Système cardiaque

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ligature partielle de la veine cave pour provoquer une thrombose veineuse, puis une injection de vésicules extracellulaires, pour étudier leur rôle dans la coagulation. Le porteur reconnaît un stress et une douleur liés à la chirurgie. La mise à mort se fait par surdosage anesthésique afin de récupérer le caillot formé.

Objectifs

La thrombose est un sujet de santé publique important puisqu'elle touche environ 70000 personnes par ans en France. L'étude des vésicules extracellulaires dans ce domaine est prometteur car elles sont de potentiel biomarqueur du risque de thrombose. Les vésicules extracellulaires sont produites par toutes les cellules de notre corps et sont impliquées dans de notre processus grâce à leur contenu en protéine. Des travaux préliminaires ont montré qu'elles transportent des protéines décrites dans les processus de coagulation, c'est à dire de formation des caillots mais également dans la dégradation, la lyse, de celui-ci. Ce projet a donc pour but de montrer la contribution des vésicules extracellulaires dans la formation et la dégradation de ces caillots.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du rôle de ces vésicules extracellulaires dans la formation des caillots permettra d'améliorer la prise en charge des patients. En effet, le dosage des vésicules extracellulaires à partir d'un prélèvement sanguins chez les patients permettrait de les classer en fonction de leur risque de thrombose et ainsi d'instaurer un traitement préventif pour éviter l'apparition d'un caillot.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à une ligature partielle de la veine cave inférieure pour produire un phénomène de stase veineux pour reproduire les conditions de formation de thrombose veineuse profonde humaine. Cette intervention est de courte durée, environ 15 minutes. Les animaux recevront une injection de vésicules extracellulaires par voie caudale 30 minutes après l'intervention. De plus les animaux recevront par injections des traitements antidouleurs toutes les 12 heures après la chirurgie.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir une période de stress et/ou de douleur liée à la procédure de chirurgie qui sera exercée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par un surdosage en anesthésiant à la fin de la procédure dans le but de récupérer le thrombus formé dans la veine cave inférieure. Nous effecturons différentes analyses sur celui-ci et nous procèderons à un prélèvement sanguin de l'animaux pour mesurer différents paramètres reflétant les mécanismes de coagulation et de fibrinolyse chez l'animal.

Remplacement

Des expériences réalisées in vitro, dans le but d'étudier l'impact du profil coagulolytique de vésicules extracellulaires, nous ont permis de mettre en évidence leur mise en jeux lors de la formation et de la lyse d'un thrombus. Mais ces modèles in vitro sont très simplifiés. En effet, la formation d'un thrombus in vivo est un processus complexe mettant en jeu de nombreuses entités cellulaires, sub-cellulaires et protéiques. L’étude d'un système aussi complexe n’existe pas in vitro d’où la nécessité de l’explorer in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux strictement nécessaire pour atteindre un résultat significatif a été calculé. Avec comme objectif de résultat une diminution de 50% de la prévalence de formation d'un thrombus dans la veine cave inférieure 10 animaux seront nécessaires par bras expérimental.

Raffinement

L'angoisse des animaux sera dépistée et évitée. Les animaux seront hébergés en groupe (5 individus par cages) dans des conditions d'accès à l'eau et l'alimentation et leur milieu sera enrichi (sous la forme de carré de coton pour fabriquer leur nid) afin de limiter le stress. Des visites régulières post-chirurgie seront effectuées toutes les 12 heures pour s'assurer du bien-être de l'animal grâce à différents critères d'apparence générale (amaigrissement et posture), d'apparence de la peau et du pelage, et de l'interaction avec les autres animaux (hyperactivité, hypoactivité, prostration). Ces observations peuvent conduire à l'euthanasie de l'animal si les points limites sont franchis (par exemple une perte de poids importante). De plus, lors de ces visites une injection d'antalgique sera effectué pour limiter la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle in vivo disponible le plus simple à exploiter aux vues des données existantes dans la littérature, de sa taille et de sa disponibilité. Les animaux seront utilisés entre 6 et 8 semaines de vie (poids compris entre 18 et 25g) ce qui permet d'avoir un modèle comparable aux données décrites dans la littérature.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur leur implante par chirurgie un capteur d'électrocardiogramme, leur administre par gavage des molécules anticancéreuses connues pour leur cardiotoxicité et suit leur cœur par échocardiographie sous sédation. Toutes sont ensuite euthanasiées pour prélever le cœur. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne remplace l'étude du cœur dans un organisme "entier", tout en menant en parallèle des travaux sur cardiomyocytes issus de cellules humaines.

