Système cardiaque

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une thoracotomie provoquant une ischémie-reperfusion du coeur, avec un risque déclaré de douleurs post-opératoires, de saignements et d'hypothermie, avant que le coeur infarci ne soit prélevé. Le porteur cherche à identifier des récepteurs impliqués dans le remodelage cardiaque, en vue de "biomédicaments" dont il rappelle qu'ils sont une spécialité de son université. Il affirme que seul l'animal entier permet d'observer ces interactions, hors de portée des cellules en culture.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires dont le chef de file est l’infarctus du myocarde constituent à l’heure actuelle la première cause de mortalité dans les pays développés et ont une progression continuellement croissante dans les pays en voie de développement. Dans ces maladies, une part importante de la physiopathologie est liée à l’ischémie-reperfusion (l’ischémie est définie par la réduction ou l’interruption du débit sanguin dans un territoire vasculaire donné ; la reperfusion correspond à la restauration du flux sanguin). Même si leur prise en charge s’est beaucoup améliorée ces dernières années, certainescomposantes restent pour l’instant non ciblées par les thérapeutiques actuelles, qu’il s’agisse des lésions de reperfusion ou de la réponse immuno-inflammatoire à l’ischémie-reperfusion . La séquence ischémie-reperfusion myocardique, observée lors d’un infarctus du myocarde reperfusé, est associée à la libération de signaux de danger, parmi lesquels l’Adénosine Tri-Phosphate (ATP) et autres nucléotides extracellulaires. L’ATP et ses dérivés se fixent sur des récepteurs particuliers, les récepteurs purinergiques, entrainant des signaux extra et intracellulaires par cascades : la signalisation purinergique. Les récepteurs purinergiques sont communs aux cellules de l’immunité innée, aux cardiomyocytes et aux cardiofibroblastes. L'hypothèse de notre travail est que la modulation des récepteurs purinergiques pourrait permettre de diminuer l’impact de l’ischémie-reperfusion myocardique en diminuant les tailles d’infarctus. Dans ce nouveau projet, nous souhaitons réaliser une cartographie de l’expression des récepteurs purinergiques activés en contexte d’infarctus du myocarde chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier les principaux récepteurs purinergiques impliqués dans le remodelage ventriculaire après infarctus du myocarde. A moyen terme, cette étape nous permettra d’identifier des biomédicaments cardioprotecteurs dont la production est une spécialité reconnue de notre université.

Procédures

Ischémie-reperfusion coronarienne sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins d’1h30. Prélèvement sanguin dans la veine caudale sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins de 10 minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie par thoracotomie peut générer des douleurs postopératoires, surtout dans les premières heures après le réveil. La prise de sang peut également engendrer un hématome. La contention peut stresser les animaux. Enfin, la période périopératoire est à risque de saignements, d’hypothermie, voire de deshydratation. Tous les moyens seront mis en œuvre pour prévenir ces différentes nuisances/complications.

Devenir

Mise à mort. Le protocole d'étude prévoit in fine l'étude du coeur infarci explanté. La survie sans coeur n'est pas invisageable.

Remplacement

Des études sur cellules cardiaques en culture suggèrent l’implication de certains récepteurs purinergiques dans la survie de ces cellules en condition d’ischémie-reperfusion. Seul le modèle animal permet de voir cette implication sur un tissu entier où des interactions cellulaires sont à l’œuvre.

