Système cardiaque
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Cibler les récepteurs à l’histamine pour traiter les cancers associés à EBV chez la souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
354 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger pour 90 d'entre elles et modéré pour 264. Elles reçoivent une série d'injections, dont un virus EBV et des cellules humaines, pour développer un lymphome, puis un ligand testé contre les cancers liés au virus, avant d'être tuées par dislocation cervicale. Le suivi de la tumeur va jusqu'à un volume de 2 000 mm³ ou l'apparition de signes de douleur. Le porteur mentionne des organoïdes en développement mais affirme que seul le modèle murin permet de tester les deux phases du traitement.
Objectifs
Le virus Epstein-Barr (EBV) est associé à plusieurs cancers d’origine épithéliale ou lymphoïde. Ce virus infecte plus de 90% des humains et la mononucléose infectieuse est la manifestation commune de l’infection primaire. EBV établit ensuite une infection chronique dormante c'est à dire qui passe inaperçue, durant laquelle son potentiel oncogénique peut s’activer et conduire notamment à des cancers comme des carcinomes nasopharyngés et des lymphomes. La réplication du virus EBV entraine la lyse des cellules infectées (cycle lytique). La réactivation du virus dormant dans les cellules épithéliales et les lymphocytes B est par conséquent une piste explorée pour éliminer le réservoir viral et les cellules infectées prolifératives, avant ou après leur transformation en cellules cancéreuses. Si des progrès importants ont été réalisés dans la découverte d’inducteurs du cycle lytique, des molécules sures et spécifiques sont toujours attendues. Un récepteur cellulaire a été identifié comme étant une cible majeure impliquée dans la réactivation du cycle lytique d'EBV, et donc une cible pour développer des molécules antivirales contre EBV. S’appuyant sur de solides résultats, le projet qui sera developpé ici vise à tester des ligands de ces récepteurs cellulaires ayant les meilleures structures chimiques autorisant un transfert vers la clinique. Pour cela, des modèles murins précliniques permettant de reconstituer des lymphoproliférations humaines EBV positives à partir de souris immunodéficientes seront développés et permettront de tester l'efficacité de ces ligands in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet qui vise à tester de nouvelles molécules dans des modèles précliniques de tumeurs EBV+ devrait avoir un impact en santé humaine à moyen terme. En effet, si les molécules testées s'avèrent avoir un effet dans ces modèles précliniques, un essai clinique de phase I voire II pourrait être mis en place afin de tester ces molécules chez l'homme.
Procédures
1. Injection unique de Bulsulfan en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 2. Injection unique du virus EBV en intrapéritonéale (durée de quelques secondes). 3. Injection unique de cellules CD34+ humaines (durée de quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 4. Injection répétée (1 fois par jour pendant 5 jours jusqu'au développement du lymphome) d'anticorps anti-CD3 humain (durée quelques secondes) en intraveineux après anesthésie gazeuse. 5. Injection répétée (toutes les 12h, pendant 2 semaines) du ligand du récepteur à l'histamine JNJ7777120 en intrapéritonéal (durée quelques secondes). 6. Prélèvement de sang par ponction submandibulaire, 1 fois par semaine jusqu'à reconstitution d'un système hématopoiétique humain, à l'aide d'une lancette (durée de quelques secondes). 7. Injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi dans 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes) après anesthésie gazeuse. 8. Injection en sous-cutanée d'un fragment de 1 à 2 mm3 de PDX T1 ou T2 dans100µl de PBS qui seront mélangés à 100µl de Matrigel (durée de quelques secondes).
Impact sur les animaux
1. Nuisances légères attendues liées aux injections en intrapéritonéale, durer que quelques secondes, temps requis pour effectuer l'injection. 2. Nuisances modérées attendues liées aux injections en intraveineux. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 3. Nuisances modérées attendues liées aux prélèvementx de sang par ponction submandibulaire (limités à 2 gouttes soit 50µl). 4. Nuisances légères attendues suite à l'injection unique en sous-cutanée des cellules Daudi ou d'un fragment de PDX. Afin de limiter les nuisances de ces injections, les souris seront préalablement anesthésiées. 5. Nuisances modérées attendues liées au développement du lymphome. Afin de limiter au minimum les effets indésirables associés au développement du lymphome, les animaux seront observés 3 jours par semaine afin de mettre en évidence tous signes évoquant une éventuelle douleur (gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté). Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Pour les lymphomes greffés en sous-cutané le suivi sera réalisé par mesure de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse et les souris seront mises à mort dès que la tumeur atteinsra un volume de 2000 mm3.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale afin de réaliser les prélèvements nécessaires pour analyser l'impact des molécules thérapeutiques sur le développement des tumeurs associées à EBV.
Remplacement
Des modèles d'organoïdes de tumeurs sont actuellement en cours de développement qui pourraient à terme remplacer une partie des expériences actuellement réalisées chez la souris. Il n'existe cependant pas de modèle de ce type permettant d'analyser à la fois l'effet des molécules testées dans ce projet directement sur les tumeurs et leur impact indirecte sur la réactivation du système immunitaire pour aider à détruire ces tumeurs. Seuls ces modèles murins précliniques permettent de tester les 2 phases potentielles de l'activité de ces traitements qui visent à réactiver le cycle lytique d'EBV.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons : - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris. - effectuer une étude statistique descriptive (Test t) qui déterminera les différences qualitatives et quantitatives entre les groupes des souris. Cela permettra d’éviter la répétition de l’expérience et de réduire au minimum l’utilisation des animaux - optimiser le matériel issu des tumeurs pour production multiple (cellules des différents organes congelés en DMSO, extraction des acides nucléiques (ADN, ARN), et inclusion des organes pour histologie) et éviter ainsi la répétition de l’expérience. - quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection ou greffe pour limiter les échecs.
Raffinement
Les souris seront laissées en acclimatation en zone expérimentale pendant une semaine. Dans la procédure 2, les souris seront observées de façon journalière afin de mettre en évidence les points limites définis dans la procédure. Dans la procédure 3, avant injection des cellules en sous-cutanée, les souris seront anesthésiées. Lors du suivi des animaux, la prise tumorale sera évaluée par palpation jusqu'à apparition des signes cliniques. Dans la procédure 4, lors de l'humanisation des souris, celles-ci seront observées 2 fois par semaine jusqu'à reconstitution à hauteur de 40% de cellules humaines dans le sang des souris. A partir de l'infection par EBV, les animaux seront alors surveillés 3 fois par semaine afin de mettre en évidence le développement de lymphome qui se caractérisera par la mise en évidence des signes suivant : gonflement de l'abdomen, réduction de l’activité (prostration), poil hérissé et dos vouté. Si un de ces signes cliniques est observé, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale. Dans la procédure 5, les tumeurs qui se développeront en sous-cutanée seront mesurées 2 fois par semaine jusqu'à obtenir un point limite de 2000mm3 maximum, la souris sera également mise à mort si la tumeur nécrose ou si elle empêche un déplacement normal de la souris. Si l'un de ces points limites est atteint, la souris sera mise à mort par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Chez la souris, des modèles très immunodéficients tels que les souris NSG sont accessibles à la communauté scientifique. Ces souris représentent donc un modèle de choix pour reconstituer soit un système immunitaire proche de l'homme soit des pathologies humaines telles que des lymphomes. Les souris seront utilisées à partir de 8 semaines qui correspond à l'âge adulte de ces animaux.
