Système cardiaque

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime hyperlipidique ou contrôle pendant cinq à quinze semaines, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline pouvant provoquer des signes d'hypoglycémie, puis à une échocardiographie avant euthanasie et collecte d'organes. Le projet vise surtout à tester la reproductibilité entre laboratoires européens de données sur le cœur des souris obèses. Le porteur affirme que les systèmes cellulaires ne reproduisent pas les régulations neuro-hormonales et conclut qu'un modèle animal est "indispensable".

Objectifs

Le projet consiste en une analyse de modèles murins avec études histologiques de divers tissus d'intérêt (cœur, rein, foie, tissu adipeux) visant à : 1/ Comparer la reproductibilité entre différents laboratoires européens des données à l'aide d'un protocole standardisé et unique sur des modèles murins de diabète de type 2 induit par l'obésité, et 2/ Mettre en place une biobanque d'échantillons sanguins et tissulaires pour réaliser des analyses multi-omiques

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester la reproductibilité de ces données en comparant dans différents laboratoires en Europe l'impact d'un régime hyperlipidique chez les souris mâles et femelles sauvages sur la structure et la fonction cardiaques, ainsi que l'évaluation métabolique et l'impact sur d'autres organes (foie, rein, tissu adipeux).

Procédures

La moitié des animaux du projet sera soumise à un régime contrôle de 5 semaines ou de 15 semaines. L'autre moitié des animaux sera soumise à un régime hyperlipidique de 5 semaines ou de 15 semaines. A la fin du protocole expérimental, tous les animaux seront soumis à des tests métaboliques (tests de tolérance au glucose et à l'insuline) ainsi qu'à des analyses échocardiographiques, avant euthanasie et collecte de sang et d'organes. Les tests métaboliques seront réalisés une fois au début du régime et une fois à la fin du protocole. Les mesures seront réalisées à différents temps post-injection : t0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes pour une durée de quelques secondes chacune. Les échocardiographies seront réalisées une fois à la fin du protocole expérimental (environ 15 min par animal).

Impact sur les animaux

Certains animaux sont susceptibles de présenter des signes cliniques d’hypoglycémie durant les tests métaboliques (ex. inactivité, yeux fermés, posture prostrée, tremblements, froid au toucher) ou encore une glycémie ≤ 3 mmol/l.

Devenir

A la fin du protocole expérimental, les animaux seront euthanasiés afin de procéder à une collecte multi-organes.

Remplacement

Pour ce type de projet visant à étudier l'impact de troubles métaboliques sur le remodelage et la dysfonction cardiaque, l'utilisation de modèles animaux est indispensable. Des modèles cellulaires seront utilisés en complément (cardiomyocytes de rats nouveau-nés, lignée cellulaire H9C2) afin de valider certaines cibles/voies métaboliques. En revanche, ces systèmes simplifiés ne récapitulent pas toutes les régulations neuro-hormonales d'un organisme complet, dont le rôle dans les régulations métaboliques est bien connu. En ce sens, un modèle animal est indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en prenant en compte de l’apparition d'altérations et de la mortalité liée au vieillissement des animaux et suite à la mise sous régime HFD selon les données de la littérature. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris (sang, urine, fécès, organes). Avant sacrifice, des méthodes non invasives seront réalisées (tests cognitifs, échocardiographies, mise en cage métabolique) pour obtenir des informations sur plusieurs thématiques et disciplines (cardiaque, métabolique, physiologique, etc.). Après sacrifice, le sang sera prélevé à la veine cave et un grand nombre d’organes seront récupérés. Ce protocole permettra ainsi d’extraire un maximum de données sur le même animal et d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et pris en charge selon la règlementation en vigueur. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 4 fois par mois. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les souris seront au nombre de 5 par cage, et suivies quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress : apathie, prostration, perte de poids >20% (les souris seront pesées à leur arrivée puis toutes les semaines), agressivité, difficultés de déplacements. Pour améliorer le quotidien des souris, des matériaux de litière ou des structures de repos adaptés seront installés dans les cages (mouchoirs en papier, rouleaux en cartons, …).