Réduction

L’outil statistique permet de réduire au minimum le nombre d’animaux indispensable à l’obtention de résultats interprétables. D’après l’analyse des résultats préliminaires, le nombre de souris nécessaire dans chaque groupe pour obtenir des résultats interprétables est de 8 par groupe. Tenant compte dans notre expérience d’une mortalité périopératoire de 25%, le chiffre de 10 par groupe nous parait raisonnable pour respecter au mieux la règle des 3R. L’étude est réalisée en plusieurs étapes successives, ce qui permet de cibler les récepteurs les plus pertinents et de réduire d’autant le nombre de substances testées et d’animaux opérés.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un effectif maximal de 5 souris par cage de 800cm3 est prévu avant les manipulations. Les animaux seront anesthésiés. La cicatrice de thoracotomie sera infiltrée en postopératoire immédiat avec une injection sous-cutanée d'anti-inflammatoire et d'anesthésique. Une analgésie post-opératoire sera réalisée. En cas de symptômes douloureux marqués, l’analgésie sera complétée. Le point limite est la présence d’une douleur sévère réfractaire au traitement antalgique. Pour le confort des animaux, durant la chirurgie, l’animal sera placé sur une table chauffante afin d’éviter les problèmes d’hypothermie liés à l’anesthésie et le réveil des animaux sera suivi par les personnels impliqués dans le protocole. Une ambiance sonore calme sera respectée. Après la chirurgie les animaux sont placés en cage individuelle pendant 12h. Après 12h, si la mobilité est satisfaisante et en l’absence de signes de douleur marquée, la souris opérée est remise en collectivité. La durée de la convalescence est estimée à 24h avec observations pluriquotidiennes (3x/jour).

Choix des espèces

La souris est une espèce reconnue pour l'étude des mécanismes immunitaires. De plus dans cette espèce, des animaux délétés génétiquement sont disponibles pour étudier l'implication de la réponse immune sur les lésions d’ischémie-reperfusion. Souris adultes de 6 semaines. L’âge est un facteur de risque cardiovasculaire.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies retirant les cinq sixièmes du rein, puis dix semaines de régime plus ou moins riche en phosphate et des passages en cage métabolique, avec un risque d'anurie, d'hypothermie, de perte de poids et de douleurs gastriques. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de fixer le sexe et le nombre d'animaux d'une étude ultérieure sur des souris génétiquement modifiées. Il affirme que seul un modèle in vivo permet d'étudier la relation entre rein, intestin et vaisseaux.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) à cause du développement de calcifications vasculaires (CV), facteur prédictif important de la mortalité. Lors de cette pathologie, la diminution de la fonction rénale induit la réduction de l’élimination du phosphate (Pi) (sel minéral présent dans le corps humain), cela conduit à une accumulation de cet élément dans le corps au niveau sérique. Ce phénomène est la principale cause de développement de CV. Chez un individu sain, la concentration sérique de Pi est maintenue dans la plage normale par l'équilibre entre un phénomène d’entrée au niveau intestinal et de sortie au niveau rénal, ce dernier étant donc déficient lors de l’IRC. Dans notre étude, nous nous intéressons essentiellement aux mécanismes d’entrée du Pi via le processus d’absorption intestinale et spécifiquement à celui du passage du Pi entre les cellules intestinales. De plus, malgré l’augmentation du taux sériques de Pi, le processus d’entrée reste anormalement activé, cela suggère que la détection et/ou le transport du Pi intestinal sont défectueux dans cette pathologie. Nous souhaitons donc étudier les médiateurs impliqués dans l’absorption du Pi de façon à identifier, dans le futur, des cibles thérapeutiques pour diminuer la concentration sérique de phosphate via la réduction de l’entrée de ce sel dans l’organisme. Ceci permettrait de limiter le développement de CV et donc de réduire la mortalité des patients atteints d’IRC. Nous avons récemment découvert que des souris modifiées génétiquement pour une certaine protéine : la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de Pi réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce défaut dans le développement des CV au cours de l'IRC. Dans le futur ces souris seront étudiées et donc rendues malades via une opération d’ablation de 5/6ème des reins (néphrectomie (Nx)-laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place). De plus ces souris recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 10 semaines. Cependant, la présente demande concerne la mise en place d’une étude pilote préalable. Ici, nous chercherons uniquement à caractériser la réponse en termes de CV de souris contrôle néphrectomisées, en fonction de leur régime (plus ou moins riche en phosphate) et de leur sexe.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, cette étude pilote nous permettra de savoir si les souris contrôles tolèrent bien la néphrectomie, si elles sont capables de développer des CV sous régime riche en phosphate et également si le sexe des animaux impacte leur réponse. Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’ajuster le nombre et le sexe des animaux pour la prochaine étude.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures : buprénorphine (injection sous cutanée de 5 secondes, 30 minutes avant le début de la chirurgie et 4 heures post-op) ; xylocaine (injection sous cutanée de 5 secondes sur le site de l'opération - 5 minutes avant la chirurgie). La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (buprénorphine avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 10 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 24 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. 6 et 2 jours avant le prélèvement sanguin terminal, les animaux recevront une injection en IP de tétracycline (marqueur de formation osseuse). Ces injections seront effectuées rapidement sur animal vigile par contention (5 seconde/animal). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang sur cœur battant va être réaliser via une ponction cardiaque (sur des animaux anesthésiés (injection en intrapéritonéale de 5 secondes- mélange de Kétamine et Xylazine)), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique (Euthasol, injection en intrapéritonéale de 5 secondes) , pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, les injections et le passage en cage métabolique. Les effets possibles sont : l’anurie, la perte de poids, l’hypothermie, des modifications comportementales (prostration, hypoactivité), une zone d’incision douloureuse, des douleurs gastriques (dos vouté, diarrhée). Anurie : durée post-chirurgical (environ 3h), Hypothermie : pendant chirurgie et réveil : environ 2h, Modifications comportementales : peut se déclencher pendant les 11 semaines post chirurgie, Zone d’incision douloureuse : pendant la cicatrisation post – chirurgie, Douleurs gastriques : peut arriver pendant les 10 semaines de régime.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre divers organes : le rein (néphrectomie), l’intestin (via l’absorption paracellulaire) et l’arche aortique/carotides (développement de CV). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

