Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de Vangl2 dans la mémoire chez la souris au cours du vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un animal prostré reçoit un antalgique, une plaie qui paraît infectée est désinfectée, une perte de poids trop marquée déclenche une injection de glucose : le suivi postopératoire de ce projet est biquotidien pendant 72 heures. 100 souris y sont utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 20 opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller. Maintenues en vie jusqu'à 19 mois pour être âgées, elles passent deux tests comportementaux de quatre jours au total, qui ne sont pas nommés, puis une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes. Le prélèvement du cerveau, que le porteur juge "indispensable" aux analyses histologiques, impose leur mise à mort.
Objectifs
L'objectif général de ce projet est d'étudier le rôle de protéines dans le développement et la morphologie des neurones de l'hippocampe. L'hippocampe est l'une des structures les plus atteintes lors du vieillissement menant à des altérations de la mémoire. Nous proposons d'analyser la mémoire chez des animaux âgés dont certaines protéines sont modifiées. Puis nous effectuerons des analyses histologiques du circuit de neurones de l'hippocampe de ces animaux.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre le rôle de protéines dans les altérations de la mémoire lié au viellissement.
Procédures
Vieillissement des animaux jusqu'à l'âge de 19 mois. Deux tests comportementaux d'une durée de 4 jours maximum au total. Une seule procédure chirurgicale d'une durée de 45 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Des pathologies spontanées peuvent apparaitre au cours du vieillissement des animaux. La procédure chirurgicale peut entrainer une hypothermie, une infection de la plaie, une deshydratation de l'animal et une douleur modérée dans les 24h suivant l'acte chirurgical.
Devenir
Le prélèvement du cerveau est indispensable pour réaliser les études histologiques, necessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou bio moléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. L'évaluation de la cognition et de la mémoire ne peut se faire que via des études comportementales qui nécessitent l'utilisation d'animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 20 animaux par groupe est nécessaire pour notre expérience. Pour réduire de moitié le nombre d'animaux utilisés, les souris seront soumises aux 2 tests comportementaux et subiront également la chirurgie stéréotaxique pour les analyses morphologiques.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux sont tous portés de l’animalerie d’élevage à l’animalerie d’expérimentation, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé plusieurs mois avant le début des expérimentations. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal, surveillés régulièrement et des points limites suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique (gazeux) pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi postopératoire biquotidien pendant 72h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 1 à 2 semaines avant le début de l’expérimentation ou ils sont pesés tous les jours.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car les mutants génétiques de nos protéines d'intérêt ne sont actuellement disponibles que chez ce modèle animal. De plus, nous cherchons à comprendre comment certaines proteines peuvent affecter la formation in vivo du cerveau. Par définition, pour nos études intégrées évaluant le comportement animal (la mémoire), l'utilisation de techniques in vitro ou d'organismes d'une plus faible sensibilité neurophysiologique (invertébrés ou des plantes par exemple) n'est pas appropriée pour les questions auxquelles nous cherchons à répondre. L'utilisation de souris afin de comprendre la fonction des protéines et leur dysfonctionnement dans le cerveau est essentielle à ce projet. Au stade agés de 19 mois. Pour étudier le déclin cognitif liés à l'âge, il est indispensable d'utiliser des souris agées de plus de 18 mois.
Etude du potentiel des nanoémulsions chargées de cryptophane pour la vectorisation du xénon hyperpolarisé en IRM.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
426 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 406 reçoivent une injection de nanoémulsions, 358 subissent des prises de sang étalées jusqu'à six mois, 252 une perfusion intracardiaque, et 68 passent en imagerie par résonance magnétique pour des séances de vingt à soixante minutes. Le projet vise à valider un agent de contraste au xénon destiné à détecter l'inflammation cérébrale, le diagnostic clinique restant annoncé comme une perspective. Le porteur affirme que ces procédures ne peuvent pas être remplacées par des méthodes n'impliquant pas d'animaux vivants et "susceptibles d'apporter le même niveau d'information".
