Système cardiaque

250 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès l'âge de deux jours, les souriceaux sont gavés deux fois par jour pendant sept jours avec des staphylocoques, ce qui peut provoquer une inflammation digestive, des diarrhées, une infection généralisée avec fièvre et déshydratation. Le porteur prévoit la mise à mort par décapitation dès une perte de poids supérieure à 15 %, puis une analyse bactériologique des tissus. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'animal et retient le modèle néonatal parce que les infections humaines visées surviennent dans les premiers jours de vie.

Objectifs

Les bactériémies à Staphylocoques chez les nouveaux-nés peuvent-être médiées par le portage digestif. Lors d'une étude préliminaire, nous avons pu montrer une forte présence de Staphylocoques dans les selles des patients atteints de bactériémie. Nos travaux in-vitro se sont donc portés sur la colonisation de différentes espèces de Staphylocoque (aureus, capitis, haemolyticus) au niveau digestif. Nous avons réussi à déterminer que ces pathogènes parvenaient à passer à travers la barrière intestinale en utlisant des cellules appelées entérocytes et cellules M. Pour confirmer nos observations, un modèle in-vivo de souris néonatal nous permettra de (i) confirmer le passage intestinale de ces souches à travers l'épithélium intestinal. Nous pourrons également vérifier (ii) qu'une souche microbiotique (L. lactis) peut avoir un effet protecteur quant à l'implantation de souches pathogènes.

Bénéfices attendus

Nos résulats in-vitro valident nos hypothèses sur un modèle simple. Un modèle animal complexe permettrait de résoudre le mystère de la physiopathologie des Staphylocoques dans l'intestin.

Procédures

Les interventions seront des gavages répétés 2x/jour (20 secondes par gavage, donc 40 secondes par jour de gavage) pendant 7 jours chez des souriceaux âgés entre 2j et 9j. La pesée et le test du pli de la peau du dos prendront environ 30 secondes par jour. Au total, les souriceaux seront exposés à environ 1 minute de procédure par jour pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Le gavage sur souris adulte est une technique maitrisé dans le laboratoire, il faudra cependant adapter notre protocole à des souriceaux. Il est possible que la sonde de gavage puisse provoquer une légère irritation dans la gorge de l'animal. L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériemie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour une analyse bactériologique et inflammatoire des tissus.

Remplacement

Nous sommes limités par notre modèle simple in-vitro. Un modèle de récupération de cellules primaires de patients est envisagé mais restera circonscris à un modèle in-vitro. Il est impossible d'envisager de travailler sur un modèle in-vitro reproduisant la complexité d'un animal.

Réduction

Nous n'aurons pas besoin d'effectuer des génotypages et des sélections de génotypes puisque nous travaillerons sur des souris au génotype "sauvage" issus d'éleveurs agréés. Afin de minimiser le nombre d'individus nécessaires, un test statistique ANOVA a permis de défnir le nombre d'animaux nécessaire pour une puissance statistique significative.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois tous les jours pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur. Cela évitera également que la mère délaisse ces petits après les manipulations de l'expérimentateur. Les petits resteront avec leur mère (il ne pourra donc n'y avoir qu'une condition par cage) pour éviter toute souffrance des bébés. Les bébés seront pesés 1 fois par jour avec une balance de précision pour détecter une perte de poids correspondant à l'installation de la maladie. Une perte de poids supérieure à 15% conduira au sacrifice de l'animal par décapitation. Les petits ne seront utilisés qu'à partir de l'âge de 2 jours, les recommandations demandent de laisser généralement la femelle et ses petits tranquilles pendant les premières 24h de vie. Les gants seront changés entre chaque cage, avec un frottage préalable avec de la litière avant de manipuler les petits. Les souriceaux seront manipulés sur une table chauffante (préalablement frottée avec de la litière de la cage) ou dans le creux des mains pour éviter une hypothermie. Les mères seront alimentées avec une nourriture enrichie pour reproducteurs. Les cages seront enrichis (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture pour les individus adultes seront mis à disposition "ad libitum". Chaque animal bénéficie d'une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude. Les gavages seront effectués via une sonde flexible spécialement adapté aux souriceaux.

