Système cardiaque

232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par un régime gras de douze semaines, elles subissent une constriction chirurgicale de l'aorte pour provoquer un stress cardiaque, puis des échocardiographies et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, afin d'étudier le rôle de l'enzyme PIKfyve. Le porteur indique que cette chirurgie a déjà entraîné 10 % de mortalité post-opératoire. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de se passer du modèle animal en physiopathologie cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est un problème majeur de santé publique, dont la prévalence augmente fortement, principalement à cause de l’obésité et du diabète de type 2. Nos études précédentes ont montré que l’enzyme PIKfyve est un acteur majeur dans la progression de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, son rôle exact reste à élucider, notamment dans le contexte de l’insuffisance cardiaque liée à l’obésité. L'objectif de ce projet est de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque liée au diabète en utilisant un modèle de souris dont le gène PIKfyve est non-fonctionnel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre le rôle de PIKfyve dans la progression de l'insuffisance cardiaque en lien avec l'obésité et le diabète de type 2, problématique majeure de santé publique, et permettra d'améliorer nos connaissances sur la progression de cette pathologie multifactorielle et complexe.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2 (n=96, pendant 12 semaines); 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque (n=96, durée de l’intervention : 1h); 3/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux (n=192, durée de l’intervention 15min); 4/ une mesure de la composition corporelle (n=192, durée de la procédure : 2min); 5/ un test de tolérance au glucose afin de mesurer le métabolisme glucidique (n=192, durée de l’intervention : 3h); 6/ un test de tolérance à l'insuline afin d'étudier la sensibilité des animaux à l'insuline (n=192, durée de l’intervention : 3h).

Impact sur les animaux

Le régime riche en gras induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime riche en gras auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La procédure chirurgicale de constriction transverse de l'aorte (TAC, ou aortic banding) peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Afin de limiter la douleur occasionnée par la chirurgie, nous utiliserons un analgésique lors du protocole chirurgical. La lignée invalidée pour PIKfyve dans le cœur est une lignée déjà établie et qui a fait l'objet d’une étude rétrospective démontrant aucun effet néfaste chez la souris. L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté. Pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, les prélèvements sanguins sont réalisés au niveau de la veine caudale afin de limiter la douleur occasionnée à l'animal, à 2 semaines d'intervalle afin de garantir un repos suffisants aux animaux. Les volumes prélevés conformes aux BPL. Une surveillance sera assurée par un zootechnicien afin de s'assurer de l'absence de saignements après réintroduction des animaux dans les salles d'hébergement.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements d'organes nécessaires.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de méthode alternative validée permettant de s’affranchir du modèle animal pour les études de physiopathologie cardiaque.

Réduction

Le critère principal de jugement de la fonction cardiaque sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales : anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal, traitement analgésique après réveil et 24h après l'opération. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal, selon une grille de score établie. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage. Le franchissement de ces points limites précoces conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux obèses et diabétiques dont un gène a été rendu non-fonctionnel. A ce jour, seul le modèle de souris (Mus musculus) permet de réaliser ces études. Les animaux utilisés seront âgés de 2 mois, correspondant au stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature car ils sont les plus réceptifs à la procédure chirurgicale et au régime riche en gras.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vieillies puis soumises trois mois à un régime gras déséquilibré, elles subissent un test de tolérance au glucose puis une chirurgie d'accident vasculaire cérébral de dix à quarante minutes, qui provoque une douleur peropératoire, des pertes sensorimotrices et une perte de poids. Le porteur indique qu'une première étape sert surtout à choisir le meilleur modèle et à faire acquérir le geste chirurgical par deux personnes du laboratoire. Il écarte le remplacement en affirmant que l'étude ne peut s'envisager que dans un "organisme entier", et justifie la mise à mort par le prélèvement des tissus.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est dans un premier temps de déterminer le meilleur modèle d’étude de la maladie chez le sujet âgé. Dans un premier temps nous comparerons deux modèles classiquement utilisés et qui sont les plus proches de l’accident vasculaire cérébral chez l’homme. Dans un second temps, le modèle choisi fera l’objet d’une acquisition du geste chirurgical par deux personnes pour permettre la continuité de la compétence acquise au sein du laboratoire. Enfin, le modèle sélectionné et acquis par le personnel compétent sera appliqué dans le cadre d’une première étude dont le but est de prendre en compte le rôle de l’âge et des comorbidités associées dans l’accident vasculaire cérébral. En effet, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude permettra de choisir un modèle d'étude fiable et reproductible pour mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en place un modèle adapté et robuste pour comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Tout d’abord, nous testerons 2 différents modèles d’accident vasculaire cérébral ischémique chez des animaux de plus de 9+/- 2 mois. La chirurgie est de 40min pour le modèle semi permanent (procédure 1) et de 10 min pour le modèle permanent (procédure 2). Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral ischémique en utilisant un modèle in vivo, préalablement retenu, d'ischémie cérébrale (chirurgie de 10 ou 40 min). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés à 72h après la mise en place du modèle d’accident vasculaire cérébral à l’aide de tests de comportement et de l’imagerie post mortem.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). Le test d'intolérance au glucose pourra induire une légère douleur de courte durée (1 injection intrapéritonéale de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie). Le modèle d’accident vasculaire cérébral induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire de l’imagerie

