Système cardiaque

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit un régime gras pendant seize semaines pour induire obésité et diabète, avec échographies, seize mesures de pression artérielle, prélèvements sanguins et douze injections de vésicules, avant que toutes soient tuées pour prélever les tissus. Le porteur indique que le régime provoque prise de poids, diabète de type 2 et mobilité réduite chez 240 souris. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun moyen ne peut remplacer une étude portant sur l'organisme entier.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un travail expérimental plus global ayant débuté́ en 2008 par l’étude du rôle des vésicules libérées par les cellules dans le développement du syndrome métabolique. Même si les résultats acquis montrent un rôle prépondérant des vésicules dans cette pathologie, les mécanismes par lesquels ces vésicules peuvent favoriser la formation de la plaque d’athérome et le développement de complications cardiovasculaires lors de l’obésité ne sont pas complétement connus. Cette expérimentation animale sur le modèle de souris knock-out pour plusieurs protéines jouant un rôle dans l’inflammation et le diabète nous permettra de valider les effets délétères des vésicules et d’obtenir des données en vue d’utiliser les vésicules comme des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que d’être proposées comme nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Démontrer l'implication des vésicules extracellulaires portant des protéines jouant un rôle dans le processus inflammatoire et dans le développement de la plaque d'athérome liée à l'obésité et au diabète. En plus, ces protéines transportées par les vésicules extracellulaires se sont avérés être des biomarqueurs possibles pour la détection précoce et l'évaluation du développement de l'athérosclérose, ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques possibles pour le traitement

Procédures

Cinq interventions : - Régime riche en graisse : 16 semaines - Echographie : 3 mesures (début de protocole, mi-parcours, fin de protocole) - Mesure pression artérielle : 16 mesures, 1 fois par semaine pendant 16 semaines - Prélèvement de sang sur animaux vigiles : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime - Injection de vésicules : 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 4 semaines du protocole)

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2 ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de sang à la base de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 240 souris sur 480, qui seront nourris avec le régime riche en graisse durant 16 semaines. L’effet 4 concernera l’ensemble des souris.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et que seule l’expérimentation animale permet un suivi complet de la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, des mâles et des femelles seront utilisés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon complémentaire et hebdomadaire en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses). Comme le régime riche en graisse peut induire un diabète de type 2, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de détecter toutes pathologies liées au diabète. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores et la définition de points limites de Morton et Griffiths. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. En effet, les animaux sont issus d’un élevage, et il peut avoir un seul mâle par portée, rendant impossible de mettre des mâles de différentes portées ensemble afin d’éviter des conflits entre eux qui peuvent s’accompagner de blessures. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes en cartons pour se cacher et faire des nids. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. L'absence de ces protéines protège contre la réponse inflammatoire et le diabète, donc les phénotypes ne sont pas dommageables. L'absence d'une troisème protéine induit une prédisposition au développement de la plaque d’athérome, le modèle est le plus utilisé pour étudier l’athérosclérose. Les souris db/db présentent une mutation spontanée du récepteur à la leptine (modèle utiliser pour étudier le diabète et l'obésité). Avec un régime de 16 semaines la plaque est dans son état précoce.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser l'implication des protéines inflmmatoires dans le processus de développement de l'athérosclérose liée à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement l’implication des vésicules extracellulaires portant ces protéines dans le processus inflammatoire qui précède le développement de la plaque d'athérome. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection de vecteur de thérapie génique dans une veine, puis des prises de sang chaque semaine pendant six mois et des examens cardiaques mensuels, pour vérifier si ce traitement d'une maladie du foie provoque des effets sur le cœur. Le porteur indique ne pas attendre d'effet indésirable mais surveiller infarctus et troubles du rythme éventuels. Il affirme que tester la fonction cardiaque impose un animal vivant.

