Système cardiaque
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Réponse moléculaire de l’endothélium vasculaire à l’irradiation chez la souris : intérêt pour la prédiction du risque de toxicité pulmonaire après une irradiation localisée du thorax à forte dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Uniquement des mâles, elles reçoivent une irradiation localisée du thorax de 17 à 20 grays sous anesthésie, avec un risque de détresse respiratoire voire de mort aux doses les plus fortes, avant d'être tuées pour prélever les poumons. Le porteur étudie la réponse des cellules des vaisseaux à l'irradiation pour améliorer un modèle de prédiction de la toxicité pulmonaire de la radiothérapie. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe, tout en présentant ce projet comme une étape vers un modèle in vitro censé, à terme, "remplacer l'expérimentation animale".
Objectifs
L’irradiation localisée à forte dose engendre des lésions tissulaires d’origine plurifactorielle et liées à l’altération de nombreux types cellulaires. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de développer des moyens de limiter ces toxicités tout en conservant/augmentant le contrôle tumoral. Avec les nouvelles pratiques avec des débits de doses plus importants et des faisceaux de particules de plus grandes énergies, il est essentiel de comprendre les mécanismes conduisant aux lésions tissulaires, limiter les toxicités et développer des moyens de prédire la toxicité tissulaire. Un des programmes a pour objectif de concevoir des outils de prédiction des risques de complications liés aux nouvelles pratiques de radiothérapies, en se basant sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro. Nous nous appuyerons sur les mesures de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales in vitro : expression de gènes, sénescence ou cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. Jusqu’à présent, la difficulté d’isoler les cellules endothéliales à partir d’organes rendait difficile l’étude de leur réponse moléculaire. Depuis quelques années, les études sur cellules uniques sont devenues réalisables. Il est possible de mesurer l’expression de milliers de gènes dans des cellules uniques par des approches de séquençage de l’ARN à haut débit et de cytométrie en flux pour évaluer simultanément l’expression des protéines sur des cellules uniques. La phase 1 a été réalisée dans un projet précédent et a permis de choisir le poumon. Dans la phase 2 du projet, présentée ici, il s’agit d’irradier le poumon à différentes énergies et différents débits de doses afin d’étudier la réponse des cellules endothéliales et immunitaires. Ces expériences nous permettront de comprendre comment les cellules endothéliales répondent à l’irradiation in vivo au niveau moléculaire et comment elles interagissent avec les cellules immunitaires, de corréler les niveaux d’expression de gènes et de protéines des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in situ à ceux des cellules endothéliales cultivées in vitro, et d’étudier la toxicité de ces modalités d’irradiation chez la souris.
Bénéfices attendus
L’objectif global de ce projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues des poumons irradiés in vivo chez la souris afin d’améliorer notre modèle de prédiction du risque de séquelles tardives radio-induites dues à la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est d’une part une meilleure compréhension de la réponse des cellules endothéliales in vivo, et d’autre part un renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles sur des cellules en culture en comparant les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle aura pour but d’évaluer les risques in vitro sans recourir à l’expérimentation animale. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : (i) par une meilleure compréhension de la réponse à l’irradiation et à différentes modalités d’irradiation des cellules endothéliales in vivo, nous pourrons mieux comprendre comment les séquelles radio-induites sont initiées et comment elles se développent ; (ii) par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous souhaitons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie volatile (isoflurane) (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément par anesthésie par volatile (isoflurane) afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Certains animaux seront imagés au micro-CT sous anesthésie volatile (isoflurane) juste avant l’euthanasie (durée max de 10 minutes). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation du thorax à 17 Gy est assez bien caractérisé dans notre laboratoire. Cependant, les configurations d’irradiation sont différentes de celles utilisées dans les études précédentes (énergies des faisceaux, débit de dose, champ d’irradiation) ce qui nécessite des tests préliminaires à différentes doses (17, 18, 19 et 20 Gy). Les doses les plus fortes pourraient occasionner des douleurs et l’euthanasie ou la mort prématurée d’une partie des animaux, c’est pourquoi la première étape du projet s’attachera à définir la dose d’irradiation suffisante pour induire une fibrose pulmonaire à long terme sans entrainer la mort des animaux. Aux plus fortes doses, les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder, c’est pourquoi nous avons prévu une première étape qui permettra de déterminer la dose qui permet de générer des lésions tardives pulmonaires de type fibrose sans engendrer de la mortalité. Les animaux devront être euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, des groupes de 10 à 12 animaux sont nécessaires. Pour les analyses moléculaires, des groupes de 4 à 6 animaux sont suffisants, car les tests statistiques sont réalisés sur des milliers de cellules par échantillon, ce qui augmente significativement la puissance statistique.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). Nous utiliserons des souris mâles afin d’avoir des animaux de poids suffisamment important (animaux de 20-25 gr à 10-12 semaines). Nous avons fait le choix scientifique de ne travailler que sur des mâles dans un premier temps, car nous avons au laboratoire un recul conséquent de ce modèle sur des souris de sexe mâle. Nous envisageons un futur projet sur des femelles pour étudier les conséquences de la dose d’irradiation choisie à une modalité d’irradiation. La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour ce modèle.
Mesure de l’efficacité de l’emicizumab dans des modèles murins d’hémophilie A et de maladie de Willebrand
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées pour l'essentiel sous anesthésie sans réveil, la seule douleur légère attendue survenant au réveil d'une injection faite 24 heures avant. Modèles d'hémophilie A et de maladie de Willebrand, elles reçoivent l'emicizumab puis une piqûre de la veine de la cuisse sous anesthésie pour induire un saignement mesuré pendant trente minutes, avant d'être tuées sans réveil. Le porteur veut comparer l'efficacité de cet anticorps dans les deux maladies et renforcer l'idée d'un essai clinique dans la maladie de Willebrand. Il affirme que les tests sans animaux ne reproduisent pas l'intégralité du processus de coagulation.
Objectifs
La maladie hémorragique la plus connue est l'hémophilie A, une pathologie qui affecte principalement les hommes (1 naissance de garçons sur 5000 environ). Dans cette pathologie, une des protéines importantes de la coagulation, le facteur VIII, est absente. Une autre maladie hémorragique génétique moins connue mais pourtant plus fréquente est la maladie de Willebrand qui affecte jusqu’à 1% de la population dans sa forme modérée (hommes et femmes indifféremment). Dans ce cas, c’est une autre protéine de la coagulation qui est absente, le facteur Willebrand. Les saignements observés sont différents dans ces deux pathologies avec des hémorragies plutôt au niveau des muscles et des articulations dans le cas de l’hémophilie et plutôt au niveau des muqueuses (sphère ORL ou gynécologique) dans le cas de la maladie de Willebrand. Les deux protéines impliquées dans ces deux maladies, le facteur VIII et le facteur Willebrand sont en fait liées l’une à l’autre dans le sang et circulent sous forme d’un complexe. Récemment un anticorps thérapeutique appelé emicizumab a été développé pour remplacer le facteur VIII chez les patients hémophiles. Et la question se pose de son efficacité dans la maladie de Willebrand. Notre projet va consister à tester et comparer l’efficacité de l’emicizumab dans des modèles murins d’hémophilie A et de maladie de Willebrand grâce à un modèle de saignement spécialement mis au point pour ce projet.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude permettront 1) de mieux appréhender comment l’emicizumab est capable de se substituer au facteur VIII dans le modèle de saignement de la veine saphène et 2) de déterminer si l’emicizumab peut aussi être efficace dans la maladie de Willebrand et pas seulement dans l’hémophilie A. A long terme, le projet contribuera à renforcer l’idée d’un essai clinique dédié à l’utilisation de l’emicizumab dans la maladie de Willebrand. Malgré quelques cas cliniques décrits jusqu’à présent, il est en effet important d’accumuler plus d’évidence dans des modèles pré-cliniques avant de lancer une étude clinique prospective chez l’homme.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure impliquant plusieurs gestes sur une période courte (24H au maximum). Les animaux sous anesthésie/analgésie chimique recevront le médicament à tester 24H avant, et/ou 5 minutes avant d’induire le saignement. Pour induire le saignement, une piqûre sera faite avec une aguille au niveau de la veine de la cuisse sur des souris anesthésiées. Le nombre de caillots sanguins se formant sur une période de 30 minutes sera mesuré, le sang sera recueilli sur une compresse et au terme des 30 minutes, l’animal toujours sous anesthésie sera euthanasié par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une légère douleur transitoire à leur réveil après l’injection qui a lieu 24H avant le saignement. Ensuite l’intégralité de la procédure se fait sous anesthésie/analgésie chimique et sera sans réveil.