Rôle d’HSF1 dans l’érythropoïèse.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale de BrdU, puis sont tuées 24 heures plus tard pour prélever la moelle osseuse de leurs fémurs et tibias, afin d'étudier le rôle de la protéine HSF1 dans la formation des globules rouges. Le porteur indique avoir d'abord travaillé sur le poisson zèbre et des cellules humaines de sang de cordon, mais affirme que ces modèles ne permettent pas de tester son hypothèse au niveau de la moelle osseuse. La retombée annoncée reste fondamentale, définir HSF1 comme molécule clé de l'érythropoïèse.
Objectifs
L’érythropoïèse est le processus de formation de globules rouges. C’est un phénomène permanent et débute lorsqu'une cellule souche pluripotente (donnant naissance à n'importe quelle cellule sanguine) s’engage en progéniteurs érythroïde qui, par des phénomènes de prolifération et de maturation, donnera naissance à des érythrocytes. La proportion de progéniteurs érythroïdes dans la moelle osseuse est faible (-d’1 % des cellules). On estime la production moyenne de globules rouges à 10 milliards de cellules par heure. Il existe une remarquable expansion du compartiment érythroïde ainsi qu’une fine régulation de l’érythropoïèse au niveau cellulaire et moléculaire. Notre équipe a montré que les protéines de choc thermiques (HSP) sont impliquées dans l’érythropoïèse. Nos résultats préliminaires chez le poisson-zèbre montrent que la protéine HSF1 (Heat Shock Factor 1), contrôlant l’expression des HSPs, est également nécessaire à l’érythropoïèse, et de façon partiellement indépendante des HSPs. Nous avons observé une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons dans lesquels l’expression d’HSF1 est inhibée. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. Des travaux récents ont montré que de nombreux gènes n’appartenant pas à la famille des HSP sont régulés par HSF1 et jouent un rôle fondamental dans le cycle et la différenciation cellulaire. Notre hypothèse est que des gènes essentiels à l’érythropoïèse seraient également régulés par HSF1. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons besoin, dans des souris déficientes en HSF1 (Hsf1-/-), de mesurer les quantités d’érythrocytes dans le sang d’une part, et d’autre part de tester la capacité des précurseurs érythrocytaires de la moelle à former des globules rouges. La formulation sanguine de nos animaux de phénotypes sauvages (WT) et déficients pour HSF1 (Hsf1-/-), sera analysée grâce à un prélèvement sanguin (veine caudale). Après anesthésie, la mise à mort permettra de récupérer leurs fémurs et tibias afin d’en extraire la moelle osseuse dans le but de déterminer : Sa capacité à réaliser l’érythropoïèse via un phénotypage par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire (progéniteurs et précurseurs). Le niveau d’expression d’HSF1. L'état du cycle cellulaire des cellules en cours de différenciation érythroïde via injection intrapéritonéale de BrdU
Bénéfices attendus
Nos résultats chez le poisson-zèbre montrent une forte diminution du nombre de globules rouges dans les poissons délétés en HSF1. Ce phénomène s’accompagne d’une diminution de la maturation des précurseurs érythrocytaires, suggérant un blocage de l’érythropoïèse. La confirmation de ces résultats dans un modèle murin in vivo permettrait de définir HSF1 comme une molécule clé de la régulation de l’érythropoïèse.
Procédures
Les animaux vigiles recevront une injection par voie intrapéritonéale de BrdU (bromodésoxyuridine) (injection unique ; 3-4 secondes). 24h après injection, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés, la moelle osseuse sera extraite des fémurs et des tibias prélevés et l’analyse du cycle cellulaire réalisée par cytométrie en flux sur la base du phénotypage érythroïde précédemment mis au point.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles relatifs à l’utilisation de BrdU sur modèle murin sont les suivants : o Diarrhée o Léthargie o Agression o Perte de poids o Lésions inflammatoire cutanées o Réduction de la croissance du pelage o Atteinte hématologique (anémie, leucopénie, thrombopénie) Ces effets peuvent être observés dans le cas d’une exposition longue à la molécule (6 semaines pour une administration via l’eau de boisson ou 1 semaine par injection intrapéritonéale quotidienne). Dans notre cas de figure, nous n’excèderons pas 24h post injection ce qui, selon nous, limitera l’apparition de tels effets. Sachant cela, nous porterons toutefois une attention particulière à ces paramètres durant les 12 à 24h suivant l’injection de BrdU afin de garantir au maximum un qualité de vie optimale de nos animaux.
Devenir
A l’issue de la procédure expérimentale, nous projetons de prélever et d’utiliser les moelles osseuses issues des tibias et fémurs des animaux de type sauvages (Wild Type ; WT) et déficients pour le facteur HSF1 (Hsf1-/-). Ce mode d’analyse sera réalisé ex-vivo par cytométrie en flux afin d’analyser la composition cellulaire relative à la voie de différenciation érythrocytaire de nos souris.
Remplacement
Nos résultats préliminaires obtenus dans le modèle de poisson zèbre nous a permis à la fois de remplacer l’utilisation de petits mammifères tels que les souris (Mus musculus ; A1) et d’en réduire le nombre au regard des différents axes restant à être investigués. Toutefois, ce model ne nous permet pas de tester notre hypothèse de régulation de gènes essentiels à l’érythropoïèse par HSF1 car 1) il nous permet seulement de travailler sur l’érythropoïèse embryonnaire et 2) l’étude des gènes régulés ne peut se faire qu’au niveau du poisson entier, et non pas au niveau de la moelle osseuse (site de l’érythropoïèse).
Réduction
En plus du modèle poisson zèbre, nous avons obtenu un ensemble de données grâce à l’utilisation de cellules souches et cellules progénitrices érythroïdes humaines à partir de sang de cordon ombilical. La réalisation de telles expériences sur ce matériel cellulaire nous a permis d’affiner nos axes de recherche, d’affiner notre investigation relative aux voies de signalisation intracellulaire d’intérêts ainsi que nos cibles géniques. Ceci ayant pour répercution la réduction, in fine, du nombre d’expérience à réaliser sur le modèle murin (Mus musculus) et par extension la réduction du nombre d’animaux à utiliser afin de confirmer nos résultats. Nous estimons à 60 le nombre total d’animaux qui seront utilisés dans le cadre de la phase expérimentale (30 Wild Type ; WT (phénotype sauvage) / 30 Hsf1-/- (déficientes pour le facteur HSF1) toutes expérimentations comprises). Ce nombre d’animaux correspond au nombre minimal permettant d’obtenir des résultats significatifs avec le test statistique utilisé ainsi que les mises au point (principalement sur des souris de phénotype sauvage).