Objectifs

Notre projet a pour but de développer des solutions thérapeutiques pour patients atteints de glycogénose de type 1A (GSD1A), due à des mutations de la sous-unité catalytique de la glucose-6-phosphate (G6pc). La G6pc permet de fournir de l’énergie à tout l’organisme (sous forme de glucose) et de maintenir la glycémie lors d’un jeûne. La technologie de transfert de gène consiste à introduire un gène médicament dans les cellules malades cibles via un vecteur. Il existe plusieurs types de vecteurs, dont les vecteurs dérivés des virus adéno-associés (AAV) qui sont aujourd’hui les plus utilisés et les plus prometteurs pour cibler le foie. Plusieurs équipes dont la nôtre ont déjà démontré l’efficacité de ce type de stratégie dans un modèle murin de la GSD1A (en cours de publication). Dans ce projet, nous voulons explorer l’expression de la G6pc dans le cœur et les conséquences sur la fonction cardiaque. En effet, l’AAV apporte la protéine G6pc dans le cœur, alors qu’il n’y est pas exprimé naturellement. L’expression cardiaque de la G6pc pourrait induire une surcharge en glucose. Or, il est connu que la surcharge en glucose conduit à une toxicité responsable de cardiomyopathies diabétiques. Afin de poursuivre le développement de notre produit, le projet présenté ici a pour but d’évaluer l’expression d’un ensemble de biomarqueurs tissulaires et fonctionnels permettant de détecter tous les signes de complications cardiaques. Nous utiliserons des rats, mâles et femelles, de 4 à 6 semaines.

Bénéfices attendus

La GSD1A touche 1 naissance sur 100 000 chaque année. Il n’y a à ce jour aucun traitement curatif sur le marché. Notre but est de développer une thérapie génique efficace pour traiter ces patients. Dans nos études chez le modèle murin de la GSD1A, nous avons mis en évidence une correction de la glycémie (les hypoglycémies sont les principales causes de décès chez les patients) et une diminution de la fréquence d’apparition des tumeurs grâce à notre vecteur AAV. Afin de poursuivre le développement de notre produit vers la clinique, nous devons déterminer s’il peut entraîner des effets indésirables dans le cœur. En effet, l’AAV est capable d’apporter la G6pc dans le cœur, or, cette protéine n’y est pas exprimée naturellement. Ces études nous permettront donc de déterminer si nos vecteurs AAV conduisent à l’apparition d’effets cardiaques indésirables.

Procédures

Tous les animaux seront injectés sous anesthésie gazeuse avec des vecteurs AAV au niveau de la veine caudale. Tous les animaux seront prélevés en sang, sous anesthésie gazeuse ou sur animal vigile selon le site de prélèvement, toutes les semaines pendant 6 mois. Les sites de prélèvements seront alternés (veine caudale, veine sous-mandibulaire droite ou gauche et veine rétro-orbitale droite ou gauche sous anesthésie). L’activité cardiaque sera mesurée mensuellement par électrocardiogramme sur animal vigile, et par échocardiogramme sur animal endormi par anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Lors nos études précédentes chez la souris, nous n’avons pas observé d’effet indésirable, cardiaque ou autre, ni de surmortalité chez les groupes traités par AAV. Nous ne nous attendons pas à une mortalité supérieure chez les rats traités par AAV. Néanmoins, ces complications cardiaques, si elles survenaient, pourraient être de trois types : infarctus (fibrose cardiaque), cardiomyopathie (hypertrophique ou dilatée) ou troubles primaires du rythme.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’utilisation d’animaux n’est pas remplaçable pour réaliser cette étude car (1) il faut tester la fonction cardiaque sur animal vivant ; (2) il est nécessaire de tester nos produits sur un corps entier pour observer les effets simultanés sur le foie et sur le cœur ; et (3) il faut obtenir des fluides (sang, urine) pour mesurer les biomarqueurs.

Réduction

Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat significatif nous permettant de répondre aux problématiques posée. Ce nombre minimum est respectée pour chaque procédure.

Raffinement

La taille des cages devrait permettre aux rats de démontrer des comportements importants pour leur qualité de vie : ils seront hébergés par 2 ou 3 individus (selon leur poids) de même âge, favorisant les comportements normaux de l’espèce, comme le jeu et les relations sociales (Pellis et coll., 2010). L’enrichissement des cages avec des éléments tels que des aménagements pour favoriser l’activité physique (structures pour grimper) ou se cacher / éviter le contact (tubes, séparateur), des matières pour permettre de creuser, des objets à mâcher (blocs en bois) etc… devraient limiter le stress des animaux, les rendre moins craintifs et moins agressifs et favoriser leur bien-être général (Botelho et coll., 2007; Patterson-Kane et coll., 1999). Dès leur arrivée en zone d'expérimentation (2 semaines avant le début des traitements), les rats seront manipulés et contentionnés au moins 3 fois avant le début de la procédure, afin d’être familiarisés aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux. Le rat étant très sensible au stress, cette habituation est importante. Ceci devrait réduire stress et angoisse. Avant chaque intervention, l’identification de l’animal doit être vérifiée et son état général observé avec attention. Les informations pertinentes pourront alors être notifiées sur une fiche d'évaluation. En effet, l'évaluation du comportement de l'animal et de ses signes cliniques doit être réalisée de manière minutieuse afin de détecter tout changement ou signes d'inconfort de stress ou de douleur. Après intervention, une surveillance minutieuse sera mise en place pour garantir que l’animal récupère pleinement de l’acte réalisé.