Objectifs
L'inflammation joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de nombreuses maladies cérébrales, tels que les accidents vasculaires cérébraux (AVC), la maladie d'Alzheimer, ou la sclérose en plaques. Différentes techniques sont utilisées dans le but de détecter l'inflammation. Parmi ces techniques on trouve l'imagerie par résonance magnétique (IRM), une technique d'imagerie clinique puissante grâce à une résolution spatiale potentiellement élevée, un faible caractère invasif et un excellent contraste tissulaire. Cependant elle souffre d'une faible sensibilité. Afin de remédier à ces contraintes, l’utilisation de plusieurs types d’agent de contraste (AC) ont été proposés. Le xénon hyperpolarisé (Xe-HP) apparaît ces dernières années comme un agent de contraste prometteur. L'utilisation du Xe-HP en IRM présente plusieurs avantages grâce à son hyperpolarisation : son signal peut être amélioré jusqu'à cinq ordres de grandeur, et donc détectable à de très faibles concentrations. Le xénon est un gaz inerte et non toxique soluble dans les solutions organiques, aqueuses et les fluides biologiques comme le plasma sanguin. Cependant, comme ce gaz n'est pas spécifique, il doit être vectorisé pour atteindre sélectivement une autre cible biologique. Dans ce sens, le cryptophane A et ses dérivés ont été largement utilisés comme hôtes moléculaires pour concevoir un biocapteur à base de xénon. Néanmoins, ces molécules organiques ne sont pas optimales pour les applications biologiques surtout que leur solubilité dans l'eau a été rapportée comme étant basse, et que les dérivés de cryptophane A forment des agrégats dans l'eau à de faibles concentrations. Par conséquent, des nanoassemblages de cryptophanes ont été décrits afin à la fois de bien contrôler le comportement du cryptophane in vivo et d'améliorer sa concentration locale. Nous avons donc utilisés et testés des nanoémulsions chargées de cryptophane in vitro pour optimiser l’application de l’IRM du xénon dans le diagnostic de maladies inflammatoires. Ainsi, l’objectif principal de ce projet sera d’évaluer la capacité des nanoémulsions chargées en cryptophanes, utilisées en association avec du Xe-HP in vivo, à servir d’outil diagnostic IRM, et de breveter l’outil issu de cette évaluation pour un transfert vers l’industriel.
Bénéfices attendus
Ce projet qui vise à transformer les avancées scientifiques fondamentales en produits /services utiles au monde socio-économique. On s’attend donc à valider nos nanoémulsions chargées de cryptophane comme un outil innovant de l’IRM du Xénon. Ceci permettra de les utiliser en toute sécurité pour le diagnostic clinique de diverses maladies tel que les maladies inflammatoires.
Procédures
IInjections vigiles des nanoémulsions (NE) ou du chlorure de sodium (NaCl 0.9%) (Jour 0 (J0) ; Durée : 1min/injection ; n=406) Prélèvements de sang (premier jour après l’injection J1, premier mois M1, troisième mois M3, sixième mois M6 ; Durée : 1min/prélèvements ; n=358 Imagerie IVIS® (Spectrum in vivo imaging system) (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1, M6 ; Durée : 5min/session ; n=252) Perfusion intracardiaque (J0+1H, J0+6H, J1, J2, M1 ; n=252) Imagerie par Résonance Magnétique (IRM ; Durée : 20-60min/Session ; n=68)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient du stress léger lié à la manipulation pour l’ensemble des procédures. Une hypothermie Modérée lors des phases d’anesthésies.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus nécessaires pour des analyses cytologiques et histologiques
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies de diagnostic chez l'animal. Les principaux tests réalisés in vitro sont des tests de viabilité cellulaire au WST-1 (Water-Soluble Tetrazolium-1) évalués à 1h, 24h, 48h et 72h d’incubation avec des nanoémulsions chargées ou non de cryptophane. Les résultats ne montrent aucune mortalité cellulaire associée. Une évaluation de la stabilité métabolique (microsomes et plasma) des cryptophanes a été aussi effectuée. Le cryptophane montre une bonne stabilité plasmatique (t1/2> 6h) et est dégradé au niveau des microsomes hépatiques de souris. Ces résultats semblent indiquer que si le cryptophane était relargué dans la circulation sanguine, il serait néanmoins métabolisé.des tests in vivo sont nécessaires pour confirmer ces résultats. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’imagerie et de l’inflammation ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal.
Réduction
Notre projet ne permettant pas d’utiliser d’autres moyens que l’expérimentation animale, nous nous sommes assuré d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes utilisées et la littérature. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec les tests statistiques prévus lors de ce projet. Le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et surtout des données disponibles dans la littérature (des expérimentations qui ont été appliquées avec des procédures et des buts similaires à ce qui est dans notre projet ). Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues). L’ensemble des échantillons prélevés lors des procédures pourra être partagé et utilisé, permettant une réduction du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons la litière de peuplier "aspen small", plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les souris seront pesées et acclimatées pendant une semaine dans le laboratoire avant le debut de protocoles. Une fois entrés en protocole, les animaux de la première procédure seront pesés tous les trois jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7. Toutes injections auront lieu en intraveineuse en vigile avec une application d’un antalgique local en spray pour minimiser la douleur. Pour toutes les imageries in vivo, Les animaux seront sous anesthésie générale induite par isoflurane. Pendant l’imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie générale avec un masque en respiration spontanée et ils seront thermo-régulés. Après toute anesthésie, Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage dans des enceintes chauffées où leur réveil spontané se fera sous surveillance régulière de l’expérimentateur. Ils seront ensuite pris en charge par l’équipe animalière.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues (notamment en imagerie par IRM) et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature.