Objectifs

Le projet consistera à évaluer de nouvelles options thérapeutiques pour traiter le cancer. Il concerne le développement d’approches basées sur la nanotechnologie, en particulier l’incorporation des molécules dans des formulations nanostructurées. Il s’agira d’étudier les effets bénéfiques espérés de deux nouveaux systèmes de vectorisation pour une molécule déjà utilisée dans la maladie de Chagas et repositionnée pour traiter le cancer, et pour une autre molécule de référence très efficace mais cardiotoxique. Nous évaluerons les effets bénéfiques des deux formulations chez la souris.

Bénéfices attendus

La nanomédecine est une stratégie innovante émergente. Elle vise à mieux contrôler le niveau plasmatique de médicaments et à réduire leur toxicité tout en préservant leur efficacité. Par exemple, des molécules incorporées dans des nanostructures séjournent plus longtemps dans l´organisme ; ce qui améliore leur efficacité à dose plus faible et leur tolérance. L’un des deux médicaments testés est déjà utilisé pour traiter la maladie de Chagas. Il est actuellement évalué dans une stratégie de repositionnement comme traitement d'appoint anticancéreux. Son incorporation dans dans une formulation nanostructurée est prometteuse. Nous comparerons les effets de ce médicament nanoformulé avec ceux d’une molécule de référence, qui sera elle aussi nanoformulée pour supprimer ou atténuer sa cardiotoxicité latente. Nous déterminerons la meilleure option thérapeutique possible pour traiter le cancer. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les animaux auront deux à trois échocardiographies (de 15 à 20 minutes chacune) au cours des traitements et, si nécessité de suivre une évolution de leur statut cardiaque, entre une et trois échocardiographies en post-traitement. Les enregistrements se font sous anesthésie légère et sont non-invasifs. L’acquisition d’ECG se fera en ambulatoire (animal vigile, libre de mouvement, dans son environnement) avant et au cours du traitement. Il n’y a aucun intervention particulière (enregistrement neutre pour l’animal). Une chirurgie préalable est réalisée en amont (10 jours avant le premier enregistrement) pour l’implantation du capteur-émetteur de l'ECG.

Impact sur les animaux

Les traitements administrés sont une source potentielle d’effets indésirables chez les animaux. Nous limiterons ces nuisances par un traitement à une dose moyenne et de durée minimale permettant toutefois d’avoir un effet détectable, quantifiable, et actionnable avec des points limites bien définis. L’une des molécules testée est utilisée chez l’homme pour traiter la maladie de Chagas, elle-même source d’insuffisance cardiaque et d’arythmies. Sa cardiotoxicité est donc difficile à apprécier et donc peu documentée. Nous avons montré des effets cellulaires qui pourraient, possiblement, affecter la contraction cardiaque et induire des troubles du rythme. La cardiotoxicité subclinique de l’autre molécule testée, mieux connue chez l'homme, est définie par échocardiographie cardiaque. Elle est donc plus ou moins attendue chez la souris et devra être surveillée. Il est à noter que les deux formulations avec ces deux molécules sont censées diminuer toute toxicité éventuelle. Le gavage peut également une cause de stress qui peut cependant être limité (brièveté de l’acte, expertise de l’expérimentateur). L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Elle est non-invasive. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo et rend possible un suivi des animaux au cours du temps. Le stress subi par les animaux se limite à la manipulation (période courte, 10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie, l’animal est vigile et maintenu dans son environnement habituel, sans stress. Cette approche permet de gérer de façon optimale la période post-opératoire après implantation des capteurs de télémétrie. La nuisance que représente l'étape chirurgicale au cours et après l'implantation sous-cutanée des capteurs est prise en charge par sédation/analgésie. Le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie pratiquée au cours de l’étude, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal, et une diminution des artéfacts.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin des procédures pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