Raffinement
Dans le but de réduire, supprimer/soulager la douleur/détresse de nos animaux dans le cadre de nos expériences nécessitant une intervention (injection intrapéritonéale) sur animaux vigiles, nous avons basé notre méthodologie sur des travaux optimisés, revus et publiés dans la littérature scientifique. Pour l’ensemble de nos animaux (injectés ou non), ces derniers seront minutieusement observés lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées). Des mesures seront prises pour améliorer le bien-être des animaux. L’hébergement se fera en groupe pour favoriser la socialisation des animaux. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Un enrichissement structural du milieu sera également mis en place. Un contenant sera placé dans chaque cage permettant aux souris de se cacher et de développer leur répertoire comportemental (exploration, enfouissement…).
Choix des espèces
L’érythropoïèse murine est bien caractérisée et est proche de celle de l’homme. Les souris déficientes en HSF1 sont disponibles et viables. Nous utiliserons des souris de 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.
BHE-permeabilite-hypergravite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées à une hypergravité de 2G par centrifugation pendant 24 heures pour ouvrir la barrière hématoencéphalique, avec des prélèvements de glycémie, des injections d'un composé et d'un traceur fluorescent, avant une perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique que la centrifugation réduit la prise de boisson et de nourriture sur 24 à 48 heures sans induire de stress selon les taux de corticostérone mesurés. Le projet teste des composés modulant la barrière, avec des applications présentées jusqu'à la remise en forme des spationautes.
Objectifs
Aujourd’hui la barrière hématoencéphalique (BHE) est impliquée dans les mécanismes d’échange entre le compartiment sanguin et le parenchyme cérébral (neurones et cellules associées qui établissent les fonctions cérébrales). Elle est assurée par les cellules endothéliales bordant la lumière des vaisseaux et d’autres cellules comme les péricytes, les astrocytes et des macrophages. Ces cellules forment l’unité neurovasculaire qui permet le passage sélectif de molécule du sang vers le cerveau et vice-versa. Si la rupture des vaisseaux sanguins cérébraux induit des accidents vasculaires cérébraux, des défaillances plus subtiles de la BHE participent aux maladies neurodégénératives ou sont produites dans les pathologies métaboliques ou par des agents infectieux. Depuis 2-3 ans sont décrits des modulations physiologiques de l’efficacité de la BHE. Dans ce contexte la maitrise pharmacologique de l’efficacité de la BHE pourrait améliorer le fonctionnement cérébral comme suggéré dans des modèles de la maladie d’Alzheimer. Enfin, des ouvertures de la BHE de faible amplitude et temporaire pourraient améliorer la vectorisation de médicament dans le cerveau comme envisagée pour le traitement de la maladie de Parkinson. Ainsi des molécules favorisant une ouverture de la BHE, ou améliorant son efficacité sont recherchées en pharmacologie. Ces molécules une fois testées in vitro doivent passer par une étape de validation in vivo chez l’animal avant de faire l’objet d’essais précliniques. Pour cela nous proposons de tester certaines de ces molécules sur un modèle d’ouverture temporaire de la BHE chez la souris par exposition l’hypergravité. Cela permettra également de mieux comprendre comment l’efficacité de la BHE évolue dans des contextes de changement gravitaires et comment ce mécanisme peut être régulé. Le protocole consiste à exposer des souris, recevant le traitement pharmacologique, à 2G pendant 24h pour induire une ouverture de la BHE et mesurer si le traitement accentue ou diminue le passage de molécules du sang vers le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet devra nous permettre de préciser des mécanismes d’action de l’hypergravité sur la BHE et de valider des composés pharmacologiques dans ce modèle d’ouverture partiel et temporaire de la BHE. Ces composés pouvant avoir des intérêts thérapeutiques soit pour protéger le cerveau d’ouvertures non désirées de la BHE soit pour au contraire ouvrir partiellement et temporairement la BHE pour aider au passage de molécule d’intérêt thérapeutique. Enfin ce projet permettra de préciser les mécanismes de l’ouverture de la BHE lors de l’exposition au changement gravitaire ce qui peut avoir également un intérêt biomédical puisque la centrifugation est proposée comme une contre mesure pour aider à la remise en forme des spationautes.
Procédures
Les animaux seront exposés à l'hypergravité apr centrifugation à 2g pendnt 24h. prélèvement sur animaux vigiles, au maximum les animaux subiront deux prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue pour une mesure de leur glycémie à 48h d'intervalle, il s'agit d'un acte identique à celui pratiquer pour l'automesure de glycémie par les patients diabétiques. Le volume prélevé est de 10-30 µL. dans la procédure, les animaux subiront des injections intrapéritonéales après habituation à la contention pour l'injection d'une molécule pouvant améliorer l'efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et une injection rétro-orbitaire sous anesthésie générale d'un traceur fluorescent permettant de mesurer l'efficacité de la BHE . La procédure se termine par une anesthésie profonde et sans réveil pour perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables connus sont principalement les éventuels effets secondaires des composés pharmacologiques de régulation de la BHE. Ceux-ci devront être décrits et seront pris en considération, nous ne testerons que des composés dont les études in vitro et les études de toxicologie auront été réalisées et publiées. Les effets indésirables de la centrifugation sont également bien caractérisés, l’exposition à 2G n’induit pas de stress (mesuré par le taux circulant de corticostérone post-exposition) mais elle induit une baisse significative de la prise de boisson et de nourriture pendant les 24 à 48 h après le départ de la centrifugation. Ceci induit un léger retard à la prise de poids chez les animaux jeunes. Tous les animaux sont suivis par surveillance vidéo en permanence y compris au sein des nacelles de la centrifugeuse. Leurs poids sont pris régulièrement avant et après la centrifugation tout comme leur consommation de nourriture et de boisson. Après centrifugation la glycémie des animaux sera évaluée pour indexer leur statut métabolique et une mesure de corticostérone sera réalisée sur échantillon sanguin prélevé au moment de la pose de la perfusion intracardiaque. L’ensemble de ces paramètres nous permettent d’évaluer les potentielles altérations physiologiques et sont systématiquement associées à la publication des résultats.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes à des fins d 'investigations par histologie.
Remplacement
Les expériences proposées visent à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l’ouverture de la BHE en contexte hypergravitaire et apporter la preuve de l’efficacité in vivo de composés pharmacologiques sur la perméabilité de la BHE. L’ouverture physiopathologique de la BHE ne peut être étudiée que sur un modèle in vivo car elle implique des mécanismes complexes de régulation neurovasculaire comprenant des interactions entre différents types cellulaires impossible à reproduire in vitro. Nos expériences ont pour but de proposer ou renforcer des arguments précliniques à l’utilisation de molécules d’intérêt thérapeutique. Pour ces composés des preuves expérimentales auront suggéré ou démontré une action in vitro sur des cellules endothéliales en culture et des études de toxicologie auront démontré une utilisation in vivo possible.
Réduction
Les études précédentes démontrent qu’un nombre de 12 souris par centrifugation est suffisant pour une analyse statistique (2 way ANOVA pour comparer les interactions entre l’effet du traitement et l’effet de la centrifugation). Pour une validation expérimentale, la reproduction de l’effet observée est nécessaire et nous proposons donc 3 expériences qui devront aboutir au même résultat. Afin de Réduire le nombre de souris, les résultats seront évalués statistiquement après chaque centrifugation et la composition des groupes expérimentaux ré-évaluer à la baisse si besoin.