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la neuropathie chimioinduite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Rendues douloureuses par administration répétée d'un anticancéreux, les souris de ce projet portent une neuropathie chimio-induite depuis la mise en place du modèle jusqu'à leur mort, soit deux semaines. Elles sont 552, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La douleur est mesurée par application d'un filament sur la patte, 64 animaux subissant en plus l'immersion de la patte dans un bain thermostaté et 16 une chirurgie de trente minutes sous anesthésie. Le porteur qualifie cette douleur de modérée, quand le projet déclare l'ensemble des 552 souris en souffrance sévère. Toutes seront tuées, la souffrance de l'animal ne pouvant pas être supprimée selon le porteur.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif, qui représente environ 17% des cancers du sein, a un pronostic très défavorable. Plus de 50% des patientes recevant une chimiothérapie développent des douleurs dites douleurs neuropathies induites par la chimiothérapie. De telles douleurs imposent des réductions de dose et des interruptions de traitement qui affectent inévitablement la survie. Il a été montré qu'un composé modulant le récepteur GPER (pour "G protein-coupled estrogen receptor") était doté d'une action anticancéreuse sur des cancers triple négatif chez la souris. Plus récemment, il a été montré chez l’animal que ce composé exerçait une action antalgique et anti-inflammatoire. Cela suggère qu'il serait possible de contrôler en même temps et chez un même sujet la croissance tumorale et la douleur en ciblant ce récepteur GPER. Ce projet s’intègre dans une collaboration avec une équipe de chimiste qui réalise la synthèse et la sélection de molécules modulatrices du GPER. Les meilleurs composés sont testés in vitro sur la croissance tumorale. Ainsi, nous souhaitons, chez des souris, évaluer l’action des meilleurs molécules précédemment identifiées sur la douleur neuropathique induite par la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant non seulement de lutter contre la progression du cancer mais aussi les douleurs neuropathiques induite par la chimiothérapie. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, diffusion sanguine et système immunitaire. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
L’ensemble des animaux (552 souris) subiront des injections pour administrer l’anticancéreux et des composés à tester. Une injection dure quelques secondes sur animal vigil. L’évaluation de la douleur sera réalisée par l’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal. La douleur chez certains animaux (64 animaux) sera évaluée par le test d’immersion de la patte. Ce test consiste à immerger la patte de l’animal dans un bain thermostaté. Ces deux tests sont susceptibles d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. 16 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale qui durera environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux du projet présenterons une douleur neuropathique induite par la chimiothérapie à l’exception des animaux contrôles. L’induction de cette douleur neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. Elle sera induite par administrations répétées d’anticancéreux. Elle peut être associée à une diminution du gain de poids des animaux. La douleur est modérée et sera ressentie de la mise en place du modèle jusqu’à sa mise à mort, c’est-à-dire 2 semaines. Les animaux de l’ensemble du projet subiront des injections pour administrer les composés testés. La piqure d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’application d’un filament au niveau de la patte de l’animal ou l’immersion de la patte de l’animal dans un bain thermostaté est susceptible d’entrainer une douleur de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. Après la chirurgie de certains animaux, ils seront isolés pendant environ 30 minutes pour la vérification du bon déroulement de l’étape de réveil.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal ne peut être supprimée.
Remplacement
Les composés synthétisés seront, avant tout passage sur modèle animal, testé in silico pour leur capacité à interagir avec le récepteur GPER, ainsi que in vitro sur culture cellulaire pour évaluer et comparer leur effet avec le peptide de référence. Seuls les composés possédant une meilleure activité pharmacologique que le peptide de référence seront étudiés chez l’animal. S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus, le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. Si les résultats de la 1ère procédure sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour les animaux subissant une chirurgie, une anesthésie adaptée sera mise en place ainsi qu’une analgésie post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. Afin de limiter la souffrance liée au prélèvement de queue et de phalangectomie des animaux issus de croisement génétiques, l’identification de l’animal se fera par tatouage à l’âge d’une semaine et l’évaluation du génotype se fera sur prélèvements de follicules pileux. Une grille de score adaptée au modèle utilisé a été réalisée et fournie en pièce jointe. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 969 souris vont être utilisées, 7 744 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune recevant une greffe de cellules tumorales dans le cerveau ou dans le vitré des deux yeux. Après une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, certaines portent un dispositif intracérébral relié à une pompe implantée dans le dos, et toutes passent deux à trois séances d'imagerie par semaine, avec trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et une prise de sang toutes les deux semaines. La perte de vision provoquée par les tumeurs oculaires est présentée comme sans conséquence, la vue n'étant pas l'organe sensoriel prédominant chez les rongeurs, et les deux yeux sont greffés pour diviser par deux le nombre d'animaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de lymphome cérébral primitif ou de glioblastome restent renvoyés à des travaux précliniques que le porteur reconnaît nécessaires, toutes les souris étant tuées pour des analyses post-mortem.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Rôle des circuits thalamo-corticaux dans les déficits d’attention dans l’autisme
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Maintenues à 90 ou 95 % de leur poids initial par un rationnement alimentaire pouvant durer deux mois, les souris doivent rester assez affamées pour travailler contre une récompense. 560 souris porteuses d'une mutation modélisant l'autisme vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie d'entre elles subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure pour l'injection d'un virus et l'implantation de fibres, avec inconfort, fatigue et parfois douleur dans les jours qui suivent. Ce rationnement, dont le porteur juge l'impact très faible, accompagne une "claire perspective translationnelle" annoncée pour le trouble du spectre autistique, quand l'expérience consiste à faire exécuter une tâche d'attention une heure par jour pendant deux mois.