Choix des espèces

La souris est à l'heure actuelle l'animal le mieux adapté pour la modélisation de la colonisation intestinale à Staphylocoques. Il se trouve que cet animal peut-être naturellement colonisé par S. aureus. L'expérimentation sur des animaux de petites tailles permet d'apporter des élements dans un contexte physipathologique impossible à atteindre in-vtro ou en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à H+48 par rapport à leur naissance. En effet, les bactériémies observées chez les nouveaux-nés humains se produisent dans les 5 jours suivant la naissance. Il est donc nécessaire de développer un modèle murin néonatal. Les souris adultes ne pourront pas être infectées par le gavage de leurs petits. En effet, les trois espèces bactériennes utilisées sont : - S. capitis pour lequel le risque d’infection est impossible pour une souris adulte en bonne santé (C’est avant tout un germe opportuniste qui profite de l’axenie des nouveau-nés pour s’implanter) - L. lactis qui est une souche commensale sans pouvoir pathogène - S. aureus pour lequel il pourrait exister une faible chance pour les souris adultes d’être inféctées. L’inoculum étant principalement localisé dans les souriceaux, un transfert suffisamment important de l’inoculum des souriceaux à la souris adulte est impossible. Une quantité très importante est généralement nécessaire pour induire un effet direct sur la souris adulte (en gavage direct ou sur une plaie profonde et maintenue induite par l’expérimentateur). Il est impossible que cette dose se retrouve par accident au contact des souris adultes.

190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une IRM, de prélèvements de sang, de l'injection d'un anticorps et de tests comportementaux de récupération dont le détail n'est pas précisé, avant la mise à mort pour analyses au microscope. Le porteur reconnaît des douleurs après la chirurgie et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone du cerveau lésée. Il situe une éventuelle nouvelle stratégie thérapeutique au conditionnel et affirme que les méthodes de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Nous allons baser notre étude sur ALCAM (Activated Leukocytes Cell Adhesion Molecule). En effet, en contact avec des molécules inflammatoires, les monocytes et lymphocytes circulants dans le sang expriment ALCAM à leur surface, facilitant ainsi leur infiltration à travers la paroi des vaisseaux sanguins. De plus, la concentration d’ALCAM dans le sang des patients est positivement corrélée à la gravité d’un AVC. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1) développer l’IRM ciblant la molécule ALCAM et tester sa sensibilité dans la détection de l’inflammation dans un modèle murin d’AVC; 2) caractériser le rôle d’ALCAM dans la pathologie de l’AVC et 3) évaluer l’efficacité du blocage d’ALCAM dans la récupération des animaux soumis à un modèle d’AVC.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la protéine ALCAM dans les AVC et pourrait conduire à l'élaboration d'une nouvelle stratégie thérapeutique plus efficace dans la prise en charge des patients touchés par un AVC.

Procédures

-Phase 1: Développement de l’IRM moléculaire ciblant ALCAM. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne et l'IRM de l'inflammation seront réalisés. -Phase 2: Étude de l’implication de ALCAM dans la physiopathologie des AVC. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne ainsi qu'un prélèvement sanguin seront réalisés. -Phase 3: Test de l’efficacité d’un anticorps bloquant l’interaction d’ALCAM avec ses ligands dans un modèle d’AVC chez la souris. Un modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne sera utilisé. Une injection intraveineuse d'anticorps anti ALCAM, d'isotype control ou de médicament thrombolytique sera réalisée, suivie par la réalisation de tests comportementaux de mesure de la récuperation fonctionelle.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) peut être observé, mais ce dernier disparaît généralement dans la première semaine après l'AVC. De plus, l'injection intraveineuse d'anticorps bloquant ou de radiotraceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle d'ALCAM dans les AVC. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, une laparotomie au cours de laquelle une thrombose de la veine cave inférieure est provoquée, puis une perfusion mortelle de fixateur pour prélever les organes. Le porteur indique que ces actes peuvent provoquer douleur, durcissement de la zone opérée et occlusion intestinale, ce qui justifie la gravité sévère. Il présente le projet comme la recherche de nouveaux mécanismes de la maladie thromboembolique, les traitements adjuvants espérés étant renvoyés au moyen terme.

Objectifs

La maladie veineuse thromboembolique (MVTE) est la conséquence de la formation d'un caillot sanguin (thrombus), obstruant partiellement ou totalement une veine. Les deux principales présentations cliniques de la MVTE sont l’embolie pulmonaire et la thrombose veineuse profonde ou phlébite. La MVTE constitue un problème de santé publique majeur en raison de sa fréquence et de sa gravité. Cependant, chez la moitié des patients aucun facteur de risque n’est identifié, excluant ainsi tout pronostic d’évolution de la pathologie. De ce fait, afin de prévenir une éventuelle récidive, les patients sont traités à vie avec des anticoagulants. Or, ces traitements sont associés à un risque d’hémorragie non négligeable et ne préviendront de potentielles récidives que chez 30% des malades. Il est donc nécessaire de lever le voile sur les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Nos travaux de recherche menés chez des patients et sur des cellules en culture, ont permis de mettre en lumière deux acteurs potentiellement impliqués dans ce phénomène. Ces cibles se situent à l’interface du système immunitaire et du système sanguin. Elles jouent un rôle majeur dans la réponse inflammatoire du système immunitaire et pourraient en conditions pathologiques conduire à la survenue de la thrombose. Il est à présent bien établi que le phénomène nommé thrombo-inflammation joue un rôle important dans la survenue de la thrombose. Il reste encore à en définir tous les acteurs et à identifier leur rôle. Notre demande d’autorisation de projet a pour objectif d’étudier le rôle de deux acteurs du système immunitaire dans la survenue d’un thrombus. Dans la poursuite des travaux in vitro que nous avons menés, nous souhaitons à présent étudier l’impact de ces molécules sur la formation d’un thrombus in vivo. Ces travaux nécessitent l’utilisation de modèles murins chez qui nous induirons une thrombose veineuse.