Raffinement
Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci, afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Les animaux sont en groupe sociaux tout au long de l’expérimentation et surveillance vidéo permanente dans le dispositif de modification gravitaire afin de pouvoir intervenir si un point limite est observé. Par ailleurs, ils sont hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Ils sont placés dans la centrifugeuse dans leur cage d’hébergement. Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition « ad libitum ». Les paramètres physiologiques tels que prise alimentaire, poids sont mesurés régulièrement tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront manipulés pendant les 3 jours qui précèdent le début du traitement pharmacologique pour les habituer à la contention nécessaire à l’injection i.p. L'ensemble des données recueillies feront l'objet de l'argumentaire expérimental de la publication issues de ces expériences.
Choix des espèces
Le choix de la souris se base principalement par l’existence de données sur ce modèle qui permettent d’établir que l’hypergravité peut altérer l’efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et qu’il est le modèle le plus utiliser pour fonder des bases à la recherche préclinique. De plus si nous parvenions à identifier un composé efficace pour réduire l'ouverture de la BHE, il pourrait être testé rapidement sur d'autres modèles murins de pathologies neurodégénératives par exemple. Il s’agit de jeunes adultes arrivant dans l’établissement à l’âge de 8 semaines au moins. Ce choix se base principalement sur des expériences préliminaires et la littérature indiquant un état fonctionnel et stable de la barrière hématoencéphalique.
Création de modèles de cathétérisation vasculaire et non vasculaire chez le rongeur destiné à des études toxicologiques, pharmacodynamiques ou pharmacocinétiques
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 12000
15 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie générale pour poser à demeure un cathéter dans un vaisseau, un organe ou le cerveau, puis peut recevoir jusqu'à quatre prélèvements sanguins ou gavages par jour, avec un hébergement isolé jusqu'à sept jours. L'établissement décrit une activité de fourniture de rongeurs cathétérisés "prêts à l'emploi", les animaux étant ensuite expédiés vivants aux laboratoires ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Il justifie l'élevage d'animaux "surnuméraires" par les taux d'échec chirurgical et conclut que la complexité des mécanismes exclut un modèle in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique de modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) de cathéters dans des vaisseaux, des organes ou le cerveau permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit le prélèvement de fluides biologiques (sang, bile, liquide cérébro spinal)
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles cathétérisés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques grâce au prélèvement de fluides biologiques comme le sang, la bile ou le liquide cérébro spinal chez l’animal tout en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des injections ou des prélèvements de manière répétée à différents sites d’injection ou de prélèvement. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (devenir d’un médicament dans le corps, toxicité d’un médicament, maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, ...) tout en réduisant les nuisances possibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel cathétérisé. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins ou à des gavages (maximum 4 prélèvements sanguins/gavages par jour). Les actes de prélèvements, de gavages et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Un hébergement isolé peut être nécessaire pour les besoins du projet pour une durée maximale de 7 jours. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place du cathéter suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel cathétérisé. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont à la demande, expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles cathétérisés a pour objectif de mettre à disposition des modèles prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou leurs interactions face à une substance, de comprendre la vie d’une substance à l’intérieur d’un organisme ou sa toxicité, ce qui entraine l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les cathétérisations permettent le suivi de paramètres biologiques ou encore l’administration de substances répétées ou en continu en minimisant les manipulations de la part du scientifique et sans anesthésie ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des prélèvements ou des injections répétés à différents sites. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration d’analgésique avant la chirurgie et lors du post-opératoire ainsi qu’en cas de besoin. L’utilisation complémentaire d’anesthésique local peut être effectuée, si nécessaire. Une injection systématique sous-cutanée de sérum physiologique de réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation (en fonction du stress observé de l’animal à réception, par exemple). Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques (traitements médicamenteux, soins locaux, ajout d’enrichissement, mesures de réhydratation ou de réchauffement, ajout d’aliment, de gel hydratant, de litière ou d’eau complémentée ou non directement dans la cage afin d’en améliorer l’accès). En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique mais l’équipe de chirurgie se réserve le droit de proposer des changements de modèles sur la base de son expérience. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel cathétérisé, selon les recommandations éthiques en vigueur.
Nouvelle étude du rôle de l’estérification du cholestérol sur la mise en place de la dysfonction adipocytaire et des complications cardiométaboliques au cours de l’obésité chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris génétiquement modifiées sont soumises à un régime riche en cholestérol ou en graisses pendant quatre à six mois pour induire une obésité et un diabète, avec des tests métaboliques, des gavages de glucose et des prélèvements sanguins répétés, avant mise à mort pour prélever les organes. Le porteur étudie le rôle de l'estérification du cholestérol dans le tissu adipeux, avec des applications thérapeutiques renvoyées au moyen terme. Il indique disposer de modèles in vitro, adipocytes en culture et biopsies humaines, mais présente le modèle animal comme "l'unique moyen" d'observer les effets systémiques.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer les conséquences locales et systémiques de la délétion adipocytaire de la capacité d’estérification du cholestérol sur les complications métaboliques de l'obésité induites par des aliments riches en graisses.
Bénéfices attendus
Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux maladies métaboliques, l'homéostasie du tissu adipeux a été largement étudiée dans une multitude de contextes physiopathologiques. Cependant, le rôle du cholestérol et particulièrement de son estérification dans la fonction adipocytaire sont n’a quasiment jamais été explorée. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus chez des patients, dans des modèles précliniques et in vitro montrent pour la première fois que l'accumulation de cholestérol libre dans les adipocytes est un déclencheur de la dysfonction adipocytaire et des complications métaboliques qui y sont liées. A court terme, notre projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeu et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler le contenu en cholestérol libre dans l'adipocyte par l'induction de son estérification, ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer le risque métabolique de l'obésité. Une telle approche sera bénéfique pour les patients obèses souffrant de complications mais aussi pour la population générale en promulguant des recommandations pour les personnes à risque.
Procédures
Les souris transgéniques dont la capacité d'estérification du cholestérol dans l'adipocyte est délété seront dans un premier temps phénotypées métaboliquement sans stimulus alimentaire obésogène ou diabétogène. Nous suivrons la glycémie par prise de sang à la queue (5 secondes) mensuellement entre 1 et 6 mois d’âge. Ces souris seront dans un second temps exposé à une alimentation riche en cholestérol (4 mois de régime) ou une alimentation riche en triglycérides (6 mois de régime). Ces expériences seront répétées 5 fois pour évaluer différents aspects de la perturbation de l’homéostasie adipocytaire. Au cours de la première répétition nous réaliserons mensuellement des tests métaboliques dynamiques pour déterminer la sensibilité à l'insuline (injection d'insuline par voie intra péritonéale - durée de l'injection 5 secondes) et la tolérance au glucose (gavage avec une solution riche en glucose - temps de gavage 10 secondes) en suivant la glycémie (prise de sang au niveau caudal à la suite de ces stimuli métaboliques - 5 secondes par prélevement). Au cours de la seconde répétition la sensibilité tissulaire à l'insuline sera évaluée après l'euthanasie des animaux 5 minutes post injection d'insuline par voie intraveineuse (temps d'injection : 5 secondes). Au cours de la répétition finale, la capacité d'internalisation du cholestérol dans les adipocytes sera testée en délivrant du cholestérol marqué par voie orale (gavage - temps de gavage : 10 secondes) et veineuse aux animaux transgéniques trois jours avant euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Le protocole d'induction de l'obésité et de diabète avec les régimes riches en cholestérol ou en graisses est de classe modérée. La délétion adipocytaire de la capacité d'estérification du cholestérol pourrait contribuer à rendre le tissu adipeux moins capable de tamponner l'excès énergétique des régimes riche en cholestérol ou en graisses et donc de potentialiser le diabète induit par ces régimes. Les souris transgéniques devraient présenter une insulinémie et une glycémie plus marquée que les animaux de type sauvage.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'interet pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.