Choix des espèces

Les rats de type sauvage ont été choisis comme animaux modèles car ce modèle est plus sensible aux éventuels effets secondaires cardiaques que les modèles de souris (meilleure entrée du vecteur dans le cœur de rats que dans le cœur de souris). De plus, nous regardons l’expression supraphysiologique d’une protéine et ses conséquences au niveau cardiaque, nous n’avons donc pas besoin de rats modèles de la pathologie. Nous allons utiliser de jeunes rats et des rats adultes pour cette étude (4 et 6 semaines) Ce choix est basé sur trois considérations : 1) Nous souhaitons traiter de jeûnes adultes et des adultes lors des essais cliniques, nous voulons utiliser une population de rats « mimant » cet âge. 2) L’utilisation de rats de 4 ou 6 semaines nous permettra par comparaison d’évaluer l’effet de notre produit sur un cœur en développement. 3) Le foie est un tissu en forte croissance lors des premières semaines de vie chez le rongeur, entraînant ainsi une dilution du génome de l’AAV dans les hépatocytes ce qui a pour conséquence de réduire son efficacité au cours du temps, nous souhaitons donc minimiser cet effet en utilisant des rats dont le foie est suffisamment développé pour que la prolifération soit modérée. Selon les études précédentes réalisées au sein du laboratoire, des animaux de plus de 4 semaines peuvent être inclus.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles génétiquement prédisposées à l'athérosclérose sont accouplées, reçoivent un traitement pendant la gestation et subissent des prélèvements de sang répétés, pour étudier l'effet d'un traitement prénatal sur l'athérosclérose de leur descendance. Le porteur affirme que la molécule employée n'a montré aucun effet indésirable ni sur les mères ni sur les petits dans ses essais antérieurs. Les femelles sont tuées au jour 18,5 de gestation pour prélever les placentas et les fœtus.

Objectifs

L’athérosclérose est la première cause de mortalité dans le monde. Les facteurs de risque associés à l’athérosclérose sont bien connus, le principal étant l’hypercholestérolémie. Cependant, ces facteurs n’expliquent pas toujours les variations inter-individuelles. Selon l’hypothèse de Barker formulée en 1993, des facteurs environnementaux agissant durant la période fœtale et périnatale peuvent induire des altérations prédisposant au développement de maladies cardiovasculaires plus tard dans la vie adulte. Des études chez l’homme et l’animal montrent que la présence d’une hypercholestérolémie chez la mère pendant la grossesse/gestation pourrait avoir un impact sur le développement de l’athérosclérose chez la descendance. Pendant la grossesse, le cholestérol peut augmenter jusqu’à 1,5 fois. Cette augmentation, bien que nécessaire au développement du fœtus, pourrait induire une empreinte expliquant le développement précoce de l’athérosclérose chez la descendance. Cette hypercholestérolémie gestationnelle, génère également un stress oxydant qui peut s’avérer délétère pour l’homéostasie vasculaire. Nous avons montré que la souris ApoE-/-, génétiquement programmée pour développer spontanément de l’athérosclérose, en développe moins quand elle est née de mère normocholestérolémique . Dans une étude en cours, nous avons montré qu’un traitement, avec un hypocholestérolémiant et/ou un antioxydant, pendant la gestation diminue le développement de l’athérosclérose. (Résultats en cours de rédaction pour publication) Étant donné que les mères sont traitées durant leur gestation ou gestation et lactation alors que les descendants des différents groupes étaient maintenus sous régime contrôle pendant 25 semaines, notre hypothèse que ces traitements périnataux sont responsables d’une modification de l’expression de transporteurs et d’enzymes impliqués dans la fonction placentaire aboutissant à la protection des descendants de mères traitées avec ces molécules. L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’effet d’un traitement périnatal avec un hypocholestérolémiant) et/ou un antioxydant sur la fonction placentaire afin d’expliquer la protection contre la progression de l’athérosclérose chez la descendance adulte de souris ApoE-/- traitées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle du placenta dans le développement de l’athérosclérose de la descendance en cas d’hypercholestérolémie génétique. Les études ont montré les effets délétères du stress oxydant, entrainé par une hypercholestérolémie, sur le développement placentaire et par conséquent fœtal dès l’étape d’implantation. L’étude histologique du placenta envisagée permettra de visualiser la surface occupée ainsi que la vascularisation des différentes zones de placentas de mères recevant ou pas le traitement. Nous nous servirons de l’analyse des résultats issus à la fin de cette étude pour expliquer l’effet protecteur des 2 traitements en périnatal contre le développement de l’athérosclérose chez la descendance adulte à 25 semaines d’âge chez la souris ApoE-/- hypercholesterolémiques que nous avons récemment observé.