Objectifs
Les déficits attentionnels affectent une large proportion des autistes (jusqu’à 80%). De récentes études suggèrent que les difficultés sensorielles et attentionnelles des autistes seraient étroitement liées. Ainsi, les autistes auraient des difficultés à sélectionner les stimuli sensoriels appropriés, ce qui entrainerait une surcharge cognitive. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle que joue l’attention dans le trouble du spectre de l’autisme. Plus précisément, ce projet examinera l’implication de différentes régions du cerveau et leur interaction lors d’une tâche comportementale permettant d’évaluer la capacité de transition attentionnelle dans un modèle transgénique d’autisme chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure connaissance des structures et circuits impliqués dans l’attention ainsi qu’une meilleure compréhension de l’implication des déficits attentionnels dans un modèle animal d’autisme. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle, en particulier pour le trouble du spectre autistique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale d'environ 1h/jour pendant 2 mois maximum ainsi qu'à un rationnement alimentaire léger qui n'exédera pas deux mois. Les animaux de la procdure 2 subiront une chirurgie cérébrale qui dure en moyenne 1h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies d’injection intra cérébrale de virus et d’implantation de fibres présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.
Remplacement
Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables. Le recours à des méthodes réversibles (inactivation transitoire de certaines voies anatomiques par la technique d’optogénétique) permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, maisonnette) et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 7 jours pour s’assurer de la récupération complète des souris. Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez la souris des aptitudes cognitives complexes que l’on retrouve chez l’humain. Enfin, la souris permet l’utilisation de modèles transgéniques, dans notre cas un modèle induisant un phénotype autistique. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes âgés de 6-8 semaines au début des expérimentations. Ils atteindront 10-12 semaines avant le début des chirurgies et des protocoles comportementaux afin de limiter la variabilité de taille. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge sur les fonctions remyélinisantes et cognitives des cellules oligodendrogliales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour décrire comment le vieillissement de certaines cellules du cerveau limite la mémorisation et la réparation, 450 souris d'une lignée transgénique conçue pour modéliser ce vieillissement vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent un punch d'oreille qui les marque à vie, cinq semaines d'alimentation supplémentée par une substance qui altère la myélinisation du cerveau, puis une injection avant leur mise à mort. Les essais comportementaux dont le porteur tire son effectif de dix souris par groupe, par âge et par génotype, n'apparaissent pas dans la description des procédures. La pesée hebdomadaire tient lieu de seuil: si l'état général se dégrade ou si la perte de poids est jugée importante, les souris sont tuées.
Objectifs
Nos capacités de mémorisation et réparation du cerveau diminuent avec l’âge. Si les neurones sont à la base de l'organisation du cerveau, des études récentes ont aussi mis en évidence le rôle des cellules non-neuronales. Tout particulièrement, les cellules oligodendrogliales (qui myélinisent les neurones) semblent jouer un rôle essentiel dans le cerveau. Notre équipe a récemment développé une lignée de souris transgénique, qui modélise le vieillissement des cellules oligodendrogliales du cerveau. Dans ce projet, nous allons 1/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de réparation ; 2/ Décrire comment le vieillissement de cellules du cerveau limitent les capacités de mémorisation. Notre projet pourrait ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques intéressantes pour la maladie d’Alzheimer et les démences associées au vieillissement.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement, en particulier dans les capacités de mémorisation et réparation. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge, comme dans la maladie d’Alzheimer. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille. Les souris seront nourries avec de l’alimentation supplémentée (en continu, à volonté, pendant 5 semaines). Les souris seront injectées avec un analgésique et anesthétique, avant mises à mort (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Le punch à l’oreille entrainera une douleur légère de courte durée et marquage permanent. L’administration de l’analgésique et de l’anesthésie entraînera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corréler l'analyse comportementale par une analyse au niveau moléculaire et/ou cellulaire.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, quand possible, nous exploitons des modèles cultures cellulaires, dont des lignées ou des cellules souches pluripotentes.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux, chaque âge et génotype. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes, à parité.