Choix des espèces

Le développement de pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, la mise en place de pathologies cardiaques fait intervenir des systèmes hormonaux, neuro-hormonaux, des adaptations circulatoires, centrales, métaboliques, etc., si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. En outre, l'obésité étant un facteur de risque connu de dysfonction cardiaque chez l'Homme, il est intéressant de mettre en place des conditions expérimentales (facilement réalisables chez l’animal) pour étudier ces processus chez l’animal. Le modèle "souris" permet d’étudier ce phénomène dans un laps de temps court (quelques mois) et il permet l’utilisation de conditions expérimentales simples à mettre en place (régime HFD) afin d'induire ce processus, permettant des analyses précises. Les souris auront 5 mois au début de l'étude, âge auquel le développement cardiaque est terminé.

400 rats et 100 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale d'une prothèse crânienne sous anesthésie de 2 à 6 heures, puis jusqu'à une dizaine de sessions d'enregistrement, certaines en contention sur plateforme rotative, d'autres après une lésion vestibulaire provoquant des troubles de l'équilibre. Le porteur indique que la lésion vestibulaire entraîne des vertiges et une désorientation transitoires, et que les lignées modèles d'épilepsie-absence figent l'animal quelques secondes à minutes. Il affirme qu'aucune simulation ni organoïde ne reproduit ces interactions neuronales, l'euthanasie survenant entre 3 et 12 mois.

Objectifs

Le fonctionnement du cerveau est basé sur l'interaction réciproque entre les neurones, qui traitent l'information, et le réseau sanguin, qui répartit en permanence le soutien métabolique selon les contributions de différentes aires cérébrales. Ce couplage entre métabolisme et traitement cognitif sert de moyen d’exploration des processus cérébraux, grâce à l’imagerie des processus vasculaires et métaboliques pour identifier et comprendre les réseaux neuronaux associés à chaque comportement, activité physiologique ou pathologique. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment les différentes aires fonctionnelles du cerveau interagissent pour produire des processus cognitifs, des comportements, ou des anomalies handicapantes telles que les absences (brêves périodes de passivité associée à une perte de conscience). Ce projet associe trois axes d’analyse complémentaires : 1/Comment mesurer simultanément la dilatation des vaisseux sanguins et la charge en oxygène du sang pour estimer la charge métabolique des aires cérébrale à travers l’ensemble du cerveau ? On développe des méthodes pour la mesure du métabolisme tissulaire in vivo sur l’ensemble du cerveau de façon minimalement invasive, en combinant des moyens acoustiques et optiques. 2/L’orientation spatiale nécessite des repères visuels stables, i.e. dont le mouvement apparent est uniquement causé par les mouvements de l’animal. Comment le cerveau identifie et utilise de tels repères à partir des signaux visuels et vestibulaires ? On aborde une situation physiologique, la dynamique des réseaux impliqués dans des fonctions cognitives d’orientation spatiale, où des aires cérébrales spécialisées coopèrent pour produire une fonction intégrée. 3/Existe-t-il des marqueurs de l’activité cérébrale annonçant la survenue d’absence, et quels en sont les mécanismes déclencheurs? On explore une situation pathologique, l’épilepsie de type absence (non convulsive), où des réseaux distribués à travers le cerveau perturbent l’ensemble de l’activité jusqu’à interrompre le comportement et figer l’animal de façon transitoire (typiquement 3s à 3min).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans ce projet apporteront une meilleure connaissance de mécanismes cérébraux physiologiques et pathologiques. D’un point de vue scientitifque on attend de mieux comprendre quelles aires cérébrales sont impliquées dans l’orientation et dans l’attention (interrompue par les absences) et globalement de mieux comprendre comment les différentes aires cérébrales spécialisées interagissent pour produire un effet de conscience. D’un point de vue technologique on développe des moyens d’observation donnant une vision étendue des liens entre mécanismes métaboliques et cognitifs. L’ensemble de ces progrès constitueront une base pour mieux comprendre et à terme traiter les pathologies impliquant l’orientation, les absences, ou les troubles métaboliques, dont l’impact sur la santé est significatif.