Bénéfices attendus

Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Le but de ce projet est de mettre en évidence de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires qui permettront à moyen terme le développement de traitements adjuvants aux anticoagulants et donc une prise en charge plus personnalisée des patients.

Procédures

Toutes les souris (520 animaux) seront soumises à une thrombose de la veine cave inférieure induite de façon chirurgicale. Elles seront opérées une seule fois (durée intervention 1h30) sous anesthésie générale. Elles seront analgésiées 30 minutes avant. Nous assurerons un suivi post-chirurgical renforcé pendant 48 heures (Analgésie et scoring clinique systématique). 30 souris seront soumises à deux administrations : la première juste avant la chirurgie et l’autre le lendemain matin. Elles seront anesthésiées et analgésiées, l’intervention aura une durée de 10 minutes. A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront soumis à une perfusion de serum physiologique suivi d'un fixateur en vue d'utilisation des organes pour des expériences d'histologie. Ils seront sous anesthésie gazeuse et auront reçu au préalable un analgésique.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la procédure subissent une chirurgie. Nous réalisons une laparotomie puis nous dégageons le tube digestif et nous induisons une thrombose au niveau de la veine cave inférieure (1). Les organes sont ensuite remis en place (2), la paroi musculaire et la peau sont suturées (3). Les nuisances possibles suite à ces actes chirurgicaux sont les suivants : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée. Par conséquence, nous avons attribué une gravité prospective sévère à la procédure. Concernant les 30 souris recevant une administration intrapéritonéale, nous estimons comme nuisance possible une douleur liée à l’injection. La molécule administrée ne présente aucun toxicité. Concernant la perfusion intra-cardiaque ante-mortem, elle conduira à la mort de l’animal.

Devenir

Afin de réaliser des analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes vitaux et de sang seront effectués sur les souris. C’est pourquoi, les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.

Remplacement

Concernant le remplacement, nous avons eu recours à des expériences in vitro (culture cellulaire) et aux études cliniques (analyses de cohortes de patients) qui nous ont permis d’élaborer ce projet de recherche. Toutefois ces études ont des limites. En effet, la maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et cellules immunitaires) et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à la thrombose veineuse nécessite la mise en place de protocoles in vivo pour que toutes les composantes nécessaires soient présentes. Il n’est aujourd’hui pas possible de reproduire la thrombose veineuse par l’utilisation de modèles in vitro ou ex silico.

Réduction

Afin de réaliser une étude statistique robuste sur nos cohortes d’animaux, des groupes de 12-15 animaux sont nécessaires. Toutefois, nous ferons systématiquement un point lorsque nous aurons 8 animaux par groupe, nous réaliserons une étude statistique avant de poursuive ou non les inclusions d’animaux. Nous avons optimisé nos tests de sorties afin qu’au terme de la procédure expérimentale, le sang et différents organes soient prélevés sur un même animal et puissent servir à diverses analyses. L’utilisation de l’échographie-doppler 48h après l’induction de la thrombose a pour but d’inclure dans nos procédures uniquement les animaux qui ont thrombosé, limitant ainsi la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Tous les animaux utilisés dans le projet sont sains et ne présentent aucune pathologie. Au cours de la procédure expérimentale, tous les animaux seront pris en charge par les responsables du projet qui s’assureront de leur bien-être. Ils recevront une analgésie et une anesthésie adaptées ainsi que du sérum physiologique pour pallier à une éventuelle déshydratation. Ils seront déposés sur un tapis chauffant à 37°C et nous déposerons du gel ophtalmique sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Concernant la prise en charge de la douleur opératoire, nous utiliserons de façon systématique une analgésie adaptée. En post-opératoire, nous disposerons dans la cage des animaux du gel d’hydratation. Ce gel sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Afin de rendre le gel plus appétant, il sera supplémenté avec l'équivalent d'une noisette de pâte à tartiner commerciale au chocolat. Nous habituerons les animaux à ce gel dans les 7 jours avant la chirurgie. Dans les 48h après la chirurgie, la douleur et le site de suture des animaux seront évalués selon des grilles d’observation et chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement.