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale dans un contexte de vieillissement vasculaire et comorbidités liées à l’âge, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’accident vasculaire cérébral. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à "phénotype nocif". Le porteur indique n'attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu'aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l'animal demeure "crucial".

Objectifs

La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d'imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l'excès de teinture - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 30 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 60 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux - 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) - Expérience de 90 jours - les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l'ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l'eau ou par injection intrapéritonéale. - Injection intrapéritonéale avec un temps d'anesthésie inférieur à 5 minutes. - Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L'administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d'absorption. 4. Choc thermique local - Moins de 1 minute pour le choc thermique - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 90 jours (maximum) - Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d'aileron pour le génotypage - Moins de 1 minute par clip d'aileron - Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d'animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu'à l'âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu'à 2 ans après la fécondation.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d'alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c'est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d'ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse (histologique, moléculaire)

Remplacement

Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.

Réduction

La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l'exigence d'un plus grand nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d'animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d'utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d'animaux demandé est le plus grand nombre d'animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d'utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d'imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d'animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : - Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux - Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d'imagerie qui ne sont pas possibles avec d'autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d'autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d'ablation génétique, font du poisson zèbre l'organisme idéal pour l'expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l'établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l'âge adulte pour comparer l'apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu'aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l'on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour pendant 14 jours une injection sous-cutanée d'isoprénaline pour provoquer un stress cardiaque, une partie recevant en fin de protocole une injection d'un inhibiteur, avant prélèvement du cœur. Le porteur indique que le traitement augmente la fréquence et le débit cardiaques et que l'inhibiteur peut provoquer une hypertension. Sur le remplacement, il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier le remodelage cardiaque et qualifie le recours aux animaux d'"indispensable".

Objectifs

Le stress adrénergique cardiaque peut entraîner un remodelage physiologique du cœur, comme on l'observe en réponse à l'entraînement physique. Cependant, lorsque ce stress est chronique, il conduit à un remodelage cardiaque défavorable qui est associé à un dysfonctionnement. À ce jour, le principal traitement efficace pour limiter le remodelage myocardique consiste à réduire la surcharge de pression. Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les voies de signalisation qui sous-tendent les (mauvaises) adaptations cardiaques dépendantes du stress adrénergique afin de fournir des pistes pour le développement de nouvelles thérapies. En réponse à la stimulation des recepteurs β-adrénergiques, le myocarde produit des quantités accrues d'oxyde nitrique (NO). Jusqu'à récemment, on considérait que la signalisation du NO impliquait principalement l'activation des voies de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) (GMPc-PKG). Cependant, le NO peut également se fixer directement de manière covalente aux résidus thiol de cystéines, un processus appelé Snitrosylation (SNO). Ce second mécanisme a été moins étudié et fait l'objet du présent projet. La SNO est une modification post-traductionnelle réversible majeure impliquée dans la régulation de l'activité des protéines ; il permet également de protéger les protéines contre l'oxydation irréversible des fragments thiols. Ce processus a été bien décrit dans les mitochondries où il est associé à une production réduite d’espèces réactives de l’oxygène. Les myofilaments cardiaques sont également rapportés comme étant sensibles à l'oxydoréduction et, par conséquent, potentiellement affectés par la signalisation du NO. La question est de tenter de mieux comprendre comment la SNO des protéines myofilamentaires est impliquée dans la régulation de la machinerie contractile cardiaque. L’objectif du projet NitrosoCard est de tester l'hypothèse selon laquelle, en réponse au stress adrénergique, la eNOS (enzyme responsable de la synthèse de NO) peut se relocaliser vers les mitochondries pour moduler la SNO de protéines clés dans la régulation de la réponse du cœur à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress adrénergique. En effet, il est bien connu qu'un stress adrénergique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfique du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jour, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement, pendant 14 jours, avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques, l’isoprénaline, par injection sous-cutanée (une injection sous cutanée tous les jours pendant 14 jours). A la fin des 14 jours, certains animaux (groupe taités avec l'inhibiteur des NOS, L-NAME) reçoivent une dernière injection cette fois en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Le traitement sub-chronique à l’isoprotérénol peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux (principalement augmentation de la fréquence et du débit cardiaque). Les animaux seront donc surveillés, tout particulièrement dans les heures qui suivent l’injection sous-cutanée d’isoprotérénol, par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. L'injection de L-NAME peut aussi être à l'origine de stress (hypertension artérielle). Dans ce cas aussi, les animaux seront particulièrement surveillés dans les heures suivant l'injection. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress adrénergique sur le remodelage myocardique. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique).