Devenir
Du fait des pertes sanguines potentielles lors du test de saignement, les souris seront euthanasiées selon les méthodes réglementaires afin de ne pas souffrir d’hypovolémie (trop grosse perte de sang) à leur réveil.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus.
Réduction
Afin de déterminer le nombre d’animaux approprié pour le projet, nous avons réalisé une analyse de puissance. Les hypothèses sous-jacentes à nos calculs sont basées sur la littérature existante utilisant ce modèle de saignement et prenant en compte sa variabilité. Il est d’ailleurs à noter que ce modèle de saignement de la veine saphène est réputé comme ayant une reproductibilité supérieure aux autres modèles connus, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. S’il s’avère après les premiers essais que 6 animaux/groupe (8 proposés actuellement) est suffisant, nous adapterons les groupes suivants en réduisant notre nombre d’animaux.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux et la procédure aura lieu principalement sous anesthésie et sans réveil. Au cours de ce projet, les opportunités de raffinement seront régulièrement ré-évaluées pour nous assurer de la mise en place rapide de tout nouveau développement technique qui interviendrait pendant la période du projet.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui reproduisent les pathologies étudiées (hémophilie et maladie de Willebrand). Ces modèles ont d’ores et déjà montré leur pertinence en tant que modèles des pathologies humaines. Les souris adultes des deux sexes seront utilisées à partir de 10 semaines d’âge, lorsque la veine saphène est clairement visible.
Chirurgies d’implantation de dispositifs permettant la diffusion de substances ou le suivi de paramètres biologiques chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 2500
5 500 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation, sous la peau ou dans l'abdomen, d'un dispositif diffusant des substances ou mesurant des paramètres biologiques, avec jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, puis sont expédiés vivants aux chercheurs ou tués en cas d'atteinte d'un point limite ou pour contrôle qualité. Le porteur produit ces modèles implantés pour la communauté scientifique et revendique qu'ils réduisent le stress lié aux manipulations répétées. Il prévoit des animaux surnuméraires liés au taux d'échec des chirurgies et admet un "phénotype dommageable" possible selon les besoins du projet.
Objectifs
L’objectif du projet est de permettre la production et la mise à disposition pour la communauté scientifique des modèles de rongeurs équipés de manière permanente (par technique chirurgicale) d’implants sous la peau ou dans l’abdomen permettant soit la libération de substances (comme des médicaments ou des hormones) de manière répétée ou continue, soit la mesure de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension).
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles implantés permet l’administration répétée ou continue de substances d’intérêts (comme des médicaments ou des hormones) ou la mesure et le suivi de paramètres biologiques (comme l’activité cérébrale, musculaire ou cardiaque ou la mesure de la tension) chez l’animal sans la moindre manipulation de la part du chercheur et sans anesthésie. Cela permet donc la réduction très importante du stress provoqué chez l’animal par des manipulations répétées. Ces administrations et mesures pourront permettre à la communauté scientifique d’augmenter leurs connaissances et leurs compréhensions sur différents domaines de recherche (maladies cardiaques, maladies du cerveau, hypertension, cancer, infertilité, …) tout en réduisant les nuisances posssibles sur l’animal.
Procédures
Tous les animaux dans le cadre de ce projet seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’une durée d’une demi-heure à une heure sous anesthésie générale et à la mise en place d’un matériel implanté. Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins (maximum 4 prélèvements sanguins par jour). Les actes de prélèvements et d’injection ont une durée d’une dizaine de secondes à une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux font suite à la mise en place de l’implant suite à la chirurgie : douleur, stress et perte de poids possible chez tous les animaux dus aux contentions, aux procédures chirurgicales, à la présence du matériel implanté. Hébergement individuel possible jusqu’à une semaine.
Devenir
Les animaux sont expédiés chez les scientifiques ou sont mis à mort dans le cas d’atteinte d’un point limite ou pour contrôle qualité du modèle.
Remplacement
La production de modèles implantés a pour objectif de mettre à disposition des modèles rongeurs implantés prêts à l’emploi pour les scientifiques. Les animaux opérés sont intégrés dans des programmes de recherche ou d’études précliniques. Ces programmes visent à étudier les réactions des organes ou du comportement des individus face à une substance ou un stimulus. Cela entraîne de nombreux mécanismes différents et implique de nombreux organes. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels programmes sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires est défini par le scientifique. Il est possible que des animaux surnuméraires doivent être utilisés de par les contraintes du modèle, ce nombre étant basé sur les taux de réussite connus et attendus des modèles. La réduction de ces animaux surnuméraires repose sur : l'expertise de l’équipe chirurgie et la maitrise des procédures, les locaux adaptés, les données historiques, l’observation de l’état clinique de l’animal en péri-opératoire afin d’adapter les traitements post-opératoires et de diminuer la mortalité éventuelle. Le nombre d’animaux surnuméraires utilisés dans chaque procédure est déterminé au cas par cas, en fonction du degré de difficulté du modèle, du taux de succès de la chirurgie, du nombre d’animaux à opérer, de la souche, du sexe et de la provenance.
Raffinement
Les implantations permettent le suivi de paramètres biologiques ou l’administration de substances en continu sans intervention humaine ce qui permet une réduction très importante pour l’animal du stress provoqué par des manipulations répétées. Le contrôle de la douleur est réalisé par une administration appropriée d’analgésique et/ou d’anesthésie locale, sous le contrôle d’un vétérinaire. Une réhydratation est pratiquée pour tous les animaux au réveil. Une habituation par la manipulation positive des animaux peut être effectuée dès la phase d’acclimatation. Une observation quotidienne de l’état clinique général des animaux est réalisée tout au long de la procédure. Des soins spécifiques sont apportés en cas de signes cliniques. En cas de détection d’un point limite, l’animal est immédiatement mis à mort. Des points limites spécifiques sont établis et raffinés au fur et à mesure des observations. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score et document qualité d’enregistrement permettant une traçabilité.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce et de la souche est très généralement effectué par le scientifique. Le rat et la souris sont des animaux couramment utilisés dans ce type de projet. Ce sont des mammifères dont l’anatomie et la physiologie sont proches de l’homme, la disponibilité de données historiques chez ces espèces permet d’obtenir des informations fiables et pertinentes. Sont concernés ici que les animaux sevrés à partir de 3 semaines, dont la taille et le poids sont compatibles avec la pose du matériel implanté, selon les recommandations éthiques en vigueur et les recommandations du fournisseur.
Mécanismes moléculaires du vieillissement prématuré des cellules souches hématopoïétiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 538 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées et des transplantations de cellules après baisse de leur immunité, avec trois prélèvements sanguins chacune, avant d'être tuées pour isoler leurs cellules souches du sang. Le porteur décrit des risques d'infection et de rejet de greffe et fixe la mise à mort à une perte de poids de plus de 20 %. Il affirme qu'il n'existe pas de système in vitro comparable au corps du mammifère pour étudier l'hématopoïèse, ce qui rend selon lui les expériences in vivo "essentielles".
