Système cardiaque

473 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiées pour exprimer le facteur Willebrand humain, elles reçoivent l'injection d'un anticorps puis, selon les groupes, des prélèvements sanguins, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou l'observation de la formation de caillots, les gestes les plus invasifs se faisant sous anesthésie sans réveil. Elles sont tuées à l'issue, le porteur jugeant les tests incompatibles avec une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité de la coagulation et vise des anticorps utilisables ensuite chez l'humain.

Objectifs

Le facteur Willebrand est une protéine qui circule dans le sang et qui a un rôle important dans l'arrêt du saignement après une blessure. Lorsqu'il est absent, le caillot sanguin ne se forme pas correctement et par conséquent, les saignements se prolongent. Il existe d'ailleurs une maladie, appelée maladie de Willebrand, dans laquelle les patients n'ont pas de facteur Willebrand ou alors un facteur Willebrand anormal. Dans les deux cas, les patients ont alors une maladie hémorragique qui peut être très sévère. Par contre, à l'opposé, si des personnes ont trop de facteur Willebrand, ils ont un risque augmenté de développer des pathologies thrombotiques telles que les accidents vasculaires cérébraux ou les infarctus du myocarde. De par son rôle important dans cet équilibre entre saignement et thrombose, le facteur Willebrand est une cible intéressante pour essayer de traiter ces conditions pathologiques. On peut effectivement envisager de développer des outils pour réduire la quantité de facteur Willebrand chez les personnes qui ont un taux trop élevé ou au contraire, l'augmenter chez les personnes qui n'en n'ont pas assez. L'objectif du projet réside dans cette dualité et nous avons à notre disposition des molécules (anticorps) qui sont susceptibles de moduler la quantité et la fonction du facteur Willebrand. Nous souhaitons donc tester leur effet dans un modèle murin spécialement développé à cet effet. Nous espérons ainsi identifier certains outils avec la capacité d'augmenter ou de diminuer la quantité de facteur Willebrand ou encore de corriger le défaut de fonction de cette protéine.

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de valoriser un modèle permettant de tester des agents ciblant le facteur Willebrand dans un modèle murin et 2) d'identifier potentiellement des outils biologiques permettant de moduler la fonction et la concentration du facteur Willebrand. A plus long terme, le projet a le potentiel d'identifier des pistes thérapeutiques avec un intérêt soit comme traitement de la maladie de Willebrand, soit comme anti-thrombotiques.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 17 jours maximum. Le premier geste consistera en une prise de sang de petit volume (sous anesthésie), suivi 24H plus tard d'une injection unique de la molécule (anticorps) à tester. Ensuite les souris seront divisées en 3 groupes: Un groupe subira un second prélèvement sanguin à différents temps. Selon les animaux, ce prélèvement interviendra entre 24H et 14 jours après l'injection de l'anticorps. Chaque souris ne sera prélevée que 2 fois en tout. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie et les souris seront euthanasiées à l'issue du second prélèvement. Pour un second groupe de souris, 1 heure après l'injection de l'anticorps, le temps de saignement des souris sera mesuré. Ce test réalisé sous anesthésie consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes. A l'issue du test, les souris toujours sous anesthésie seront euthanasiées par les méthodes réglementaires. Pour le troisième groupe de souris, 1 heure après l'injection de l'anticorps nous regarderons comment des caillots sanguins peuvent se former dans les vaisseaux au niveau de l'abdomen pendant une durée de 60 minutes. Au terme des 60 minutes, les souris toujours sous anesthésie seront euthanasiées par les méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après les injections. Au moment des prélèvements de sang, les souris seront sous anesthésie. Enfin, les derniers gestes qui sont les plus invasifs (tels que le test de saignement) se feront entièrement sous anesthésie et seront sans réveil puisque les souris anesthésiées seront directement euthanasiées.

Devenir

Les tests pratiqués ne sont pas compatibles avec une ré-utilisation potentielle des animaux.

Remplacement

La coagulation est un processus complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.

Réduction

Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. Le nombre d'anticorps monoclonaux qui sera testé a été limité à 10. Nous avons sélectionné les anticorps les plus intéressants sur la cinquantaine d'anticorps dont nous disposons. Cette pré-sélection a été réalisée grâce à des tests in vitro

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. Les points limites susceptibles d'entraîner l'euthanasie immédiate de l'animal seront les suivants: Hyperalgésie après les injections et les prélèvements, visible par une agitation importante de la souris ou manifestation hémorragique qui serait visible par un écoulement de sang au niveau oculaire/nasal. Pendant le reste de la procédure (3-17 jours), observation quotidienne des animaux (1 fois pendant le week-end): Décision d'euthanasie si un des critères suivants est noté: 1) perte de 20% du poids par rapport à la veille, 2) poils hérissés ou 3) état apathique.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin exclusif, récemment développé et qui exprime le facteur Willebrand humain dans la souris. A l'exception de modèles de primates non humains, il s'agit du seul modèle qui permette d'utiliser des anticorps contre le facteur Willebrand humain in vivo, outils qui pourraient ensuite être utilisés chez l'homme. Des souris des deux sexes, allant d'un âge entre 4 et 16 semaines seront utilisées.