Procédures

Chaque animal est soumis à une unique procédure chirurgicale d'implantation d'une prothèse crânienne et d'un système d'attache permettant des mesures ultérieures non invasives (EEG, imagerie ultrasonore, imagerie optique). Cette étape est réalisée en une seule chirurgie sous anesthésie profonde d’une durée de 2-6h, suivie d’une période de récupération de 5-7 jours. Chaque animal participe ensuite à une campagne d’observation non invasive, composée au maximum d’une dizaine de sessions d’enregistrement espacées de 3 jours à 3 mois, étalée sur une durée totale maximale de 1 an. Chaque session nécessite une brêve anesthésie initiale, pour fixer le système d’enregistrement, pendant environ 30 minutes. Une fois le système attaché la session peut se dérouler de trois façons différentes : 1/L’animal est maintenu anesthésié pour la session de mesure, d’une durée maximale de 6h ; 2/L’animal réveillé reste en contention sur une plateforme rotative, pour évaluer des stimuli visuo-vestibulaires imposés, sur une durée maximale de 6h ; 3/L’animal est mobile, en restant attaché au système de mesure par un cordon léger, pour une durée d’enregistrement des mesures en continu de 6h à une semaine. Les animaux participant à l'étude de l'intégration visuo-vestibulaire sont soumis à une brève chirurgie de lésion vestibulaire (environ 30 minutes), sous anesthésie profonde, au milieu de la période d'observation. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la dernière session d'observation.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale d’implantation d’une prothèse crânienne est associée à un risque post-opératoire de douleur à traiter de façon préventive, d’infection ou de dégradation de la prothèse à surveiller. La procédure de lésion vestibulaire produit un stress lié à un défaut de sens de la verticale et des accélérations de la tête, se traduisant par des mouvements déséquilibrés de l’animal et/ou une immobilisation inhabituelle. Ce handicap est transitoire, grâce à compensation du système nerveux atteinte en une semaine environ. Les sessions d’observations avec l’animal en contention sur une plateforme rotative peuvent induire des vertiges brefs et du stress en cas de stimuli visuel et vestibulaire discordants. Les sessions d’observation sur animal éveillé peuvent produire un stress pendant la durée de la session, lié à la contention ou à la gêne occasionnée par le câble rattachant la tête au système de mesure. Les lignées établies comme modèles d’absence spontanée présentent des périodes de quelques secondes à quelques minutes pendant lesquelles l’animal est figé, interrompant son comportement pour le reprendre à la fin de l’absence. Bien que le comportement soit inhabituel pour des rongeurs il n’est pas dommageable dans le cadre sécurisé du laboratoire (notamment absence de prédateur). La rotation imposée sur une plateforme mobile, et la lésion vestibulaire provoquent des vertiges et perte d'équilibre. La récupération spontanée d'une lésion vestibulaire est de 3 jours.

Devenir

La qualité des mesures obtenues au moyen d'une prothèse crânienne permettant l'observation décroit avec le temps, ce qui ne permet pas de conserver les animaux pour obtenir plus de données. Les animaux sont gardés en vie durant au maximum 12 mois pour permettre d’obtenir des données suffisantes en qualité et quantité pour établir des observations répondant aux questions abordées par le projet. On prévoit une euthanasie entre un âge de 3 et 12 mois.

Remplacement

Les questions abordées dans ce projet concernent les propriétés émergentes des interactions entre assemblées de populations neuronales réparties à travers le système nerveux, en rapport avec des questions de physiologie et pathologies des mammifères. La diversité des types cellulaires, de leurs connexions, la richesse des intéractions moléculaires -d’ailleurs tous encore incomplètement décrits- font qu’il n’existe aucun moyen de simulation ou de remplacement par des organismes plus simples ou des organoïdes. En outre les mécanismes étudiés sont très dynamiques et propres aux animaux vivants, ce qui ne permet pas de les aborder sur des tissus fixés.