L'une des deux molécules testées est un médicament anticancéreux de référence, mais entaché d’effets cardiotoxiques. Des approches in-vitro et in-vivo ont permis d’envisager l’utilisation d'une autre molécule déjà utilisée pour traiter la maladie de Chagas. L’évaluation d’éventuels effets cardiotoxiques est fondamentale pour poursuivre cette piste. Des études antérieures, réalisées dans notre laboratoire, ont montré des effets cellulaires pouvant être source d'arythmies cardiaques in vivo. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution idéale pour l’évaluation des effets cardiaques dans un organisme « entier ». Le cœur est un organe complexe, en interaction avec de nombreux autres systèmes (systèmes nerveux autonome, neuroendocrines, etc…). L'approche in vivo est donc nécessaire pour étudier des molécules libérées à partir de nanostructures comme cela est notre cas. Nous comparerons les effets potentiels de notre molécule d'intérêt repositionnée avec ceux de notre molécule anticancéreuse de référence, après incorporation dans des nanostructures censées diminuer leur cardiotoxicité. En parallèle, nous mènerons des études mécanistiques sur des cardiomyocytes dérivés de cellules iPS humaines pour limiter les investigations chez l’animal. Les données seront replacées dans leur contexte d'utilisation et des connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix utilisées chez l’homme en clinique : l’électrocardiograhie (ECG) et l’échocardiographie. Elles permettent un suivi de la fonction cardiaque au cours du temps. Cela permet d’augmenter la puissance statistique et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour des mesures répétées et peu, voire non-invasives, au cours du temps. Les animaux ne sont pas sacrifiés après chaque examen (étape) nécessaire à l’étude. Chaque animal est son propre témoin. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études précédentes similaires. Pour limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, nous étudierons aussi les effets électrocardiographiques avec une méthode d’enregistrement simplifiée de l’ECG. Cette approche a de nombreux avantages : elle est techniquement simple, peu coûteuse, avec un court temps de mesure et facile à mettre en œuvre pour un dépistage d’altérations évidentes. En cas d’altérations significatives, et seulement si, une mesure d'ECG en ambulatoire (sur des animaux vigiles) serait alors mise en œuvre pour approfondir les effets. Notre expérience et une analyse statistique a permis de définir le nombre minimum mais suffisant d'animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental pour les deux procédures. Chaque animal étudié sera utilisé en fin de protocole après sacrifice pour mesurer des caractéristiques histologiques, biochimiques et moléculaires. Les données numériques seront moyennées +/- l'écart-type. Nous exécuterons un test normalité de D'Agostino-Pearson (symétrie et distribution Gaussienne) pour chaque ensemble de données indépendantes avec une analyse des variances pour les comparaisons par one-way ANOVA et un test post-hoc (Bonferroni or Tukey) pour comparer les paires de données.

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives et performantes (échocardiographie, électrocardiographie) utilisées chez l’homme afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques acquis. Notre objectif est également de réduire au strict minimum la quantité de détresse imposée aux animaux. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, à savoir en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), enrichissement du milieu (jouets, tunnel, cell nest; carrés de coton pré-découpés, etc…) pour répondre à leurs besoins physiques et comportementaux, détresse éventuelle, points limites et arrêt anticipé de la procédure en particulier si des effets indésirables intervenaient durant le protocole.

Choix des espèces

Les modèles murins sont utilisés en laboratoire pour des études pré-cliniques, et en particulier pour des investigations pharmacologiques. D’une manière générale, le modèle souris est de très loin le plus utilisé de tous les modèles animaux. Les paramètres cardiaques morphologiques et fonctionnels chez la souris normale sont parfaitement connus, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante; ce qui élargit les possibilités de comparaison et d’interprétation des résultats avec les études déjà effectuées dans le domaine. Nous utiliserons des souris Swiss, une souche hétérogène avec un pourcentage élevé d'hétérozygotie au niveau des allèles, car elles imitent le mieux la variabilité génétique de la population humaine typique. Les animaux seront réceptionnés au stade adulte, à 2 mois. Ils seront utilisés après la phase d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal).