Raffinement
Sous le traitement alimentaire supplémenté, les animaux seront nourris avec des croquettes alimentaires complémentées avec une substance qui affecte la myélinisation du cerveau. L’alimentation, à volonté, sera changée tous les 2 jours. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Nous avons défini des points limites et nous appliquerons une grille de score. Si l'état général de l’animal se dégrade ou si la perte de poids est importante, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils nous permettent de faire des études comportementales, et d’adresser les changements de mémorisation et d’apprentissage. Les souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, 9 mois et 12 mois. Les différents âges nous permettent de comparer les souris jeunes, adultes, et âgées.
Etude du rôle de d’une protéine d’intérêt dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, entrecoupés d'une semaine de repos, 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent aussi une biopsie pour le génotypage et développent, à partir de quatre mois, les troubles cognitifs de leur lignée. Les tests censés mesurer leurs capacités mémorielles ne sont pas nommés, et l'objet du projet se limite à une "protéine d'intérêt" qui n'est pas davantage identifiée, dans un modèle de la maladie d'Alzheimer réparti sur deux établissements. Les souris qui ne portent pas le génotype recherché sont tuées faute d'usage, les autres avant huit mois, pour éviter les souffrances liées à un phénotype dommageable qui apparaît à douze mois et que la lignée a été construite pour porter.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.
Etude des voies nerveuses impliquées dans le contrôle de la transmission sensorielle chez la souris : modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisies parce que seules leurs lignées transgéniques permettent de cibler les populations de neurones visées, 5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 2 520 d'entre elles en gravité sévère. Chaque animal reçoit deux chirurgies sous anesthésie, une heure trente sur le cerveau et quarante-cinq minutes sur la moelle épinière, puis trois injections intrathécales et cinq heures d'électrophysiologie, 4 320 subissant en plus une perfusion intracardiaque. Les sept tests comportementaux annoncés, répétés trois fois par animal, ne sont pas nommés, et le porteur signale des saignements, une douleur postchirurgicale, des infections de suture et une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l'application répétée des stimuli. La mise à mort sert à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Objectifs
La maladie de parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la lésion des neurones à dopamine, neurotransmetteur jouant un rôle clé dans la communication entre les neurones et plus spécifiquement dans la MP. La région précise du cerveau concernée est appelée la substance noire compacte (SNc). Ceci provoque la dégénérescence des voies de communication entre des structures impliquées dans la motricité avec l’apparition des symptômes moteurs handicapants. En plus des symptômes moteurs, la MP est caractérisée par des symptômes non-moteurs qui affectent la qualité de vie des patients y compris les sensations douloureuses. Il est donc important d’identifier et de comprendre le fonctionnement les circuits neuronaux au sein du cerveau, mais aussi ceux impliqués dans les échanges entre le cerveau et la moelle épinière afin d’apporter un éclairage sur le dysfonctionnement du système nerveux dans la maladie. Ce projet vise donc à étudier dans le contexte de la MP le fonctionnement des neurones de la moelle épinière lombaire en lien avec des structures du cerveau produisant des neurotransmetteurs spécifiques (dopamine, sérotonine, noradrénaline et glutamate) et qui jouent un rôle clé dans cette maladie et les symptômes douloureux associés. Cette étude sera conduite sur un modèle expérimental de la MP chez la souris sauvage et transgénique. Nous pourrons ainsi apporter une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de la connexion entre le cerveau et la moelle épinière et son implication dans un modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Il apportera une avancée dans la connaissance de la physiopathologie de la pathologie.
Procédures
Chirurgie : 5040 animaux recevront 2 chirurgies sous anesthésie au niveau du cerveau et dans la moelle épinière : durée moyenne 1h30 pour le cerveau et 45min pour la moelle Tests comportementaux : 5040 animaux recevront 7 tests comportementaux sans anesthésies 3 fois d'une durée moyenne de 30min par test Injections intrathécales : 5040 animaux recevront 3 injections intrathécales sous anesthésies durée moyenne de 2 min Electrophysiologie : 5040 animaux seront soumis à cette approche sous anesthésie d'une durée moyenne de 5h Perfusions intracardiaques : 4320 animaux subieront une perfusion intracardiaque sous anesthésie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson qui induit un déficit moteur (réduction d'activité locomotrice, perte de poids). Les effets sont liés aux différentes chirurgies d’injection de virus dans le cerveau et/ou la moelle épinière. Ils comprennent : le saignement, la douleur postchirurgicale, l’infection de la suture et la perte de l’implant. Le saignement peut aussi apparaître suite à l'injection intrathécale répétée. Certains effets indésirables pourraient également survenir à la suite du comportement sensoriel tels qu’une hypersensibilité mécanique et thermique causée par l’application répétée des différents stimuli.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de procéder à l'analyse histologique des cerveaux et des moelles épinières.
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques dans un organisme intégré. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions.
Réduction
La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expériences, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle ainsi le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe expérimentaux.