1000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vers d'autres laboratoires après l'opération et les autres tués. Chaque animal subit l'ablation de la rate sous anesthésie, une chirurgie que le porteur associe à des risques de douleur, de saignement, de mauvaise cicatrisation et d'infection. Ce prestataire produit ainsi 100 rats et 100 souris par an sans rate, destinés aux projets de ses clients. Il reconnaît qu'"aucune approche statistique" n'a fixé les effectifs et présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires et l'immunologie. Ce projet a pour but de fournir des rongeurs sans la rate donc déficient pour la production de globules rouges, la cicatrisation, la coagulation et dans l’immunité en vue de leur utilisation dans les études expérimentales de nos clients. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année pour nos clients sur nos animaux : 100 rats et 100 souris par an.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Chaque animal subira une ablation de la rate sous anesthésie d'une durée maximale de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie et celle en post-opératoire, le risque de saignement continu, de mauvaise cicatrisation et un risque infectieux (baisse du système immunitaire).

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés. Les autres animaux seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans les études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce entre rat et souris est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet. Puis, 5-6 jours après l'opération, les animaux lui seront envoyés après un examen vérifiant la bonne récupération des animaux de la chirurgie.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal sodique cardiaque, elles subissent l'implantation chirurgicale de capteurs de télémétrie et trois échocardiographies sous sédation avant que leur cœur ne soit prélevé. Le porteur qualifie ses investigations d'"indolores et non-invasives" tout en décrivant une étape chirurgicale de 25 minutes et un isolement de dix jours en cage individuelle. Il affirme que la progression de la maladie ne peut s'étudier que dans un "organisme entier" et conclut qu'aucune méthode de substitution n'existe.

Objectifs

Le projet consiste à étudier une pathologie : la cardiomyopathie dilatée, liée à une mutation d’un canal ionique (sodique) cardiaque. Le mécanisme induit par la mutation est nouveau. Les investigations in-vivo sont essentielles pour comprendre le développement de la pathologie et permettre de nouvelles approches thérapeutiques. Il s’agira de caractériser, de manière non-invasive, les effets de la mutation sur différents paramètres cardiaques clés d’un modèle murin (souris) porteur de la mutation.

Bénéfices attendus

Des données cliniques humaines associent la mutation étudiée ici à une cardiomyopathie dilatée. La mutation d'un canal ionique est le plus souvent accompagné par le développement d'un phénotype remarquable in-vivo, pouvant se traduire par des effets sur l'électrocardiogramme (ECG), avec la survenue d'arythmies très souvent létales, et des modifications de la structure, de la morphologie et de la fonction du cœur. L'étude in-vivo est incontournable pour valider le concept du lien entre la mutation et la cardiomyopathie dilatée, étudier la relation gène-phénotype complexe (parfois contre-intuitive), et évaluer le potentiel thérapeutique de molécules visant, soit directement la cible d'intérêt, soit indirectement le remodelage cardiaque pathologique. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les investigations in-vivo sont indolores et non-invasives. On notera une étape chirurgicale légère, unique, d'une durée de 25 minutes qui consiste à implanter les capteurs de signaux en amont des enregistrements d’ECG en télémétrie. Les capteurs sont retirés après le sacrifice des animaux. Les enregistrements ECG sont complètement neutres pour l’animal (pas de présence humaine, pas de stress, réalisés en ambulatoire comme chez l’homme). Trois échocardiographies seront réalisées avec des anesthésies légères et un stress limité à une manipulation pendant 10 minutes.

Impact sur les animaux

La lignée murine utilisée, génétiquement modifiée, est établie depuis plusieurs générations avec une transmission de la modification génétique stable. Ni dans le laboratoire qui l’a établie, ni dans notre étude pilote, il n’a été noté de phénotype dommageable. Le phénotype est purement cardiaque (comme attendu) avec une insuffisance cardiaque, modérée et stable, et des troubles du rythme ne conduisant pas à la mort subite. L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Sa nature non invasive permet des études longitudinales avec un suivi des animaux au cours du temps. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo (3 investigations). Le stress subi se limite à la manipulation pendant une période courte (10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie en ambulatoire, le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal. La nuisance liée à l'implantation chirurgicale des capteurs (25 minutes) est limitée. Après l’implantation, les aninaux sont maintenus en cage unique pendant 10 jours pour : (i) éviter des blessures au niveau des cicatrices chirurgicales par les congénères (risque d’inflammation ; modification des conditions expérimentales) et, (ii) respecter la nécessité technique d’avoir un seul animal par plaque (qui est le receveur des signaux) d'enregistrement de l'ECG.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