Objectifs
Le vieillissement de la population, en particulier au sein de la population occidentale, est aujourd’hui l’un des principaux problèmes socio-économiques. Le vieillissement du système sanguin et en partie de la population de cellules appelée cellules souches hématopoïétiques entraîne un dysfonctionnement de la formation de sang. Ceci accroit le risque de développer diverses maladies du sang malignes telles que la myélodysplasie, un ensemble de maladies caractérisées par une production insuffisante de cellules sanguines matures saines par la moelle osseuse, la leucémie ou encore le lymphome. Au sein de notre laboratoire, nous supposons que le vieillissement "sain" ou "physiologique" est une succession de moments de stress. Notre hypothèse est donc de vérifier si des signaux de stress provoquent des changements dans l’ADN ou les ARNm constituant ainsi une signature du vieillissement des cellules souches hématopoïétiques. Pour répondre à cette hypothèse nous 1) vérifierons si les cellules sont capables de se souvenir d’un stress subi et donc de répondre plus rapidement ou plus fortement à un second stress ; nous 2) évaluerons si cette mémoire contribue au vieillissement ; et finalement nous 3) déterminerons si le vieillissement à un impact sur la réponse au stress en laissant des marques permanentes et potentiellement héréditaires sur l’ADN et les ARNm.
Bénéfices attendus
L'objectif de cette étude est d’identifier de futures cibles thérapeutiques qui permettront de développer de nouvelles thérapies dans le but d’améliorer la qualité de vie de la population vieillissante.
Procédures
Un traitement sera injecté aux souris une, deux ou trois fois pour une durée de 15sec environ par injection. Les souris seront également soumises à des transplantations de cellules, impliquant une diminution de l'immunité et une injection de 15sec environ, ainsi qu'à des prélèvements sanguins (prélèvement de 15s environ, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation).
Impact sur les animaux
Les injections du traitement peuvent induire des rougeurs et des gonflements. La diminution de l'immunité des souris receveuses de la transplantation peut entrainer des infections. La transplantation peut induire un rejet de greffe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure dans le but d’isoler et d’étudier les cellules souches hématopoïetiques.
Remplacement
Nous avons envisagé la possibilité de modéliser les mêmes processus in vitro. Cependant, il n'existe pas de système in vitro approprié pour étudier l'hématopoïèse, qui soit comparable au corps du mammifère. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les tests d'unités de formation de colonies, que nous allons mettre en place. Par conséquent, les expériences in vivo utilisant des souris sont essentielles.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est importante. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée pour réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de prévenir les infections bactériennes, les souris transplantées recevront un traitement antibiotique dans l'eau de boisson. Lors des prélèvements sanguins une pression sera appliquée sur le site de prelevement pour arrêter l'hémorragie. Les souris seront surveillées pour détecter tout signe d'inconfort 10 à 15 minutes après la procédure. Un manque de soin ou un isolement de l’animal entrainera une surveillance quotidienne. Un deplacement anormal nécessitera l’administration d’eau gélifée et de nourriture directement dans la cage. Une respiration haletante entrainera une surveillance quotidienne. L’animal sera mis à mort dans tous les cas si les symptomes persistent plus de 3 jours. Une perte de poids de plus de 10% sans récupération sur 2 semaines entrainera une vigilance accrue des autres paramètres. Une perte de poids supérieure à 20% entrainera la mise à mort de l’animal. Des rougeurs ou gonflements au niveau des sites de prélèvement ou d’injection entraineront l’utilisation quotidienne de solution antiseptique non colorée. Les animaux seront mis à mort s’il n’y a pas d’amélioration après 3 jours.
Choix des espèces
La souris est le système idéal pour étudier l'hématopoïèse car le système hématopoïétique est hautement conservé entre la souris et le système hématopoïétique humain. En outre, le vieillissement du système hématopoïétique est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre les humains et les souris est connue. Enfin, la capacité d'isoler les CSH de la souris est bien définie et les CSH peuvent être préservées dans un système normal où elles sont situées dans leur niche et peuvent donc conserver leur quiescence. Des procédures telles que la transplantation sont également facilement réalisables chez la souris puisque des protocoles d'irradiation sont en place. Les âges des animaux utilisés (très jeune de 4 à 8 semaines ; jeunes de 4 à 6 mois ; âgés de 10 à 14 mois) ont été choisis car ils simulent les humains très jeunes, jeunes et d'âge moyen. Une attention particulière sera portée aux groupes, afin d'équilibrer autant que possible les âges dans chaque expérience.
Implication du MIcrobiote dans les maladies CARdiométaboliques (MICAR)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transferts de microbiote humain par gavage puis des prélèvements de sang, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans les maladies cardiométaboliques. Le porteur précise qu'une souris en inconfort sera sortie du protocole et tuée plutôt que soignée, un traitement pharmacologique risquant de fausser le microbiote étudié. Il qualifie la compréhension du microbiote d'"indispensable" et juge le modèle murin "incontournable" pour ce transfert fécal.
Objectifs
Nos objectifs sont de déchiffrer (i) le rôle physiopathologique du microbiote intestinal dans les pathologies cardiométaboliques, (ii) de découvrir des biomarqueurs liés au microbiote intestinal dans ces maladies (qui pourraient être utilisés soit pour la prédiction ou le pronostique) et enfin (iii) d'effectuer des études sur la preuve du concept de développement thérapeutique pour modifier la dysbiose dans ces maladies et améliorer ainsi la santé de tous. Le premier objectif est de mieux comprendre comment le microbiote intestinal est impliqué dans les maladies cardiométaboliques. À cette fin, nous utilisons l'approche suivante : nous identifions les différences de microbiote intestinal en termes de composition, de fonction ou de production de métabolites chez des cohortes de patients humains à différents stades de gravité de la maladie pour identifier la signature de cibles bactériennes potentielles d'une maladie. Ensuite nous confirmons plus spécifiquement les cibles dans des modèles de souris humanisées dans lesquels nous pouvons transférer les selles de patients bien phénotypes et évaluer le phénotype clinique induit de façon différenciée (la glycémie, la cholestérolémie, la prise de poids, la stéatose, l'inflammation et l'athérosclérose). Ces transferts fécaux chez la souris compareront les patients avec ou sans les maladies ou à différents stades de gravité ou encore avec ou sans un médicament spécifique (en évaluant si le médicament a un impact sur le microbiote intestinal et par la suite sur la santé métabolique ou si le médicament est plus actif chez les patients avec une composition spécifique en microbiote intestinal).
Bénéfices attendus
Les travaux menés depuis 15 ans positionnent le microbiote à l’interface entre organismes vivants et leurs environnements et démontrent son influence considérable sur le fonctionnement de multiples voies métaboliques et d’un grand nombre d’organes, intestin, foie, système immunitaire, cerveau, mais aussi poumons, système cardiovasculaire, rein, os. 50% des métabolites circulants seraient issus du métabolisme bactérien. Le microbiote apparaît ainsi comme un déterminant clé au carrefour de la physiologie et de multiples pathologies en attente de progrès thérapeutiques. Il émerge aussi comme une puissante courroie de transmission des changements environnementaux et ceci en interface directe avec notre horloge biologique. En effet, sa composition en bactéries mais aussi la synthèse des multiples molécules issues du métabolisme bactérien varient en fonction du rythme nycthéméral, de l’alimentation, de la prise d’antibiotiques et de l’exposition aux agents infectieux comme aux polluants. Les modifications du microbiote induites par les changements récents de l’environnement humain semblent ainsi un acteur majeur non seulement dans l’épidémie actuelle de maladies métaboliques et inflammatoires chroniques de cancers, mais également dans la survenue de certains cancers et maladies auto-immunes. La compréhension par une approche ‘holistique’ des effets du microbiote comme des mécanismes qui contrôlent sa composition et son activité métabolique, se révèle donc aujourd’hui indispensable pour mieux appréhender la physiopathogénie de nombreuses maladies, améliorer leur prise en charge et leur prévention. Ce projet permettra de mieux comprendre les interactions entre le microbiote humain et les organes cibles des différents facteur de risque cardiovasculaires afin de pouvoir par la suite, élaborer une thérapie efficace et moins contraignante pour les patients.