Remplacement
Le projet global dans laquelle la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture différentiés à partir de fibroblastes murins 3T3-L1 ainsi que des biopsies tissu adipeux de patients bénéficiant de chirurgies bariatrique. Ces modèles ont permis de remplacer les modèles animaux dans la détermination du rôle du cholestérol dans la dysfonction adipocytaire et ils permettent également de déterminer quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires protecteurs de l'estérification du cholestérol dans l'adipocyte.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 528 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, un examen régulier permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant les analgésiques adaptés à chaque procédure. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate).
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques (obésité, diabète de type 2 et dysfonction adipocytaire pour ce projet) utilisés ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (délétion adipocytaire de la capacité d’estérification du cholestérol). Pour tous les animaux débuterons la supplémentation orale à 8 semaines de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet d’un stress métabolique sur le tissu adipeux au cours du développement de l’organisme. L’homéostasie du tissu adipeux est très fortement influencé par le genre. De façon à déterminer si la délétion adipocytaire de l’estérification du cholestérol au cours d’un stress métabolique à des effets délétères dépendamment du sexe nous utiliserons des souris mâles et femelles pour l’ensemble de ce projet.
Etude des mécanismes de passage du tPA vasculaire dans le compartiment cérébral et de son interaction avec les macrophages périvasculaires.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse puis, sous anesthésie, une injection chirurgicale dans le liquide céphalo-rachidien, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet vise à comprendre par quels mécanismes le tPA vasculaire, molécule utilisée contre l'AVC, passe vers le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes sans animaux ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information et retient la souris comme le meilleur compromis.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase sécrétée par l’endothélium vasculaire. Le tPA est surtout connu pour son rôle dans la fibrinolyse mais il est aussi présent dans le parenchyme cérébral. Il est sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires tels que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes. Le tPA cérébral est impliqué dans de nombreuses fonctions non fibrinolytiques comme l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le tPA est également un médicament, seul traitement pharmacologique à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Cependant, l’injection intraveineuse de tPA recombinant chez des patients victimes d’AVC peut entrainer des effets secondaires sur les cellules nerveuses déjà compromises par l’AVC. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Dans cet espace à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié. Il a été démontré qu’en condition physiologique, le tPA vasculaire est capable de passer du compartiment vasculaire vers le cerveau et que les PVM expriment des récepteurs LRP ("Low density lipoprotein receptor-related protein") . Le tPA possède un domaine de liaison à LRP : le domaine finger, et il a déjà été démontré que le tPA cérébral pouvait être endocyté par les astrocytes via un mécanisme LRP-Finger dépendant. Notre hypothèse est donc que le tPA vasculaire passe dans le compartiment cérébral via un mécanisme LRP-finger dépendant, qu’il peut être endocyté par les PVM également via ce mécanisme. Ce projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le tPA vasculaire passe dans le parenchyme cérébral et quels effets ce tPA peut avoir sur les différents types cellulaires et notamment sur les macrophages périvasculaires. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacent présente un intérêt à la fois pour une meilleure compréhension de la physiologie du système nerveux et de ces interactions avec le compartiment sanguin, mais également pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’un AVC, et traités avec du tPA recombinant en injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Une meilleur compréhension des interractions sang cerveau, et une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique, en limitant les effets secondaires délétères causés par la thrombolyse avec du tPA .
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une seule injection intraveineuse (duréé : 40min). Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une procédure chirurgicale permettant une injection dans le liquide céphalo rachidien (durée : 30min)
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, l'induction et le maintient de l'anesthésie. Douleurs eventuelles liées à la chirurgie (prises en charge par un traitement analgésique adéquat)
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, afin de procéder à des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. Le marquage des différentes protéines avec deux fluorochromes permet une co-injection des protéines recombinantes deux à deux et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence de l’étude de la physiopathologie cérébrale dans la littérature. Les mécanismes d’action du tPA, l’anatomie, la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude des mécanismes physiopathologique du tPA.
Le rôle de PRL2 dans les métastases lymphatiques et les lymphoedèmes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?
Bénéfices attendus
Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.
Contrôle optique de l’activité cardiaque à l’aide de l’implantation d’un stimulateur optique dans un modèle de rat.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Ils subissent une thoracotomie et l'implantation d'un dispositif optique sur le cœur, avec injection de peptides photosensibles, avant d'être tués par une dose létale d'anesthésique. Le projet cherche à démontrer la possibilité de contrôler par la lumière l'activité électrique cardiaque chez un animal vigile. Le porteur affirme que seule l'expérimentation animale peut établir l'intérêt clinique de cette approche, un criblage in vitro ayant précédé la sélection des peptides.
Objectifs
Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat vigile préalablement implanté d’un dispositif optique permettant l’activation de peptides photo-sensibles injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm de la zone sur laquelle est implanté le dispositif permet un clivage du groupement protecteur et l’activation du peptide uniquement dans les zones illuminées. Les peptides utilisés dans ce projet ont été sélectionnés in vitro et ex vivo pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal afin de proposer une nouvelle approche dans la prise en charge des arythmies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique, chez un animal vigile, de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler, chez un animal vigile, la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement de l'activité électrique cardiaque. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min. Après pose de l'implant, des prélèvements sanguins seront réalisés afin de s'assurer de la bonne santé de l'animal et des composés activiés par la lumière seront injectés par voie veineuse.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une mini-thoracotomie. La gestion peropératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Une étude précédente a démontré chez le rat l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégés similaires à ceux utilisés dans cette étude.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux sont euthanasiés par injection de dose léthale d'anesthésique après sédation en raison de l'efficacité de l'approche et de la non utilisationdes tissus par la suite.
Remplacement
Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur les cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé in vitro sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 90 rats seront utilisés dans cette étude. La première étude visant l’adaptation à nos conditions d’un modèle déjà décrit et validé vise à raffiner le modèle et les conditions expérimentales. La mise en place rapide du modèle par des utilisateurs expérimentés permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour les analyses statistiques lors de la seconde étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les conditions « sans activation » et « avec activation » des composés apparait (une valeur de p
Raffinement
Avant la procédure, les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids pendant à minima 2 semaines. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (sevoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable, une perforation pulmonaire non resolvable conduirait à une euthanasie de celui-ci. Ce projet se base sur l’utilisation de points limites gradés, précis et adaptés. Leur application se fera en lien avec la SBEA à l’aide d’un arbre décisionnel visant à l’arrêt des souffrances.