Le projet, dans sa globalité fait appel à des approches in-vitro et in-vivo. Les approches in-vitro concernent la caractérisation des effets moléculaires et cellulaires de la mutation. Elles permettent de comprendre les mécanismes de base, sans utilisation d’animaux. Pourtant, la validation des effets dans un modèle expérimental in-vivo est indispensable pour évaluer l’impact de la mutation sur la fonction cardiaque intégrée. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution. Le cœur est un organe complexe, en interaction forte avec de nombreux autres systèmes. La progression de la maladie et les nombreux effets qui découlent de la mutation ne peuvent être étudiés que dans un organisme « entier ». La validation du modèle et les connaissances acquises permettront cependant d’évoluer vers l’utilisation de cellules cardiaques dérivées de cellules souches de patients en se basant en partie sur les connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix dérivées d’approches couramment utilisées chez l’homme en clinique ; à savoir : (i) l’électrocardiograhie (ECG par télémétrie) et (ii) l’échocardiographie. Elles permettent toutes les deux un suivi de l’animal au cours du temps ; ce qui permet d’augmenter la puissance statistique et de limiter le nombre d’animaux utilisés dans le cas d’une pathologie évolutive comme la cardiomyopathie. Les animaux peuvent ainsi faire l’objet d’investigations répétées (chaque animal étant son propre témoin), au lieu d’être sacrifiés à chaque stade de la pathologie. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études similaires. Notre expérience permet, pour chacun des paramètres étudiés, de définir de manière pratique, le nombre minimum, mais scientifiquement nécessaire, d'animaux dans chaque groupe. Il est à noter que le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu; ce qui simplifie et fiabilise les interprétations scientifique, et réduit ainsi le nombre d'animaux nécessaire.Nous avons évalué le nombre d’animaux nécessaires par une étude statistique, établi à un minimum de 10 par groupe (échocardiographie, ECG). Dans un souci de Réduction, chaque animal sera également utilisé pour mesurer plusieurs autres caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires).

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives (électrocardiographie, échocardiographie) pour comparer le phénotype murin pathologique avec la pathologie humaine afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), de douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), d’enrichissement du milieu (jouets, tunnel, etc…), de détresse, de points limites et d’arrêt anticipé des procédures expérimentales. Une grille d’évaluation avec différents scores a été établie pour mesurer, réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse, et pour définir précisément des points limites et l’arrêt anticipé de la procédure.

Choix des espèces

Les animaux transgéniques sont principalement des modèles murins (souris). Les rongeurs sont effectivement le modèle le plus couramment utilisé en laboratoire. Ceci est particulièrement vrai pour l’étude du phénotype pathologique résultant de mutations humaines (comme décrit ici). Le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante ; ce qui simplifie et fiabilise les analyses et les interprétations scientifique. Cela réduit aussi le nombre d'animaux nécessaire pour maitriser le modèle. Les animaux seront réceptionnés au stade jeune adulte, entre 4 et 8 mois. Ils seront utilisés après une période d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus faciles et précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal). Il s’agit également d’un stade approprié pour l’étude de la progression de la cardiomyopathie.

298 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie coupant la circulation d'un rein pendant vingt-cinq minutes pour provoquer une insuffisance rénale aiguë, suivie d'échographies et de mesures de pression artérielle, avant d'être tué à un à vingt-huit jours pour prélever ses organes. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur au site opératoire et une perte de 10 à 15 % du poids, prises en charge par des antalgiques. L'objectif déclaré est de tester si le blocage d'une molécule inflammatoire, l'interleukine-3, limite les atteintes cardiaques et rénales, le porteur jugeant le recours à l'animal "nécessaire".

Objectifs

Notre étude vise à évaluer l’implication d'une molécule inflammatoire dans l’insuffisance rénale aiguë. Nous travaillons sur un modèle murin chez qui nous induisons une insuffisance rénale aiguë via une chirurgie visant à couper la circulation sanguine dans le rein pendant 25 minutes, on parle d'un modèle d'ischémie reperfusion rénale. Nous allons analyser chez des animaux contrôles et des animaux ne possédant pas notre molécule inflammatoire d'intérêt les conséquences de l'ischémie reperfusion rénale au niveau du rein, du cœur mais également au niveau immunitaire. L'objectif de cette étude est d'évaluer si l'inhibition de cette molécule inflammatoire est en mesure de réduire les conséquences cardio-rénales induites par une insuffisance rénale aiguë.

Bénéfices attendus

Nous étudions le syndrome cardio-rénal, soit la survenue d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale ainsi que les conséquences immunitaires dans ces organes (cœur et reins). Notre étude s'intéresse plus particulièrement au rôle d'une molécule produite lors d'une inflammation. Il est rapporté dans la littérature que cette molécule inflammatoire est associée à une surmortalité dans différentes maladies telles que dans les infections graves. L’inhibition de cette molécule est désormais une potentielle cible thérapeutique. Mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'insuffisance rénale pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.

Procédures

Les animaux de la série 1 sont soumis à 2 procédures : - procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) avec une mise à mort des animaux à j1, j3 j7 ou J28 -procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant chirurgie et au moment de l’euthanasie de l’animal (2 fois 10 min) et à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant une semaine avant la chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de l’euthanasie de l’animal (6 fois 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleur au niveau du site opératoire. Un traitement antalgique pré- et post-opératoire systématique sera administré pour diminuer les douleurs liées à la chirurgie. La potentielle persistance de la douleur au-delà de 24h sera systématiquement recherchée et traitée. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel et régresse quelques jours après. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle et n'excède pas 48 heures au-delà des différentes procédures. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures aux différents temps de l'étude (j1, j3, j7, j28) en concervant tous les organes que nous avons à analyser.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.