Procédures
Les animaux seront tous soumis a 3 gavages de microbiote 3 jours de suite (1800 souris) et de FITC-dextran (max 360). Pour le gavage les animaux doivent être maintenu par contention douce et ferme sur animal vigile afin de ne pas les blesser et ajuster le geste de gavage à leur déglutition/respiration et à tout signe potentiel de douleur. Le gavage dure 4-5 secondes environ. Toutes les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse (3 maximum par animal sur une période de 114 jours). Une prise de sang dure environ 10-15 secondes. La récolte des fèces sera réalisée sur des animaux vigile qui sont maintenus en cages individuelles environ 30 mn le temps de récolter des fèces fraiches au fond de la cage.
Impact sur les animaux
Les animaux pourrait souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froid au toucher) ou de comportements anormaux: immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux à la fin des procédures
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l'impact du microbiote humain sur la physiologie de l'hôte ce qui est impossible in vitro, ni possible chez l'homme in vivo. Toutes les expérimentations sur l'animal seront conduites en respectant la règle des 3R.
Réduction
Pour les analyses statistiques, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance permetant une interprétation fiable des résultats. Une visite quotidienne des animaux sera effectuée pour vérifier leur état général et ne pas atteindre un des points limites. Un nombre maximale de 1800 animaux sera utilisé sur une periode de 5 ans. Chaque groupe d'animaux fera l'objet d'une analyse complete et détaillée : suivi de la prise de poids, ramassage des feces fraiche et en fin d'étude les souris seront euthanasiés. Une analyse phenotypique complête sera réalisée sur chaque animal (tissus et contenus intestinaux). Ces analyses exhaustives évitent de multiplier les groupes experimentaux.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Si les animaux devaient souffrir d'inconfort (poils hérissés, dos vouté, hypothermie (froide au toucher) ou comportements anormal immobilité, hyperactivité, diarrhée prolongée, ils seraient alors sortis du protocole et euthanasiés car tout traitement pharmacologique visant à prévenir l'inconfort pourrait affecter le microbiote et créer un biais dans les phénotypes recherchés. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse après application d'un gel ophtalmique.
Choix des espèces
Le besoin d’avoir recours à des modèles expérimentaux permettant d'évaluer des changements de microbiote et leur impact sur la sante après transfert fécal spécifique de matériel fécal humain rend le modèle murin incontournable. De même l'accès aux contenus intestinaux et aux tissus murins ayant cohabité avec un microbiote humain représente un outil de comparaison avec l'homme avant de concevoir des études cliniques plus spécifiques. Ces modèles animaux sont de plus des modèles génétiques de prédisposition aux pathologies cardiométaboliques. Nos études requièrent que les animaux soient transplantés au moment du sevrage (3 semaines) lorsque la fenêtre de transférabilité du microbiote est la plus opportune en raison de l'adaptabilité du système immunitaire. Dans les deux procédures nous devons attendre environ 3 mois pour que les phénotypes cardiovasculaires (athérosclérose) se manifestent. Entre le gavage des fèces et le sacrifice, 13 semaines s'écouleront le temps qu’un équilibre se fasse chez la souris receveuse en termes de stabilité de l’écosystème bactérien en équilibre avec le système immunitaire de l’hôte.
Nouvelle approche thérapeutique des arythmies cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injectées avec un virus dès l'âge de trois à cinq jours, ces souris transgéniques subissent des enregistrements cardiaques sous anesthésie puis une stimulation intracardiaque chirurgicale, suivie systématiquement de l'euthanasie et du prélèvement du cœur. Le porteur indique qu'il n'attend pas de phénotype sévère car les animaux ne sont pas maintenus jusqu'aux signes cliniques de la maladie. Il affirme que le cardiomyocyte adulte ne peut se cultiver et que l'efficacité de la thérapie ne peut s'évaluer que sur l'animal.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de troubles du rythme cardiaque héréditaires pouvant être mortels. Nous testerons l'effet de différents traitements (pharmacologiques et géniques) dans des lignées de souris transgéniques reproduisant la pathologie en étudiant leurs effets sur les arythmies déclenchées par stimulation électrique du cœur.
Bénéfices attendus
L'étude de ces modèles murins nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie des maladies liées à la conduction cardiaque et à ses troubles. Nous espérons définir de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de ces arythmies pouvant être mortelles chez l'Homme et pour lesquelles nous ne disposons pas de traitement efficace.
Procédures
La totalité des 220 animaux de ce projet subiront la procédure expérimentale "Étude des effets de nouveaux traitements sur la susceptibilité aux arythmies de 2 modèles murins de troubles du rythme cardiaque". Cette procédure expérimentale se déroule en 4 interventions qui se succèderont chez chaque animal: 1) Injection des virus à l'âge de 3 à 5 jours: quelques secondes par animal. 2) Enregistrement de l'échocardiographie sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal. 3) Enregistrement de l'ECG de surface sous anesthésie légère à l'âge de 9 semaines pour une lignée et de 23 semaines pour l'autre lignée: 10 minutes par animal (40 minutes par animal pour le groupe recevant l'antiarythmique). 4) Stimulation endocavitaire sous anesthésie (unique procédure chirurgicale du projet): 40 minutes par animal (1 heure par animal pour les lots recevant l'antiarythmique) suivie systématiquement par l'euthanasie de l'animal.
Impact sur les animaux
Le phénotype des souris génétiquement modifiées utilisées ne sera pas considéré comme dommageable car aucune ne sera maintenue jusqu’au stade où apparaissent les signes cliniques des modèles concernés. Les potentiels effets néfastes de l'injection d'un AAV dans la circulation systémique d'une part, et de la surexpression de la GFP dans le cœur des souris d'autre part, seront évalués par comparaison des groupes recevant l'AAV-GFP avec les groupes recevant du sérum physiologique. On peut s’attendre à ce qu'il n'y ait pas de différence notable sur les paramètre ECG et échographiques entre les différents groupes au vu de résultats obtenus précédemment. L'introduction de la sonde de stimulation intra-cardiaque dans le ventricule droit de la souris via la jugulaire comporte un risque pour l'animal, risque lié à l'anesthésie et à la chirurgie.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet, toutes les souris seront euthanasiées par une injection létale dans le but de réaliser des analyses ultérieures. Les cœurs seront alors prélevés et congelés immédiatement dans l’azote liquide pour les expériences de biochimie, de biologie moléculaire et d'immunohistologie.
Remplacement
Le myocyte cardiaque adulte ayant atteint un état de différenciation terminale, il ne se divise pas, il ne peut être conservé en culture primaire plus de quelques jours et il ne peut être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). De ce fait, l'utilisation d'animaux ne peut être remplacée par des modèles d'expression in vitro ou ex vivo. D'autre part, les lignées murines étudiées dans ce projet constituent d'excellents modèles pour tester de nouvelles thérapies car ces lignées sont plus susceptibles aux arythmies déclenchée électriquement que les souris sauvages. Nous utiliserons cette susceptibilité pour évaluer l'efficacité de notre approche thérapeutique, ce qui ne peut être réalisé que sur des animaux.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux: mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. Nous injecterons le même virus dans l'ensemble d'une portée. Nous exploiterons toutes les naissances et nous ne ferons pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. En tenant compte de tous ces critères, le nombre total d'animaux de ce projet s'élève à 220 animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons ou tunnels en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe autant que possible, formation technique des utilisateurs. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous injecterons les virus (dilués dans une solution physiologique) par voie systémique, ce qui évite la chirurgie cardiaque lourde liée à une injection intracardiaque. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives : enregistrements échocardiographiques et électrocardiographiques. Seul l'acte de déclenchement des arythmies nécessite quelques minutes de chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) leur développement et leur physiologie sont bien connus. 2) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 3) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. 4) la reproduction rapide de ces rongeurs permet d’obtenir le nombre d’animaux requis pour les analyses statistiques des résultats. 5) la souris est le modèle animal le plus utilisé pour caractériser les vecteurs viraux AAV à tropisme cardiaque que nous allons utiliser. 6) les modèles pathologiques que nous souhaitons utiliser pour nos tests de thérapie génique sont murins. Les AAV seront injectés chez des animaux de quelques jours dans le but de limiter la réponse immunitaire des animaux et de limiter les volumes de virus à produire. De plus, les délais d'expression des AAV étant relativement longs, l'injection à un âge précoce, au lieu d'utiliser des animaux adultes, nous permettra de gagner beaucoup de temps et donc de place dans l'animalerie. L'étude de l'effet potentiellement thérapeutique des virus sera effectuée sur des animaux d'au minimum 9 semaines afin qu'ils aient atteint une taille adulte et que les transgènes soient exprimés.