Réduction

On prévoit d’employer au maximum 400 rats et 100 souris sur 5 ans. Nos études déjà publiées ont montré que la bonne sensibilité des méthodes utilisées dans nos approches EEG-imagerie fonctionnelle permet typiquement de dresser un panorama de l’activité fonctionnelle et d’exhiber des variations statisiquement significatives avec un nombre limité d’animaux (par exemple sur la dynamique d’activation, la comparaison avec une situation contrôle). Ces animaux permettront d’aborder nos trois axes d’étude (méthode, orientation, absence). L’étude de méthode compare les variations temporelles des signaux cérébraux entre des activités de base et des activité induites pharmacologiquement sous anesthésie, suivant un protocol établi. L’étude sur l’orientation spatiale repose sur un groupe avec lésion vestibulaire et un groupe contrôle, tous deux soumis à des stimuli concordants ou discordants. L’étude sur les absences compare également deux groupes d’animaux, présentant des absences spontanées contre animaux contrôles. Pour réduire les effectifs, étant donné les similitudes techniques entre les procédures engagées pour ces 3 axes d’étude, des données pourront être partagées et le cas échéant des animaux pourront participer à plusieurs axes d’étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés pendant 5 jours suivant leur arrivée aux conditions de température et d'humidité de l'animalerie. Les conditions de stabulations sont conformes aux standards: taille des cages, nourriture et eau ad libitum, éclairage suivant un cycle régulier jour/nuit. L'environnement est enrichi par des buchettes. Les animaux sont hébergés par groupes sauf lorsque cela représente un risque post-opératoire (détérioration des prothèses par un congénère). Le projet n’a pas de finalité associée à la douleur et ne prévoit pas l’occurrence de situation douloureuse, en dehors d’un épisode d’intensité au maximum modérée, post-opératoire sur une durée de 3 jours, pris en charge de façon systématique et anticipée. La survenue éventuelle d’autres épisodes douloureux pourrait se produire en cas de complication chirurgicale, impliquant une vigilance quotidienne. Afin de minimiser les douleurs post-opératoires les animaux recevront un traitement antalgique initié dès le début de la chirurgie. Durant toute l'étude : les animaux seront évalués quotidiennement par les zootechniciens pour des comportements tels qu'une posture ou des mouvements anormaux. En cas de comportement anormal, les animaux seront isolés et feront l'objet de soins adaptés par les expérimentateurs pendant 72h. Les animaux seront euthanasiés s'ils présentent des signes de douleur persistants ou perdent 10% ou plus de leur poids pendant cette période, selon une grille standard. L'atteinte d'un point limite exige une ou plusieurs des actions suivantes : -l'isolation et la surveillance bi-quotidienne, injection de solution glucosée en sous-cutanée en cas de dénutrition - l'administration d'un analgésique -l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Les rats et souris forment un modèle des activités cérébrales et du couplage neuro-vasculaire des mammifères. Ils forment des modèles particulièrement développés pour étudier les circuits cérébraux de l’orientation spatiale, des comportements cognitifs simple et du sommeil. De plus, des lignées spécifiques (WAG/Rij, GAERS) sont des modèles de référence pour les absences. Le projet repose sur des rats et souris adultes, dès la fin du sevrage, soit un âge compris entre 4 semaines et 1 an, poids d'un animal sain (souris 10-20g, rat 150-500g). Des animaux adultes présentent un référentiel stable des capacités cognitives et du couplage neurovasculaire. Les lignées WAG/Rij et GAERS présentent des absences spontanées qui émergent dans les 2-4 semaines suivant la naissance, ce qui en fait d'excellents modèles. Les modèles rats et souris sont complémentaires : la taille du cerveau de rat est particulièrement adaptée à la technique d'imagerie ultrasonore (résolution spatiale, masse de la sonde fixée sur le tête de l'animal), la souris offre une perspective de comparaison avec un corpus d’études plus diversifié.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection d'ARN interférents puis, sous anesthésie, un test de saignement consistant à couper les trois derniers millimètres de la queue, ou un test de thrombose par extériorisation des vaisseaux intestinaux pendant une heure. Le porteur indique que ces tests ne sont pas compatibles avec un réveil et que la perte de sang serait trop importante pour une réutilisation. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas "l'intégralité" du processus de coagulation.