Réduction

Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisé. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.

Raffinement

Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h8 post-chirurgie pour tous les animaux, surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.

Choix des espèces

Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle d’ischémie-reperfusion rénale comporte de nombreuses similitudes par rapport à une insuffisance rénale aiguë chez l’Homme. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d’analyser l’effet d’une absence/surexpression d’un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale après IRr et de grader des paramètres physiologiques normaux. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole, car les femelles présentent une protection relative à l’insuffisance rénale induite par ischémie reperfusion rénale liée aux œstrogènes Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme.

1010 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à un régime gras induisant obésité et diabète, elles subissent des injections quotidiennes, des séances de natation forcée deux fois par jour, des tests métaboliques et des échographies, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur reconnaît une perte de poids et une fatigue liées à l'exercice, et un risque de rupture de l'estomac ou de l'œsophage lors du gavage. Il indique remplacer certaines cellules primaires par des lignées in vitro mais juge l'analyse d'un cœur "entier" impossible à reproduire ainsi, les retombées thérapeutiques restant au conditionnel.

Objectifs

Dans un premier temps, il s’agit d’effectuer une analyse in vivo et histologique de modèles murins pour les tissus d’intérêt comme le cœur, le rein, le foie et le tissu adipeux dont le but est de : 1) comparer la reproductibilité des données en utilisant un protocole unique et standardisé sur les modéles murins de diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses, 2) mettre en place une bio-banque d’échantillons de sang et de tissus pour réaliser des analyses multi-translationnelles, 3) étudier le rôle des macrophages résidents du coeur dans un contexte d’obésité. Le deuxième objectif du projet est de définir des nouvelles stratégies thérapeutiques prévenant le développement de cardiomyopathie dont la formation est liée aux altérations induites par des troubles métaboliques (l’obésité et le diabète) et le vieillissement accéléré du cœur dans ce contexte d’obésité (inflammation, dommages faits à l’ADN, dysfonction mitochondriale). Etape 1) Evaluer l’effet de molécules à fin thérapeutique modulant spécifiquement l’action de molécules impliquées dans le métabolisme sur la fonction cardiaque. Etape 2) Valider et optimiser la molécule cible sur les troubles métabolliques. Etape 3) Définir les mécanismes d’action spécifiques de la molécule thérapeutique sur l’amélioration de la fonction cardiaque et sur la résolution de l’inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité des données en comparant dans différents laboratoires en Europe l’impact d’un régime riche en graisses chez des souris mâles et femelles de type C57BL/6 sur la structure et la fonction cardiaque ainsi que l’évaluation métabolique et l’impact sur d’autres organes comme le foie, le rein ou le tissu adipeux. L’identification du rôle des macrophages dans le vieillissement cardiaque permettra d’identifier de nouvelles voies pathophysiologiques et donc d’envisager de nouvelles thérapies. Enfin, nous attendons une action géroprotrectrice et plus généralement une protection renforcée des tissus avec une haute tolérance du produit chez les animaux traités. De plus, de façon plus spécifique, nous attendons une amélioration des fonctions cardiaques avec une action anti-fibrotique ainsi qu’une amélioration des dommages faits à l’ADN. Ces données pourraient permettre de repositionner certaines molécules dans le traitement des cardiomyopathies métaboliques, pourvoyeuses d’insuffisance cardiaque en pathologie humaine.

Procédures

Echocardiographie : Geste non-invasif d'une durée de 3-4 minutes, permettant d’évaluer les fonctions cardiaques, réalisé au début, au milieu et à la fin de l'expérimentation sur animaux vigiles. Grip test : Test de préhension soutenue non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire, réalisé sur animaux vigiles pour l’ensemble des animaux en début, milieu et fin d'expérimentation. Glycémie : Mesure du taux de glucose sanguin de tous les animaux. Sur animaux vigiles, on prélève une goute de sang à la queue. Injections : Sur animaux vigiles, on effectue une injection quoitidienne en i.p. ou en sous-cutané (selon l’efficacité de distribution du produit) en utilisant de fines aiguilles afin de limiter la souffrance chez l’animal. Exercice physique : Séances biquotidiennes de natation en cuve d’eau chauffée à 33°C ± 2°C espacées de 6h et augmentant progressivement de 5 à 40 min pendant une période de 6 semaines. Insuline-tolérance test (ITT) et glucose-tolérance test (GTT) : Tests métabolliques permettant d’évaluer la résistance à l’insuline et la tolérance au glucose. Sur animaux vigiles mient à jeun pendant 6h, injection en i.p. (vol max 200µl, calculé en fonction du poids de l’animal) soit d’insuline (ITT), soit de glucose (GTT) et de suivre la glycémie à T=0, T=15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min. La moitié des animaux seront soumis à un test GTT et l’autre moitié au test ITT en début et fin de régime. Gavage : Technique non utilisée sur les animaux âgés (8 et 24 mois) et uniquement dans le contexte d’un produit ne pouvant être administré en eau de boisson. Sur animaux vigiles, on effectue un gavage quoitidien pendant 30 jours à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une sonde de gavage adaptée sans induire de souffrance ou détresse chez les souris.