Impact d’un inhibiteur de SGLT2 à prevenir la dysfonction endothéliale et la cardiomyopathie de stress (syndrome de Takotsubo) induite par les catécholamines chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
473 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un syndrome de Takotsubo, cette cardiomyopathie de stress induite par des catécholamines, leur est provoqué pour tester un médicament déjà utilisé dans l'insuffisance cardiaque, avec échocardiographies et mesures de pression sous anesthésie et isolement 24 heures pour recueillir l'urine. Le porteur indique que le modèle peut entraîner une cardiomyopathie et une mort subite par arrêt cardiaque. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit ces interactions complexes et renvoie le bénéfice, un traitement pour une maladie sans traitement, au terme du projet.
Objectifs
Le syndrome de Takotsubo, aussi appelé syndrome des cœurs brisés, est une pathologie liée à une défaillance du cœur principalement suite à un stress émotionnel associée à une mortalité élevée. Ainsi, la crise sanitaire liée à la pandémie de COVID-19 a vu une augmentation des cas de syndrome de Takotsubo dans la population due aux répercussions psychologiques, sociales et économiques. Actuellement, il n’existe aucun traitement approuvé pour cette pathologie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel effet bénéfique d’un médicament ayant déjà montré son efficacité dans la prise en charge de l’insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Takotsubo et ainsi de proposer un traitement permettant de protéger le cœur et les vaisseaux dans cette maladie pour l’instant sans traitement.
Procédures
Les animaux recevront un traitement inclus dans la nourriture pendant l’ensemble du projet (3 semaines maximum). Une injection unique durant quelques secondes sera pratiquée. Trois ou quatre mesures par échocardiographie et électrocardiogramme d’environ 20 minutes seront réalisées sous anesthésie au cours du projet. Une mesure de pression artérielle sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie à la fin de la procédure. Les animaux seront isolés en cage individuelle pendant maximum 24h pour procéder à un recueil d’urine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels associés à ce projet sont liées d’une part à l’induction du modèle (accélération du rythme cardiaque et/ou comportement de stress transitoires) avec le développement d’une cardiomyopathie. Une mortalité subite par arrêt cardiaque est aussi rapportée pour ce modèle d’insuffisance cardiaque. Par ailleurs, le traitement induit une augmentation de la production d’urine et de la consommation d’eau de boisson. Les injections peuvent induire une inflammation au site d’injection, et les manipulations peuvent induire un léger stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure experimentale afin de collecter le maximum de tissu pour procéder à des analyses complémentaires.
Remplacement
Le developpement de la pathologie étudiée nécessite les interactions complexes entre les divers systèmes physiologiques. Il n’existe à ce jour pas de méthode alternative permettant de reproduire ces interactions complexes.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculée statistiquement (calcul de puissance) afin d’être réduit à son minimum tout en permettant d’atteindre les objectifs du projet. Dès que les objectifs du projet seront atteints, ou en cas d’absence total d’effet des traitements, aucun animal supplémentaire ne sera inclus, permettant de réduire encore les effectifs.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être des animaux, les cages seront enrichies avec différents objets adaptés au mode de vie des rats (bâton à ronger et tube en carton). L’amélioration du bien-être animal se fait également en ayant recours à des méthodes non-invasives et par l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques. Les méthodologies employées tiennent compte de la notion de points limites et définissent des critères d’interruption d’expérimentation.
Choix des espèces
L’espèce choisie est largement utilisée pour l’étude de ce type de pathologie car les caractéristiques physiopathologiques sont très proches de celles retrouvées chez l’homme. Les animaux seront de jeunes adultes car ils doivent doivent présenter un système cardiovasculaire mature mais pas de dysfonction liée à l’âge.
Création et caractérisation fonctionnelle d’un modèle murin du syndrome de Brugada
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont quarante opérées par cathétérisme intracardiaque sans réveil. Ce modèle du syndrome de Brugada est obtenu en croisant deux lignées mutantes, puis soumis à des enregistrements cardiaques et une échocardiographie sous anesthésie et, pour une partie, à l'implantation d'une sonde de télémétrie. Le porteur indique que les souris peuvent développer des arythmies pouvant conduire à des morts subites imprévisibles, ce qui empêche de fixer un point limite. Il conclut que ce niveau d'intégration ne peut être obtenu que sur un modèle animal et renvoie les retombées thérapeutiques au conditionnel.
Objectifs
Le syndrome de Brugada est une maladie génétique caractérisée par un risque élevé d'arythmies cardiaques et de mort subite survenant généralement chez des sujets jeunes (35-40 ans), majoritairement des hommes. Il serait impliqué dans environ 10% des morts subites dans la population générale. Ses mécanismes sont peu connus. On sait cependant qu'ils impliquent des anomalies de l'activité électrique cardiaque. Sur le plan génétique, on pense aujourd'hui que le syndrome de Brugada serait une maladie génétique complexe qui nécessiterait la combinaison de mutations sur plusieurs gènes, chaque gène prédisposant de façon plus ou moins importante à cette maladie. Parmi ces gènes, SCN5A est le plus fréquemment retrouvé (environ 25% des cas). Les mutations de ce gène conduisent à une perte de fonction de la protéine codée par ce gène. Un modèle de souris invalidée pour ce gène (souris KO) présente une perte de fonction équivalente, qui conduit à des anomalies mineures de l'activité électrique cardiaque, prédisposant à la survenue d'arythmies peu sévères. D'autres mutations sur plus de 25 autres gènes ont été identifiées, dont une mutation du gène RRAD. La fonction cardiaque de souris porteuses de la mutation du gène Rrad (souris KI) a été caractérisée : ces souris ne montrent que des anomalies mineures de l'activité électrique cardiaque et ne présentent pas d'arythmies. Dans ce contexte, nous voulons déterminer la contribution relative de ces 2 gènes de prédisposition au syndrome de Brugada dans les mécanismes physiopathologiques de ce syndrome. Pour cela, nous caractériserons la fonction cardiaque de souris avec la mutation sur le gène Rrad et l'invalidation du gène Scn5a (souris KI/KO), obtenues en croisant souris KI et souris KO.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques du syndrome de Brugada, pathologie génétique complexe, en combinant pour la première fois plusieurs anomalies génétiques prédisposant à ce syndrome. Le développement d'un modèle murin plus pertinent que les modèles actuellement disponibles pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir la survenue des arythmies. En effet, il n'existe pas actuellement de solution thérapeutique autre que l'implantation d'un défibrillateur chez les patients considérés les plus à risque. Ceux-ci sont cependant difficiles à identifier, et les défibrillateurs implantables ne sont pas sans risque de complications.
Procédures
Dans une première étape, 80 souris seront soumises à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 15 min) à l'âge de 10 semaines, puis de 30 et 50 semaines, et un examen échocardiographique (15-20 min ), réalisés sous anesthésie générale. Dans une seconde étape, 40 autres souris seront soumises à une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 15-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus, 40 souris supplémentaires pourront être implantées avec une sonde de télémétrie, sous anesthésie générale et analgésie, permettant un enregistrement de l'électrocardiogramme en continu (24 h) en condition vigile. La durée de l'intervention chirurgicale est de l'ordre de 30 min. L'âge des animaux lors de ces deux dernières étapes sera déterminé en fonction des résultats obtenus lors de la première étape.