De façon à optimiser le nombre d’animaux et notamment à réduire au juste nécessaire, cette étude pilote est proposée. Ces résultats vont nous permettre de choisir le sexe des animaux utilisés pour les prochaines études (non présentées dans cette demande), et d’adapter le nombre au taux de mortalité observer ici. Après étude statistique ; il faut inclure au moins 8 animaux par groupe, mais en prenant en compte un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique robuste. Les études de cages métaboliques seront réalisées sur les mêmes animaux avant et après de façon à ce que l’animal soit son propre contrôle et donc diminuer la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. La procédure expérimentale implique la réalisation d’une néphrectomie pour induire une insuffisance rénale chronique, ce qui engendre de la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. De plus, les souris seront entrainées à être changées via un passage dans un tube pour ne pas avoir à toucher leur dos/queue lors des changes après néphrectomie car la zone pourrait être douloureuse. Ce tube sera toujours dans la cage et constituera également un enrichissement physique. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections en fin de protocole de tétracycline (IP ; 30mg/kg), elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. De plus, il n’y a aucun risque de toxicité car la concentration utilisée (30mg/kg) est largement en dessous de la DL50 décrite pour ce produit. L’acte de ponction cardiaque sera réalisé sous anesthésie lourde, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.

Choix des espèces

Ici, l'étude pilote est proposée sur des souris contrôles. Dans le futur (si les résultats de cette étude pilote sont concluants), une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées sera réalisée pour une meilleure compréhension de la pathologie. Ces études sont la suite de projets portant sur l'étude du métabolisme et menées dans le laboratoire. De ce fait, nous souhaitons continuer ce nouveau projet sur le même modèle que les souris utilisées précédemment au laboratoire et nous disposons de ces modèles de souris à l'animalerie. Cette étude pilote est donc proposée sur la souris. L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place) est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). L’étude pilote sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant la pose chirurgicale d'une fenêtre crânienne. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction transitoire de l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une injection d'anticorps et d'une imagerie du cerveau de deux heures sous anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur justifie l'impossibilité de garder les animaux en vie par la nature même de l'expérience, un thrombus occlusif étant provoqué. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité de la désagrégation plaquettaire et que les plaquettes, cellules anucléées, ne peuvent être cultivées.

