Système cardiaque
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- Organes sensoriels
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Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections d'agents de contraste au gadolinium ou à l'oxyde de fer sous anesthésie, puis passent des séances d'IRM, non pour étudier une maladie mais pour régler les paramètres et séquences de l'appareil d'imagerie. Le porteur décrit des procédures non invasives et indolores, et prévoit de réutiliser certains animaux entre projets quand c'est possible, les autres étant mis à mort après les acquisitions. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" car l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Rôle des enzymes du métabolisme des phosphoinositides dans l’hémostase primaire et la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent des sections répétées du bout de la queue pour chronométrer le saignement, des prélèvements de sang à la veine cave, des lésions provoquées de la carotide ou de la jugulaire et une ligature de la veine cave, sous anesthésie pour les actes chirurgicaux. Le porteur affirme que les composés injectés ne sont ni irritants ni délétères et que les souris génétiquement modifiées n'ont pas de phénotype dommageable. Il étudie le rôle d'enzymes plaquettaires dans la coagulation et juge le modèle murin "irremplaçable" faute d'approche in vitro.
Objectifs
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Les plaquettes représentent cependant des cibles majeures en clinique dans la prévention de pathologies cardiovasculaires comme les maladies artérielles thromboemboliques, l'athérosclérose ou la resténose après angioplastie (première cause de mortalité dans les pays industrialisés). De nombreux anti-thrombotiques efficaces sont utilisés en clinique mais ils ont généralement des effets relativement drastiques pouvant entraîner des complications hémorragiques. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent aussi être dus à des défauts de production plaquettaire. Ainsi, la mise en évidence de cibles pharmacologiques et/ou de biomarqueurs plaquettaires est nécessaire pour une meilleure prise en charge des thromboses et des syndromes hémorragiques chez le patient. Le rôle des phosphoinositides et des enzymes régulant leur taux dans les diverses étapes qui sous-tendent la production et l’activation des plaquettes reste encore mal étudié. Pourtant, ils ont un rôle majeur à jouer dans les plaquettes sanguines car ils occupent une place de plus en plus centrale dans la régulation spatiotemporelle de la signalisation cellulaire, la dynamique cellulaire notamment le remodelage du cytosquelette et des membranes et le trafic vésiculaire, processus majeurs dans la production et les fonctions plaquettaires. Ainsi, ce projet vise à mettre en lumière comment le métabolisme de phosphoinositides régulent la physiopathologie des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra un meilleure compréhension du rôle des différents phosphoinostides et de leur métabolisme dans un contexte intégré visant à identifier de potentiels biomarqueurs et/ou cibles pharmacologiques dans les syndromes hémorragiques et thrombotiques dûs à des défauts de plaquettes sanguines.
Procédures
Pour la procédure 1, une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. Pour la procédure 2, la souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Pour la procédure 3, une injection d’un composé inoffensif et irritant est réalisé en intra-veineux durée de 10 secondes sur souris anesthésiée en IP. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en IP avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. En fonction des résultats obtenus , les procédures 4, 5 et 6 seront effectuées sur certains ou tous les groupes. Pour la procédure 4, la souris est anesthésiée par injection IP pendant toute la procédure. L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la carotide dure 10 minutes et l'enregistrement dure 30 minutes. Pour la procédure 5, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte de ligature partielle de la veine cave dure 10 minutes. La souris est ensuite retraitée par injection IP d’un anti-douleur . Pour la procédure 6, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la jugulaire dure 15 minutes. Toutes les injections IP dure 10 secondes et se font sur animaux vigiles. Les autres actes expérimentales se font sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés ne présentent pas de phénotypes dommageables de la vie à la mort. Pour les actes expérimentales, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères. Aucune données n'existent quant à des conséquences néfastes des produits injectés qui ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le notre, sans aucun effets indésirables. Chaque acte expérimentale de chaque procédure est maitrisée par les responsables du projet et est réalisée sous anesthésie/analgésie sauf pour les injections intra-péritonéales qui sont des actes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. En effet, le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus lors des procédures expérimentales 1 à 3, en réalisant ou pas les procédures expérimentales 4 à 6. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées par inhalation ou injection de composés. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyé 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée.
Choix des espèces
Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré. Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables de la souris à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiées invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 24 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.
Mise au point du modèle d’ischémie/reperfusion cérébrale chez la souris : Rôle de nouveaux gènes et identification de cibles thérapeutiques d’intérêt dans l’ischémie cérébrale.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 230 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chez ces dernières, un monofilament siliconé bouche une artère cérébrale pendant une heure pour provoquer un accident vasculaire, avant 24 heures de reperfusion puis la mise à mort pour mesurer la zone du cerveau détruite. Le porteur décrit une paralysie possible, une prostration et une hypothermie, les souris les plus atteintes selon l'échelle neurologique étant alors tuées, et 40 autres subissent un prélèvement de sang terminal sans réveil. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier le rôle des gènes dans un "système intégré" et juge le recours à la souris "indispensable".
Objectifs
En France, les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap acquis de l’adulte et la seconde cause de démence. Dans plus de 80% des cas, les AVC résultent de l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot sanguin ou thrombus. On parle alors d’« AVC ischémique » ou « infarctus cérébral ». La principale cause de ces AVC reste l'athérosclérose qui se définit comme une accumulation de dépôts de cholestérol sur les parois des artères. Ces dépôts durcissent et forment des plaques d'athérome qui favorisent la formation du caillot. L’élimination du caillot devient alors une priorité pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale reste une pathologie complexe à explorer chez l’homme. Les modèles in vivo ont pour objectif de reproduire, chez l'animal, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet alors de pouvoir tester plus facilement des hypothèses physiopathologiques et déterminer des stratégies thérapeutiques potentielles pour les patients atteints d’accident vasculaire cérébral. Pour ce projet, nous allons donc utiliser un modèle mis en place et développé chez le rat puis adapté à la souris. Ce modèle, reconnu pour être fiable et reproductible, est un modèle d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (tOMCA), par insertion, pendant 1 h, d’un monofilament siliconé au niveau de l’artère cérébrale moyenne. Après 24 h de reperfusion, la taille de l’infarct sera évaluée. La mise au point et la validation de ce modèle nécessiteront l’utilisation de 80 souris au maximum. Nous pourrons ensuite étudier le rôle de différents gènes potentiellement impliqués dans la formation du thrombus (jusqu’à 5) en mesurant la taille de la zone cérébrale infarcie dans des souris avec délétion ou mutation des ces gènes d'intérêt. Nous prévoyons d’utiliser 30 souris par mutation, soit 150 souris pour 5 gènes. Les premières mutations étudiées portent sur des gènes jouant un rôle important dans la régulation de l’agrégation plaquettaire. Des prélèvements sanguins seront donc réalisés pour évaluer cette fonction chez nos souris (besoin de 40 souris). Pour la réalisation de ce projet, 270 souris au maximum seront donc utilisées
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (80% des AVC) résultent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus (caillot sanguin) qui empêche le cerveau d’être alimenté en oxygène par une circulation sanguine normale. Ce type d’accident vasculaire est favorisé par les facteurs de risque cardio-vasculaires comme le tabagisme, l’hypercholestérolémie ou le diabète. Les accidents ischémiques cérébraux provoquent des dommages cérébraux parfois irréversibles, pouvant conduire, lorsque les lésions sont étendues, au décès. Il s’agit donc d’une urgence médicale absolue : le caillot doit être éliminé le plus rapidement possible pour limiter la privation d’oxygène dans le cerveau et les séquelles neurologiques qui en découlent. La pathologie ischémique cérébrale, en dépit de sa grande fréquence, reste une pathologie complexe à explorer, de par son hétérogénéité clinique mais aussi de par ses interactions possibles avec les nombreux facteurs de risque cardio-vasculaires. Ceci explique les difficultés à aborder, chez l'homme, les nombreux mécanismes physiopathologiques et/ou à identifier des cibles pharmacologiques potentielles de la pathologie ischémique cérébrale. Ces faits ont conduit à développer de nombreux modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale chez le rat dans un premier temps, pour les adapter ensuite à la souris transgénique. Les modèles in vivo ont donc pour objectif de reproduire chez l'animal, dans un contexte physiologique proche de celui de l'homme, l'ischémie cérébrale humaine dans son étiologie, ses conséquences anatomiques, métaboliques, cellulaires et fonctionnelles. Cette proximité avec la pathologie humaine permet ainsi de tester des hypothèses physiopathologiques et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Procédure 1: prélèvement terminal de sang en veine cave sur animaux anesthésiés (40 souris au maximum). Procédure 2: modèle d'ischémie/reperfusion réalisé sur 230 souris. L'ischémie transitoire est induite pendant 1h et la reperfusion se fait sur 24h. A l'issue, les animaux sont sacrifiés pour évaluer la taille de la zone infarcie.