Impact sur les animaux

Un effet de stress est attendu lors de la réalisation de l’échocardiographie ou du test de tolérance au glucose. L’animal sera alors sous haute surveillance jusuqu’au rétablissement d’une glycémie normale, c’est-à-dire à partir de 80 mg/dL. La pratique de l’exercice physique peut entraîner une perte de poids et une fatigue chez l’animal qui est directement lié à la pratique régulière d’une activité physique. À la suite de ces observations, les temps de pratique de l’exercice physique seront ré-évalués chez les animaux concernés. Le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métabloliques. Les injections quotidiennes peuvent entraîner l’apparition d’un hématome. Nous limiterons l’utilisation de la méthode de gavage pouvant entraîner un stress chez les animaux, surtout âgés et afin de limiter les désagréments chez l’animal et le dépôt de la substance dans le poumon ou la rupture de l'estomac ou de l'œsophage.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Nous remplaçons les cellules primaires par des lignées cellulaires dans nos tests "in vitro": soit en utilisant les lignées cellulaires H9C2 de cardiomyocytes, les lignées 3T3L1 d'adipocytes pour les co-cultures, soit des lignées cellulaires de macrophages murins (raw264) comme cible de l’action sénolytique des molécules thérapeutiques

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à notre étude a été calculé pour nous assurer de l’obtention de résultats concluants afin de répondre aux questions posées en tenant compte des expériences antérieures du laboratoire sur le stress métabolique induit par le régime riche en graisse ayant été étudié préalablement sur ce fond génétique: il faut entre 10 à 15 animaux par lot pour obtenir une réponse statistique fiable des expériences puisque nous n'obtenons pas de réponse équivalente chez tous les animaux en expérimentation. De même, le nombre de souris a été optimisé pour chacune de nos procédures expérimentales tout en assurant une reproductibilité et une robustesse dans nos expérimentations, mettant à profit nos connaissances sur les tranches d’âge auxquelles nous devons réaliser nos expérimentations afin d’être le plus pertinent possible dans l’établissement de nos procédures. Enfin, afin d’utiliser au mieux les animaux, nous regarderons simultanément différents tissus d’intérêt dans un même animal (réduction importante du nombre d’animaux prévus).

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures. entraîner une hypoglycémie sévère qui pourra être détectée par mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre et qui sera immédiatement prise en charge par l’administration d’une dose de glucose. La surveillance hebdomadaire de la prise de poids puis un contrôle de la glycosurie en cas de prise de poids trop importante assurera le suivi nécessaire au bien être animale pendant le régime riche en graisse. Pour éviter l’apparition d’un hématome, les injections seront pratiquées en changeant de côté régulièrement pour laisser du temps à la résorption d’un éventuel hématome. Enfin, l’administration orale du produit se fera autant que possible dans l’eau de boisson.

Choix des espèces

La cardiomyopathie est bien caractérisée chez les mammifères avec des méthodes d’analyse facilement accessibles et reproductibles. Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisses est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. Par ailleurs, l’évaluation de l’action combinée de l’obésité et de l’âge sur les mécanismes conduisant au développement d’événements cardiovasculaires nécessite l’analyse de la fonction cardiaque (organe entier) dont la complexité est impossible à reproduire in vitro. Le modèle expérimental choisi est donc la souris. Ce modèle murin présente l’avantage de développer un vieillissement relativement rapide et d’offrir des conditions très reproductibles de développement d’une cardiomyopathie métabolique. Enfin, la souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme sur les paramètres liés au métabolisme du glucose et la surcharge pondérale. L’étude se fera sur des souris à un stade de jeune adulte (5 mois) et à deux stades âgés (12, 18 mois) et à un stade très âgé (24 mois). Pour l’étude portant sur le vieillissement cardiaque, nous utiliserons des animaux mâles âgés de 12, 18 et 24 mois. Pour l’étude de l’obésité conjugué au viellissement, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 5 mois dont le fonctionnement du système cardiovasculaire commence à subir les effets du vieillissement et de 12 mois d’âge dont leur système cardiovasculaire est altéré spontanément par le vieillissement.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour être dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B, elles reçoivent cinq injections d'un stimulant plaquettaire, jusqu'à quatre prises de sang sous anesthésie et un prélèvement terminal, la moitié subissant en plus une section de la queue pour mesurer le temps de saignement. Le porteur affirme que le traitement n'entraîne aucun effet négatif et attribue la gravité modérée au seul cumul des gestes. Il conclut que ces mécanismes doivent être étudiés dans un "organisme entier" et que la souris est la seule espèce porteuse de cette mutation.