Objectifs

La maladie hémorragique génétique la plus fréquente est la maladie de Willebrand qui affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée. Cette pathologie est causée par des mutations sur le gène qui produit le facteur Willebrand, une protéine impliquée dans la coagulation sanguine. La maladie de Willebrand est très hétérogène et est divisée en plusieurs types et sous-types. Le sous-type 2B par exemple est caractérisé par la présence d’un facteur Willebrand anormal. Même si les mutations responsables de la maladie de Willebrand 2B ne sont présentes que sur une des copies du gène du facteur Willebrand (chaque gène est en double chez tous les individus, un qui vient de la mère et un qui vient du père), la protéine anormale va aller empêcher la protéine normale de faire son travail. Si trop peu de facteur Willebrand ou un facteur Willebrand anormal conduit à des hémorragies, à l’inverse, une quantité trop importante de facteur Willebrand entraîne un risque de thrombose ou survenue de caillots sanguins dans les vaisseaux. Dans les deux cas, il serait donc très utile de pouvoir inhiber la production de facteur Willebrand à partir d’une des deux copies du gène : soit pour empêcher la protéine anormale d’être produite (dans le premier cas), soit pour diminuer la quantité totale de facteur Willebrand (dans le deuxième cas). La difficulté est d’aller cibler spécifiquement une des deux copies du gène sans affecter l’autre. C’est donc le but de ce projet qui va consister à utiliser des inhibiteurs de la production du facteur Willebrand à partir d’une seule copie du gène. Pour cela le croisement de souris de deux souches génétiques différentes va permettre d’obtenir des souris avec deux gènes légèrement différents (reproduisant la situation humaine où les gènes reçus de ses deux parents sont différents) et ce sont ces petites différences qui vont être exploitées pour développer des inhibiteurs spécifiques d’une des copies du gène et non pas des inhibiteurs qui aboliraient totalement la production de facteur Willebrand.

Bénéfices attendus

A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de montrer qu’il est possible de cibler une copie d’un gène directement chez un animal, ce qui important d’un point de vue preuve de concept bien au-delà de la maladie de Willebrand et 2) de déterminer si l’inhibition du gène anormal corrige les symptômes hémorragiques dans la maladie de Willebrand 2B. A long terme, le projet contribuera à renforcer l’idée de cibler le facteur Willebrand anormal dans la maladie de Willebrand dans le cadre d’une médecine personnalisée et éventuellement de réduire les quantités de facteur Willebrand chez les patients à fort risque de thrombose.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période de 4 jours maximum. Les souris recevront une injection intraveineuse unique pour leur administrer les inhibiteurs de la production du facteur Willebrand. Quatre jours après cette injection, les souris seront anesthésiées et tout le reste de la procédure se déroulera pendant cette anesthésie. Pour toutes les souris, une prise de sang sera alors effectuée afin de mesurer divers paramètres biologiques. A la suite de la prise de sang un groupe de souris sera soumis à un test de saignement. Ce test consiste à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 10 minutes. Pour un autre groupe de souris, nous évaluerons leur capacité à développer des thromboses dans les vaisseaux intestinaux à l’aide d’un microscope. Ceci impliquera l’injection intra-veineuse d’un marqueur fluorescent sur les souris anesthésiées puis le test de thrombose sur une durée de 60 minutes, le tout sous anesthésie. Au terme des 10 minutes (pour le test de saignement) ou des 60 minutes (pour le test de thrombose), l’animal toujours sous anesthésie sera euthanasié par les méthodes réglementaires.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire pendant et après l’injection intra-veineuse qui a lieu 4 jours avant les tests. La seconde partie de la procédure se fait entièrement sous anesthésie/analgésie chimique et sera sans réveil.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Les tests de thrombose impliquent d’extérioriser des vaisseaux intestinaux ce qui n’est pas compatible avec un réveil éventuel. Pour le test de saignement, les souris peuvent perdre beaucoup de sang, ce qui provoquerait un impact trop important sur une ré-utilisation potentielle.