Impact sur les animaux
Ce modèle d'occlusion transitoire induit des infarctus plus ou moins sévères qui se traduisent par une mortalité importante si le temps d’occlusion de l’artère est supérieur à 3h. Dans notre étude, le temps d’occlusion n’excèdera pas 1h, limitant ainsi la taille de l’infarct et les éventuelles complications. Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h après la reperfusion . Cette évaluation confirme le succès de la tMCAO post-AVC et détermine l'efficacité de la tMCAO post-reperfusion. Pour une occlusion d’1h, les souris devraient présenter au moins un léger enroulement cohérent (neuroscore 2) et selon la littérature, les déficits neurologiques sont généralement stables jusqu'à 72 heures. Un neuroscore de 4 ou 5 entrainera une mise à mort de l’animal par injection IP d’un bolus d’Euthasol. Les principales complications liées à ce modèle expérimental sont : risque d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne, déplacement du fil induisant un risque d’hémorragie sous-arachnoïdienne par rupture vasculaire ou encore reperfusion diminuée liée à l’altération de la paroi carotidienne. La souris , prostrée, dos voûté, poils hérissé, et probablement en hypothermie, sera alors mise à mort. Pour les autres souris, la taille de l'infarct sera évaluée histologiquement après 24h de reperfusion.
Devenir
Procédure 1: Prélèvement de sang en veine cave: procédure sans réveil car nous avons besoin d'une grande quantité de sang pour étudier l'agrégation plaquettaire. Procédure 2 d'ischémie/reperfusion: les souris sont gardées en vie pendant 24h. Après 24h de reperfusion, l'animal est mis à mort pour prélever le cerveau et évaluer la taille de la zone infarcie
Remplacement
Les modèles in vitro disponibles à ce jour ne permettent malheureusement pas l’étude de l’implication de gènes dans un système intégré. Le recours au modèle animal reste ici indispensable pour nous permettre de cibler rapidement et efficacement les gènes ayant un impact positif sur la taille de l’infarctus.
Réduction
Quand ce sera possible, les souris contrôles serviront à l’étude de plusieurs gènes. Le modèle sera alors mis en place par des personnes expérimentées et un protocole analgésique adapté sera mis en place sur toute la durée du protocole pour limiter toute souffrance de l’animal.
Raffinement
Les animaux sont stabulées dans des conditions standards d’animalerie, avec dans la cage nourriture à volonté et milieu enrichi (frisottis ou dôme). Les déficits neurologiques seront évalués à 1h et 24h , selon une échelle en 6 points. Si l’atteinte neurologique est trop importante, l’animal sera alors exclu de l’étude.
Choix des espèces
Ce modèle d'AVC ischémique a tout d’abord été mis au point chez le rat. En raison de la disponibilité de souris génétiquement modifiées permettant d'analyser le rôle physiopathologique et/ou l'intérêt thérapeutique de gènes candidats, ce modèle a également été développé chez la souris. Pour l'étude de la physiologie et la physiopathologie du système cérébro-vasculaire, il est fondamental de prendre en compte l’ensemble des systèmes régulateurs de façon intégrée. Malheureusement, il n’existe pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. De plus, nous disposons déjà du modèle de souris Arhgef1, premier gène que nous étudierons dans le cadre de ce projet Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes âgés entre 2 et 4 mois.
Mise en place d’un modèle d’insuffisance cardiaque post infarctus chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ligature d'une artère du cœur reproduisant un infarctus, la pose d'un implant abdominal puis une chirurgie du thorax pouvant durer jusqu'à 140 minutes, avec six échographies et six prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort jusqu'à seize semaines plus tard pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'une insuffisance cardiaque doit se développer après la seconde opération et prévoit des points limites en cas de souffrance qu'il ne pourrait soulager. Les retombées annoncées, mieux comprendre la maladie et évaluer des médicaments développés par des entreprises pharmaceutiques, restent au conditionnel et à long terme, tandis qu'il affirme que suivre la fonction cardiaque sur plusieurs semaines exige un "organisme entier".
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. L’insuffisance cardiaque se traduit par un remodelage du tissu cardiaque associé à des dysfonctions cardiaques. Outre une lourde mortalité (50% à 5ans après l’apparition des premiers symptômes), cette pathologie se traduit également à terme par des symptômes parfois invalidants et des hospitalisations longues et récurrentes. Les insuffisances cardiaques surviennent en très grande majorité dans les suites d’un infarctus du myocarde aigu et sont souvent associées à un remodelage cardiaque délétère. Plusieurs pistes de traitement sont à l’étude mais des efforts majeurs en ce sens restent à entreprendre. L’objectif de ce projet est d’adapter notre modèle de ligature transitoire de l’une des artères principales du coeur (mimant un infarctus du myocarde), afin de développer et caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque post infarctus. Ce modèle devrait permettre, à terme, de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie et de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux traitements médicamenteux, actuellement développés par les entreprises pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’insuffisance cardiaque est une pathologie à forte incidence (2,3% de la population adulte française) et aux conséquences lourdes (hospitalisations multiples, syndromes invalidants). Notre projet vise à caractériser un modèle murin d’insuffisance cardiaque, nous permettant à court et moyen terme d’étudier les mécanismes impliqués dans cette pathologie et proposer à terme des cibles thérapeutiques pertinentes et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques nouvelles (études précliniques).
Procédures
Selon les groupes expérimentaux, les animaux suivront l’un des parcours suivants : 1) Deux chirurgies, espacées de 14 jours, seront réalisées sur l’animal, sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée (durée : environ 20mn et 140mn maximum respectivement) : la première chirurgie implique la pose d’un implant dans l’abdomen et la seconde chirurgie implique une chirurgie au niveau du thorax. Le suivi des animaux implique 6 examens échographiques (20-30 minutes chaque examen) et 6 prélèvements sanguins (1 minute chaque prélèvement), sous sédation ou anesthésie générale, répartis tout au long de l’expérimentation (à 6 reprises). L’animal est mis à mort au plus tard 16 semaines après l’infarctus pour le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque. 2) Une chirurgie unique, impliquant une chirurgie au niveau du thorax est réalisée sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptée (durée de 140mn maximum). La mise à mort est réalisée 48h plus tard (sous anesthésie et analgésie), après un rapide examen échographique (10mn, sous anesthésie et analgésie), pour permettre le prélèvement et l’analyse du tissu cardiaque.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont réalisées intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée, impliquant l’injection de substances en sous-cutané et une mise sous respirateur (pour la seconde chirurgie). Les animaux sont réveillés en fin de chirurgie, impliquant des soins post-opératoires adaptés aux gestes réalisés. Un délai de 15 jours entre les deux opérations permet un rétablissement complet de l’animal avant la seconde opération. Les examens échographiques (non invasifs) et prélèvements sanguins sont réalisés sous sédation ou anesthésie générale selon l’examen. Pour les groupes d’animaux avec infarctus, le développement d’une insuffisance cardiaque est attendu après la seconde chirurgie. Des points limites sont donc établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.