Procédures

Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,

Impact sur les animaux

La cholestyramine est un médicament prescrit pour l’Homme dans le cas d’hypercholestérolémie. Chez la souris, les études n’ont montré aucun effet tératogène de la molécule. Nous avons utilisé une dose similaire de la molécule (3% de la masse du régime) pendant des périodes de gestation et nous n’avons noté aucun effet indésirable : ni perte de poids, ni diarrhée chez les mères. Aucun effet sur le développement des descendants est noté. La dose de supplémentation en vitamine E (2200 UI/kg de régime) est conforme aux doses quotidiennes recommandées. Cette dose était déjà utilisée sans effets indésirables sur les mères ni les descendants. Les prélèvements chez les femelles gestantes sont réalisés au niveau de la queue et sous anesthésie locale (lidocaïne 2% sous forme de pommade) en utilisant des microvettes à capillaire pour assurer la rapidité et l’efficacité de ces prélèvements. Les femelles gestantes subiront une douleur légère associée aux prises de sang.

Devenir

Dans la littérature, les différences placentaires et fœtales entre la première portée et les portées suivantes (deuxième portée, troisième portée…) sont bien décrites chez la souris ainsi que chez d’autres espèces. Comme nous avons choisi de s’intéresser qu’à la première portée, les femelles seront mises à mort au jour 18.5 de gestation afin de collecter les placentas pour des analyses histologiques et moléculaires. Les foetus au jour 18.5 de gestation afin de collecter le foie et faire des analyses du métabolisme de cholestérol.

Remplacement

Seule une étude in vivo, c’est-à-dire incluant la complexité des mécanismes physiologiques lors de la gestation mis en jeu lors du développement de maladies cardiovasculaires en période périnatale, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum (80 femelles) pour permettre une bonne évaluation statistique d’une intervention nutritionnelle entre différents groupes indépendants sur le développement de l’athérosclérose (test ANOVA et Kruskal-Wallis)

Raffinement

Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée. Les cages seront enrichies (frisottis), les rares prélèvements de sang seront effectués au niveau de la queue ou de la veine submandibulaire sous anesthésie à l’isoflurane des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter toute souffrance. Dans le cas d’une perte de poids, d’une modification de la prise alimentaire, de l’apparence générale ou du comportement, la surveillance sera accentuée et les souris seront soignées et/ou placées sous antidouleurs (buprénorphine à 0.05 mg/kg en sous cutanée pour le palier 1, 0,1mg/kg pour le palier 2 et euthanasie en présence de 3 signes notables) afin de minimiser toute souffrance, détresse ou inconfort. Les prélèvements de sang seront stoppés momentanément jusqu’au rétablissement de l’animal. Enfin, si l’animal ne parvenait pas à se rétablir, la mise à mort sera réalisée (annexe points limites).

Choix des espèces

La souris est un modèle adéquat car c’est une espèce docile et facile à manipuler possédant une période de gestation courte. Première lignée murine à avoir été séquencée, la souris C57BL/6 offre une documentation importante, facilitant les études génétiques. C’est également une lignée stable et c’est la souche la plus utilisée en ce qui concerne l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Le modèle ApoE-/- est hypercholestérolémique, présente un profil lipidique proche de celui de l’homme et développe spontanément des plaques d’athérosclérose, similaires à celles de l’humain. Cela en fait un modèle de choix pour l’étude de l’athérosclérose. L’efficacité des traitements envisagés a été déjà démontré dans ce modèle de souris. Des souris ApoE-/- femelles âgées de 8 semaines environ seront utilisés pour la reproduction pour les différentes conditions étudiées. Les premiers prélèvements sanguins seront effectués au démarrage du protocole puis pendant la gestation pour suivre la cholestérolémie des mères: - 1 prélèvement de sang (50 μL,

32 souris axéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées sans microbiote, elles reçoivent un unique gavage de flore intestinale de souris, puis sont tuées entre six heures et trois jours après pour analyse des tissus. Le porteur décrit une intervention réduite, une sonde souple maniée par du personnel expérimenté, et n'attend pas de réaction inflammatoire. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité d'étudier hors de l'organisme vivant les effets du microbiote sur le métabolisme.