Remplacement

Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.

Réduction

Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante et sur notre expérience des modèles expérimentaux et de la variabilité qui leur est associée. La mise au point et le développement des inhibiteurs a été conduit dans des modèles cellulaires afin qu’un seul d’entre eux soit testé sur des animaux. D’autre part, s’il s’avère après les premiers essais que le nombre d’animaux par groupe peut être réduit, nous adapterons les groupes suivants.

Raffinement

Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet. D'autre part, nous appliquerons de manière stricte les points limites définis spécifiquement pour le projet.

Choix des espèces

Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui reproduit le pathologie étudiée (maladie de Willebrand 2B). Ce modèle a d’ores et déjà montré sa pertinence en tant que modèle de la pathologie humaine. Pour ce qui concerne les tests de saignement, des souris adultes jeunes (8 semaines environ) des deux sexes seront utilisées. En ce qui concerne le groupe de souris qui sera évalué dans le modèle de thrombose, des souris des deux sexes seront utilisées à un âge entre 3 et 4 semaines. Le modèle de thrombose ne peut être réalisé que sur des souris très jeunes car sinon le tissu adipeux autour des vaisseaux intestinaux empêche leur bonne visualisation sous microscope.

1 376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent des prises de sang sur animal vigile et des injections, 880 sont placées en cage métabolique jusqu'à 18 heures dont une période sans eau, et d'autres portent un modèle de drépanocytose provoquant des crises douloureuses. Le porteur indique anesthésier les gestes les plus invasifs et surveiller la douleur par une grille de score. Il affirme que la souris est "le seul modèle" permettant d'étudier à la fois les atteintes rénales et musculaires de la maladie.

Objectifs

La drépanocytose est la maladie génétique du sang la plus fréquente au monde. Cette maladie se manifeste par une déformation et une rigidification des globules rouges. Ces globules rouges déformés sont plus fragiles et sont la source de l’anémie hémolytique décrite chez les patients drépanocytaires. La forme en faucille de ces globules rouges favorise leur agglomération, l’interruption du flux sanguin et par conséquent, des crises vaso-occlusives, très douloureuses, au niveau de tous les organes du corps. La répétition de ces ischémies (un arrêt ou insuffisance de la circulation sanguine dans une partie du corps ou un organe, qui prive les cellules d'apport d'oxygène) induit des lésions sévères, notamment des organes les plus vascularisés et donc une réduction de la qualité et de l’espérance de vie des patients.Notre projet se concentre sur deux complications chroniques majeures de la drépanocytose : la maladie rénale et la fonte musculaire en s'intéressant aussi le point sur d’autres atteintes tel que la cardiomyopathie et la rétinopathie associée a la drépanocytose. Ainsi, les objectifs de notre projet sont de comprendre : 1- comment telles altérations multi-organes se produisent 2- si le muscle altéré peut avoir des effets déletèrent sur le rein ou vice-versa 3- comment pourrait on les prévenir ou les traiter

Bénéfices attendus

Cette étude pourra révéler une voie commune jusqu'alors non reconnue affectant à la fois le rein et les muscles dans la drépanocytose et éventuellement d'autres maladies hématologiques hypoxémiques. Elle pourra apporter une stratégie thérapeutique puissante pour la progression de la maladie rénale chronique et la fonte musculaire chez les patients atteints de cette maladie. En outre, l'exploration d'une interférence potentielle entre le néphropathie et la sarcopénie associées à la drépanocytose ouvre un nouveau domaine de recherche.