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques, elles reçoivent pendant vingt-huit jours deux médicaments par gavage, avec incision de la veine de la queue pour mesurer la glycémie et échocardiographie sous anesthésie, pour tester une association contre la néphropathie diabétique. Le porteur indique que le diabète expose les animaux à un risque de déshydratation et d'hypothermie, pris en charge par du sérum et un tapis chauffant. Il juge "indispensable" de travailler sur un "organisme vivant en entier" et présente l'effet bénéfique de l'association au conditionnel.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) consiste essentiellement en l’amélioration du contrôle glycémique, la réduction du risque cardiovasculaire, un meilleur contrôle de la pression artérielle, l'inhibition du système rénine-angiotensine (SRA) et plus récemment, l’inhibition du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2). Les patients présentant une ND sont de plus en plus fréquemment soumis à un double traitement composé d’un bloqueur du SRA associé à un inhibiteur SGLT2. Toutefois, bien que cette approche soit efficace, la progression de la ND n’est freinée que dans 39% des cas. Cela démontre que les traitements actuels ne sont pas optimums et que les efforts de recherche doivent s’intensifier afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable. Ainsi, nous étudierons les effets combinés du bloqueur CB1R INV202 et l’inhibiteur SGLT2 Empaglifozine dans deux modèles de souris diabétique de type 2 présentant les principaux symptômes retrouvés au cours de la pathologie humaine dont la perte de fonction glomérulaire, le développement de fibrose ou encore la présence d'une forte inflammation. L’objectif secondaire sera de déterminer si cette approche pharmacologique entraîne une amélioration de la fonction cardiaque particulièrement impactée par la présence d’un diabète non ou mal contrôlé. Cet aspect se fera de manière non-invasive via la technique d’échocardiographie.

Bénéfices attendus

Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. En effet, selon les derniers chiffres de l’atlas de la Fédération Internationale du Diabète, le nombre d’adultes souffrant de diabète dans le monde est passé de 151 millions en 2000 à 463 millions en 2019. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu qu’une fois, après 9 semaines de régime afin de sélectionner les souris diabétiques. Les souris seront anesthésiées puis rasées sur le ventre afin de procéder à une échocardiographie avant et après traitement pharmacologique. L’ensemble de la mesure se fait en 45 minutes maximum. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Dans ce projet, nous allons utiliser des souris diabétiques. Les procédures prévues dans ce projet ne provoqueront pas de contraintes indues. Toutefois, le diabète pouvant conduire à un risque accru de déshydratation et d’hypothermie, nous opérerons un suivi quotidien des animaux afin de détecter tout dommage imprévu et ainsi intervenir pour soulager/abréger toute souffrance. Ainsi, les cages seront posées sur des tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie et en cas de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Enfin, les souris diabétiques sont susceptibles de développer une polyurie marquée, nécessitant un changement de litière plus fréquent. Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empaglifozine ou INV202+Empaglifozinee de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte.