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'implantation d'un émetteur de télémétrie, puis une seconde pour une mini-pompe délivrant de l'angiotensine, afin d'étudier le remodelage des artères sous hypertension et le rôle de gènes de la famille PI3K. Le porteur indique des douleurs modérées post-opératoires, minorées par des antalgiques, et une mise à mort pour prélèvement d'organes. Il présente la souris comme la "seule" espèce disposant des modèles génétiquement modifiés utiles et le recours à l'animal comme un "complément indispensable" des études in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont particulièrement incidentes chez les patients présentant des pathologies sous-jacentes telles que l'hypertension. Un des processus responsable de la grande majorité des accidents vasculaires est l'athérosclérose. L’athérosclérose va se développer dans différentes zones artérielles, obstruer le vaisseau et dans les étapes ultimes de la maladie provoquer des infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Afin de limiter ce risque, la technique d’angioplastie (pose de "stents") a alors été développée afin de rétablir la lumière du vaisseau. Elle consiste en la pose d’un stent actif, délivrant des substances médicamenteuses, dans le vaisseau endommagé. Cet acte chirurgical est associé à un traiement médicamenteux pour prevenir les rechutes en particulier chez les patients hypertendus. Cependant, des phénomènes de résistance à ces molécules ont été observés. Dans ce contexte, notre équipe se propose donc d'étudier le role des genes de la famille des PI3K dans le remodelage arteriel dans un contexte d'hypertension pour ameliorer ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les cibles médicamenteuses pertinentes et efficaces pour lutter contre les complications cardiovasculaires régulièrement retrouvées chez les patients hypertendus.

Procédures

Les animaux seront soumis à une ou deux interventions chirugicales selon les cas. La première intervention chirurgicale pour implanter la puce de télémetrie dure environ 30min. 1 semaine apres la pose de la puce de la télémetrie, les animaux subiront une deuxième chirurgie de 15 min consistant à la pose en sous cutanné d'une mini-pompe.

Impact sur les animaux

Les deux procédures chirurgicales induisent la pose de 3 sites de sutures sur le thorax et 1 à l'arriere de la tête. Ces actes chirugicaux peuvent entrainer des douleurs modérées post-opératoires qui seront minorées par des antalgiques et les risques d'irritations et de demangeaisons seront minorés par utilisation d'antiseptique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organe.

Remplacement

L'utilisation de ce modèle animal est un complément indispensable des études in vitro sur des lignées de cellules musculaires lisses que nous avons déjà réalisées au laboratoire. En effet, ces approches de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier le remodelage artériel et de mesurer le bénéfice de nos cibles thérapeutiques dans un contexte physiopathologique intégrés prenant en compte l'ensemble des réponses cellulaires mise en jeu au sein d'une artère.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs du projet et pour permettre de bonne analyses statistiques. Le nombre de souris utilisé est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs et est donc précisé dans chaque procédure en fonction de la variabilité obtenue des protocoles expérimentaux mis en jeu. La télémetrie permet de diminuer le nombre d’animaux enrolés dans ce protocole en augmentant significativement le niveau de fiabilité et de reproductibilité des mesures de tension arterielle.

Raffinement

Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. L’environnement des animaux est enrichi (bandes de papier Sizzle-Nest pour la nidification, cube de bois pour usure des dents mais pas de tunnel ou d'igloo pour éviter à l'animal de se bloquer avec la pompe alzet), pour éviter l’angoisse et eventuellement faciliter l'acces à la nourriture et à l'eau en placant des croquettes humidifiées et de l'hydogel dans la cage. Si les points limites déterminés par le responsable de l'étude sont atteints, nous déterminerons avec la SBEA et le vétérinaire les soins ou l'action à appliquer pour réduire la souffrance animale.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris, seule espèce animale pour laquelle il existe des modèles animaux génétiquement modifiés pour nos cibles pharmacologiques. Les complications cardiovasculaires en condition d'hypertension font intervenir des mécanismes intégrés qui ne sont pas modélisables par des approches in vitro. L’expérimentation animale est donc une approche complémentaire aux études in vitro, permettant d’utiliser des modèles animaux susceptibles au développement des pathologies vasculaires. Enfin, plusieurs des cibles pharmacologiques potentielles seront validées en utilisant des modèles animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 20 semaines, au stade jeune adulte car il est nécessaire que leurs systemes cardiovasculaire, immunitaire et métabolique soit entièrement developpé et mature.