Objectifs

La thrombocytopénie est un trouble plaquettaire fréquent dont les causes et les conséquences sont variées. Les souris dépourvues du récepteur plaquettaire G6b-B (G6B KO) naissent avec un défaut des mégacaryocytes (MK), cellules formant les plaquettes, et des plaquettes elles-même. Ces souris présentent entre autres une macrothrombocytopénie sévère (diminution du nombre de plaquettes circulantes avec augmentation de leur taille). Les mêmes caractéristiques ont été récemment signalés chez des patients présentant les mêmes mutations dans le gène codant pour le récepteur G6b-B. Pour mieux comprendre la cause et le traitement de cette pathologie, nous avons utilisé des approches génétiques et pharmacologiques pour rétablir le nombre et la fonction des plaquettes chez les souris G6b KO. Notre intérêt s’est porté sur le traitement par le romiplostim, agent stimulant la production de plaquettes sanguines, qui a permis de remédier à la thrombocytopénie. Ceci laisse penser qu'il pourrait s'agir d'une thérapie prometteuse pour les patients dépourvus de G6b-B fonctionnel. De part la similarité entre les caractéristiques souris et patients dépourvus de G6b-B, cette étude permet d’étudier le potentiel thérapeutique du romiplostim sur la thrombopénie induite. Le romiplostim étant un traitement déjà utilisé sur les patients pour d’autres pathologies. Nous avons précédemment montré que le romiplostim permettait le rétablissement de la thrombocytopénie chez les souris déficientes en G6b. Ce projet vise à étuder l’effet du traitement sur l’hémostase suite au rétablissement du nombre de plaquette. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose (trouble affectant la moelle osseuse). Ces analyses permettront également d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est, dans la continuité de précédentes expériences, d’étudier la fonctionnalité des plaquettes sanguines des souris G6b KO après traitement au romiplostim. Bien que le traitement au romiplostim permet le rétablissement du nombre de plaquettes circulantes et de leurs propriétés, il reste à savoir si ce traitement permet de rétablir efficacement la fonctionnalité principale de plaquettes, c’est-à-dire l’arrêt de saignement. De plus, il est connu que le traitement au romiplostim peut entrainer une myélofibrose. Ces analyses permettront d’étudier l’impact de l’utilisation du romiplostim sur la moelle osseuse et ses conséquences. Les phénotypes très similaires entre les souris G6b KO et la macrothrombocytopénie et myélofibrose congénitales chez l'homme constituent un modèle intéressant pour étudier la base moléculaire de cette maladie. Ainsi l'efficacité relative des actuels et nouveaux traitements de la thrombocytopénie peut être analysée. Une telle étude est particulièrement pertinente en raison de l'émergence de mutations de G6b comme cause de thrombocytopénie héréditaire dans de multiples familles

Procédures

L’ensemble des animaux recevront le traitement romiplostim par injection (5 injections au total sur 15 jours, sur animal vigile, durée de geste environ 30 secondes). Les animaux auront également un prélèvement de sang (maximum 4 prélèvements par animal sur 15 jours, sous anesthésie générale, durée d’environ 1 minute). Tous les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal (1 prélèvement, sous anesthésie générale, durée 5 minutes). La moitié des animaux subiront en plus un temps de saignement (sous anesthésie générale, durée de l’expérimentation 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le traitement romiplostim n'entraine aucun effet négatif, comme chez l'homme. Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections en sous-cutanée (durée de la manipulation estimée à 30 sec). Le produit injecté n’induit pas de douleur. Les injections sous-cutanés seront espacés de quelques jours et un total de 5 injections sera effectué. Nous n’attendons pas de douleur liées aux injections, et le site d’injection sera régulièrement observé pour s’en assurer. Suite au prélèvement de sang, les souris pourront présenter un saignement modéré ainsi qu’une douleur (estimée à 1h post-injection). Ces prélèvements répétés étant assez espacés (5-10 jours entre les prélèvements) nous n’attendons pas de traumatismes et douleurs importantes que pourraient engendrer des prélèvements rapprochés. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement de sang, durée de 30 secondes avant endormissement. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min. Après le temps de saignement, les souris pourront présenter un saignement ainsi qu’une douleur au niveau de la section de la queue. Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 5-10 min. Les différents gestes pris séparement représentent des nuisances légères, mais nous considérons que le cumul des interventions induit une nuisance de type modéré pour les souris.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Ces expériences utilisant la souris ne peuvent être remplacées par des études in vitro, d’une part car ces essais doivent être menés dans un organisme entier afin d'accéder à la complexité des mécanismes, ce qui fait l'objet de notre projet. D'autre part, la souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Les données seront traités avec des tests statistiques adaptés permettant de répondre aux questions posées. Nos études précédentes nous ont permis de définir au préalable le protocole de traitement à utiliser.