Objectifs

Les maladies cardio-métaboliques (CMD) sont aujourd'hui la principale cause de maladie et de décès dans le monde. Elles causent non seulement des souffrances considérables aux millions de personnes touchées, mais aussi des coûts considérables pour la société et les systèmes de santé. Le terme CMD englobe différentes composantes telles que l'athérosclérose, la résistance à l'insuline / diabète sucré de type 2, la dyslipidémie et la stéatose hépatique / stéatohépatite non alcoolique. Cependant, il n'existe toujours pas de traitement efficace. Le microbiote intestinal, c'est-à-dire toutes les bactéries présentes dans notre intestin, est de plus en plus reconnu comme étant un facteur important dans de nombreuses pathologies, y compris les CMD. Cependant, les connaissances détaillées des mécanismes reliant le microbiote intestinal aux CMD font encore largement défaut. En particulier, on sait encore très mal comment, en conditions physiologiques, le microbiote régule le métabolisme et comment les organismes hôtes réagissent au contact du microbiote. Le projet actuel vise à étudier ce phénomène. L’étude de la dynamique d’adaptation du microbiote à l’hôte permettra de savoir quelles populations bactériennes sont impliquées dans la régulation du métabolisme. L’analyse des fluides et tissus biologiques par spectrométrie de masse donnera une image quasi-exhaustive des métabolites produits ou modifiés par le microbiote. La caractérisation approfondie du métabolisme des lipides et des voies inflammatoires sera particulièrement pertinente pour les CMD. En effet, le métabolisme des lipides et l’inflammation sont les deux voies menant à la maladie athérosclérotique, à l’épuisement des cellules pancréatiques beta (diabète de type 2) et à la stéatose hépatique non alcoolique. Les connaissances issues de ce projet permettront par la suite de concevoir des expériences ciblant des domaines spécifiques des CMD, en utilisant des modèles animaux ad hoc (ex : régime alimentaire riche en graisse pour étudier la stéatose hépatique).

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, les bénéfices attendus sont un gain et un raffinement des connaissances fondamentales sur les interactions entre le microbiote intestinal et son hôte dans le domaine des régulations métaboliques. Il s’agit donc ici de contribuer à faire progresser les connaissances génériques sur la physiologie de l’organisme. Dans un second temps, nous escomptons qu’une meilleure compréhension des interactions mutuelles entre le microbiote et l'hôte aidera à mieux comprendre la physiopathologie des CMD et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Quatre groupes sur 7, soit 32 souris sur 56, seront soumis à un unique gavage en début d'expérimentation, avec une dilution de microbiote intestinal de souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont réduites. En effet, la seule intervention invasive sera une inoculation oro-gastrique avec 200 µL de dilution de microbiote intestinal. Ce geste technique sera effectué à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Le microbiote inoculé étant issu de souris SPF, il sera dépourvu de micro-organismes pathogènes, de telle sorte qu’une réaction inflammatoire systémique suite à cette inoculation est très improbable. Les souris seront mises à mort entre 6 heures et 3 jours après l’inoculation, ce qui exclut toute nuisance à long terme.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour collecte et analyse de tissus.

Remplacement

L'évaluation des effets du microbiote intestinal sur le métabolisme de l'hôte n'est possible que chez les animaux vivants, du fait notamment des interactions complexes entre différents organes qui déterminent les réponses métaboliques globales.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour estimer le nombre minimal d’animaux requis pour avoir des résultats exploitables. Ce nombre est de 8 par groupe. Le protocole comporte 7 groupes, ce qui aboutit à un total de 56 animaux.

Raffinement

Il n’y a pas de souffrance liée à l’hébergement en isolateur. Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 4 individus par cage, sur une litière de copeaux. Nourriture et eau stériles seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, bûchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher. Les animaux seront visités une fois par jour avant la procédure d’inoculation oro-gastrique, puis 2 fois par jour pendant les 3 jours qui suivront cette procédure. L’inoculation oro-gastrique sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. A la fin de l’expérience, soit au plus 3 jours après le gavage, les souris seront anesthésiées profondément avec de l'isoflurane avant d’être mises à mort par dislocation cervicale. Ce geste sera effectué par le personnel expérimenté de l’animalerie.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal et les maladies cardio-métaboliques, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 8-10 semaines.