Devenir
Les animaux devront être mis à mort en fin d’expérimentation, avec prélèvement du cœur pour mesures de la taille d’infarctus ou analyses tissulaires (selon les groupes expérimentaux).
Remplacement
L’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de paramètres tels que l’activité électrique cardiaque, la fonction cardiaque ou la température corporelle, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. Il s’agit enfin ici de la mise en place d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque nécessitant par essence le recours à l’animal.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - Les approches chirurgicales et la compatibilité entres les méthodes de chirurgie, de mesures et d’imagerie seront au préalable validés sur des cadavres d’animaux mis à mort dans le cadre d’autres projets. - Les procédures seront réalisées de manière successive pour une validation par étape, limitant ainsi le nombre de tests et de groupe d’animaux au strict minimum nécessaire. - L’adaptation d’un protocole d’infarctus du myocarde déjà éprouvé au laboratoire nous permet de pouvoir comparer les résultats obtenus à nos données historiques, nous affranchissant d’avoir recours ici à des animaux pour l’un des groupes d’intérêt de ce projet. - Certains groupes seront réalisés en 2 sessions décalées : la première session comportera 2/3 des effectifs de chaque groupe. La seconde session (1/3 restant, au maximum) ne débutera qu’après analyse des résultats complets de la première session. De cette manière, l’interprétation des résultats de la première session nous permettra d’adapter au plus juste l’effectif et le sexe des animaux de la seconde session. Les effectifs ont été calculés afin d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
- Le présent projet doit permettre de valider une approche chirurgicale moins invasive que la méthode classique utilisée dans les études antérieures. C’est une approche que nous souhaitons pouvoir ainsi appliquer à nos futurs projets impliquant un infarctus du myocarde. - Le suivi de la température corporelle et de l’activité électrique cardiaque à l’aide d’un implant, en particulier en période post-opératoire, fournira des données importantes longitudinales supplémentaires sur l’état général des animaux en expérimentation. Ces données doivent nous permettre notamment d’optimiser nos conditions de réveil (température de la couveuse de réveil, timing d’extubation de l’animal, etc.) pour l’ensemble de nos projets impliquant un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté et largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires : Malgré certaines différences physiologiques telles qu’un rythme cardiaque plus rapide, la souris est en effet un modèle qui a fait ses preuves dans l’étude des mécanismes de la pathologie de l’infarctus du myocarde et de la cardioprotection. La procédure chirurgicale d’infarctus du myocarde nécessaire pour induire une insuffisance cardiaque est par ailleurs maîtrisée au laboratoire, nous permettant de profiter d’un excellent retour d’expérience. A l’inverse, ce projet doit justement permettre de raffiner davantage notre modèle murin d’infarctus du myocarde utilisé par ailleurs dans d’autres projets. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (6 à 16 semaines) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe.
Stress cellulaire et susceptibilité à l’accident de décompression (ADD) : étude de l’inflammation et de la coagulation.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, puis une plongée simulée en caisson hyperbare suivie d'une heure d'observation pendant laquelle un accident de décompression peut provoquer des symptômes douloureux. Le porteur indique que les rats seront tués dès l'apparition des premiers symptômes, et qu'ils sont tous mis à mort pour prélever sang et organes. Il justifie le recours à l'animal par l'absence de biomarqueur fiable et par l'étude sur "l'organisme entier".
Objectifs
L’accident de décompression (ADD) est un syndrome systémique survenant suite à la formation de bulles dans la circulation sanguine et dans les tissus lors d’une diminution de la pression environnementale. Les mécanismes de l’ADD sont encore aujourd’hui assez peu connus et cet accident est décelé uniquement sur la base des symptômes qu’il déclenche. Dans le but d’approfondir les connaissances sur le rôle de l’inflammation et de la coagulation dans la mise en place et la susceptibilité à l’ADD, nous allons étudier les réponses cellulaires de globules blancs et de plaquettes lorsque ces dernières sont exposées à différents stress rencontrés en plongée. L’objectif de ce projet est donc double : (i) confirmer/infirmer l’existence d’une relation entre la résistance à l’ADD et des modifications fonctionnelles des globules blancs et des plaquettes, (ii) étudier les différences liées au sexe dans les mécanismes de résistance à l’ADD.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’accident de décompression (ADD) ainsi que les mécanismes physiologiques impliqués dans la mise en place de ce syndrome. Ces travaux pourront être bénéfiques en santé humaine et plus particulièrement dans un cadre de prévention de l’ADD. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension de la sensibilité à l’ADD. Plus particulièrement, sur l’implication des réponses leucocytaires et plaquettaires face à une modification de la pression hydrostatique et de la pression de l’air. A moyen terme, l’intégration de ces réponses au niveau physiologique et la caractérisation du type de stress ayant eu un impact plus marqué sur les réactions cellulaires permettra d’orienter nos recherches futures. A plus long terme, la mise en évidence de facteurs de risque permettrait de prévenir l’ADD avant une plongée. La perspective d’avoir une meilleure approche sur les mécanismes de l’ADD permettrait de mettre en place des protocoles de décompression toujours plus fiables afin de mieux prévenir l’accident.
Procédures
Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire réalisé sous anesthésie / analgésie. Si cela est nécessaire, les animaux de l'étude préliminaire pourront être soumis à un deuxième prélèvement sanguin dans les mêmes conditions. Les deux prélèvements seront séparés d'une période de 3 semaines. Au minimum 4 semaines après le dernier prélèvement retro-orbitaire, les animaux seront soumis à un protocole hyperbare de 60 minutes au total suivi d'une période d'observation d'1 heure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : - Le stress lié à la préhension et à l’injection d'asnesthésiques / analgésiques. Ces nuisances légères ne durent que le temps de l’injection (1 – 2 minutes). - Une possible diminution de la température corporelle au cours de l’anesthésie. Cette nuisance est légère et dure environ 20 minutes. - Le prélèvement sanguin au niveau du sinus rétro-orbitaire entraine un stress. Ces nuisances ne durent que le temps du prélèvement (1 – 2 minutes). - L’angoisse lors de la plongée simulée. Cette nuisance est légère et dure 2h30 (temps de l’exposition hyperbare et temps d’observation). - La douleur induite par l’apparition de symptômes de l’ADD lors de la période d’observation. Ces nuisances seront modérées et très brèves (moins de 1 minutes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette procédure car nous avons besoin de prélever du sang et des organes afin de réaliser des analyses multiples (Cultures primaires, dosages sanguins (facteurs inflammatoires, facteurs de coagulation), histologie…).