Raffinement

Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 5 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. A 9 semaines, les animaux seront soumis à un régime riche en protéines pour une durée de 9 semaines dont les 4 dernières correspondront aux interventions pharmacologiques. Cette intervention commencera donc lorsque les animaux auront 14 semaines et se terminera à l’âge 18 semaines. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète de type 2 et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte. Pour une raison de coût financier, les animaux seront commandés à l’âge de 4-5 semaines et seront hébergés dans notre animalerie en attendant d’avoir 9 semaines d’âge.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras de douze semaines pour induire obésité et diabète, une chirurgie de constriction de l'aorte par thoracotomie que le porteur associe à une mortalité de 10 %, une injection de virus AAV, puis des mesures cardiaques, pour tester l'effet protecteur d'une protéine, la myotubularine MTM1. Les bénéfices sont annoncés au conditionnel, comme une "nouvelle perspective thérapeutique". Le porteur conclut qu'il n'existe pas de modèle in vitro permettant de "s'affranchir" du modèle animal.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les effets de la surexpression de la myotubularine MTM1 dans la progression de l'insuffisance cardiaque chez la souris, notamment dans un contexte lié à l'obésité. Nos résultats in vitro sur des cellules cardiaques en culture montrent que la surexpression de MTM1 réduit le stress oxydant et préserve les fonctions mitochondriales au cours d'un stress. Ces résultats suggèrent un effet protecteur de MTM1 et ouvrent la voie à des essais in vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les effets protecteurs de la surexpression de MTM1 dans l'insuffisance cardiaque liée à l'obésité, d'étudier les mécanismes moléculaires impliqués et de proposer la myotubularine MTM1 comme nouvelle perspective thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 interventions différentes: 1/ un régime riche en graisse (60%kcal) pendant 12 semaines afin d'induire un phénotype obèse et diabétique de type 2; 2/ une procédure chirurgicale visant à réaliser une constriction de l'aorte afin d'induire un stress cardiaque, pendant 4 semaines; 3/ une injection iv par la veine caudale de virus associés aux adénovirus (AAV) permettant de surexprimer la myotubularine MTM1; 4/ une échocardiographie transoesophagienne afin de mesurer la fonction cardiaque des animaux; 5/ une mesure de la composition corporelle (echoMRI).

Impact sur les animaux

Le régime HFD 60% induit un phénotype obèse et peut entrainer des difficultés de déplacement des animaux, l'apparition d'un diabète, le graissage du pelage des animaux, une polyurie/polydipsie. Par conséquent, les animaux soumis à un régime HFD auront un suivi plus précis avec des remplissages des biberons d'eau et changes de litières plus fréquents si nécessaire. La chirurgie TAC étant une procédure chirurgicale invasive impliquant une thoracotomie, elle peut entrainer une mortalité post-opératoire (précédemment observée à 10% de l'effectif). Les AAV sont utilisés en thérapie génique et vaccinologie. Plus spécifiquement, les AAV-MTM1 sont actuellement en essais cliniques pour des thérapies géniques sur le chien (labrador) et chez l'homme atteints par la myopathie myotubulaire liée à l'X (pathologie consécutive à une mutation de MTM1). L’échocardiographie transoesophagienne est réalisée sous anesthésie gazeuse (isoflurane 2%) et n’entraîne pas de nuisances pour l’animal. La mesure de la composition corporelle est réalisée sur animal vigile et acclimaté.

Devenir

Tout les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Quand cela est possible, le modèle animal sera remplacé par des techniques in vitro. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle pas de modèle in vitro permettant de s’affranchir du modèle animal.

Réduction

Le critère principal de jugement sera la mesure de la fraction d'éjection (EF) et de raccourcissement (FS) du ventricule gauche. Des données de la littérature nous permettent de prévoir que nos groupes expérimentaux doivent comporter 12 individus afin d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les doublons expérimentaux seront évités, et des mesures strictes seront appliquées afin de réduire la douleur pendant les procédures expérimentales: anesthésie, tapis chauffant, monitoring global de l'animal. Un suivi journalier est mis en place par un zootechnicien qualifié afin de détecter le plus précocement possible la souffrance éventuelle de l’animal. Les signes de douleur spécifiques de la souris seront surveillés, comme la prostration, perte de poids, absence de toilettage.

Choix des espèces

Ce projet vise à caractériser les effets de la surexpression de MTM1 sur la progression de l'insuffisance cardiaque. Ces aspects complexes et interconnectés ne peuvent être reproduits qu'in vivo sur des modèles expérimentaux. Seul l'animal vivant peut permettre d'évaluer ces paramèters et il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs. Les animaux utilisées seront âgées de 2 mois (jeune adulte). Les souris de 2 mois sont les plus réceptives à la chirurgie TAC et les plus sensibles à l'induction par AAV (des souris plus âgées ont été décrites comme pouvant être résistante à l'induction).