Raffinement

Les conditions du travail seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux manipulations des souris. Les prélèvements de sang pour suivi cinétique de la numération plaquettaire se feront sur des souris sous anesthésie générale gazeuse afin d’éviter la souffrance mais favoriser un réveil rapide. Dans tous les cas, les souris restent ensemble dans la même cage durant toute l'expérience. Les cages sont enrichies en jouets et coton à déchiqueter pour qu’elles y fassent leur nid, et les animaux sont manipulés avec calme et par des manipulateurs avertis pour limiter le stress de contention, dans l'intérêt du bien-être animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie et analgésie. L’état de santé des animaux est suivi tout au long de l’expérimentation à l’aide d’une grille intégrant des points limites, permettant d’interrompre les procédures.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce pour laquelle nous disposons de modèles dépourvus de la protéine co-inhibitrice G6b-B, ayant un phénotype similaire à celui des patients ayant la même mutation. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge, de 8 à 20 semaines environ.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées 21 jours à un manque d'oxygène simulant l'apnée du sommeil, puis subissent une ischémie du cœur sous anesthésie sans réveil ou un test à l'insuline, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress lors des premiers jours d'hypoxie, ainsi qu'un stress lié aux prélèvements. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'étudier ensemble l'hypoxie et l'infarctus sur un "organisme entier", en intégrant le rôle du sexe.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. De plus le sexe biologique joue dans le développement de cette maladie,. En effet il y a plus d’hommes que de femmes qui en sont atteints (2 hommes pour 1 femme). Chez les femmes l’apparition de cette maladie augmente après la ménopause et chez les hommes cette maladie entraine une diminution de leurs sécrétions de testostérone. Les connaissances cliniques et fondamentales sur les interactions entre le sexe et le cœur en hypoxie sont très peu connues. Ainsi l’objectif de ce projet est de comprendre précisément le lien entre le sexe, le manque d’oxygène et la dysfonction cardiaque associés,à travers l’ 1) évaluation de l’ infarctus du cœur chez les souris mâles et femelles exposées à l’hypoxie, 2) évaluation des interactions entre les protéines activées pendant le manque d’oxygène en fonction du sexe de la souris. En considérant le rôle du sexe dans cette étude, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas été évalués dans les modèles précliniques d’une maladie qui se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles selon l’Organisation Mondiale de la Santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. En considérant le rôle du sexe, , nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas encore été évalués dans les modèles précliniques.

Procédures

Pour répondre à la première partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles subiront une ischémie reperfusion du cœur sous anesthésie générale (3h). A la fin de cette procédure, sous anesthésie générale et sans réveil, elles seront mises à mort par prélèvement cardiaque. Pour répondre à la deuxième partie du projet, les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. Elles subiront un test de tolérance à l’insuline. Ce test consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injections). A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles seront mises à jeun pendant 6 h puis injectées ou non à l’insuline, puis mises à mort par prélèvement de sang sous anesthésie générale (mise à mort au bout de 30 secondes d’anesthésie générale), puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à lhypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal non endormi nécessite une injection intrapéritonéale d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure 1, tous les animaux sont anesthésiés, et le cœur est prélevé pour mesure la taille de l’infarctus du cœur. A l'issue de la procédure 2, tous les animaux sont anesthésiés, un prélèvement sanguin est réalisé et les organes sont prélevés pour analyse ultérieure.

Remplacement

Sur des modèles cellulaires, il est possible d’avoir des modèles d’hypoxie ou d'infarctus. Cependant, ces deux modèles nécessitent le même stimulus (i.e. manque d’oxygène). Donc ils ne peuvent pas être étudiés simultanément sur un modèle in vitro. Pour notre projet nous ne pouvons donc pas « remplacer » ce modèle animal par un autre modèle cellulaire puisqu’il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant de comprendre l’effet de l’hypoxie et de l’infarctus du coeur sur les organes et l’organisme entier. Il s’agit d’une étude du corps animal entier, impliquant des modifications de l’organisme et une communication entre les oragnes. Il est donc impossible de la remplacer.

Réduction

Suite à des travaux antérieurs, nous avons « réduit » au maximum le nombre d’animaux par groupe pour observer des éventuelles différences significatives. Nous utiliserons un logiciel statistique pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Le nombre d’animaux est calculé par connaissance du nombre de données finales nécessaire par technique pour réaliser des tests statistiques adéquats, et observer des différences significatives (p

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages. Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de repos dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale avec des antalgiques et les animaux ne seront pas réveillés.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les souris auront 8-14 semaines, ceci correspond à l’âge adulte de l’animal, cela nous permet de minimaliser les variations possibles liées à l’âge de l’animal.

171 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur crée par chirurgie abdominale un anévrysme de l'aorte, puis on leur implante une endoprothèse à revêtement anti-inflammatoire, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant une mise à mort à 7 ou 120 jours pour analyser les tissus. Le porteur conçoit un revêtement censé améliorer l'intégration des stents aortiques chez l'humain, un bénéfice qu'il qualifie de "translationnel majeur". Il affirme qu'aucune simulation fiable d'anévrysme n'existe et juge l'étude animale "indispensable".

Objectifs

Actuellement, les anévrysmes de l'aorte abdominale sont traités par implantation de stents aortiques. Il existe cependant des complications nécessitant de nouvelles opérations liées à un phénomène de rejet de ces stents. En effet, ils ne sont pas complétement intégrés dans le tissu du patient. L’objectif de l’étude est de concevoir un revêtement applicable sur ces stents aortiques pour améliorer leur intégration et donc diminuer le risque de rejet. Cette étude est une étude expérimentale chez l'animal (rat) dont les résultats pourraient permettre de transposer la technique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Un anévrysme est une déformation pathologique d'un segment vasculaire. Le risque d'un anévrysme est sa fragilisation et sa rupture, entrainant une hémorragie souvent grave. Chez l’homme, les anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA) sont traités avec des endoprothèses (stents aortiques). Ce traitement est toutefois grevé d’un nombre significatif de fuite et de migrations d’endoprothèses au cours du suivi. Ces complications pourraient être liées à un défaut d’intégration de l’endoprothèse L’objectif du projet est de développer une endoprothèse fonctionnalisée avec un revetement permettant sa meilleure intégration dans le tissu aortique. Le bénéfice translationnel est majeur avec une potentielle diminution des complications évolutives du traitement endovasculaire des AAA chez l’homme.