Remplacement
Notre travail porte sur l’étude de la sensibilité à l’accident de décompression (ADD). Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler uniquement sur le modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident. De plus, l’accident de décompression est un syndrome systémique impliquant de nombreuses réponses autres que l’inflammation et la coagulation comme le stress oxydant et la dysfonction vasculaire par exemple. L’analyse des tissus post exposition hyperbare nous permettra de confronter nos résultats obtenus au niveau des globules et des plaquettes sanguines à ce que l’on observe sur l'organisme entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans cette étude a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et de permettre la réalisation d’une mise au point de la culture primaire (déterminer la quantité de cellules que nous pouvons mettre en culture suite au premier prélèvement, viabilité cellulaire…). Les tests statistiques utilisés intègreront 2 facteurs à étudier : susceptibilité à l’accident de décompression et sexe. De plus, après mise à mort des animaux, les prélèvements tissulaires vont nous permettre d’approfondir nos résultats de manière intégrée en sortie de plongée.
Raffinement
Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et les animaux sont suivis quotidiennement. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. Pour réduire au maximum la douleur du prélèvement sanguin, l’animal sera ponctionné sous anesthésie/antalgie. L’induction de l’anesthésie sera réalisée par voie gazeuse afin de réduire au maximum le stress lié à la préhension et à l’injection. L’animal sera placé sur tapis chauffant et sa température corporelle sera monitorée jusqu’au réveil. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux sont maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole de plongée utilisé limite au maximum l’apparition d’ADD sévère et les animaux seront mis à mort dès l’apparition des premiers symptômes pour réduire au maximum la souffrance.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, en particulier sur la souche Wistar qui est couramment utilisé au laboratoire afin de caractériser les mécanismes de résistances à l’accident de décompression. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement. Lors de l’étude préliminaire, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 8 et 11 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 15 semaines. Lors de l’étude définitive, le prélèvement sanguin sera réalisé à l’âge de 10 semaines et la plongée simulée dans le caisson hyperbare à l’âge de 14 semaines.
Effets thérapeutiques d’anticorps G6b-B monoclonaux et bispécifiques sur un modèle murin de thrombopénie induite à l’héparine (HIT).
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent de l'héparine et des anticorps par injections répétées, avec des prélèvements de sang quotidiens à la queue, pour modéliser une thrombopénie induite par l'héparine. Le porteur indique qu'une ablation de phalange sert au génotypage et peut être douloureuse et invalidante, et que les injections et prélèvements peuvent provoquer douleur et saignements, aggravés chez les souris thrombopéniques. Il conclut que ce processus complexe est difficile à reproduire in vitro et nécessite des souris modifiées.
Objectifs
Les plaquettes sanguines jouent un rôle majeur dans l’arrêt des saignements. Ce processus physiologique est finement régulé afin de permettre une réponse rapide, tout en prévenant le risque de thrombose (formation d'un caillot dans un vaisseau sanguin). L’héparine est un anticoagulant permettant de prévenir les thromboses, utilisé notamment lors de chirurgie. C’est l’un des anticoagulants les plus utilisés. Mais parmi les patients recevant de l’héparine, 1 à 3% vont développer une thrombopénie induite par l’héparine (HIT), une complication pouvant être potentiellement mortelle. Cette réaction provoque une thrombopénie (diminution anormale du nombre de plaquettes circulantes) suite à une activation anormale des plaquettes sanguines, pouvant également aboutir à une thrombose. L’objectif de ce projet est de cibler les récepteurs plaquettaires impliqués dans la régulation de l’activité des plaquettes sanguines. Le but étant de pouvoir empêcher ou prévenir des réactions telles que la HIT en ciblant ces récepteurs. Pour cela, nous voulons tester l’utilisation d‘anticorps qui permettent de cibler différents récepteurs : un récepteur inhibiteur de l’activité plaquettaire et les récepteurs activateurs impliqués dans la HIT. Notre hypothèse est que l’activation du récepteur inhibiteur va induire l’inhibition/inactivation du récepteur activateur, permettant ainsi de réduire ou prévenir le syndrome de HIT. Sur le long terme, cela pourrait permettre de développer une nouvelle stratégie thérapeutique dans le cadre d’une HIT ou d’autres syndromes impliquant une activation anormale des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet nous aidera à mieux comprendre le rôle de récepteurs plaquettaires dans l'activation des plaquettes et plus spécialement dans la réaction de HIT. A long terme, les différents anticorps que nous testons pourraient mener à de potentielles voies thérapeutiques afin de prévenir ou d'empécher par exemple la réaction de HIT.
Procédures
L'injection des traitements par voie intrapéritonéale (IP) ou d'héparine par voie sous-cutanée (SC) se feront sur souris vigiles. Chaque souris aura une injection IP au début de l'expérience (J0) et une injection SC quotidienne à partir de J1 pendant 4 jours. Ces procédures seront effectuées de manière rapide et efficace (moins d'une minute) afin de minimiser le stress induit par la préhension de l'animal. Un petit volume de sang sera prélevé à la queue de l'animal, après section ou retrait de la croute formée, de façon quotidienne pendant 5 jours (de J0 à J4) puis un dernier prélèvement aura lieu à J7 si nécessaire. Les anticorps à tester seront injectés par voie intraveineuse (IV) sous anesthésie, soit une fois au début de l'expérience (J0), soit quotidiennement pendant 3 jours (de J2 à J4) en fonction du protocole étudié. Pour le prélèvement de sang terminal, la durée de la procédure est inférieure à 10 minutes. Elle sera réalisée sous anesthésie et sera suivie de la mise à mort de l'animal avant son réveil.
Impact sur les animaux
La phalangectomie (PE1) utilisée à la fois pour le génotypage et l'identification des souris peut engendrer une douleur et peut avoir un potentiel caractère invalidant. Les injections intrapéritonéales ne présentent pas de douleur (PE2), hormis celle de l'insertion de l'aiguille. Pour les injections intraveineuses (PE2), les nuisances attendues sont une douleur et un risque de saignement suite à l’injection. Suite à la procédure, les animaux pourront présenter une thrombopénie. Les prélèvements à la queue peuvent engendrer une douleur et un saignement peut survenir après section de la queue, notamment chez les souris thrombopéniques.
Devenir
Les animaux seront injectés en intrapéritonéal et un prélèvement de sang à la queue sera réalisé, de manière quotidienne pendant 5 jours. A l'issue de cette procédure, le sang sera prélevé de manière terminale au niveau de l'aorte abdominale et tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
La thrombopénie induite par l’héparine est un processus complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire de façon complète in vitro. La compréhension de ces processus physiopathologiques est impossible chez l’homme : il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Pour induire une HIT et tester l’efficacité des différents anticorps, il est déterminant d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour l’expression des facteurs et récepteurs impliqués dans ce processus.
Réduction
La stratégie du développement de la nouvelle lignée est conçue pour impliquer le moins d’animaux possibles. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux utilisés pour cette étude est calculé afin d’obtenir suffisamment d’évènements informatifs et de permettre l’analyse de données statistiquement significatives. Un effectif de 3 expériences indépendantes est prévu afin de réaliser des tests statistiques permettant d’évaluer le rôle des récepteurs G6B dans la thrombopénie induite par l’héparine.
Raffinement
Le développement des bébés générés pour la nouvelle lignée sera observé attentivement afin de s’assurer que ces animaux ne présentent pas d’handicaps. Le phénotype de la lignée sera étudié et un passeport phénotypique sera réalisé. Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux entre 2 et 5 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Quelques croquettes sont déposées dans le fond de la cage afin d’aiguiser le comportement de recherche de nourriture. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites sera établie pour chaque procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire et ainsi limiter la souffrance. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduits au maximum. Pour cela, les injections intraveineuses ainsi que les prélèvements à la queue seront réalisés sous anesthésie générale et les souris seront maintenues sur une tablette chauffée à 37°C. Suite à l'injection intraveineuse, un anesthésique local sera appliqué pour éviter tout douleur. Pour le prélèvement de sang terminal, l'animal sera sous anesthésie générale et maintenu à 37°C. A la suite du prélèvement, l’animal sera sacrifié avant son réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour notre étude car des travaux publiés montrent la génération de souris génétiquement modifiées permettant d’induire ce syndrome de HIT. Pour réaliser notre étude, nous allons remplacer dans cette lignée le récepteur inhibiteur murin par le récepteur humain que l’on souhaite étudier afin de réguler l’activité des plaquettes. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet, à partir de 8 semaines, âge à partir duquel la croissance se stabilise. L’âge des souris n’étant pas un critère de choix, nous réaliserons des groupes homogènes en âge.