Objectifs

Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Une étude clinique très récente indique qu'un nouveau candidat médicament divise la mortalité par 3 de patients qui présentent un AVC ischémique aigu. Le mécanisme d’action de cet agent reste obscur étant donné que l’effet protecteur n’est pas lié à une meilleure recanalisation mais un risque hémorragique diminué, suggérant un impact lors de la reperfusion de la zone du cerveau ayant subit une privation d'oxygène. Ce projet vise à déterminer le mécanisme d’action de cet agent lors d’AVC ischémique chez la souris justifiant ainsi l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur la possible utilisation d'un nouveau candidat médicament pour de nouvelles indications et d’essais cliniques

Procédures

Tous les animaux subiront : •Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose d’une fenêtre cranienne afin de pouvoir imager le cortex cérébral. 1 fois 45 minutes •Une induction d’un AVC par obstruction transitoire de l’artère cérébrale moyenne du cerveau sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie veineuse d’un anticorps 4 semaines après la pose de la fenêtre. 1 fois 15 minutes •Imagerie du cerveau par microscopie multiphotonique sous anesthésie générale 1 fois 2h •Mise à mort pas dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long des procédures. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du crâne ainsi que du cou de la souris sera réalisée par un personnel expérimenté disposant de la formation requise pour réaliser ce type d’expérimentation limitant ainsi au strict minimum les effets indésirables. De plus les souris seront anesthésiées tout au long des procédures expérimentales et et leur état de santé sera étroitement surveillé. Après la pose de la fenêtre cranienne, nous pouvons nous attendre à une légère perte de poids des animaux qui ne devrait pas excéder 3 jours. Nous nous attendons pas a des effets indésirables après l’induction de l’AVC de plus les animaux seront conservés seulement 24h et seront encore sous traitement analgésique.

Devenir

Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs les effectifs de chaque groupe ont été calculés suivant les tests statistiques en respectant la distribution selon une loi normale. Nous utiliserons des statistiques pour la comparaison de 2 groupes.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humains chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection déclenchant une maladie proche de la sclérose en plaques, responsable d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs, avant une imagerie de l'inflammation cérébrale. Le porteur indique suivre la douleur par une grille et un "grimace scale", et retirer les animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information et qu'il n'existe pas de modèle fiable sur des espèces jugées moins sensibles.

Objectifs

L’imagerie médicale est couramment utilisée en clinique dans le diagnostic et le suivi des patients atteints de pathologies cérébrales. L'objectif de ce projet est d'utiliser un nouveau type d'imagerie médicale afin de détecter de manière précise l'inflammation cérébrale. Notre laboratoire est spécialisé dans l’étude de l’inflammation du cerveau. Cettenouvelle technique d'imagerie consiste en l’injection intraveineuse d'un agent de contraste spécifique de la protéine vasculaire étudiée. Ici, les protéines étudiées sont celles impliquées dans l’infiltration des cellules immunitaires à travers la paroi des vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

L'inflamamtion du cerveau est présente dans de nombreuse pathologies, comme la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux et la maladie d'Alzheimer. Le développement de l'imagerie de l'inflammation cérébrale permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de ces différentes maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions: (1) Induction d'un modèle de sclérose en plaques. (2) Imagerie de l'inflammation cérébrale.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle de slcérose en plaques s’effectue via l’injection d’un cocktail induisant l’apparition d’une réaction auto-immune, responsable à terme d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs. Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de l’euthanasie) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et retrait de l’étude si une perte de plus de 15% est observée par rapport au poids initial. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de douleur sont également le suivi basé sur le "grimace scale", une couverture analgésique suffisante en période pre et post induction, l'hébergement en petits groupes sociaux stables avec un enrichissement minimum (un carré de coton, dôme en carton, paillettes). Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité, et durée du cycle de lumière.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En effet, la souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans la l'inflammation cérébrale, grâce à différents modèles bien caractérisés comme celui de la sclérose en plaques utilisée dans ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de l'inflammation rencontrée chez les patients. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post induction et un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires desvaisseaux cérébraux sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'efficacité de l'imagerie dans la détection de l'activation vasculaire dans les modèles d'inflamamtion cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 2 à 3 mois. Il est classiquement décrit que le modèle de sclérose en plaques ne peut-être induit que dans cette fenêtre de temps, qui correspond à la pathologie humaine qui touche de jeunes adultes.

1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".

Objectifs

Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).

Impact sur les animaux

L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).