Procédures

Les animaux recevront de l’aspirine tout au long de la procédure pour éviter la formation de caillots (thromboses). Les animaux auront une implantation d’endoprothèses comportant des revetements anti-inflammatoires. Ces endoprothèses seront implantées chez des rats dont l’aorte est saine (pour étudier la biocompatibilité de ces endoprothèses) ou chez des rats chez qui des anévrysmes auront été créés préalablement 3 semaines plus tot pour mimer la pathologie humaine. Ces procédures d’implantation se feront par incision au niveau de l’abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et durent 30 minutes. La procédure de création d'anévrysme est également faite par une incision au niveau de l'abdomen sous anesthésie générale et antalgiques et dure 1h. Afin de mesurer l’inflammation, des examens de sang (prélèvement veineux au niveau de la joue) et d’imagerie (echographie abdominale, TEPscanner) seront réalisés sous anesthésie générale. Ces examens d'imagerie seront réalisés dans un autre établissement utilisateur et serviront à mesurer objectivement l'inflammation et donc à comparer les groupes d'étude. Dans l'axe I, les deux examens d'imagerie (echographie et TEPscanner) auront lieu 1 semaine après implantation des endoprothèses. Pour l'axe II, ces examens d'imagerie auront lieu à 1 et 4 semaines après implantation. Concernant les prélévements sanguins, dans l'axe I il aura lieu après euthanasie. Pour l'axe II il auront lieu à 1 semaine après implantation des endoprothèses (sous anesthésie générale) et après l'euthanasie à 3 mois après implantation des endoprothèses.

Impact sur les animaux

Les effets nuisibles attendus sont la présence d'un inconfort ou d'une douleur modérée de courte durée après les procédures chirurgicales. D'autres effets peuvent survenir comme une perte de poids, une deshydratation, une diminution de la mobilité ou encore la survenue de caillots sanguins (thrombose).

Devenir

Dans l'étude I, les animaux sont euthanasiés 7 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses). Dans l'étude II, les animaux sont euthanasiés 120 jours après implantation des endoprothèses pour analyse des tissus (étude microscopique de l'intégration des endoprothèses).

Remplacement

Il n’est actuellement pas possible de simuler de facon précise l’action d'un revetement anti-inflammatoire dans un tissu aortique. Il n’existe pas non plus de simulation fiable d’anévrysmes de l’aorte abdominale (AAA). L'étude chez l'animale reste indispensable. Toutefois, des expérimentations préliminaires ont permis une séléction précise du revetement anti-inflammatoire à tester chez l'animal et d’établir un protocole robuste.

Réduction

Nous avons volontairement choisi d'utiliser des examens d'imagerie non douloureuses et reproductibles dans le temps (échographie abdominale). Cela permet de suivre sur la durée les mêmes animaux sans les euthanasier. Nous avons également calculé préalablement à l'expérimentation le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Cela permet d'obtenir des résultats statistiques robustes tout en évitant d'inclure trop d'animaux.

Raffinement

-Les conditions d’hébergement seront optimisées au maximum : limitation des transports au strict nécessaire, enrichissement de l'environnement (mise en place de coton pour comportement de nidification, mise à disposition de baton à ronger), respect du rythme jour/nuit -Nous veillerons à réaliser un transport doux en limitant les mouvements brusques pour réaliser les procédures d'imagerie sur le site dédié. -Nous avons prédéfinis la liste d'élements de surveillance du bien-etre des animaux: tous les animaux seront surveillés quotidiennement à l'aide d'une grille standardisée de surveillance. Les animaux seront inspectés (poids, présence d'un inconfort/douleur, état de la cicatrice) et des soins adaptés comprenant des anti-douleurs seront administrés. Si une trop souffrance est constatée (présence de points limites), l'animal sera immédiatement euthanasié. -Nous utiliserons une procédure d’imagerie non invasive : l’echographie abdominale a été préférée à l’angiographie invasive. -Nous aurons recours à l’anesthésie et à l’analgésie pour toutes les procédures. - Concernant le transport entre site d'hébergement et site d'imagerie, une acclimatation avec transport la veille sur le site d'imagerie aura lieu avec manipulations douces.

Choix des espèces

-Le modèle animal (rat) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet (implantation d’endoprothèses dans l’aorte saine et dans des anévrysmes). Les dimensions de l’aorte du rat Wistar permettent son analyse en imagerie (echographie et TEP scanner). Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale est adulte et agée. Les animaux utilisés seront des males car il existe une nette prédominance masculine dans la population humaine présentant des anévrysmes de l'aorte abdominale.