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines sont irradiées pour une greffe de moelle osseuse, toutes suivent un régime gras de douze semaines avec prélèvements sanguins répétés, pour étudier l'inflammation des artères dans les maladies cardio-métaboliques. Elles sont tuées par dislocation cervicale, surdosage d'anesthésique ou CO2 selon les expérimentateurs. Le porteur affirme que ces pathologies complexes rendent l'approche in vivo "indispensable" et que le dépôt de cholestérol ne peut s'étudier in vitro.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de décès dans le monde. Récemment, l'inflammation (réponse de l'organisme à une agression) est apparue comme une composante centrale dans l'apparition de ces maladies mais les mécanismes restent encore inconnus. Le dérèglement des cellules du système immunitaire est souvent associé à l'inflammation et à la progression des maladies cardiovasculaires dites cardio-métaboliques, dans lesquelles un dysfonctionnement du métabolisme cellulaire (utilisation des matières nutritives pour fabriquer de l'énergie) aboutit au développement de ces maladies. Plus précisément, au sein des vaisseaux sanguins, un type particulier de cellules immunitaires, appelé les macrophages, joue un rôle important dans l'élimination des déchets pour éviter l'encrassement des vaisseaux qui provoque une inflammation et le développement de plaques d'athérome (plaques de gras bouchant les artères). Cependant, une surcharge en déchets et en cholestérol sanguin dérégule le métabolisme des macrophages qui ne sont plus capables d'exercer leur rôle d'"éboueurs" des vaisseaux. Le métabolisme cellulaire dépend d'une organelle qu'on appelle la mitochondrie qui permet de transformer les nutriments en énergie. De récentes publications ont montré l'importance de la dérégulation des mitochondries dans le développement de l'inflammation. En particulier, une modification de la structure des membranes des mitochondries entraine des perturbations quantitatives et qualitatives de ces organelles. Les membranes mitochondriales ont une structure spécifique qui dépend de lipides spécifiques appelés phospholipies mais leurs rôles dans la fonction mitochondriale des cellules immunitaores restent inconnus. Néanmoins, leur quantité dans le sang est souvent associé aux maladies cardio-métaboliques. Ce projet vise donc à identifier le rôle de la synthèse des phospholipides dans les macrophages. Pour cela, des approches génétiques d'invalidation de gène seront réalisées. Cela permettra de mieux comprendre l'origine de l'inflammation dans les maladies cardio-métaboliques afin de développer de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement visant à mieux contrôler la fonction des cellules immunitaires et ceci dans les maladies cardio-métaboliques. L’ensemble des procédures proposées dans ce projet sont connues comme non remplaçables par des procédures ne faisant pas intervenir directement l’animal.

Procédures

Groupe 1 (Procédure1) : Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Groupe 2 (Procédure 1) : Injection de Tamoxifen en intra-péritonéal sur souris vigiles à l’âge de 6 semaines tous les deux jours pendant une semaine (soit 3 injections). Pour ce groupe de souris, le Tamoxifen est nécessaire pour invalider, indirectement, le gène cible. Prélèvements de sang à la joue sur animaux vigiles (toutes les 2-3 semaines) à partir de l'âge de 6 semaines. 12 semaines de régime riche en graisse. 48h en cage métabolique pour étudier les variations métaboliques (1 souris par cage) puis injection de glucose par voie intra-péritonéale (une injection) puis détermination de la glycémie (taux de sucre sanguin) par prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (1 goutte). Dans le cadre de la Procédure 2 (greffe de moelle osseuse), les souris receveuses, âgées de 10 semaines, seront irradiées (pour éliminer les cellules de la moelle osseuse) dans un irradiateur prévu à cet effet pendant 6min30sec. Ces souris recevront une solution contenant des cellules de moelle osseuse par voie intra-veineuse au niveau de la veine de la queue. Ces souris seront ensuite soumises aux interventions citées ci-dessus selon leur groupe. Par ailleurs, une grille de score a été établie afin de limiter la douleur, et déterminer les mesures à prendre si besoin (antalgique (anti-douleur), désinfection ou mise à mort).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont une douleur légère lors du prélèvement à la joue et lors des injections intra-péritonéales et intra-veineuses. Lors du changement de cage, les animaux peuvent être légèrement stressés mais ce stress diminue au bout des 24h d'acclimatation à la cage métabolique. Il peut également survenir une perte de poids et une prostration suivant l’irradiation, ainsi que, très rarement, une respiration perturbée et une mobilité réduite avec le régime riche en graisses.