Choix des espèces

L'utilisation de souris comme modèle d'étude de la maladie thromboembolique est pertinente car : - Les modèles de thrombose veineuse utilisés dans ce projet chez la souris sont très bien caractérisés dans la littérature, fiables et reconnus par nos pairs. - Nous maîtrisons les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de ce modèle. - Nous utiliserons deux lignées de souris transgéniques, ces souris sont déficientes pour nos protéines d’intérêts. En comparant les résultats obtenus avec un groupe contrôle nous pourrons déterminer comment la thrombose est modulée par l’absence de ces protéines impliquées dans l’inflammation. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 10 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est immunisée pour déclencher une myocardite auto-immune, l'autre subit une chirurgie du thorax reproduisant une sténose de l'aorte, les deux menant à une insuffisance cardiaque avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique que les deux procédures sont classées sévères parce qu'elles conduisent à cette défaillance du cœur. Il prévoit quelques expériences in vitro mais juge l'animal "nécessaire" faute de modèle de myocardite ou d'hypertrophie cardiaque hors de l'organisme entier, les cibles visées restant renvoyées à d'éventuelles études cliniques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les intéractions moléculaires des cellules immunitaires avec les vaisseaux lymphatiques pendant l’inflammation cardiaque afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies cardiovasculaires (MCV) tels que la myocardite ou l’hypertrophie pathologique. Nous souhaitons utiliser un modèle de myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induit par immunisation contre la troponine I (TpnI) pour : 1) caractériser l’expression des molécules de co-signalisation et 2) moduler la réponse immunitaire à l’aide de traitement ICI (immune checkpoint inhibitors) afin de comprendre au mieux les cas cliniques rapportés dans la littérature de myocardite induite par traitement ICI chez des patients atteints de cancers. D'autre part, le modèle de sténose aortique (TAC : transverse aortic constriction) permet de modéliser une cardiomyopathie hypertrophique pathologique. En caractérisant finement la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques au travers des cytokines, chimokines et des molécules de co-signalisation, nous souhaitons proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler cette hypertrophie pathologique. Ensemble, ces deux modèles vont permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de MCV. Nous pourrons alors proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la médiation de cette réponse immunitaire et ainsi prévenir le développement d’une insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde suivi dans les pays industrialisés du cancer (OMS, 2017). Le besoin de nouvelles thérapeutiques anti-tumorales a permis l’émergence de l’immunothérapie. Cependant, l’utilisation en oncologie d’immunothérapie a rapporté la présence d’effets indésirables d’origine auto-immune tel que les myocardites. Bien que rares, ces évènements sont associés à une mortalité élevée. C’est pourquoi nous avons choisi de mettre en place le modèle EAM pour comprendre le développement de ces effets indésirables à la suite d’un traitement d’immunothérapie. Ce projet va nous permettre de caractériser le remodelage lymphatique et la réponse immunitaire cardiaques au cours de maladies cardiovasculaires. Nos deux modèles décrit dans cette DAP permettent d’étudier deux maladies cardiovasculaires d’origine non-ischémique présentant un phénotype cardiaque différent. Dans un premier temps, la caractérisation précise de la communication qui existe entre cellules structurantes cardiaques (cardiomyocytes, fibroblastes, etc), cellules lymphatiques et cellules immunitaires dans le contexte de ces deux modèles de maladies cardiovasculaires au travers des cytokines, chimiokines et des molécules de co-signalisation va nous permettre, dans un second temps, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler l’inflammation, l’œdème et la fibrose afin de restaurer la fonction cardiaque. Ce projet s’inscrit dans un axe de recherche en plein essor qu’est la cardio-immunologie. A terme, ces nouvelles cibles thérapeutiques pourront faire l’objet d’études cliniques chez le patient et ainsi proposer de nouvelles solutions pour l’utilisation de l’immunothérapie antitumorale en limitant la survenue d’effets indésirables cardiaques mais également de nouvelles solutions pour le traitement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Dans la procédure N°1 les animaux vont etre immunisés en 3 fois ( 1 par semaine pour les 310 souris). Des prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour 360 souris) Dans la procédure N°2, une opération chirugicale de type mini Thoracotomie sera réalisée sur 180 souris. Des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour ses 180 souris).

Impact sur les animaux

Les deux procédures sont classées sévères. Les deux procédures mênent à une insufisance cardiaque, la première procédure est produite par une immunisation, induisant une inflammation cardiaque. La deuxième procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque (minimalement invasive).

Devenir

mise a mort de tous les animaux en fin d'etude pour analyses cellulaires et moleculaires

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle de myocardite ou d’hypertrophie pathologique in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique, lymphangiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de détecter une différence de 15% (ex : one way ANOVA et test de Tukey). Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie. Un meilleur suivi post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle TAC.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle.