Système cardiaque

120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie d'environ 30 minutes pour poser des cathéters dans la veine et l'artère fémorales, suivie de 60 à 120 minutes d'imagerie, avec un risque d'hémorragie. L'objectif est de mettre au point un modèle mathématique de la cinétique de traceurs radioactifs pour l'imagerie TEP, en vue d'un passage ultérieur chez le primate puis chez l'humain. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut pas être remplacé par une méthode in vitro, l'objectif final étant d'utiliser les mêmes traceurs en clinique.

Objectifs

Le projet vise à réaliser des expérimentations permettant d’évaluer la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) de différents traceurs fluorés et ainsi permettre de quantifier les images Tomographie par Emission de Positons. La TEP (Tomographie par Emission de Positons) est une méthode d'imagerie scintigraphique médicale qui permet de mesurer en trois dimensions l'activité métabolique d'un organe grâce aux émissions produites par les positons issus de la désintégration d'un produit radioactif injecté au préalable. L’apparition des traceurs radioactifs à visée diagnostique constitue une avancée majeure en imagerie Tomographie par Emission de Positons (TEP) et accroît de façon significative les performances du diagnostic en clinique. L’imagerie TEP apporte des informations (qualitatives et quantitatives) fonctionnelles en plus des informations morphologiques.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons ainsi visualiser et quantifier en temps réel la fonction d’entrée artérielle chez le rat afin de mettre au point un modèle mathématique (cinétique plasmatique) des différents traceurs radioactifs afin de poursuivre ce projet vers la cinétique des traceurs chez le primate non humain et chez l’humain.

Procédures

Cette procédure durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à une chirugie d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l’artère fémorales. Les rats seront ensuite imagés pendant 60 à 120min.

Impact sur les animaux

Hémorragies après la chirurgie pendant l’imagerie. L’ensemble du plan expérimental étant sans réveil aucun autre critère ne sera être déterminant. Cependant toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique.

Réduction

Les effectifs ont été choisis sur la base d’étude précédemment menées au laboratoire sur l’évaluation de fonctions d’entrées artérielles et sur la base des images obtenues en imagerie TEP avec le traceur radioactif de la neuroinflammation. Tous les scans réalisés seront moyennés afin d’avoir un cerveau moyen de fixation du traceur radioactif des animaux témoins et des animaux ayant été injectés avec différents radiotraceurs développés par l’équipe. Communément aux études que nous avons déjà publiées, des analyses seront ensuite réalisées pour comparer les groupes d’animaux à l’aide d’un test statistique. Le nombre d’animaux est réduit d’environ 50% : le système dédié pour évaluer la cinétique du traceur permet d'obtenir des mesures toutes les secondes. Sans ce système, du sang devrait être prélevé toutes les secondes ce qui conduirait à une instabilité hémodynamique. Cette instabilité induirait une diminution de la perfusion du radiotraceur dans le sang et donc modifierait sa cinétique réelle. Ces facteurs font qu'il est difficile de répéter les prélèvements sanguins pour générer la fonction d’entrée artérielle chez un même animal. Il faudrait répéter le nombre d’expériences. Pour cette étude nous aurons besoin de 120 animaux pour l’ensemble du projet sur 5 ans.

Raffinement

Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer le stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les rats seront observés une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux sont anesthésiés à l’isoflurane et placés sur le dos dans un masque à anesthésie sur un tapis chauffant. Une protection oculaire sera appliquée. Une dose d'analgésie sera induite en sous cutanée avant la chirurgie et un analgesique sera mis en application localement. Un bolus de réhydratation chauffé à 37°C sera injecté à l’animal en sous cutanée . De plus, les animaux seront hébergés par deux par cage en présence d’un enrichissement comprenant un tunnel en plastique et du papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthesie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude notamment en raison de son gabarit permettant la pose du shunt artério-veineux. Pour cela, nous réalisons une cathéterisation sur la même patte, l'artère et la veine fémorale. Cette artère et cette veine sont reliées entre elles par une tubulure, cela correspond à un circuit en boucle fermée. Donc la circulation sanguine continue de se faire entre la veine et l'artère de la patte concernée mais la circulation sanguine ne se fait plus dans 'la partie de la patte" en dessous de la cathétérisation. Nous utiliserons des rats mâles de 8 semaines et des femelles 12 semaines. Les femelles de 12 semaines seront utilisées pour avoir le même poids que les mâles à 8 semaines.

237 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Porteuses d'un défaut génétique plaquettaire reproduisant celui d'un patient, elles font l'objet de prélèvements d'organes post-mortem pour étudier le rôle de la tubuline beta1 dans la fonction des plaquettes et de la thyroïde. Le porteur affirme qu'il n'y a "pas de contraintes pour les animaux" puisque tout se déroule sans réveil. Il indique que les plaquettes ne peuvent pas être mises en culture et conclut qu'il est "nécessaire" de disposer de plaquettes issues de sang frais dans un organisme vivant.

Objectifs

Chez un individu en bonne santé, les plaquettes sanguines participent lors d’une coupure du vaisseau sanguin à l’arrêt du saignement en colmatant la brève vasculaire. En revanche, dans des conditions pathologiques, ces plaquettes peuvent ne pas être fonctionnelles ce qui peut causer des saignements abondants (hémorragie) ou au contraire, entrainer une trop grande réactivité des plaquettes et dans ce cas induire une occlusion des vaisseaux sanguins, c’est la thrombose. Par ailleurs la production des plaquettes dans le sang nécessite des remaniements importants de la morphologie de la cellule pour qu’elle devienne fonctionnelle. Ces modifications morphologiques impliquent un remodelage constant du squelette (appelé cytosquelette) de la plaquette. Récemment, il a été montré que des défauts génétiques touchant certaines protéines du cytosquelette des plaquettes avaient également une répercussion sur des maladies de la thyroïde. Le projet a pour objectif de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ces deux défauts plaquettaires et thyroïdiens associés aux atteintes génétiques du cytosquelette.

Bénéfices attendus

Dans son ensemble, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la production des plaquettes et leur morphologie, mais également d’aborder de façon plus approfondie le rôle de la tubuline β1 dans les fonctions plaquettaires. Par ailleurs, cette étude devrait permet d’envisager un meilleur suivi de ces patients qui sont susceptibles de présenter des risques de thrombose.

Procédures

Toutes les procédures se feront sur animaux anesthésiés. A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés sans retour au préalable à la conscience.

Impact sur les animaux

Le projet ne comporte que des procédures sans réveil sous anesthésie générale. Il n’y a donc pas de contraintes pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure (sans réveil). Des prélèvements d’organes post-mortem seront alors effectués.

Remplacement

Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur des études in vitro de cultures cellulaires. Ces modèles cellulaires in vitro sont essentiels pour orienter nos recherches, mais ces cellules ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mises en culture. Par ailleurs, hors d’un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang frais. Le modèle murin que nous avons généré porte le même défaut génétique plaquettaire qu’un patient. Ces souris permettront d’étudier les plaquettes sanguines dans un organisme vivant, d’évaluer les interactions entre toutes les composantes du sang, et d’évaluer les risques de saignement ou d’occlusion des vaisseaux encourus par le patient porteur de ce même défaut génétique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est de 237 animaux. Nous avons pu définir au plus juste ce nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistique (GPower3.1).

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, traitements analgésiques...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Pour limiter le stress des souris, les animaux seront sortis de la zone d’hébergement de l’animalerie juste avant l’expérimentation.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et pratiques. En effet, la souris est l'animal dont la génétique est la mieux connue et avec laquelle il est assez facile de générer des modèles porteurs de défauts génétiques spécifiques comme ici où notre modèle murin est porteur d’un défaut génétique comparable à celui décrit chez un malade. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l’expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. De plus, la souris est l'animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer plus facilement les résultats. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce.

260 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une chirurgie d'accès aux valeurs hémodynamiques puis un suivi de quatre heures pendant lequel des peptides de venins de serpents sont testés sur le système cardiovasculaire, avant le prélèvement des organes. Le porteur indique que certaines toxines peuvent perturber la respiration ou provoquer des convulsions, l'animal étant alors tué par injection létale. Il affirme que les réactions complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro et qualifie le recours aux rats d'"indispensable".

Objectifs

Cette étude vise à identifier de nouveaux composés intéressants et de nouvelles approches thérapeutiques au niveau cardio-vasculaire in vivo. Les venins de serpents contiennent de nombreuses toxines ayant des propriétés physiologiques intéressantes. Au-delà de l’intérêt, de la connaissance de la composition et du mode d’action des venins, certaines protéines se sont révélées comme d'excellents outils pharmacologiques. De nombreux chercheurs se sont intéressés aux venins dans la perspective de développer de nouveaux médicaments. Les venins et les toxines sont des mélanges complexes de protéines avec parfois plusieurs centaines de peptides et de protéines dans un même venin qui ont chacune leur activité biologique propre. Le venin contient de nombreux composés ayant des propriétés physiologiques intéressantes. Les toxines produites par les espèces animales venimeuses peuvent servir de bases au développement de médicaments contre la douleur, le diabète ou les maladies cardiovasculaires. Dans une précédente étude, nous avons montré que certains peptides pouvaient avoir des effets hypotenseurs ex-vivo en ciblant les récepteurs muscariniques. Cette précédente étude n'avait pas pour objectif de comprendre les voies de signalisation impliquées dans la mise en place des effets hypotenseurs et n'a pas pu confirmer les effets in vivo à moyen terme. L'étude actuelle visera donc à comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine des effets des peptides et de caractériser leurs effets à moyen terme grâce à un protocole de monitoring comprenant des électrocardiogrammes et des mesures de pressions à long terme sur une durée de 4h sous anesthésie générale. Le but de notre projet est donc d’étudier et de valider les effets de différentes toxines provenant de peptides sur le système cardiovasculaire chez le rat WISTAR HAN adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension physiopathologique du rôle de toxines provenant de venins et potentiellement à terme l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques au niveau cardio-vasculaire chez l’Homme. Les toxines de venins ont une forte affinité (grâce à l’action directe qu’elles ont sur les récepteurs, les enzymes ou les canaux ioniques de l’organisme) et une grande sélectivité (elles bloquent ou activent plus particulièrement un récepteur, permettant de limiter les effets secondaires), ce qui en font d’excellents candidats pour de futurs médicaments.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 intervention permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal grâce à une chirurgie de 10 min. Au bout de 4h, les rats seront mis à mort pour le prélèvement des organes.

Impact sur les animaux

Au cours du protocole, pour certaines toxines, nous pourrions avoir des modifications de la respiration des rats liées à la fixation sur des récepteurs cholinergiques. Si le rat venait à convulser, lutter, ou qu’un mouvement du diaphragme devenait important, avec des difficultés respiratoires sévères ou prolongées, le rat sera mis à mort par injection intrapéritonéale de dose létale (120 mg/kg) de pentobarbital sodique. Un saignement abondant non maitrisable soit une perte de plus de 20 % de la volémie de l’animal conduira à la mise à mort de celui-ci. L’animal sera suivi tout au long de la procédure et en fonction des points limites abordés précédemment, soit nous garderons l’animal en vie soit il sera mis à mort par injection intrapéritonéale de dose létale (120 mg/kg) de pentobarbital sodique. Le protocole se fera sous anesthésie générale pendant 4 heures sans réveil de l’animal.

Devenir

Après mise à mort de l’animal, divers prélèvements seront réalisés pour compléter l'étude. Des échantillons de mésentères, d’aorte, de cœur, de poumons, de reins, de foie seront prélevés immédiatement pour les études de réactivité vasculaire, de biologie moléculaire et de biochimie.

Remplacement

Nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies. Des études in-vitro ont déjà été effectuées montrant la fixation des peptides sur leurs récepteurs.

Réduction

Les rats utilisés sont des Wistar mâles et femelles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations permettant de réaliser l’acquisition de plusieurs paramètres (pressions, ECG) sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits (n=8) afin de déterminer les conditions d’expérimentation optimales (tels que le temps de suivi des animaux pour l’étude des constantes hémodynamiques). Dans un second temps, lorsque les conditions d'expérimentation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie. L’analgésie des animaux est réalisée 20 à 30 minutes avant le début de la procédure. Afin de prévenir une éventuelle sécheresse oculaire liée à l’anesthésie prolongée, de la pommade ophtalmique contenant de la vitamine A est ajoutée sur les yeux au début de la procédure pour le bien-être de l’animal avant la pose d’un champ stérile. Toutefois au cours de la procédure, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat mis à mort par injection intrapéritonéale d’une dose létale d'anesthésique. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable conduira à la mise à mort de celui-ci.

Choix des espèces

Ce modèle est actuellement le plus utilisé et le mieux décrit. C’est un modèle qui a une très bonne reproductibilité et qui en fait un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. Nous avons la connaissance de ce modèle dans l’équipe et toute les procédures réalisées sont maîtrisées au sein de notre équipe et effectuées par une personne titulaire d’une formation à la chirurgie du rongeur. Les rats utilisés sont des Wistar Han âgés de 10-13 semaines, âge standard pour ces manipulations. Leurs tailles permettent de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats grâce à notre connaissance du modèle et à de précédentes études menées dans notre équipe permettant de mettre en évidence ou non des différences entre les groupes. Nous réduisons ainsi le nombre d'animaux. Les rats Wistar Han utilisés dans ce projet auront entre 10 et 13 semaines soit un âge adulte. C’est un âge standard pour ce genre de manipulation. De plus, la bio collection réalisée en fin de procédure permettra de réaliser plusieurs expériences et donc de réduire le nombre d’animaux dans l’étude.

138 souris vont être utilisées, maintenues sous anesthésie puis tuées par excès d'anesthésique sans reprise de conscience, dans des procédures classées sans réveil. Chacune est canulée à la trachée et à une veine, son muscle crémaster exposé pour observer la thrombose et l'inflammation pendant des expériences allant jusqu'à sept heures. Le projet évalue des molécules antithrombotiques ou anti-inflammatoires fournies par des collaborateurs. Le porteur affirme qu'aucune lignée cellulaire ne produit assez de neutrophiles et de plaquettes et que l'intégrité du vaisseau n'est "pas reproductible" in vitro.

Objectifs

Évaluation en précliniques de molécules étant identifié par des collaborateurs académiques ou industriels comme ayant des propriétés anti-thrombotique ou anti inflammatoire.

Bénéfices attendus

Ce type d’expérimentation permet d’évaluer dans un modèle complexe vertébré ne pouvant pas être reproduit in vitro les capacités anti thrombotique ou / et anti inflammatoire de molécules d’intérêts. Il permet notamment de mettre en évidence un élément clef pour la poursuite de l’étude des molécules : la stabilité du thrombus plaquettaire et donc sa capacité à emboliser. Ces embolisations sont critiques car elles sont à l’origine des embolies pulmonaires et des acidents cardiovasculaires cérébraux. Ces expérimentations en complément d’expérimentation in vitro permettent de sélectionner les meilleurs candidats possibles pour poursuivre leurs évaluations selon la réglementation en vigueur.

Procédures

Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Ces expérimentations sont sans réveil, les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié par excès d’anesthésique. Il y a une seule procédure expérimentale par animal. Seule l’anesthésie en intrapéritonéal et l'injection de buprénophine en sous cutanée pour le protocole d'inflammation sont réalisés sur animal vigile. Dans les deux types d'experimentations thrombose et inflammation les points limites sont une perte sanguine trop importante au niveau du creamaster, un flux sanguin trop irregulier au niveau du crémaster, ainsi qu'une décanulation de la jugulaire. Dans tous ces cas les animaux seront euthanasiés par excès d'anesthésiques. La durée maximale d'une expérience de thrombose est de 4 heures et de 7 heures pour une expérience d'inflammation. Pour le modèle de thrombose les cinétiques sont en médianes d’intensités de fluorescence (Wilcoxon's rank-sum test avec P

Impact sur les animaux

Les deux types d’expérimentations sont sans réveil. Les Animaux sont maintenus sous anesthésie durant la totalité de la procédure qui dure maximum 7 heures et sont euthanasiés par excès d’anesthésique.

Devenir

Les animaux sont, sous anesthésie profonde, canulés aux niveaux trachéal et veineux, avec une exposition du muscle crémaster dans le but de visualiser les veinules et les artérioles afin d’étudier la thrombose et l’inflammation. Les animaux ne seraient pas viables en l’état, il est nécessaire de les euthanasier.

Remplacement

Les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales sont des cellules clefs dans l’immunothrombose. A ce jour, Aucune lignée cellulaire immortalisée ne permet de produire dans des proportions satisfaisantes des neutrophiles et de plaquettes. D’autre part, Il n’est pas possible de reproduire à l’heure actuelle l’intégrité du vaisseau (incluant la contractibilité, la perméabilité, les cellules musculaires lisses) ni l’activation des cellules endothéliales in vitro.

Réduction

Dans un soucis d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux anoncée a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une difference significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'experimentations supplémentaires. Dans la mesure du possible dans les experimentations de thrombose plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 5, en présence de coton de nidification ; avec boisson et nourriture ad libitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisé pour tous les animaux avant expérimentation. Pour les deux types d’expérimentation thrombose et d’inflammation les animaux sont anesthésiés avec un mélange Ketamine, Xylazine et Atropine. L’ajout de l’atropine nous permet de mieux stabiliser les animaux au cours de l’anesthésie par une réduction des sécrétions respiratoires et salivaires et d’éviter la perte d’animaux durant les procédures. Dans les deux types d'experimentations thrombose et inflammation les points limites sont une perte sanguine trop importante au niveau du creamaster, un flux sanguin trop irregulier au niveau du crémaster, ainsi qu'une décanulation de la jugulaire. Dans tous ces cas les animaux seront euthanasiés par excès d'anesthésiques. L’administration de thiopental est minutée et avec une posologie précise. Les expérimentations d’évaluation anti inflammatoire pouvant se prolonger jusqu’à 7 heures, en incluant la chirurgie nous avons fait le choix de traiter les animaux avec un analgésique supplémentaire (buprénorphine; 0,01 mg/kg par voie sous cutanée) 30 minutes avant de réaliser l’anesthésie par Ketamine, Xylazine et Atropine par voie intrapéritonéale.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose et de l'inflammation. En effet la formation d’un thrombus et le dévelopement d'une inflammation dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Nous travaillons sur des animaux adultes de 5 à 12 semaines, nous avons besoin d'un système immunitaire et d'une production de plaquettes matures.