Réparation cérébrale post-AVC chez la souris : rôle de l’activation de la coagulation et de l’inflammation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.
Objectifs
En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.
Bénéfices attendus
L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.
Procédures
Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.
Impact sur les animaux
Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.
Réduction
Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.
Raffinement
Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.
Choix des espèces
En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.
Optimisation des conditions d’acquisitions par IRM des données anatomo-fonctionnelles
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Rats : 50
250 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent des injections de produits de contraste sous anesthésie pour régler les paramètres d'un appareil d'IRM, l'enjeu déclaré étant d'optimiser les réglages de l'imageur plutôt que de produire une connaissance biologique. Le porteur décrit ces injections comme n'entraînant "aucune douleur ou stress" puisque réalisées sous anesthésie, et prévoit la mise à mort des animaux de réforme après la séance comme des animaux extérieurs en fin de projet. Il affirme que le recours aux rongeurs est "inévitable" parce que l'étude porte sur "l'organisme en entier".
Objectifs
Notre service d’exploration non invasive du petit animal est équipé depuis Juin 2017 d’un imageur par résonance magnétique (IRM) 7T dont le diamètre utile est de 72 mm permettant son utilisation pour les projets de recherche précliniques du petit animal (souris, rat, marmouset). L'IRM est basée sur la mesure des propriétés magnétiques des tissus biologiques, permettant d'obtenir des informations anatomiques, fonctionnelles et métaboliques in vivo et de manière non traumatisante chez le petit animal. Afin de garantir le maintien du statut sanitaire des animaux durant tout le processus expérimental (prise en charge, analyse IRM, renvoi vers les différents sites de zootechnie d'expérimentation), notre service s’est doté d’installations (salle de préparation aménagée, PSM) et d’équipements (cellules de confinements compatibles IRM) spécifiquement développés en partenariat avec un fabricant d’équipements vétérinaires. Il s’agit de la première installation nationale complète permettant le maintien du statut sanitaire des animaux (souris, rat, marmouset) pour l’analyse par IRM. La demande concerne l’autorisation d’utilisation d’animaux pour l’optimisation des paramètres et des méthodes permettant la caractérisation anatomique et fonctionnelle par IRM sur des rongeurs (souris, rats). Ainsi, nous pourrons optimiser des méthodes adaptées à la cardiologie, la vascularisation, la diffusion de molécules d'eau, l'IRM fonctionnelle (cerveau), la mesure de la consommation d’oxygène dans le cerveau et la caractérisation des lipides dans les tissus adipeux par spectroscopie par résonance magnétique. Ces optimisations sont un préalable récurrent pour l’utilisation des nouvelles séquences d’IRM afin d'assurer la reproductibilité et un meilleur compromis sur la qualité de l'image pour les différents projets de recherche dans un environnement confiné, c'est-à-dire réalisées avec nos systèmes de confinement adaptés pour les rongeurs (souris et rats) et la configuration IRM ad hoc (résonateurs, antennes de surface). Les optimisations peuvent aussi inclure le recours à des agents de contraste. Ces agents de contraste, paramagnétiques (gadolinium) ou superparamagnétiques (oxyde de fer), permettent de modifier les temps de relaxation des tissus (foie, muscle, cerveau, cœur, etc.) de manière sélective et ainsi de mieux différencier les tissus sains et malades et les différentes régions anatomo-fonctionnelles.
Bénéfices attendus
L’optimisation de séquences en IRM permettra de réduire le temps que les animaux passent dans l’IRM lors des acquisitions. Ces optimisations permettent aussi de s’assurer de la reproductibilité de nos mesures et de la correcte visualisation des phénomènes physiologiques et physico-chimiques sur les différents modèles animaux qui seront étudiés.
Procédures
Des injections des produits de contraste pourraient être faites par voie intraveineuse ou par intrapéritonéale chez les rongeurs, selon la demande des utilisateurs. Sur des souris ou rats de réforme, on les injectera seulement une fois par projet de faisabilité. Pour des animaux commandés à des fournisseurs externes, le nombre d'injections par semaine sera maximum de 3 (une seule injection pourra être faite par jour). Il est important de mentionner que ces injections n'entrainent aucune douleur ou stress chez les animaux car elles sont faites sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Il s’agit des procédures non invasives, sans douleur et sous anesthésie.
Devenir
Pour les animaux de réforme la mise à mort est réalisée après la séance d'IRM. Pour les animaux des fournisseurs "externes", à la fin des acquisitions IRM, les animaux sont remis dans leur cage de vie et monitorés régulièrement jusqu'au réveil. Toutefois, ces animaux des fournisseurs externes seront sacrifiés à la fin du projet de faisabilité méthodologique.
Remplacement
L’utilisation des rongeurs est inévitable car nous travaillons sur des mécanismes intégratifs et donc sur l’organisme en entier.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de façon à permettre une validation statistique des résultats expérimentaux préliminaires, tout en tenant compte des exigences de réduction. Nous réutiliserons les animaux disponibles pour différents projets de recherche quand cela sera possible et selon les demandes des utilisateurs.
Raffinement
Les animaux sont surveillés quotidiennement et une procédure d’estimation et de suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé à 20% de perte du poids corporel (chez les adultes) avec repérage des signes de mal-être définis au préalable par notre vétérinaire référent. Les animaux provenant des fournisseurs externes auront une période d'acclimatation de 2 semaines au nouvel environnement avant de chaque procédure expérimentale à l'IRM.
Choix des espèces
Comme nous avons indiqué dans le point 3.4.11, nous n'utiliserons que des animaux âgés de plus de 10 semaines dans ce projet. La plupart des utilisateurs de notre service d’imagerie font leurs études sur des animaux âgés de plus de 10 semaines, basés sur la littérature scientifique et le modèle étudié. Du point de vue de l’IRM, l’âge des animaux n’a pas d’impact sur la qualité de l’image. Cependant, nous utilisons des animaux du même âge et taille pour mieux interpréter les données anatomo-fonctionnelles obtenues.