Impact sur les animaux
Les souris KI et les souris KO se développent normalement et ne montrent pas de signes notables de souffrance. Sur cette base, nous n'anticipons pas de survenue d'un phénotype sévère chronique chez les souris KI/KO. On ne peut cependant pas exclure la possibilité que les souris KI/KO présentent des arythmies ventriculaires susceptibles de conduire à des morts subites, même si la fibrillation ventriculaire, généralement à l'origine de la mort subite, n'est que très rarement observée chez la souris. Par définition, la mort subite est totalement imprévisible, ce qui empêche la mise en place de points limites spécifiques. L'enregistrement de l'ECG et l'échographie (procédure 2) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ces examens seront cependant réalisés sous anesthésie pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque (procédure 3) sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire ; celle-ci sera prévenue par une anesthésie locale. Comme toute intervention chirurgicale, l'implantation d'une sonde de télémétrie (procédure 4) peut conduire à une douleur péri- et post-opératoire qui sera prévenue par la mise en place d'une analgésie pour une durée minimale de trois jours.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (électrocardiogramme aux âges de 10, 30 et 50 semaines + échocardiographie à 51 semaines), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur coeur pour des examens histologiques et moléculaires. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves tricuspides, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études moléculaires. A l'issue de la procédure 4 (enregistrement de l'ECG par télémétrie), les animaux seront mis à mort et leurs cœurs prélevés pour des études moléculaires.
Remplacement
Cette étude fait suite à des études in vitro réalisées avec des cardiomyocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites de patients avec un syndrome de Brugada qui ont permis d'identifier des anomalies de l'activité électrique cellulaire et leurs mécanismes moléculaires. Cependant, les arythmies cardiaques en général, et le syndrome de Brugada plus particulièrement, sont des maladies complexes résultant des interactions entre les cardiomyocytes (30-40% des cellules cardiaques), dont l'activité électrique est altérée, les autres cellules cardiaques (fibroblastes, cellules endothéliales, neurones intracardiaques et cellules du système immunitaire) et le système nerveux autonome. Ce niveau d'intégration ne peut être obtenu que sur un modèle animal. Le syndrome de Brugada présente également la particularité d'une localisation préférentielle des anomalies électriques dans le ventricule droit et plus précisément dans l'infundibulum pulmonaire. Ce niveau de spécificité anatomique ne peut être obtenu in vitro.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (procédure 2), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en trois étapes successives. La dernière étape ne sera réalisée que si les deux premières démontrent que le nouveau modèle généré est plus pertinent que les précédents. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels en plastique ou de cabanes en carton pour se camoufler et/ou de papier pour fabriquer des nids. Des mesures spécifiques adaptées à chacune des procédures seront prises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris causées par ces procédures. Ainsi, les enregistrements des électrocardiogrammes et les échographies seront réalisés sous anesthésie pour éviter tout stress lié à une contention des animaux. Les interventions chirurgicales (cathétérisme intracardiaque et implantation de sonde télémétrique) seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Après implantation d'un capteur de télémétrie, qui permet l'enregistrement continu d'un ECG sur des souris vigiles, une analgésie post-opératoire sera mise place pendant au moins 3 jours jusqu'à la disparition de tout signe clinique de douleur ou d'inconfort. Pour ces animaux, les tunnels en plastique seront systématiquement remplacés par des cabanes en cartons, moins rigides, pour éviter d'éventuels frottements et des blessures potentielles sur la zone de l'implant. Tout au long de la vie des souris, des points limites, basés sur la présence de signes cliniques détaillés sur l'aspect général et le comportement des animaux, leur respiration, leur évolution pondérale, leur prise alimentaire ou encore la nature et la couleur de leur fèces et urine, ont été définis. En cas de présence d'un ou deux signes cliniques notables, un traitement et une prise en charge de la douleur adaptés seront mis en place jusqu'à disparition de ces signes. En cas de persistance de signes cliniques notables ou d'apparition d'un signe clinique sévère malgré la prise en charge thérapeutique mise en place, les animaux seront mis à mort, que l'objectif de l'étude soit atteint ou pas. Pour toutes les souris inclues dans cette étude, la mise à mort sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche, notamment dans le cadre de modèles de pathologies génétiques. De plus, notre équipe possède une expertise avec ce modèle sur l’ensemble des procédures nécessaires au projet (ECG, échocardiographie, cathétérisme intracardiaque, télémétrie). Enfin, plus spécifiquement dans le cadre de ce projet, la création du nouveau modèle repose sur l'utilisation de 2 modèles de souris déjà existants. L'étude sera réalisée avec des souris adultes dans la mesure où la pathologie chez l'humain n'est que rarement détectée chez les enfants ou les adolescents.
Prévention de l’athérosclérose: régulation de l’homéostasie du cholestérol grâce à l’injection d’anticorps EU1/3
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
632 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles sont soumises trois à cinq mois à un régime riche en cholestérol, à six à dix injections dans la veine de la queue, à des mesures de pression artérielle et à des séances d'IRM ou d'échographie, pour tester des anticorps censés freiner l'athérosclérose. Le porteur indique que le régime peut provoquer des œdèmes de la face et des membres, une perte de poids et une nécrose localisée au point d'injection. La justification du devenir décrit une euthanasie finale pour prélever les organes, alors que le champ structuré enregistre ces souris comme rendues à l'élevage, une incohérence dans la déclaration.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de protéger de l'accumulation du cholestérol dans les vaisseaux sanguins en utilisant des anticorps. Cette accumulation de cholestérol s’appelle l'athérosclérose. C’est une maladie inflammatoire qui implique le système immunitaire et qui est chronique. Cette accumulation conduit à la formation de cellules gorgées de cholestérol qui s’accumulent pour former des plaques d’athérome dans la paroi des vaisseaux sanguins. L’origine de ces cellules gorgées de cholestérol est double : cellules du système immunitaire et cellules de la paroi des vaisseaux sanguins. La rupture de la plaque d’athérome favorise la crise cardiaque et l’accident vasculaire cérébral (AVC). Les outils thérapeutiques actuels ne sont pas suffisants pour empêcher efficacement la progression de la maladie et la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc nécessaire. Nous avons montré récemment, que deux protéines étaient responsables du contrôle de l’entrée et la sortie du cholestérol dans la cellule. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées, qui n’expriment pas l’une ou l’autre de ces deux protéines responsables du trafic du cholestérol dans la cellule. Nous allons les nourrir avec un régime riche en cholestérol qui provoque la survenue de l’athérosclérose. Nous allons traiter ces souris à l’aide d’anticorps spécifique qui favorisent la biodisponibilité des protéines du contrôle du trafic du cholestérol dans la cellule. Nous allons ainsi montrer que les souris traitées présentent moins d’accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux sanguins que les souris non traitées. Ce projet permettra de mieux comprendre et de mettre en place une nouvelle prise en charge de l’athérosclérose.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des atteintes cardiaques liées aux dépôt de cholestérol dans les artères et de déterminer si l’injection d’anticorps est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cardiaques.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 3 mois ou 5 mois. Ils seront soumis à 6 injections (protocole de 3 mois de régime) ou 10 injections (protocole de 5 mois de régime) dans la veine de la queue (processus de 10 minutes environ). Ils seront également soumis à une mesure de la pression artérielle à la queue, avec une phase d'habituation de 2 semaines et une mesure en début et en fin de protocole. Les animaux seront soumis également à une IRM et/ou échographie au début et à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les souris lors des expérimentations sous régime riche en cholestérol avec ou sans injection dans la veine de la queue sont le développement d'oedème facial et des membres en toute fin de la période de régime. Un stress engendré par les injections à la veine de la queue et lors de l'anesthésie finale en IP. L'injection à la queue peut potentiellement entrainer des dégats cellulaire au point d'injection aboutissant à la mort très localisée des tissus. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids.
Devenir
Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traité par anticorps seront euthanasiés pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
L’athérosclérose est un phénomène multifactoriel qui ne peut être totalement décrit par un modèle cellulaire qui ne permet l’analyse que d’un ou deux types de cellules à la fois et omet les interactions multicellulaires, primordiales dans cette pathologie. Nous avons montré, principalement dans un modèle cellulaire, qu'une protéine était une actrice majeure dans le contrôle de l’accumulation de cholestérol dans la cellule. Afin de poursuivre nos études et de mieux comprendre les mécanismes contrôlant l’accumulation du cholestérol au niveau de la plaque d’athérome, nous devons intégrer les facteurs présents dans un organisme entier qui sont responsables de la survenue de cette pathologie.