Procédures

Tous les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang de 20 microlitres a sur souris vigile maintenue en contention manuelle. 160 souris subiront une injection deux fois par semaine pour six semaines sur souris vigile. 160 souris subiront une injection pour 5 jours consécutifs sur souris vigile. 160 souris subiront une injections de la patte postérieure aprés anésthésie gazeuse. 160 souris subiront deux injections séparées de 56 jours, de la patte, postérieure aprés anésthésie à l'isoflurane. 80 souris subiront une injection aprés anésthésie gazeuse. Tout les souris (1376 souris) subiront un prélèvement de sang aprés anésthésie à l'isoflurane et avant mis à mort. 880 souris seront mises en cages metaboliques, pour deux fois, séparées de 24 heures. La premier confinement en cages metaboliques sera pour 18 heures, le second sera pour 6 heures. 880 souris subiront deux mesures de pressions de 20 minutes non ivasives sur souris vigiles sur deux jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant 20 minutes pour les mesures de pressions. Elles subiront aussi le stress d'être isolées pendant 6 heures allant jusqu'à 18 heures en cages metaboliques. Elles resteront sans eau pour 18 heures lors du confinement en cage metabolique. Elles subiront une douleur minime lors de certains prélèvements et injections. Cependant, lors des procédures plus invasives les souris seront anésthésiées à l'isoflurane et analgésiées.

Devenir

Etant donné que les organes de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

Le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concernent l'étude des maladies glomérulaires et musculaire car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Les résultats seront analysés par des tests statistiques adaptés à la taille de nos échantillons. Pour chaque animal, un maximum d'organes et de prélèvement biologique sera fait afin de ne pas avoir à refaire des experiences sur de nouveaux animaux.

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises : 1) Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bihebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie. 3)Les procédures invasives tel que certaines injections seront réalisées aussi sous anesthésie et les souris recevront un traitement analgésique qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel.

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie rénale et musculo-squelettique de mammifère et d'utiliser la recombinaison homologue ou l'excision allélique dirigée afin de connaitre la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. A partir de 4 semaines, une fois que le sevrage physiologique est effectif et jusqu'à 6 mois pour ne pas observer une potentielle fibrose rénale liée au vieillissement. En effet, l'âge est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop âgées induirait une plus grande variabilité de nos résultats expérimentaux.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.

1 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose du foie par des injections deux fois par semaine pendant quatre à douze semaines ou par un régime gras, puis certaines subissent sous anesthésie une coupure de la queue ou une lésion du foie au laser après ouverture du ventre pour provoquer un saignement observé au microscope. Le porteur étudie le rôle de la coagulation dans la cirrhose et les saignements associés, sur des mécanismes qu'il décrit comme mal connus. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