Choix des espèces
Le rat constitue un bon modèle pour l’étude des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux et en raison de la taille de l’implant.
Effets de la dapagliflozine orale ou du dulaglutide sous-cutané sur le remodelage cardiaque dans un modèle murin de cardiomyopathie liée au diabète
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ces souris développent un diabète et une cardiomyopathie, puis subissent prélèvements sanguins répétés, mesures de pression, échographies et examens IRM ou TEP avec injection d'un traceur, avant d'être tuées pour prélever le tissu cardiaque. Le projet compare deux antidiabétiques quant à leurs effets sur le cœur. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes de remplacement pour l'étude du diabète, mais affirme que ces mécanismes dans un organisme entier restent difficiles à reproduire et que le modèle de souris est unique.
Objectifs
L'objectif du projet est de comparer l'effet d'un SGLT2i (dapagliflozine) et d'un GLP-1 RA (dulaglutide), deux agents antidiabétiques au mécanisme d'action très différent, sur la gestion du glucose cardiaque. En effet, alors que SGLT2is ne présente pas d'effet direct sur la sécrétion d'insuline ni sur la sensibilité, les GLP-1 RA augmentent la sécrétion d'insuline, entraînant potentiellement une augmentation de la captation du glucose par les cellules et notamment les cardiomyocytes. Notre hypothèse est que l'effet du SGLT2i sur la réduction de la glucotoxicité cardiaque est spécifique et pourrait, au moins partiellement, expliquer son action bénéfique sur l'insuffisance cardiaque. D'autre part, l'effet de sécrétion d'insuline du GLP-1 RA pourrait augmenter le flux de glucose dans les cardiomyocytes, conduisant potentiellement à l'effet différentiel observé entre ces deux classes de médicaments sur l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mieux comprendre 2 traitements distincts du diabète sur l'insuffisance cardiaque. Avec ces connaissances, les traitements du diabète pourront être adapté en fonction des pathologies annexes du patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélevement sanguins au niveau de la queue pendant 1 semaine pour surveiller leur glycémie (2 min par prélevement par animal). La pression artérielle sera également prise au niveau de la queue de l'animal pendant 1 semaine, cette procédure prend environ 15 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à de l'imagerie (1 échographie et 1 IRM/TEP par animal). Pour la TEP, pour chaque animal une injection d'environ 100 µL de 18FDG (traceur) en intrapéritonéale est prévue avant l'examen d'imagerie. L'échographie dure en moyenne 5 à 10 minutes et l'IRM/TEP environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux SKO développent une lipodystrophie dès leur plus jeune âge et présentent par la suite un phénotype diabétique à partir de 8 semaines. Tout cela va conduire à une cardiomyopathie entre 10 et 12 semaines qui va s'aggraver avec le temps. Les différents traitements administrés ne devraient pas produire d'effets indésirables sur les animaux au contraire.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure d'entretien de la lignée, l'euthanasie des animaux aura lieu à la fin de la procédure comprennant les divers examens d'imageries pour le prélévement des tissus cardiaques.
Remplacement
Malgré l'existence certaine de méthode de remplacement pour les études sur le diabète. Ici le projet a pour but d'étudier 2 traitements du diabète et leurs actions au niveau cardiaque. Tout cela implique des mécanismes divers et variés dans un organisme entier qu'il est très difficile de reproduire in vivo ou in situ. Le modèle de souris SKO est un modèle diabétique unique qui ne permet pas son remplacement.
Réduction
Le principe de réduction a été appliqué au début du projet par l'équipe de Nantes. De nombreuses études pilotes ont permises de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Des techniques d'imageries non invasives seront utilisés pour limiter au maximum les nuissances sur le bien-être des animaux. Un suivi cardiaque et respiratoire sera effectué pour surveiller du mieux possible les animaux durant ces procédures. L'anesthésie préalable sera effectuée de manière progressive pour limiter le stress chez les animaux. L'administration des différents traitements sera effectué avec précaution et un suivi post-traitement sera effectué pour s'assurer du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La lignée de souris Bscl2-/- est unique en son genre de par l’absence de lipotoxicité et ne peut donc pas être substituée par une autre espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 12 semaines. Cela s'explique par les souris SKO qui présente un phénotype diabétique à partir de 8 semaines et une cardiomyopathie à partir de 12 semaines. Comme nous souhaitons travailler sur ces pathologies, il est nécessaire d'attendre le temps qu'elles apparaisent.
Etude de l’implication du gène ABCC9 dans l’établissement et le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire induit par la monocrotaline chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
160 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Ils reçoivent une injection de monocrotaline qui provoque chez tous les animaux exposés une hypertension artérielle pulmonaire, avant échographies et cathétérismes cardiaques sous anesthésie, puis sont tués pour prélever le bloc cœur-poumon. Le projet étudie le rôle du gène ABCC9 dans cette maladie et une éventuelle cible thérapeutique. Le porteur affirme que le recours aux animaux est indispensable et qu'il est impossible de simuler ex vivo un processus multifactoriel complexe.
Objectifs
La pathogenèse de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est complexe, et implique des facteurs hémodynamiques et environnementaux, ainsi que des prédispositions individuelles. Nos résultats préliminaires obtenus sur cellules primaires vasculaires pulmonaires indiquent que le gène ABCC9 pourrait être impliqué dans la pathogenèse de l'HTAP. Cependant, à l’heure actuelle les mécanismes impliquant ABCC9 dans le développement de l’HTAP ne sont pas connus. Ainsi, nous étudierons le rôle d'ABCC9 dans le développement et l’apparition de l’hypertension artérielle pulmonaire chez le rat. Puis, nous testerons si ce canal constitue une nouvelle cible thérapeutique pour lutter contre le développement de l'HTAP.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de comprendre l'implication du gène ABCC9 dans le développement de l’hypertension artérielle pulmonaire, et permettra de déterminer si le gène ABCC9 peut être envisager comme une nouvelle cible thérapeutique dans le développement de cette pathologie. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l' hypertension pulmonaire, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous cutanée unique de Monocrotaline afin d'induire l'HTAP (réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 5% pour l’induction puis 3% pour l’entretien)). Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie à J21 au moment des échocardiographies. Le Pinacidil ou le DMSO seront injectés sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à la monocorotaline (MCT) pendant 3 semaines conduira au développement d'une hypertension pulmoniare chez tous les animaux exposés. Les injections (Monocrotaline, Pinacidil et DMSO) sont réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 5% pour l’induction puis 3% pour l’entretien). Les échographies et cathétérismes cardiaques sont réalisés sous anesthésie gazeuse (isoflurane 5% pour l’induction puis 3% pour l’entretien). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie gazeuse (isoflurane 5% pour l’induction puis 3% pour l’entretien)lors des examens échographiques.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélever le bloc cœur-poumon afin de réaliser une analyse histologique pulmonaire et cardiaque, des expériences de biochimie et des immunomarquages. Après l'euthanasie des animaux, les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du gène ABCC9 dans le développement de l'hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte physiologique et physiopathologique. Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place de l'hypertension pulmonaire qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des analgésiques. Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Afin de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après un dernier bilan (cathétérisme) de leur fonction cardiaque. Afin de déterminer le plus précisement possible le nombre necessaire et suffisant d'animaux, nous avons utilisé un test statistique.