Raffinement
Tous les protocoles seront réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cages collectives avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après les chirurgies jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance et détecter d’éventuels signes cliniques (poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration, état de la suture).
Choix des espèces
La souris est un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. De plus, c’est un mammifère présentant une relation de parenté biologique avec l’espèce humaine. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.
Evaluation des effets de l’argon dans le modèle d’ischémie thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris qui dépassent les points limites fixés après l'opération sont tuées par dislocation cervicale. 62 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie crânienne de vingt minutes pour recevoir une injection de thrombine qui bouche l'artère cérébrale moyenne, puis quatre heures seule en cage sous argon ou sous air, puis deux passages en IRM à un et cinq jours. Le porteur écrit qu'"aucune douleur n'est à prévoir" pendant ces examens et juge "indispensable" de trouver de nouvelles stratégies, moins d'un patient sur dix pouvant aujourd'hui recevoir le traitement existant.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester les effets d’un gaz, l’argon sur les volumes lésionnels post AVC. L’argon est susceptible d’agir sur la diminution de l’activation des macrophages et donc d’induire une neuro protection. Nous utiliserons donc un modèle d’infarctus cérébral thromboembolique qui reproduit au mieux la physiopathologie de l’AVC permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Les effets seront observés par IRM à J1 et J5 post AVC.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la murine alpha-thrombine, provoquant ainsi l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM). Cet acte chirugical durera 20 minutes. Les animaux traités à l'argon seront placé en cage individuelle afin de recevoir de l'argon pendant 4 heures post AVC. A J+1 et +5, la moitié de ces animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 11 minutes. La seconde moitié seront aussi passés à l’IRM dans les mêmes condtions pour une durée totale de 26 minutes. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, perfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique à savoir : déficit sensorimoteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion. Néanmoins, le modèle utilisé ici affecte une région du cerveau ne causant pas d’effets délétères sur le long terme. Les animaux seront sous anesthésie générale pour les examens IRM, aucune douleur n’est à prévoir.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond à l’étape de validation in vivo qui fait suite aux nombreuses validations réalisées in vitro, et ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que de tester ces stratégies thérapeutiques chez l'animal. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que la souris est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, la souris est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. Le nombre d’animaux utilisés est fixé à 26 souris par groupe (+ 20%), ce qui nous permettra de déceler des différences significatives. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique administrée en sous-cutanée. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles au niveau du conduit auditif, une anesthésie locale de lidocaïne est appliquée. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée, et une couverture isothermique sur son dos limite les pertes de chaleur. Lors de la phase de réveil, les animaux seront placés dans une cage individuelle pendant 4 heures sous 100% Air ou 70% argon / 30% O2 ; avant d’être remis dans leur cage. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil (4 heures). Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Il pèsera chaque animal et veillera à ce que les points limites ne soient pas dépassés.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la protection, la perfusion cérébrale ainsi que le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.
Decoder le role des astrocytes dans le traitement visuel du colliculus superieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne est ouvert pour une injection intracérébrale d'une demi-heure, puis une lentille ou une fenêtre de verre est implantée au cours d'une opération d'une heure et demie. Vient ensuite un mois d'isolement, dont le porteur indique qu'il "peut induire une dépression", avant quatre heures d'imagerie sous stimulation visuelle. 464 souris sont concernées, 89 opérées sans jamais se réveiller, 15 dans des procédures légères, 270 modérées et 90 sévères. Toutes finissent par une perfusion intracardiaque de quinze minutes, thorax ouvert, que le porteur justifie en écrivant qu'elles "ne pourront être réutilisées".
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d’autres cellules au moins aussi nombreuses : les astrocytes. Bien que les astrocytes aient été longtemps considérés comme cellules de soutien pour les neurones, il est désormais admis qu’ils participent activement aux fonctions cérébrales en interagissant étroitement avec les neurones. Même si leur implication dans le traitement des informations au sein de certaines régions sensorielles du cerveau a été mise en évidence, leur rôle dans le traitement sensoriel du message visuel par le colliculus supérieur, une structure clé du système visuel, reste encore largement inexploré. De récentes études ont montré que dans les couches visuelles du colliculus supérieur, les astrocytes forment des réseaux particulièrement étendus comparés aux astrocytes d'autres régions du cerveau. Il a été montré que ces réseaux astrocytaires jouent un rôle crucial dans la mise en place des propriétés fonctionnelles des neurones spécifiquement dans cette région. L’objectif de ce projet est de caractériser plus précisément le rôle des astrocytes dans le traitement de l'information visuelle au sein du colliculus supérieur en étudiant leurs propriétés fonctionnelles ainsi que les interactions entre neurones et astrocytes.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ces travaux permettront d’enrichir nos connaissances concernant les propriétés fonctionnelles des astrocytes ainsi que les mécanismes neurogliaux qui sous-tendent le traitement des informations visuelles. D’un point de vue plus translationnel, l’étude du rôle des astrocytes dans le traitement visuel offrira de nouvelles pistes pour comprendre la contribution des astrocytes dans les pathologies cérébrales visuelles.