La fibrose hépatique est une cicatrisation anormale du foie en réponse à des agressions répétées (infection par un virus, consommation excessive d'alcool, consommation excessive d'aliments gras ou sucrés (maladie du foie gras). La maladie du foie gras est la première cause de maladie du foie dans le monde, affectant 25% de la population mondiale, et est caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie puis l'apparition d'une inflammation et à terme d'une fibrose. La fibrose du foie peut progresser vers la cirrhose qui est une maladie grave responsable de 150000 décès par an en Europe. Les mécanismes de la fibrose du foie sont incomplètement compris et il n'existe à ce jour aucun traitement approuvé. La coagulation est une cascade de réaction aboutissant à la formation d'un caillot qui va permettre d’arrêter un saignement. Le foie joue un rôle central dans la coagulation car il synthétise les facteurs qui servent à coaguler. En cas de cirrhose, la production de ces facteurs est perturbée ce qui peut favoriser les saignements, notamment après une biopsie. Mieux comprendre les mécanismes qui perturbent la coagulation au cours de la cirrhose permettrait de mieux prévenir les saignements. De plus, la coagulation favorise également le développement de la fibrose du foie, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous étudions une protéine enzymatique qui inhibe la coagulation et favorise donc les saignements. Elle est produite par les plaquettes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, et sa concentration est augmentée dans le sang des patients qui ont une cirrhose. Cette protéine enzymatique protége du développement de la fibrose pulmonaire mais son rôle dans le développement de la fibrose du foie est inconnu. Les deux objectifs du projet sont de comprendre le rôle de cette protéine enzymatique dans le développement de la fibrose du foie (en général et dans la maladie du foie gras) et son rôle dans la coagulation et les saignements survenant au cours de la cirrhose.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont nombreux 1) En déterminant les mécanismes de développement de la cirrhose et fibrose du foie, nous allons potentiellement trouver de nouvelles pistes pour développer des traitements de ces maladies chez les personnes avec un foie gras mais aussi chez les personnes qui ont de la fibrose liée à un virus ou à une consommation excessive d'alcool. 2) En étudiant la coagulation de la cirrhose, nous comprendrons mieux les mécanismes complexes qui entrainent une coagulation anormale chez les patients atteints de cirrhose. Nous allons voir si bloquer une protéine de la coagulation permet de diminuer les saignements sur des modèles de souris. Si c'est efficace, cela pourrait devenir un traitement préventif des saignements qui surviennent chez les patients qui ont une cirrhose après une biopsie et cela éviterait d'avoir à transfuser les patients dans un contexte actuel où on manque de poches de sang.

Procédures

La demande d’autorisation de projet concerne les procédures suivantes Sur animal vigile : - Injections dans le ventre d'un produit deux fois par semaines pendant 4 à 12 semaines pour développer de la fibrose au niveau du foie - Mise sous régime riche en matières grasses pour créer une maladie du foie gras pendant 4 à 12 semaines. Sur animal anesthésié: - Injection dans une veine de la queue d’un anticorps (molécule qui bloque la coagulation) pour stopper les saignements sous anesthésie - Coupure de la queue pour induire un saignement sous anesthésie - Lésion avec un laser du foie après ouverture du ventre pour induire un saignement et observation des cellules qui aident à arrêter le saignement à l'aide d'un microscope sur la souris encore vivante sous anesthésie - Prélèvement de sang dans une veine du ventre puis euthanasie sous anesthésie et prélèvements des organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont - Une perte de poids initiale puis une stabilisation du poids chez les souris traitées pour induire une cirrhose - Pour les souris qui ont un régime riche en graisses, une prise de poids modérée est attendue - Des douleurs temporaires au moment de l'injection de produit dans le ventre - Possible stress les premiers jours des injections dans le ventre lié à la nouveauté de la procédure qui devrait s’estomper avec le temps - Les procédures pouvant induire des douleurs ou un stress telles que le prélèvement dans la veine du ventre, l’injection de produit dans la queue, la coupure de la queue pour induire un saignement ou les lésions du foie induites par un laser - La fibrose du foie et la cirrhose sont des maladies indolores qui n'entraînent pas d'altération du bien être animal.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées à l'issue des procédures sous anesthésie car elles ne pourront pas être maintenues en vie (car on aura prélevé plusieurs organes vitaux ou prélevé une trop grande quantité de sang).

Remplacement

La coagulation et le développement de la fibrose du foie étant des processus complexes, il n’est actuellement pas possible de remplacer totalement le modèle animal par des modèles informatiques ou des modèles de cellules en laboratoire. Néanmoins, pour limiter l'utilisation de trop de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier la coagulation sur du sang prélevé sur des malades quand cela est possible.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous incluerons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les deux groupes. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles (souris qui n'ont pas de traitement toxique pour le foie) pour plusieurs procédures. De plus, nos souris contrôles seront issues des accouplements faits pour générer les souris des différentes lignées.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien être des animaux: surveillance quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (batonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée.

Choix des espèces

Le modèle murin permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l'étude. Enfin, la fibrose du foie et la cirrhose étant des maladies multifactorielles, la proximité génétique de la souris vis à vis de l’Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 8 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l'âge auquel apparaît cette maladie chez l'homme).