Raffinement
A la fin des expérimentations, les animaux seront sacrifiés pour prélèvement d’organes. De l'enrichissement (rouleau, coton) sera ajouté dans les cages des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Les tissus prélevés sont partagés afin de minimiser encore le nombre d'animaux utilisés. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant des rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires. Nous avons donc l’expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Nous allons travailler avec des rats Wistar mâles de 4-5 semaines (100g ). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’hypertension artérielle pulmonaire est plus rapide.
ETUDE DES MECANISMES REGULANT LE REMODELAGE VASCULAIRE AU COURS DE L’HYPERTENSION CHEZ LA SOURIS
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie de 15 à 20 minutes pour induire une hypertension puis des mesures de pression et une échocardiographie sous anesthésie, pour étudier le remodelage des vaisseaux. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, infection et hémorragie et que l'anesthésie peut entraîner un arrêt cardiaque, tout en affirmant que l'hypertension induite reste indolore. Sur le remplacement, il affirme que la régulation de la pression artérielle ne peut être évaluée qu'in vivo et impose le modèle murin.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'altération de la structure des vaisseaux et le développement de l’hypertension artérielle. Plusieurs travaux ont corrélé l’activation d’un récepteur membranaire avec l’augmentation de la pression artérielle plus particulièrement chez les mâles. Notre objectif est de démontrer que cette voie régule la pression artérielle et la structure des vaisseaux, de comprendre quelles cellules vasculaires sont affectées et quelle est l'origine de l'effet dépendant du sexe.
Bénéfices attendus
L'identification de nouveaux acteurs régulant la structure des vaisseaux et jouant un rôle dans le développement de l'hypertension va permettre de mettre à jour de nouvelles cibles potentielles pour le traitement des hypertensions résistantes aux traitements actuels (environ 15% des malades).
Procédures
Au total 600 souris seront utilisées pour 3 procédures légères ou modérées. Dans les procédures modérées 1 et 2, les 480 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine puis 2 fois par semaines pendant 5 semaines. Elles seront soumises à une procédure chirurgicale de 15 à 20 min pour mettre en place des modèles d’hypertension. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie et sous analgésique donné en préventif mais aussi en post-chirurgical. La pression sera mesurée à la queue de façon hebdomadaire. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées. Dans la procédure 3 légère, les 120 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine. La pression sera mesurée à la queue toutes les 2 semaines pendant 3 ou 6 mois. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur péri et post-opératoire. Les procédures chirurgicales ou d’injection peuvent aussi conduire à des infections. Lors de la chirurgie, il peut y avoir une hémorragie. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Selon notre expérience, les modèles transgéniques, utilisés à l'état adulte, n’entrainent pas de phénotype douloureux pour les animaux.
Devenir
Les 600 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression artérielle sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et vasculaires et étudier les tissus.
Remplacement
Dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture), cependant la régulation de la pression artérielle et la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évalués qu'in vivo, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins.
Réduction
Ce projet implique 600 souris au total avec des lots de 10 et 15 animaux. La taille des effectifs des différents lots a été déterminée grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. En post-opératoire, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les 2 jours pendant 1 semaine. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémiques en péri-opératoire et à 24h et 48h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin de permettre la modification de l'expression de certains gènes ou de marquer des cellules par immunofluorescence. Seuls des modèles de souris existent pour ces altérations géniques. De plus la souris est un modèle couramment utilisé pour l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle. Les études sur le rôle de la voie ciblée sur le remodelage vasculaire et la pression artérielle seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. De plus, la voie étudiée est importante pour le développement de la souris, donc nous utiliserons les souris à l'âge adulte (entre 8 et 15 semaines) afin de ne pas perturber leur développement en modulant la voie étudiée.
Effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur le métabolisme cardiaque
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
144 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis pendant six mois à des régimes incluant des arrêts de nourriture de trois jours, à des tests de tolérance au glucose avec ponctions répétées de la queue et à des IRM sous anesthésie avec pose d'un cathéter dans la veine caudale, pour évaluer les effets du jeûne sur le cœur. Le porteur indique que les ponctions et la pose du cathéter peuvent provoquer stress, douleur et risque d'infection. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe et que l'expérimentation animale est "nécessaire" pour valider son hypothèse de cardioprotection.
Objectifs
Le jeûne est une méthode d’alimentation consistant à ingérer peu ou aucune nourriture sur une période allant de 12h à plusieurs semaines chez l’Homme. Cette coutume ancestrale est pratiquée par de nombreuses religions et, plus récemment, a reçu une attention croissante pour d’autres raisons de santé, économique et écologique. On distingue le jeûne intermittent, qui consiste à se priver de nourriture pendant une période de 14h sur une journée, le jeûne intermittent prolongé (3 – 5 jours) et le jeûne thérapeutique (1 à 3 semaines). En France, jeûner n’est pas proposé dans un cadre médicalisé. Pourtant, il a été prouvé que le jeûne retarde les processus liés à l’âge (stress oxydant, inflammation…), protège le cerveau des maladies neurodégénératives et diminue la croissance tumorale. Le jeûne intermittent prévient et réverse tous les aspects du syndrome métabolique chez le rongeur et chez l’Homme. En cardiologie, des études précliniques sur des rats mâles ont démontré une diminution de la fibrose myocardique liée à l’âge en prévenant l’inflammation et en maintenant les antioxydants. De plus, le jeûne intermittent diminue l’apoptose et l’inflammation puis prévient le remodelage du myocarde sur modèles d’infarctus du myocarde. Plusieurs jours de jeûne améliorent la diffusion de l’oxygène du capillaire à la mitochondrie de myocarde murin suggérant une amélioration de l’énergie cellulaire. Les objectifs de cette étude sont de caractériser les effets du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique sur le cœur de rat et de déterminer si ces derniers sont protecteurs lors d’un stress aigu induit par un épisode d’ischémie-reperfusion et dans un modèle de cardiomyopathie prédiabétique (induit par un régime riche en graisse et en sucre). Plus précisément, nous souhaitons caractériser le profil cardiométabolique du jeûne, notamment le métabolisme énergétique et le profil lipidique myocardiques. Notre hypothèse est que les changements physiologiques et métaboliques induits par le jeûne intermittent et/ou thérapeutique seraient cardioprotecteurs. Enfin, nous souhaitons déterminer s’il y a un effet du genre et comparer les mécanismes du jeûne intermittent et du jeûne thérapeutique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux caractériser les effets des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la fonction cardiaque, le métabolisme énergétique et le remodelage du profil lipidique. Nous souhaitons savoir si ces méthodes sont cardioprotectrices envers un stress aigu (ischémie/reperfusion) et chronique (modèle de prédiabètes induit par le régime riche en graisse et en sucre). Enfin, nous évaluerons l’effet du genre de ces régimes.