Procédures
Injection intracérébrale (environ 30 min, une seule fois par souris). Implantation d’une lentille (environ 1h30, une seule fois par souris). Injection intracérébrale couplée à l’implantation d’une fenêtre crânienne (environ 1h30, une seule fois par souris). Imagerie calcique in vivo (environ 4h, une seule fois par souris). Perfusion intracardiaque (environ 15 min, une seule fois par souris).
Impact sur les animaux
L’injection intracérébrale (environ 30 min, une seule fois par souris) nécessite une incision de la peau au-dessus du crâne ainsi qu’une ouverture du crâne, ce qui peut provoquer une douleur. L’implantation d’une lentille (environ 1h30, une seule fois par souris), l’implantation d’une fenêtre crânienne (environ 1h30, une seule fois par souris) et les expériences d’imagerie calcique (environ 4h, une seule fois par souris) nécessitent une incision de la peau du crâne ainsi qu’une ouverture du crâne ce qui peut provoquer une douleur. L’isolement (1 mois, une seule fois par souris) peut induire une dépression. La perfusion intracardiaque (environ 15 min, une seule fois par souris) nécessite une incision de la peau, et une ouverture de la cage thoracique ce qui provoque une douleur.
Devenir
Les animaux ne pourront être réutilisés à l'issue de chaque procédure et seront donc mis à mort.
Remplacement
Nos précédents résultats ont montré que les astrocytes jouent un rôle crucial dans la mise en place des cartes fonctionnelles dans le Colliculus supérieur. Nous souhaitons maintenant étudier les propriétés fonctionnelles des astrocytes et neurones à l’échelle de la cellule unique pendant une stimulation visuelle. Pour cela, il n’est pas possible de remplacer les enregistrements sur le cerveau intact par des simulations ou des cultures de cellules du cerveau.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des lots au nombre minimum d'animaux permettant une analyse statistique pertinente des résultats. Pour les expériences ex vivo, plusieurs régions d’intérêt seront étudiées sur les tranches de cerveau provenant du même animal. De plus, dans les expériences utilisant des agents pharmacologiques, un animal sera son propre témoin en comparant les données avant et après le traitement, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de manière significative.
Raffinement
Les animaux seront logés à plusieurs dans des cages contenant du coton pour faire leur nid ainsi qu’un abri. Durant les procédures expérimentales, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à l’injection intra-corticale ou la pose de la fenêtre crânienne, les animaux seront surveillés quotidiennement et suivis à l’aide d’une grille de score prenant en compte l’apparence et le comportement de l’animal afin de détecter tout indicateur de souffrance et décider si besoin l’arrêt de l’expérimentation et l’euthanasie. Lors des chirurgies, pour pallier à la douleur induite par l'incision de la peau au- dessus du crâne, de la lidocaïne sera injectée auparavant. Pour certaines expériences, les enregistrements seront réalisés à travers le crâne aminci afin d’éviter une incision de l’os.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car son développement cérébral est proche de celui de l’homme, et les propriétés fonctionnelles des neurones et astrocytes ont été bien décrites dans le système visuel, ce qui permettra une meilleure comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. De plus, notre équipe utilise couramment cette espèce et possède l’expertise technique appropriée. Par ailleurs, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons par femelles gestantes élevé, ce qui nous permet d’obtenir un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir d’un petit nombre de parents. Enfin, la souris permet de nombreuses manipulations génétiques à la différence d'autres mammifères. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 50 jours afin d’effectuer nos expériences dans un système visuel mature où les cellules et réseaux sont constitués.
Etude d’innocuité et d’efficacité de molécules destinées au traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’AVC hémorragique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
De la collagénase bactérienne est injectée dans le striatum de chaque souris pour y provoquer une hémorragie cérébrale, opération de quinze à vingt minutes suivie de la pose d'un cathéter dans la veine de la queue. 1 232 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune passe jusqu'à cinq séances d'IRM sous anesthésie et une batterie de tests sensorimoteurs répartis sur trois semaines, le porteur précisant que les déficits provoqués restent "légers" et que l'animal peut "aisément" continuer à s'alimenter et à se fabriquer un nid. La mise à mort passe par une ouverture de l'abdomen et du thorax pour ponctionner le cœur, puis par une perfusion transcardiaque qui fixe le cerveau avant son prélèvement.