Devenir

A la fin des expériences, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, surdosage d’anesthésiant ou asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs).

Remplacement

Les maladies cardio-métaboliques sont des pathologies complexes dans lesquelles de multiples voies métaboliques et physiologiques interviennent. De ce fait, une approche in vivo reproduisant ces interactions nous est indispensable pour répondre à notre problématique. De plus, l'étude du dépôt de cholestérol dans les artères ne peut être réalisé in vitro. Des modèles murins capable de développer de l'athérosclérose ont donc été développés et validés par la communauté scientifique comme outils d’études précliniques.

Réduction

Notre approche statistique garantit l’obtention de résultats exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Dans le cadre de cette étude, et pour chaque groupe, nous utiliserons des souris mâles et femelles. Ceci permettra d’utiliser l’ensemble des animaux générés dans les élevages. De plus, les résultats pourront ainsi être appliqués à la fois aux hommes et aux femmes. Ce projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur 5 ans.

Raffinement

La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés à chaque procédure et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger).

Choix des espèces

1) Nous avons choisi le modèle murin car c’est un modèle standard bien reconnu dans le domaine scientifique pour l’investigation de manipulations génétiques liées aux maladies cardio-métaboliques. 2) Nous avons également des souris déficientes pour le gène ApoE ou LDLR connues pour leurs différents facteurs de risque liés au développement de l’athérosclérose et donc à l’apparition des maladies cardio-métaboliques après un régime riche en graisse. 3) Des souris déficientes pour la protéine Cardiolipin synthase 1 spécifiquement au niveau des macrophages nous permettront de déterminer l’importance de cette enzyme sur la dynamique mitochondriale et le métabolisme des macrophages. 4) De plus, le modèle murin présente plusieurs avantages par rapport à d’autres espèces : cycle de vie court, natalité importante. A partir de l’âge de 6 semaines (âge à partir duquel les souris sont considérées comme suffisamment matures), les souris nécessitant une induction au Tamoxifen seront injectées. La greffe de moelle osseuse est réalisée sur des souris plus âgées (10 semaines). A l’âge de 8 ou 17 semaines toutes les souris seront soumises à un régime riche en graisse durant une période de 12 semaines afin de permettre la formation des plaques d’athérome. Pendant cette période, les expériences de calorimétrie et de tolérance au glucose seront réalisées afin d’étudier les variations des voies métaboliques. A la fin des expériences, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale, par surdosage d’anesthésiant ou par asphyxie au CO2 (selon les expérimentateurs) à 29 semaines ou moins selon les procédures.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections rétro-orbitaires reproduisant un purpura thrombotique, avec perte de poids attendue, puis subissent des prélèvements sanguins avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever sang et organes. Le porteur indique développer en parallèle des modèles cellulaires à partir de plasma humain. Il affirme néanmoins que ces procédures ont un caractère de "stricte nécessité" et ne peuvent être remplacées.