Procédures
Les animaux seront soumis à différents régimes décrits ci-après : régime normal pendant 6 mois ; régime normal pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux pendant 3 mois ; - régime normal pendant 3 mois avec deux arrêts de la nourriture pendant 3 jours (à 4.5 et à 6 mois) ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 3 mois puis nourris un jour sur deux avec le même régime pendant 3 mois ; régime riche en graisse et en sucre pendant 6 mois avec 2 arrêts de la nourriture pendant 3 jours à 4.5 et 6 mois. Tous les animaux seront soumis à trois tests de tolérance au glucose sur animaux vigiles. Celui-ci comprend une injection intrapéritonéale et 6 prélèvements de gouttes de sang dans la queue de l’animal (mesure de glycémie). Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois. Tous les animaux seront soumis à trois examens d’imagerie IRM avec insertion d’un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie générale. Cette procédure sera répétée trois fois à 3, 6 et 9 mois.
Impact sur les animaux
La procédure sur la mise en place des régimes peut entrainer un léger stress chez les animaux mais ne doit pas entrainer d'effet indésirable notable et a déjà fait l’objet de nombreuses publications au niveau international. L'eau quant à elle restera à disposition ad libitum. Le test de tolérance au glucose fait l’objet d’injection en intrapéritonéale et de ponctions répétées au bout de la queue de l’animal pour mesure de la glycémie pouvant générer un stress pour l’animal et un risque d’infection. Les animaux réagissent et cicatrisent bien, notre groupe a l’habitude de travailler avec ces mesures et fera le nécessaire pour surveiller tout évènement indésirable (stress, infection). Les anesthésies et les examens d’imagerie in vivo par IRM sont également des nuisances pour les animaux mais l’imagerie reste l’exploration la moins invasive de nos jours. Enfin, la pose d’un cathéter se fera sous anesthésie pou diminuer le stress de l’animal, cela peut augmenter la douleur après réveil ainsi que le risque d’infection que nous surveillerons quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (après l'IRM à 9 mois) pour pouvoir prélever le cœur et réaliser des expériences ex vivo en cœur isolé afin de caractériser le métabolisme énergétique et le profil lipidique cardiaque par spectroscopie par résonance magnétique.
Remplacement
A l'heure actuelle, il n'existe aucune méthode de substitution in vitro et in silico pour étudier l'effet des jeûnes intermittent et thérapeutique sur la physiologie et le métabolisme cardiaque. De plus, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider notre hypothèse de cardioprotection de ces régimes face à des stress aigu et chronique selon le sexe. De nombreuses similitudes existent entre la physiologie cardiaque des rongeurs, particulièrement celle du rat, et celle de l'homme. Les modèles pathologiques chez les rongeurs sont utilisés au laboratoire depuis de nombreuses années et toutes les techniques d'imagerie/ spectroscopie de résonance magnétique dans ce projet ont été caractérisées au sein même du laboratoire.
Réduction
Notre approche expérimentale permettra de réduire de façon drastique le nombre d'animaux en accord avec la règle des 3R. En effet, l'étude in vivo permettra de réaliser un suivi longitudinal de l’animal sans sacrifice et l'étude ex vivo sera réalisée sur le même animal. Le nombre d'animaux dans ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Nous souhaitons obtenir un effectif final de n=10 par groupe et nous envisageons 20% de perte de données (problème technique d’imagerie et de spectroscopie, problème de prélèvement du cœur pour l’expérience ex-vivo). Nous prévoyons donc 10 + 2 (20% de perte) = 12 rats par groupes. L’effectif de 10 animaux par groupe est déterminé à l’aide d’une analyse statistique (Statistica) prévoyant, pour un risque alpha de 5% et un risque béta de 10%, une amélioration de 25% de la fonction cardiaque dans nos modèles animaux pathologiques pour revenir à des valeurs physiologiques observées chez des animaux contrôles.
Raffinement
Les rats seront acclimatés pendant 14 jours avant le début de l'étude. La procédure sur la mise en place des régimes ne doit pas entrainer d'effets indésirables. Les durées et fréquences sont déterminées en fonction des données de la littérature (1 jour sur 2 pour le jeûne intermittent et 3 jours de jeûne thérapeutique). L'eau sera mise à disposition en qualité et quantité satisfaisantes. Tout au long des régimes et du projet, le bien-être des animaux sera assuré par un hébergement en portoir ventilé par cage de 2 individus avec un enrichissement composé de matériel pour nicher et se cacher ainsi que des buches et des rondins pour ronger afin de satisfaire les besoins physiologiques des animaux. Les conditions de température, lumière et humidité des cages seront contrôlées. Un animalier ou un chercheur contrôlera le bien-être des animaux tous les jours. Pour le test de tolérance au glucose et la mesure de l'insuline à jeun ou l'anesthésie ne peut pas être réalisée, une compresse d'eau chaude sera placée sur la queue de l'animal afin de faciliter le prélèvement de la goutte de sang le plus rapidement possible. Afin d'éviter toute infection, la queue de l'animal sera désinfectée avant et après la procédure avec de la Vétédine. Les jours suivants, nous vérifierons la bonne cicatrisation de la queue de l'animal. Pour la procédure d'IRM in vivo, les rats seront anesthésiés par un mélange d’isoflurane (Vetflurane 2%) et d’oxygène (1L/min) à l’aide d’une chambre d’induction et le bien-être animal sera assuré par le maintien des constantes vitales de l'animal. Durant les anesthésies, les yeux seront hydratés (Ocrygel) et la température maintenue à 37°C par couverture chauffante et monitoring par sonde rectale. Durant l'IRM, une injection d'adénosine (poudre chez Sigma Aldrich) à 0.33 mg/kg/min diluée en solution de chlorure de Sodiul à 0.9% à usage vétérinaire (B.Braun) sera réalisée via un cathéter disposé dans la veine caudale, le volume maximal est de 3 ml pendant 10 minutes maximun. La respiration et l'ECG seront surveillés pendant toute la durée de l'examen. Le comportement des animaux sera étroitement surveillé et une grille d'évaluation de la douleur sera remplie et le point limite déterminé en fonction des principes de Morton et Griffiths. Enfin, pour la procédure ex vivo sur le coeur isolé perfusé, nous réaliserons une euthanasie par injection d'euthasol (140mk/mg, IP) avant de prélever le cœur afin de ne pas faire souffrir l'animal.
Choix des espèces
Le modèle de rat soumis à ces régimes a été choisi car des études des jeûnes ont été réalisé sur cette espèce. De plus, nous souhaitons comparer nos résultats de cardioprotection avec ce qui a déjà été fait dans le laboratoire dans un souci de respect des 3R. Nous souhaitons également tester la cardioprotection des jeûnes sur le modèle de rat nourri avec un régime HFS qui permet de développer un modèle de prédiabète reproduisant la même genèse que chez l’Homme et de suivre ces effets sur l’organisme, en particulier le coeur. Le modèle HFS a été récemment décrit par notre équipe pour induire un état prédiabétique. Les rates soumises à ce régime présentent une altération de l’homéostasie glucidique, une dysfonction cardiaque précoce des trois mois de régime, ainsi qu’une sensibilité plus importante aux lésions d’ischémie-reperfusion caractérisée par une altération du métabolisme énergétique et de la fonction cardiaques, par comparaison aux rates contrôles sous-alimentation normale.