommation d'une préparation à base de tomate ou de baies de goji sur le flux de perfusion ne peut s'étudier qu'à l'aide d'un modèle in vivo sur l'animal. En effet il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l'impact d'un aliment sur la fonction vasculaire.

Réduction

Compte tenu de la variabilité et de la stabilité de la mesure, Un n de 10 animaux par groupe apparait comme le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des variations relatives de 10% de flux de perfusion entre les groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, pour s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu ((tubes, coton, bâtons à ronger). La température et l’hygrométrie sont contrôlées dans des conditions constantes de température avec des cycles jour/nuit de 12 heures et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les procédures seront réalisés sous anesthésie associée à une analgésie. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Cette période d'habituation vise à diminuer le stress lié à la préhension et au gavage.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie digestive et cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Afin d'éviter des modifications liées au développement des animaux, les animaux seront utilisés à un stade mature (rats de 12 semaines) pour être représentatif d’une population adulte.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans une maladie rénale inflammatoire. Une glomérulonéphrite est induite par injection d'un sérum, avec collecte d'urine par pression sur la vessie et prises de sang, une partie des souris étant irradiée pour détruire leur moelle osseuse ou opérée du rein pour y injecter des particules virales. Le porteur décrit une présence de protéines dans les urines et un gonflement du ventre, et fixe une durée limitant l'aggravation de la maladie, avant mise à mort pour analyser les reins. Il affirme que la fonction rénale et la circulation sanguine ne peuvent se reproduire in vitro.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de determiner si notre protéine d'intêret, un inhibiteur d'enzymes vasculaire, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Notre hypothèse est que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. De plus nous voulons déterminer quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.

Procédures

La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 14 jours. Pour cela, de l'urine, émise spontanément par la souris pendant quelques secondes en pressant la vessie, sera collectée tous les 3 jours et un prélèvement sanguin durant quelques minutes sera effectué après 7 jours. Un groupe de souris sera auparavant exposé à des rayons X afin d'éliminer les cellules de la moelle osseuse qui sont remplacées le lendemain par injection intraveineuse de cellules de la moelle d'autres souris qui n'ont pas notre protéine d'interêt. Un autre groupe de souris sera auparavant injecté soit par voie intraveineuse, soit directement dans le rein par une procédure chirurgicale avec des particules virales qui permettent de modifier la production de notre protéine d'intêret. A la fin des procédures,un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale et les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal). La durée du protocole est établie pour éviter un développement trop important de la maladie et donc éviter au maximum la souffrance des animaux. Ils sont cependant anesthésiés plusieurs fois pour réaliser des injections et prélèvements sanguins et certains auront une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.

Remplacement

L'étude des cellules, celle de la fonction de l'inibiteur vasculaire étudié et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt ou de l'injection des particules virales, nous ne ferons pas de deuxième groupe.

Raffinement

La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. Les prélèvements sanguins et la chirurigie seront effectuées sous anesthésie et analgésie. Un antibiotique est donné après l'exposition aux rayons X pour éviter toute infection.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.