Objectifs
En clinique, les hémorragies intracérébrales spontanées (HICS) ou AVC hémorragiques, non traumatiques, résultent d'une irruption plus ou moins importante de sang dans le tissu cérébral faisant suite à la rupture d'un vaisseau cérébral. À ce jour, aucune stratégie thérapeutique pharmacologique permettant de réduire les effets délétères d'un hématome sur le parenchyme cérébral n'est disponible. L'objectif de ce projet préclinique longitudinal est de tester des stratégies thérapeutiques innovantes dans un modèle d'AVC hémorragique chez la souris afin d'étudier leur impact sur les volumes hémorragiques et lésionnels observables à différents temps grâce à l’IRM, ainsi que sur la récupération fonctionnelle au fil du temps. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d'AVC hémorragique consistant en l'injection latéralisée de collagénase bactérienne dans le striatum cérébral. Cette chirurgie, bien documentée, reproduit fidèlement la physiopathologie de l'AVC hémorragique, permettant une meilleure transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. L'AVC sera induit sur des souris âgées de 10 à 12 semaines, chez des individus femelles et mâles, afin de reproduire la diversité clinique.
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie ne repose sur aucun traitement pharmacologique. Ainsi, il est indispensable depuis des décennies de développer des stratégies thérapeutiques innovantes dans le domaine de l’AVC hémorragique. C’est l’objectif fondamental de ce projet qui consiste en l'exploration de diverses approches thérapeutiques, en employant différents modes d'administration distincts, sur des animaux de sexes et de souches différentes, afin d'évaluer leur incidence sur les aspects cruciaux de l’AVC explicités dans les paragraphes précédents. En cas de résultats défavorables, les différents tests thérapeutiques auront contribué à élargir le champ des connaissances scientifiques dans le domaine de l'accident vasculaire cérébral hémorragique, offrant des enseignements précieux pour orienter de futures recherches et guider le développement de stratégies thérapeutiques novatrices. En présence de résultats encourageants, les molécules fournies par les partenaires industriels seront soumises à des essais cliniques, avec pour objectif ultime la mise sur le marché dans les années à venir. Ces résultats auront également un impact sur la communauté scientifique, stimulant la collaboration entre le secteur public et privé. Les résultats bénéfiques permettront non seulement d'offrir un nouvel espoir aux patients victimes d'AVC, mais également d'encourager la poursuite des travaux de recherche sur des axes thérapeutiques spécifiques. Cette collaboration renforcée entre public et privé favorisera un échange continu d'idées et d'expertise, créant ainsi un environnement propice à l'innovation et à la progression des connaissances dans le domaine. Pour finir, en obtenant l'approbation réglementaire, certaines des thérapies que nous souhaitons tester pourront donc bénéficier à un grand nombre de patients, marquant ainsi une avancée importante dans la prise en charge de l'AVC hémorragique.
Procédures
Les 1232 animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin d’injecter de la collagénase dans le striatum cérébral droit des souris dans le but d’obtenir un AVC ischémique. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 30 minutes. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un traitement en intraveineux. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 20 minutes. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux ayant pour but de contrôler les déficits sensorimoteurs après AVC et la récupération fonctionnelle au cours du temps. Ces tests se dérouleront jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition et à l’ensemble des tests. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC hémorragique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales due à l’hématome et à l’œdème au niveau cortical et striatal. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Les tests comportementaux réalisés par du personnel entraîné ne sont pas destinés à induire de la souffrance animale, mais leur répétition fréquente au fil du temps peut engendrer du stress chez les animaux. Un animal trop stressé et incapable de réaliser un test particulier sera exclu de celui-ci. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Au sein de chaque cage, les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale conduisant à l’AVC hémorragique, l’animal sera anesthésié (3 minutes à 5% d’isoflurane, 30% d’O2 et 70% de N2O) et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine (0.05 mg/kg) administrée en sous-cutanée 15 minutes avant la première incision expérimentale. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil à hauteur de 2 % d’isoflurane (30% d’O2 et 70% de N2O). Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles proches du conduit auditif de la souris, une anesthésie locale sera appliquée avec de la lidocaïne à appliquer en spray. De plus, chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage et d’une désinfection à la chlorhexidine. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris qui limite les pertes de chaleur. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC hémorragique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de entre 25g et 35g selon les souches. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Douze rats sur 111 seront maintenus en vie et placés en retraite ou réaffectés à d'autres projets, les 99 autres tués pour des analyses de tissus, y compris les ratons surnuméraires des portées jugées trop nombreuses. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour douze animaux et modéré pour 99. Neuf rates gestantes sont gavées quarante-deux jours d'affilée avec un retardateur de flamme ou reçoivent une injection du médicament de référence, puis sont tuées au sevrage de leurs petits. Leurs 90 descendants passent quatre tests comportementaux destinés à repérer ceux qui présentent les signes autistiques recherchés, et dix-huit au maximum iront en imagerie cérébrale sous anesthésie, quatre séances en deux semaines.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet validera une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids. Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie. Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (4) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Neuf femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 90) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 12 rats (6 femelles et 6 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe et placés par deux dans des cages ventilées, avec des buchettes de bois et de la frisure de papier Kraft pour enrichir leur environnement. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.