Etude des effets d’un candidat médicament dans un modèle d’Ischémie-reperfusion aigue chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 750
1 125 rongeurs, 375 souris et 750 rats, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils reçoivent un candidat médicament par gavage ou injection jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, avant une chirurgie provoquant une ischémie du cœur pouvant entraîner saignements et arythmies. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires pharmaceutiques, l'espèce étant choisie selon la demande du client. Il justifie le recours aux rongeurs par la mesure sur "organe entier" de la taille de l'infarctus.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque suite à l'obstruction d'une artère coronaire. Le défaut de vascularisation est alors responsable d'une diminution (occlusion partielle) voire un arrêt (occlusion totale) de l'apport d'oxygène (hypoxémie) et de nutriment au tissu cardiaque. On parle alors d'ischémie myocardique. La taille du territoire ischémié et la durée de l'occlusion ont un impact direct sur l'étendue des lésions nécrotiques appelées "lésions ischémiques" et la seule option pour limiter leur progression est de rétablir la circulation sanguine dans les artères coronaires, c'est la reperfusion. En l'absence de reperfusion, l'ensemble de la zone ischémiée va finir par nécroser. La revascularisation va permettre de réoxygéner et de réapprovisionner les tissus en nutriments. Cependant, cette revascularisation va être à l'origine de "lésions de reperfusion" qui vont venir s'ajouter aux lésions ischémiques déjà présentent. D’un point de vue thérapeutique, malgré la diversité des stratégies médicamenteuses et non médicamenteuses qui peuvent être mises en place, elles n’apportent pas à ce jour une réponse totalement satisfaisante (effets secondaires, pas efficaces chez tous les patients). Un des axes de recherche consiste à développer des traitements visant à limiter l'apparition des lésions ischémiques et/ou de reperfusion. Cela passe par la réalisation de tests effectués sur des modèles animaux aussi prédictifs que possible. L'un des modèles les plus classiquement utilisés pour tester l'efficacité de candidats médicaments est le modèle d'ischémie-reperfusion (I/R) in-vivo chez le rongeur (rat + souris) qui est le sujet de ce projet.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, en tant que prestataire de services pour différents laboratoires pharmaceutiques développant des candidats médicaments, nous sommes responsables de la partie in-vivo, à savoir l’administration du composé, la procédure d'ischémie reperfusion sur animaux anesthésiés ainsi que de l'estimation de la taille d'infarctus après prélèvements du myocarde sur ces mêmes animaux. L’ensemble de ces expérimentations sont réalisées dans le but de tester et d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces nouveaux composés au cours d’études pré-cliniques et ainsi d’obtenir des preuves de concept quant à leurs possibles efficacité et bénéfice pour la santé humaine.
Procédures
Lors de ce projet, les animaux seront possiblement traités avec le candidat médicament par des voies d’administration nécessitant le recours à des contentions manuelles (gavage, intra-péritonéale, sous-cutanée) ou en tunnels de contention (intra-veineuse), une anesthésie générale gazeuse (intra-veineuse) et l’usage dans certains cas d’aiguilles (intra-péritonéale, sous-cutanée, intra-veineuse). Les traitements pourront être administrés jusqu'à 3 semaines (maximum) avant la procédure d'ischémie-reperfusion à raison de 2 fois par jour pour les gavages et les administrations intra-péritonéales et sous-cutanées et 4 à 5 administrations intra-veineuses pourront être réalisées. L’évaluation de l’efficacité des nouveaux traitements se fera lors d’une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale chimique à l’issue de laquelle l’animale inconscient sera mis à mort.
Impact sur les animaux
Lors des traitements, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut s’avérer stressant pour les animaux. Certains traitements nécessiteront l’usage d’aiguilles pour effectuer les injections ou encore une anesthésie générant également un stress. A l’issue du projet, un protocole d'ischémie/reperfusion sera réalisé au cours d'une procédure chirurgicale sans réveil efféctuée sous anesthésie générale pouvant êrte à l'origine de saignements et d'arythmies importantes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure 1.
Remplacement
De nombreuses études expérimentales sur l'infarctus du myocarde utilisent les rats et souris. En effet, ces espèces possèdent un système cardiaque similaire à celui de l'homme et l'ensemble des paramètres mesurés lors d'une procédure expérimentale d'I/R sont identiques à ceux mesurés chez le patient humain. Ces espèces développent des lésions cardiaques reproductibles, ce qui en fait un modèle préclinique de choix. Son utilisation a permis de développer et de tester de nombreux candidats médicaments ayant donné lieu à des essais cliniques. L'espèce choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques. L’espèce choisie correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. L'objectif du projet étant d'obtenir une preuve de concept d'efficacité de ces nouveaux composés in vivo l'utilisation de rongeurs est nécessaire afin d'évaluer l'effet sur un organe entier (taille d’infarctus) et les conséquences fonctionnelles (pression artérielle, fréquence cardiaque).
Réduction
Les données préalables obtenues sur ce modèle ont permis d'établir les effectifs d'une série expérimentale à 75 animaux répartis en 5 groupes de 15 animaux. Le nombre d'animaux par groupe a pu être fixé à 15 sur la base de notre expérience passée et de nos données antérieures sur ce modèle ainsi que sur le retour d'expérience des responsables de projet. L'étude d’efficacité d’un composé constitue une série expérimentale. A raison de 15 séries expérimentales réparties sur 5 ans, le nombre total d'animaux pour ce projet est de 1125. L'analyse des données, notamment la quantification des tailles d'infarctus, sera effectuée en aveugle (sans connaissance des groupes) par une seule personne pour éviter tout biais dans l'évaluation de l'infarctus. Les données obtenues seront soumises à des tests statistiques adéquats (paramétriques ou non paramétriques) après un test de normalité des données. Des t-tests et/ou des ANOVA une voie seront réalisés entre les différents groupes afin d'évaluer l'efficacité du composé testé.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant leur durée d'acclimatation dans des cages aux dimensions conformes aux recommandations en vigueur et ceci jusqu'au protocole sans réveil. Des enrichissements multiples sont placés dans les cages. À réception, les animaux sont collectivement hébergés (3 ou 2 rats par cage selon le poids et 6 souris par cage). L'eau et la nourriture sont données ad libitum et les animaux ont accès à différents types d’enrichissements (cubes de bois, carrés de cellulose, rouleaux de carton). Lors de la chirurgie, les animaux seront profondément anesthésiés avec un mélange d’anesthésiques et analgésiques chimiques. Une analgésie centrale sera également administrée avant la procédure chirurgicale. L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent, formé et entraîné et une attention toute particulière sera porté au suivi des animaux afin de prévenir et de remédier au plus vite à toute apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites seront également fixés avant le début des expérimentations.
Choix des espèces
La grande partie des études expérimentales sur l'étude du développement de l'infarctus du myocarde utilisent les rats et souris. En effet, ces espèces possèdent un système cardiaque similaire à celui de l'homme et l'ensemble des paramètres mesurés lors d'une procédure expérimentale d'I/R sont identiques à ceux mesurés chez le patient. Ces espèces développent des lésions cardiaques reproductibles, ce qui en fait un modèle préclinique de choix. Son utilisation a permis de développer et de tester de nombreux candidats médicaments ayant donné lieu à des essais cliniques. L'espèce choisie lors de la procédure dépend exclusivement de la demande des laboratoires pharmaceutiques l’espèce choisie correspond à celle préalablement sélectionnée pour les données pharmacologiques et sur laquelle est présente l'expression de la cible thérapeutique. Des rongeurs adultes (à partir de 5 semaines) au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés dans ce modèle. -Rats de souche Wistar ou Sprague Dawley -Souris de souche C57BL/6J ou BalbC En tant que prestataire de services, le choix des animaux et des espèces utilisées pour chaque série expérimentale dépend de la demande des laboratoires pharmaceutiques. Les animaux utilisés seront nécessairement choisis parmi la liste ci-dessus.
Le rôle de PRL2 dans la lymphangiogenèse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
436 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes, des nouveau-nés et des adultes reçoivent des injections de tamoxifène, et une partie subit une chirurgie de prélèvement d'un fragment de peau du dos, pour étudier le rôle d'une protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Le porteur indique une euthanasie immédiate en cas de saignement péritonéal, de mort des embryons dans l'utérus ou de nouveau-nés délaissés. Les animaux sont mis à mort pour prélever plusieurs tissus, le remplacement étant écarté au motif que le développement embryonnaire ne se reproduit pas in vitro.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (la formation des vaisseaux lymphatiques) afin de comprendre les mécanismes de la formation des vaisseaux lymphatiques. Ce projet se divise en deux axes : (1) Déterminer si notre protéine d'intérêt est impliquée dans la lymphangiogenèse pendant le développement embryonnaire et à quel stade précisément. (2) Déterminer si cette protéine est impliquée dans la lymphangiogenèse chez l’adulte dans un contexte de cicatrisation de tissue.