Réduction
Si nous arrivons à mettre en évidence un mécanisme d’action rapidement, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé dans ce projet. Nous utiliserons également des souris afin de faire des cultures de cellules de vaisseaux sanguins et de cellules cardiaques, dans le but de caractériser les mécanismes cellulaires de l’accumulation du cholestérol. Ceci permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaire à notre étude. Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes ont été calculés et déterminés pour obtenir un effet statistique fiable et robuste et permet de limiter le nombre d'animaux utilisé au strict nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que faire se peut la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol que nous leur donnerons : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime (oedèmes dus à l’insuffisance cardiaque qui peut s’installer, prostration). Pendant la phase de régime, les animaux seront 2 à 5 par cage, avec des enrichissements sous forme de morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents et un carré de coton qu’ils pourront utiliser pour confectionner leur nid. Le suivi de l’état des animaux sera quotidien.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour créer des lignées génétiquement modifiées. Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiées qui permet d’accélérer l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux sanguins quand ces animaux sont soumis à un régime riche en cholestérol. Ces modifications génétiques n’ont aucun impact sur la longévité ou le bien-être des souris hors régime riche en cholestérol. Pour cette étude ou les souris sont soumises à 3 ou 5 mois de régime riche en cholestérol, nous utiliserons des souris adulte de 3 mois, afin de déterminer l'évolution de la maladie qui, comme chez l'homme, apparaît à l'adolescence pour s'aggraver et évoluer vers des pathologies comme l'AVC ou la crise cardiaque à l'age adulte. Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.
Toxicité vasculaire pulmonaire du busulfan et des inhibiteurs du protéasome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système respiratoire
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections hebdomadaires de busulfan et d'inhibiteurs du protéasome, des anticancéreux, sont suivis par échocardiographie sous anesthésie, puis subissent un cathétérisme cardiaque terminal avant prélèvement du cœur et des poumons, pour étudier une hypertension artérielle pulmonaire d'origine médicamenteuse. Le porteur décrit des effets fonctionnels faibles et une "dyspnée légère" tout en classant les procédures en gravité sévère. Il qualifie le modèle chez le rat d'"incontournable" et le recours aux animaux d'"indispensable", tout en menant des expériences parallèles sur cellules humaines.
Objectifs
L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie mortelle affectant l’arbre vasculaire pulmonaire. L’HTAP peut se développer sans cause connue (HTAP idiopathique) ou peut être secondaire à des médicaments ou des toxiques (HTAP iatrogène). La liste des médicaments ou toxiques est constamment mise à jour et classifie les substances comme définitivement ou possiblement associées à de l’HTAP. Parmi ces substances le busulfan en tant qu’agent alkylant est classé comme potentiellement associés à l’HTAP et les inhibiteurs du protéasome (IP), le bortezomib et le carfilzomib n’ont pas été étudiés. Notre équipe a récemment identifié un signal fort provenant de ces molécules (travaux en cours de publication). Elles sont utilisées pour des pathologies hématologiques, notamment le myélome, et dans les conditionnements pré greffe de moelle. Les mécanismes entraînant le développement de l’HTAP après exposition à ces médicaments n’ont pas été étudiés. Les meilleurs modèles existant d’HTAP sont des modèles développés chez le rat, et miment parfaitement les caractéristiques hémodynamiques et morphologiques principales de la maladie humaine. C’est pourquoi créer des modèles d’HTAP iatrogène chez le rat est incontournable pour étudier l’effet de ces drogues sur le système cardiopulmonaire des malades. Il est en effet crucial de vérifier que ces drogues n’ont pas d’effets indésirables notamment sur le cœur et les poumons de ces animaux, qui sont très impactés par l’HTAP. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. La pratique répétée d’échocardiographie nous permettra d’étudier la fonction cardiovasculaire de manière non invasive et de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation simultanée des inhibiteurs du protéasome associée au busulfan nous permet d’une part de reproduire de manière fidèle les traitements reçus par les patients mais aussi de limiter le nombre d’animaux. Après traitement, un cathétérisme cardiaque et l'euthanasie seront réalisés sous anesthésie générale, suivi du prélèvement des tissus . Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s’assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Le nombre total de rats utilisés sera de 168 sur l’ensemble de l’étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une cause de handicap, d’insuffisance cardiaque et de mort. Au vu de l’absence d’identification des mécanismes expliquant le développement de l’HTAP chez les patients exposés à ces médicaments, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge des patients.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une échocardiographie hebdomadaire, sous anesthésie générale et 1 à 2 injections sous cutanées hebdomadaires sous anesthésie générale. Le projet soumis prévoit de sacrifier les animaux au bout de 6 semaines. Cependant, les échocardiographies hebdomadaires permettront de suivre l’évolution des paramètres cardiovasculaires des animaux et d’adapter si nécessaire la durée du protocole (diminution ou augmentation du nombre de semaines de suivi). A la fin du protocole les animaux seront soumis à un cathétérisme cardiaque droit, sous anesthésie générale. L'échocardiographie se fera de paire avec la 2ème injection le cas échéant, cette manipulation durera 10 minutes. Les injections se faisant en intrapéritonéale dureront moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Induction d'une toxicité vasculaire pulmonaire n'entrainant pas ou peu de retentissement fonctionnel. Possible dyspnée légère.
Devenir
Après réalisation du cathétérisme les organes d'intérêt que sont le coeur et les poumons vont être prélevés, leurs études sont indispensables à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement de l'HTAP.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire après exposition médicamenteuse. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une HTAP puis d'une insuffisance cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe. Cependant, autant que faire se peut, les expériences se feront parallèlement sur cellules vasculaires pulmonaires humaines afin de limiter au maximum le recours aux animaux. Ces cellules primaires sont générées dans notre hopital, référent en ile de france de la transplantation pulmonaire des patients souffrant d'HTAP.
Réduction
La surveillance échocardiographique hebdomadaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés au travers d’études longitudinales où chaque animal devient son propre contrôle. Afin de réduire encore le nombre d'animaux utilisés, les animaux sont mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme permettant d'évaluer leur fonction cardiaque et les tissus prélevés seront partagés. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et des antalgiques. Certaines expériences pourront être réalisées sur tissus pulmonaires solés. A la fin des expérimentations, les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages d'animaux. Ceux-ci seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les échographies de suivi prévues dans la procédure permettent de suivre le stade de l’insuffisance cardiaque qui peut survenir dans l'HTAP et de décider de l'euthanasie des rats avec une fonction cardiaque altérée.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire pulmonaire et des caractéristiques hémodynamiques semblables à celle de l'homme. Notre équipe travaille en routine avec des modèles murins d'hypertension artérielle pulmonaire, nous avons donc l'expérience et le matériel adapté pour travailler avec le rat. Nous allons travailler avec des rats de souches Wistar. Les animaux utilisés sont de jeunes rats (6 à 8 semaines, 100 g), l'induction de l'HTAP est connue pour être plus sévère à cet âge où le système vasculaire pulmonaire est en croissance.
Développement de l’unité gliovasculaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes sont opérées pour électroporer le cerveau de 540 embryons dans l'utérus, des nouveau-nés reçoivent une injection de tamoxifène, et les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale ou saignée sous anesthésie pour l'analyse du cerveau, afin d'étudier le développement des astrocytes. Le porteur indique que la chirurgie des mères peut provoquer une interruption de gestation ou une réouverture de la cicatrice. Il rattache ce travail aux troubles autistiques et psychiatriques et affirme qu'aucun système in vitro ne recrée les interactions d'un cerveau en développement.