Objectifs

Le purpura thrombotique thrombocytopénique acquis (PTT) est une maladie rare et grave, touchant le plus souvent l’adulte jeune. Les manifestations de cette pathologie sont une baisse du nombre de plaquettes, une anémie hémolytique, et une souffrance brutale d'un ou plusieurs organes. Cette pathologie est souvent chronique, évoluant sur un mode de poussées entrecoupées de rémissions. Malgré la prise en charge actuelle (échanges plasmatiques, anticorps thérapeutiques), 20% des patients décèdent. Cette maladie est secondaire à un déficit en une enzyme (ADAMTS13), qui est l’enzyme physiologiquement responsable du clivage de grands assemblages protéiques de facteur de Von Willebrand » (VWF). Ce sont sur ces « filaments collants », qui ne peuvent pas être coupés par l’ADAMTS13 déficitaire, que les plaquettes circulantes viennent s’agréger, obturant ainsi les petits vaisseaux. Les microthrombi ainsi créés empêchent les tissus en aval d’être perfusés en oxygène, générant ainsi des lésions ischémiques touchant notamment le cœur et les reins. L'anémie hémolytique microangiopathique comprend la fragmentation des globules rouges causée par une lésion microvasculaire ainsi que par des dispositifs mécaniques. L’anémie hémolytique mécanique a pour conséquence une élévation des concentrations d’hème dans les plasmas de patients PTT. L'hème est un cofacteur essentiel de l'hémoglobine présente normalement dans les globules rouges. Une concentration élevée d’hème libre dans la circulation est connue pour avoir une cytotoxicité élevée et provoquer des dysfonctions rénales Récemment, il a été montré qu’AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) protégeait de la dysfonction rénale induite par l’hème dans un modèle murin de paludisme. AhR est un facteur de transcription activé par la fixation de ligand. Il est notamment connu pour son rôle dans la détoxification de ligands environnementaux. L’implication de ligands endogènes dans l’activation d’AhR a montré qu’il joue un rôle dans le contrôle de nombreuses fonctions physiologiques telles que le développement, le cycle cellulaire et la réponse immuno-inflammatoire. Parmi les nouveaux ligands identifiés, des métabolites de l’hème (bilirubine et biliverdine) sont des agonistes d’AhR.

Bénéfices attendus

Ces modèles animaux sont des outils importants pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant un PTT.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 injections rétro-orbitaires (J0, J1, J2) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Ces injections seront espacées de 24h et le volume injecté sera inférieur à 100 µL. Il seront soumis à 2 prélèvements sanguins ((J0 et J3) par ponction de la veine mandibulaire (50 µl) sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). A J6, ils recevront une injection en sous cutané d'un analgésique (buprénorphine 0.1 mg/kg) 30 min avant le prélèvements cardiaque sous anesthésie générale (sevoflurane 5%) puis ils seront euthanasiés par dilocation cervicale. Les injections et les prélèvements sanguins durerons quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés au modèle d'induction du PTT par injection de vWF. Chez ces souris, nous nous attendons à oberver une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 seront gardés en vie et utilisés dans la procédures n°2. Ils seront tous euthanasiés, a lissue de la procédure 2 par dislocation cervicale, sous anesthésie générale (sevoflurane 5%). Il est nécessaire d'euthanasier ces animaux afin de prélever le sang et les différents organes et d'anaylser le rôle d'AhR sur la sévérité du PTT par rapport à des critères biologiques, histologiques et d'expression génique.

Remplacement

A chaque fois que cela sera possible, des modèles in vitro seront développés. Des modèles cellulaires et des plasmas humains provenant de sujets atteints de PTT seront utilisés pour décrire les mécanismes cellulaires qui sont modifiés au cours de la maladie. Les procédures auront un caractère de stricte nécessité et ne pourront pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d’information.

Réduction

Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Au cours du design de ce projet, nous avons choisi le nombre minimal d’animaux par groupe. Le calcul d’effectif est déterminé a priori afin de garantir la puissance statistique des paramètres étudiés. Pour cela, nous avons utilisé le logiciel anastats disponible sur www. Anastats.fr. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du C2VN et des équipes qui collaborent avec l’unité sur la thématique du PTT.

Raffinement

les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. L’état moribond de l’animal et la mort seront évités en tant que point limite. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites et des mesures seront prises pour les soulager en se basant sur l'évaluation de l'état d'un animal (poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Au moyen d'une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), nous déterminerons un score et agirons en conséquence (analgésie voire arrêt de l’expérimentation par euthanasie de l’animal). Les animaux seront hébergés par groupes de 6 individus par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de matériaux de nidification de type « Nestlets ».

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le plus utilisé pour générer un KO. Les modèles de souris KO pour AhR et ADAMTS13 sont largement utilisés pour étudier le rôle précis de ces molécules et pour la deuxième lignée, d’étudier le PTT (purpura thrombotique thrombocytopénique). Ils sont déja disponibles à l'animalerie du CEFOS et à l'animalerie de la faculté de pharmacie. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 10 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle) soit révolue.