Bénéfices attendus
La lymphangiogenèse est un sujet de recherche relativement récent et bien qu’il y ait des avancées majeures dans la compréhension de ce processus, beaucoup d’aspects restent encore à être étudier, notamment le rôle des régulateurs intracellulaires dans la formation des vaisseaux lymphatiques. Parmi ces régulateurs, nous avons principalement des protéines kinases et des protéines phosphatases. Dans ce projet, nous proposons d’étudier une protéine phosphatase qui a déjà un effet modulateur dans le développement vasculaire sanguin. Le système vasculaire sanguin et lymphatique ayant des mécanismes similaires, nous pensons que cette phosphatase aurait également un rôle régulateur sur la formation des vaisseaux lymphatiques. Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre phosphatase d’intérêt a un effet sur la prolifération et la migration des cellules endothéliales lymphatiques, mais également sur la formation de structure tubulaire par ces cellules. Ceci suggère que cette phosphatase pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la lymphangiogenèse. Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La lymphangiogenèse est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes ou les métastases. Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme adjuvant, comme les anti-angiogéniques, pourrait améliorer le traitement des cancers. Or, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre phosphatase d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Un total de 108 femelles gestantes recevront deux injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen sur deux jours consécutifs (E9-E10, E11-E12 ou E13-E14) et seront euthanasiées à E18. Un total de 208 nouveaux-nés recevront également 2 injections intrapéritonéales d’hydroxytamoxifen à P1 et P3 et seront anesthésiés à P7. 120 souris entre 8 et 10 semaines recevront 3 injections intrapéritonéales de tamoxifen par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection intrapéritonéale prend moins d'une minute par souris. Les souris injectées avec du tamoxifen subiront par la suite une chirurgie de 5 minutes pour un prélèvement de peau de 8 mm de diamètre sur le dos. Durant la chirurgie, elles seront sous anesthésie générale (isoflurane), sous anesthésie locale cutanée (crème Anesderm 5%) et sous analgésique (buprénorphine). Ces souris recevront ensuite une application quotidienne de vaseline (moins d'une minute par application) et seront ensuite suivies pendant une vingtaine de jours avant d’être euthanasiées. Les injections d'hydroxytamoxifen et de tamoxifen servent à induire l'extinction d'expression de notre protéines d'intérêt dans les cellules composant les vaisseaux lymphatiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, nous croiserons deux lignées de souris différentes afin d'obtenir une nouvelle lignée de souris avec une délétion spécifique de notre protéine phosphatase dans les cellules endothéliales lymphatiques. Au laboratoire, nous travaillons également avec une lignée de souris ayant une délétion ubiquitaire d'expression de notre protéine phosphatase et également une lignée de souris ayant une délétion spécifique de notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Aucun phénotype délétère n’a été observé chez ces deux lignées lors de l'extinction d'expression de la protéine. De ce fait, la lignée de souris que nous établirons pour projet ne devrait pas présenter de phénotype dommageable. Cependant, l’apparence et le comportement des animaux seront tout de même observés pour prévenir d’un quelconque phénotype dommageable. En cas de cachexie, de prostration, de tremblements ou d’autre comportement anormal, l’animal sera immédiatement sacrifié. La création de cette lignée de souris sera suivie et validée par la SBEA.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer la formation des vaisseaux lymphatiques. Les vaisseaux lymphatiques forment un réseau vasculaire dans le corps entier des animaux. Ainsi plusieurs tissus seront récupérés sur l'animal (oreille, diaphragme, mésentère et peau).
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse (formation des vaisseaux lymphatiques), autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire les conditions de développement embryonnaire et de cicatrisation in vitro. Le développement embryonnaire est un processus complexe où chaque étape est importante pour que la suivante puisse commencer. La formation des vaisseaux lymphatiques suit également cette logique et chaque étape importante a déjà été lié à un stade de développement particulier chez l'embryon de souris. Ainsi, le modèle murin nous permet d'étudier le rôle de notre protéine à des étapes précises de la formation des vaisseaux lymphatiques. La formation des vaisseaux lymphatiques implique également des interactions complexes avec d'autres cellules de l'organisme, comme les cellules immunitaires dans le cas d'une cicatrisation. Or ces interactions celulle-cellule sont difficile à reproduire car tous les mécanismes ne sont pas encore décrit.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, nous utiliserons 10 souris de chaque génotype/expérience. Expériences répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats). Nos génotypes d’intérêt premier sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous aurons aussi des animaux contrôle secondaire pour vérifier que le gène d'induction de la délétion n'a pas d'effet seul. Si aucun effet n’est observé lors des 2 premières expériences, nous exclurons ces souris par la suite pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée, ce qui est d’autant plus important lors de nos expériences au stade embryonnaire et post-natal, où le génotype n'est pas connu, pour limiter le nombre d’animaux. Nous ferons des croisements séparés pour les souris contrôle secondaire, afin de pouvoir les exclure facilement si nécessaire. Nombre maximal d’animaux estimé = 436. Les études statistiques seront réalisées grâce à un test ANOVA afin de comparer les différents groupes génotypiques entre eux dans chaque expérience.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections intrapéritonéales, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement au niveau de la cavité péritonéale, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour les femelles gestantes, en cas de mort intra-utérine des embryons la femelle sera immédiatement euthanasiée. Pour les nouveaux-nés, s’ils ne se nourrissent plus ou sont mis à l’écart, ils seront euthanasiés. Dans le cas des tests de cicatrisation, un analgésique et un anesthésiant local seront utilisés en plus de l’anesthésie générale lors de la chirurgie et les souris seront placées sur un tapis chauffant. Suite à la chirurgie, de la vaseline sera appliquée quotidiennement pour couvrir la plaie et la maintenir humide. Pour ne pas influencer les résultats, l’utilisation d’un désinfectant ne se fera qu’en cas d’infection ou de suppuration. Si l’état de l’animal s’aggrave et sans amélioration après traitement, il sera sacrifié. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. Pour les femelles gestantes ou avec des petits, il y aura un enrichissement de la litière en copeaux et des accessoires de nidification. Pour les animaux en cicatrisation, les cages seront aménagées pour que chaque animal soit isolé, mais avec un contact visuel et olfactif avec son congénère. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi hebdomadaire. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle d'une protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse, autant au niveau développemental que chez l’adulte. Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. Par des tests fonctionnels in vitro, nous avons déjà établi que la diminution d’expression de notre protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques formant les vaisseaux impacte les processus biologiques essentiels à la lymphangiogenèse. Afin de confirmer l’importance de cette protéine phosphatase dans la formation des vaisseaux lymphatiques, nous voulons donc passer à un modèle murin avec une délétion spécifique de la protéine dans les cellules endothéliales lymphatiques. La lignée de souris de notre projet sera obtenue par le croisement de deux lignées déjà existantes et cette lignée permettra de déléter spécifiquement notre protéine phosphatase au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra ainsi d’étudier le rôle de notre protéine dans la formation des vaisseaux lymphatiques, aussi bien au niveau développemental que chez l’adulte. Les procédures au niveau dévelopemental impliquent 2 injections d’hydroxytamoxifen à des femelles gestantes au stade embryonnaire E9-E10, E11-E12 ou E13-E14. Ces stades de développement correspondent à différentes étapes importantes de la formation du système vasculaire lymphatique : formation des sacs lymphatiques, développement des vaisseaux collecteurs et formation des valves. Les embryons seront récupérés à E18 pour analyse du réseau lymphatique. Pour le développement vasculaire lymphatique post-natal, des nouveaux-nés recevront 2 injections d’hydroxytamoxifen, à P1 et à P3, et seront sacrifiés à P7. Pour définir le rôle de notre protéine phosphatase dans la lymphangiogenèse chez l’adulte, nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 10 semaines pour les expériences de cicatrisation. Cela nous assure une cicatrisation optimale de la plaie avec un système immunitaire performant pouvant induire la lymphangiogenèse.