Objectifs
Le système nerveux central, dont fait partie le cerveau, est composé de plusieurs types cellulaires : les neurones, mais également les cellules gliales dont les astrocytes. Ces derniers sont reconnus comme des acteurs essentiel à la physiologie et impactés dans de nombreuses pathologies. Ils interagissent notamment avec les vaisseaux sanguins où ils participent à la régulation des fonctions vasculaires, comme l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Ils forment ainsi avec les vaisseaux l’unité gliovasculaire, qui est perturbée dans l’ensemble des maladies touchant le cerveau. Parmi les déficits actuels en santé publique, les maladies liées au développement du cerveau, comme les troubles autistiques ou psychiatriques, ont une place importante. Cependant les étiologies de ces maladies sont encore largement méconnues. En particulier, un possible rôle des astrocytes reste à démontrer.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des astrocytes dans le développement cérébral, dont les défauts sont une cause importante de handicap cognitif et moteur.
Procédures
Trois interventions sont utilisées dans ce projet. 1)Electroporation in utero : des femelles gestantes sous anesthésie générale sont opérées. Un mélange de plasmide et colorant est injecté dans le cerveau des embryons et incorporés dans le parenchyme par électroporation. Nombre d’embryons concernés : 540. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum). 2) Injection de Tamoxifen : du tamoxifen est injecté en voie sous-cutanée chez des nouveau-nés de 1 ou 4 jours. Cette injection n’est réalisée qu’une seule fois. Elle est sans douleur et ne nécessite pas d’anesthésie. Nombre d’animaux concernés : 494 (durée: 1min). 3) Perfusion intracardiaque: Réalisée sous anesthésie générale, cette intervention est sans réveil. Elle concerne l’ensemble des animaux expérimentés (764) (durée: 15min)
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (chirurgie de souris gestantes, injection intraperitonéale) qui peuvent entrainer des effets modérés (interruption prématurée de gestation, ouverture de la cicatrice après la chirurgie, irritation au point d’injection). Une observation particulière des animaux dans les jours suivants et l’application des points limites permettent de limiter la nuisance et la souffrance des animaux. Des lignées sont créées en croisant des souris existantes (sauvage ou mutantes) avec une lignée permettant l’expression de protéines fluorescentes dans les astrocytes. Ceci n’induit pas de changement de phénotype par rapport à la lignée initiale.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale ou par exsanguination. La mise à mort par exsanguination (sous anesthésie générale) est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Pour l’ensemble des questions traitées, il faut obtenir les observations sur au minimum 4 réplicas biologiques pour chaque génotype et à chaque stade. Ce nombre de 4 est un minimum pour intégrer dans nos étude la variabilité entre les animaux. C’est un pre-requis dans l’ensemble des publications de travaux scientifiques. Elle est particulièrement cruciale pour l’étude du développement ou les programmes de différentiation cellulaire peuvent légèrement varier d’un individu à un autre.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Certaines procédures pouvant induire une légère douleur, celle-ci est anticipée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (buprenorphine). Les animaux subissant des interventions feront l'objet d'une surveillance accrue pendant l'intervention et les jours suivants et d’éventuels soins supplémentaires (application d’analgésique supplémentaire) sont apportés en fonction de ces observations.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Les animaux seront utilisés à 3 stades développementaux postnataux: P5, P15 et P30. Ces stades correspondent à des moment clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leur interactions avec les vaisseaux sanguins (Gilbert, 2019, 2021)
Effet des composés libérant le monoxyde de carbone (CO) sur le microbiote intestinal en cas d’obésité
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises quatorze semaines à un régime riche en graisses, reçoivent des composés libérant du monoxyde de carbone puis, pour une partie, une transplantation de microbiote fécal par gavage suivie de quatorze semaines supplémentaires de ce régime, avec des prélèvements de sang à la queue sans anesthésie. Le porteur indique que tous les animaux sont mis à mort pour prélever leurs organes. Il décrit avoir d'abord testé vingt composés sur des cellules en culture pour n'en retenir que trois, et attend de l'étude des informations sur l'intérêt thérapeutique de la transplantation fécale.
Objectifs
Les altérations de la composition et de la fonction du microbiote intestinal (dysbiose) contribuent fortement à l'obésité et aux morbidités associées. Des découvertes récentes nous indique que l’administration du monoxyde de carbone (CO) réduit la prise de poids et les dérèglements métaboliques chez les souris nourries avec un régime riche en graisses. C'est pourquoi, nous souhaitons tester l’hypothèse que le CO offre ces bénéfices sur le microbiote intestinale pendant l'obésité. Pour ce faire, les souris seront d'abord nourries avec un régime riche en graisses (HFD) pendant 14 semaines et traitées avec des composés capables de libérer du CO. Par la suite, des échantillons fécaux seront prélevés de ce groupe et transplantés par gavage oral dans un deuxième groupe de souris qui seront soumises à HFD pendant 14 semaines supplémentaires. Ce projet mènera à différents objectifs. Premièrement, celuir d'évaluer l'action thérapeutique directe du CO en reprogrammant le microbiote vers un phénotype sain. Dans un second temps, cela nous permettra de déterminer si la transplantation de microbiote fécal (TMF) reprogrammé par le traitement au CO empêche le dysfonctionnement métabolique lié à l'obésité.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du CO sur le microbiote intestinal. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique de la transplantation fécal du microbiote précédemment exposé au CO sur le dysfonctionnement métabolique pendant l'obésité.
Procédures
Les souris recevant du TMF (nombre total d'animaux = 80) seront soumises à un prélèvement de sang sans anesthésie au niveau caudale, en tant qu'intervention invasive.
Impact sur les animaux
Le modèle de régime riche en graisses est un modèle largement utilisé. Cette méthode est sans douleur pour les animaux et n'implique pas de procédures invasives. De même, la transplantation fécale du microbiote est réalisée par gavage oral, une procédure bien tolérée par les animaux. Concernant le prélèvement sanguin sans anesthésie, nous recueillerons un très faible volume et l’adéquation volume/méthode permet de respecter le bien-être animal.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les organes pour une analyse fonctionnelle, génique et biochimique, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour la préparation du microbiote intestinal traité avec des composés libérant du CO par gavage oral, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés afin de déterminer leurs effets bénéfiques sur le métabolisme dans des adipocytes en culture, remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Ces 20 composés avaient tous la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer un effet positif sur la respiration mitochondriale et la glycolyse. Cependant, seulement 3 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique face aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont alors permis de sélectionner les 3 meilleurs, tout en prenant en compte leur structure chimique diversifiée.
Réduction
Pour chacun des groupes étudiés nous utiliserons 10 souris en raison de la variabilité entre les différents animaux, et ce afin d’obtenir des données significatives. De plus, l'analyse de la composition du microbiote par séquençage de l'ADN nécessite un certain nombre d'échantillons pour mieux homogénéiser les données. Dans nos protocoles, nous pourrons réduire le nombre de souris car les mêmes fèces obtenues à partir de souris HFD ou HFD+composés libérant du CO seront utilisées pour la transplantation fécale de plusieur animaux. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d’autres molécules aux mêmes propriétés. Suite à l’obtention des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d’un post test de type Bonferroni. Les résultats seront considérés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05.
Raffinement
En optimisant les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons essayé autant que possible d'utiliser des approches qui ne sont pas trop invasives et ainsi de minimiser la douleur, mais aussi la souffrance et la détresse que peuvent ressentir les animaux. Nous avons également sélectionné un nombre limité de composés sur la base de données in vitro tout en n'utilisant qu'une seule dose de traitement pour chaque composé. Nous nous assurerons que le logement et l'élevage seront effectués en prenant en compte le bien-être des animaux. Nous utiliserons des anesthésiques appropriés, et, en cas de nécessité, des analgésiques efficaces afin de minimiser la douleur des animaux. Les souris seront logées à 3 par cage, en nettoyant la cage une fois par semaine et en s'assurant qu'elles ont accès à de la nourriture et de l'eau ad libitum.
Choix des espèces
Le modèle souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l’effet des régimes alimentaire riche en graisse (« High Fat Diet », HFD). La transplantation fécale par gavage oral est également couramment utilisée dans ce modèle pour évaluer l'effet du microbiote sur l'obésité. Le choix de cette espèce de souris se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles. Des souris de 8 semaines seront utilisées pour démarrer nos protocoles car nous devons évaluer l'effet des composés libérant du CO sur le microbiote et les comparer avec des données antérieures utilisant des souris au même stade de développement.