Rôle de l’Amphiréguline dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant de l'anesthésie sans réveil ou un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est posé sous anesthésie, puis un arrêt cardiaque de huit minutes est provoqué et suivi d'une réanimation, certaines étant tuées une heure après pour prélèvements, d'autres suivies pour évaluer leur survie. Le porteur soutient, littérature à l'appui, que le coma consécutif à l'arrêt cardiaque n'entraîne pas d'inconfort, et prévoit une analgésie préventive. Il présente le contrôle de la fuite capillaire comme répondant à un "besoin médical majeur".
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez 19 patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’amphiréguline comme cible d’intérêt particulier du fait de son tropisme vasculaire. L’association entre la concentration plasmatique d’AMPHIREGULINE et la fuite capillaire a été confirmée dans une cohorte indépendante de 77 patients. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’AMPHIREGULINE permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’AMPHIREGULINE dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Chaque animal ne sera inclus que dans une procédure. Ces procédures comprendront : - la pose d'un abord vasculaire (cathéter veineux) qui sera réalisé sous anesthésie générale après une analgésie prophylactique. - un arrêt cardiaque long (8min) puis une réanimation cardiopulmonaire - une surveillance de l'animal après cardiaque avec soit une euthanasie à 1h de l'arrêt cardiaque pour quantification de la fuite capillaire, soit une évaluation de la survie. - une surveillance continue du bien être animal avec si nécessaire une analgésie supplémentaire L'ensemble de l'intervention dure entre 1 et 24 heures en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle (DAP 23817). Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit.) L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’AMPHIREGULINE régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. - Procédure 1 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 2 : Effectif fixé à 92 souris - Procédure 3 : Effectif fixé à 40 souris - Procédure 4 : Effectif fixé à 117 souris - Procédure 5 : Effectif fixé à 92 souris Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire - Une analyse échographique sera couplée à l’analyse lors de la procédure 1 - Les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés 3) Notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et le modèire : le, de façon à ne par duppliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : - Pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours de ces cinq procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure. - L'ensemble de la procédure de pose d'abord vasculaire sera réalisée sous anesthésie générale - Les procédures 1 et 4 sont entièrement réalisées sous anesthésie générale - Pour les procédures 2, 3 et 5, l’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures (soit jusque H+8 de l’arrêt cardiaque puis toutes les 4 heures le jour et toutes les 8h la nuit. - L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. - Les euthanasies seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle (APAFIS#23817)
Impact de l’absence de Npc1 sur la mobilisation des réserves de calcium contrôlées par SERCA3.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
16 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, anesthésiées puis tuées avant tout réveil. Leur cœur est exposé pour prélever le sang par ponction intracardiaque et isoler les plaquettes, afin d'étudier la mobilisation du calcium en lien avec l'activité plaquettaire. Le porteur indique que les plaquettes se conservent mal et que leur production in vitro reste limitée, ce qui l'amène à conclure que l'accès à ces animaux mutants est "la seule approche" possible. Les retombées thérapeutiques annoncées, des antithrombotiques sans risque de saignement, restent formulées comme une perspective.
Objectifs
Le calcium fonctionne comme un messager dans les cellules. Il contrôle ainsi de nombreux mécanismes d'activation cellulaire et nous cherchons à comprendre comment se construisent ces messages afin de mettre au point de nouvelles thérapies. L'objectif de ce projet est d'évaluer si l'absence d'un lipide précis chez une souris modifiée génétiquement, se traduit par un défaut de mobilisation de calcium dans les plaquettes sanguines, calcium qui est impliqué dans l'activation de ces cellules qui jouent un rôle majeur dans l'arrêt du saignement.
Bénéfices attendus
Le blocage de la mobilisation du calcium semble réduire l'activité des plaquettes sanguines, ce qui pourrait réduire les accidents ischémiques (AVC, Infarctus). L'identification des mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité des plaquettes ouvre une nouvelle voie thérapeutique permettant des traitements anti-thrombotiques sans risque de saignement.
Procédures
Les souris sont sous anesthésie générale profonde pour ne ressentir aucune douleur. Un prélèvement sanguin est réalisé par ponction intracardiaque et les plaquettes sanguines sont isolées. L'intervention ne dure que quelques minutes (moins de 5 min).
Impact sur les animaux
contention et injections d'anesthésie/analgésie
Devenir
Les souris sont euthanasiées à la fin de la procédure car pour optimiser la qualité du prélèvement de sang, le cœur est exposé afin de permettre l'insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche.
Remplacement
Les plaquettes sont des éléments cellulaires très fragiles dont la conservation est d’une durée très faible (quelques heures) et dont la production in vitro est encore très limitée. Pour caractériser le signal calcique des plaquettes, il faut utiliser des plaquettes isolées à partir du sang. Les mécanismes que nous étudions ont été observés dans les plaquettes de souris génétiquement modifiées. La possibilité d'avoir accès à ces animaux est aujourd'hui la seule approche pour la concrétisation de ce projet.
Réduction
Pour ce projet, nous avons calculé le nombre d'animaux de façon à obtenir des résultats reproductibles et de prendre en compte la possibilité d'une différence de résultats entre les mâles et les femelles. Les plaquettes issues de chaque animaux seront étudié en utilisant à chaque fois deux des activateurs principaux des plaquettes à plusieurs doses pour être sûr de pouvoir utiliser les données obtenues avec chacun des animaux utilisés.
Raffinement
Au cours de sa captivité en animalerie, le bien-être de l’animal est contrôlé tous les jours et nous avons établi un score concernant les conditions générales de façon à pouvoir définir les points limites pour permettre d'éviter la douleur à son minimum. A leur arrivée, les animaux pourront s’acclimater pendant au moins une semaine. La nourriture sera renouvelée toutes les semaines et nous nous assurerons que les animaux aient une consommation régulière. Pour la procédure, les souris sont anesthésiées. Après l'anesthésie, l'animal est surveillé (respiration, réflexe) pour s’assurer que l’animal ne se réveille pas et reste insensible à la douleur. Si l’animale montre de signe de réveil, mouvement de la patte, une nouvelle dose d’anesthésiant lui sera immédiatement administrée.
Choix des espèces
L’espèce animale sélectionnée pour ce projet est la souris. Nous utilisons cette espèce car elle partage de nombreuses voies de signalisation plaquettaire avec l'homme. Et c'est en utilisant ce modèle animal que nous venons de mettre en évidence cette nouvelle signalisation. De plus le modèle murin permet l'utilisation d'animaux transgéniques qui fournissent des plaquettes sanguines portant ces mutations et qui sont impossible à produire in vitro. La possibilité de disposer d’une lignée génétiquement modifiée est un atout essentiel pour montrer ces effets protecteurs et permettre de développer une approche thérapeutique par la suite. Les souris seront utilisées à taille adulte permettant de récupérer un volume de sang suffisant pour purifier suffisamment de plaquettes de bonne qualité.