Système nerveux

Des souris porteuses de mutations qui leur causent des douleurs, des difficultés à se déplacer et parfois la mort avant terme sont élevées ici pour d'autres projets. 7 500 d'entre elles sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la seule intervention décrite étant une biopsie de quelques secondes pour le génotypage. Le porteur affirme que l'élevage de ces lignées ne peut pas être remplacé, ces animaux constituant selon lui "le cœur même" des projets des utilisateurs. Celles dont le génotype n'intéresse aucun projet sont transférées vers un autre établissement quand c'est possible, tuées sinon, tandis que les autres partent en expérimentation ailleurs ou servent de reproducteurs.

Objectifs

Dans le cadre de la production de modèles murins génétiquement modifiés, l'objectif du projet est de décrire la prise en charge des pathologies induites par les mutations de ces modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de raffiner la production de souris génétiquement modifiées et de gérer l'apparition de pathologies induites par ces modèles en anticipant leur prise en charge et en permettant ainsi une réaction immédiate et adaptée. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines.

Procédures

Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. La biopsie pour génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable induisent en général et à des degrés divers des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures epxérimentales dans d'autres établissements utilisateurs (utilisation continue) ou peuvent servir en tant que reproducteurs. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt pour les projets expérimentaux initiaux peuvent être soit utilisés pour d'autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs si c'est possible, soit euthanasiés s'l n'y a pas de possibilité de les utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur même des projets des utilisateurs.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des points limite attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (par exemple : batonnets de coton, maison en carton si besoin, frisottiss si besoin,mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions environnementales sont très élevées afin de protéger les animaux d'infections.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.

Choisis parce qu'ils apprennent leur chant comme un enfant apprend à parler, 360 diamants mandarins sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous subissent au moins une chirurgie crânienne, de quarante-cinq minutes à six heures selon le protocole, et 160 d'entre eux une seconde opération dont ils sont tués au réveil. Certains portent ensuite un dispositif d'enregistrement fixé sur la tête et restent isolés jusqu'à trois semaines dans une cage close phoniquement et visuellement, ce que le porteur reconnaît comme une atteinte au bien-être de ces animaux sociaux. Tous sont tués pour que leur cerveau soit examiné, au terme d'un projet dont les retombées annoncées vont de la maladie de Parkinson aux algorithmes d'apprentissage en robotique.

Objectifs

Les mécanismes mis en jeu dans la maladie de Parkinson restent mal compris. Chez les patients de cette maladie, il est établi que la mort prématurée des neurones produisant de la dopamine est responsable du déclenchement et de l’évolution des symptômes moteurs de la maladie. De plus en plus de preuves indiquent que la déformation d’une protéine présente dans les neurones, appelée alphasynucléine, a un rôle causal dans la dégénérescence des neurones produisant la dopamine chez les patients parkinsoniens. De plus ces protéines déformées envahiraient progressivement de nouvelles zones cérébrales par le biais d'un mécanisme de type prion (les protéines entrant en contact avec une protéine déformée se déforment elles-mêmes) pendant le développement de symptômes. La déformation de cette protéine est également impliquée dans d’autres pathologies, regroupées sous le nom de synucléinopathies. La fonction de cette protéine (l’alphasynucléine) dans l’activité des neurones et la formation des réseaux neuronaux, ainsi que les pertes de fonctions associées à sa déformation pathologique dans les pathologies associées (les synucléinopathies), restent mal comprises. Nous proposons d'étudier le rôle de l’alphasynucléine dans le réseau neuronal responsable de la maladie de Parkinson. Ce réseau est le siège de la mémoire procédurale (mémoire des mouvements et des tâches motrices et cognitives complexes), et permet à un individu sain d’acquérir des séquences motrices complexes tout au long de sa vie (faire du vélo, attacher ses lacets, jouer d’un instrument, parler…). Pour comprendre le rôle de l’alphasynucléine dans l’activité des neurones du réseau et la modification de ce réseau pendant l’apprentissage, nous nous appuierons sur un paradigme expérimental particulièrement adapté : l'acquisition du chant chez l'oiseau chanteur. En effet, les oiseaux chanteurs ont un réseau similaire à celui responsable de la maladie de Parkinson chez l’homme, qui leur sert uniquement à apprendre et produire leur chant.

Bénéfices attendus

Les applications à long terme du projet de recherche proposé sont nombreuses, de la médecine à la robotique. Ils incluent, sans s'y limiter, la découverte de thérapies originales pour les synucléinopathies (en particulier la maladie de Parkinson) et la conception de nouveaux algorithmes d'apprentissage en réseau neuronal artificiel. Pertinence pour la santé humaine et les maladies : le projet proposé représente une recherche fondamentale à long terme sur les mécanismes sous-jacents à l'apprentissage sensorimoteur en général et à l'apprentissage vocal en particulier. Les régions impliquées et la protéine alphasynucléine sont associées à de nombreux troubles du mouvement, dont la maladie de Parkinson (MP), ou autres synucléinopathies. Les bénéfices à long terme de notre projet incluent une meilleure compréhension des conséquences de la perte de fonction de l’alphasynucléine due à son agrégation anormale. Pertinence pour les innovations technologiques : Le projet de recherche proposé vise à comprendre les mécanismes neuronaux de l'apprentissage chez les animaux. Comprendre comment les animaux apprennent pourrait aider à construire de nouveaux algorithmes d’apprentissage ou à concevoir des robots capables d’apprendre et de mieux performer dans une variété de tâches complexes. Plus généralement, les algorithmes d’apprentissage efficaces sont particulièrement utiles dans les applications où la complexité des données ou des tâches rend l’apprentissage difficile.

Procédures

L’ensemble des animaux inclus dans cette saisine subiront au moins une chirurgie sous anesthésie, deux pour certains, afin d'enregistrer l'activité neuronale sous anesthésie, de mettre en place un système d'enregistrement chronique permettant de suivre l'activité neuronale après réveil, et/ou de modifier l'expression de protéines dans les neurones. D’une part, 100 oiseaux juvéniles participeront à l’étude du rôle d’une protéine impliquée dans des pathologies humaines, l’alphasynucléine, dans le développement des circuits cérébraux responsables du chant. Ils subiront une chirurgie n'excédant pas 45-60min et une à 3 périodes d'isolement n’excédant pas 2 à 3 jours. D’autre part, 160 oiseaux adultes participeront à l’étude de la structure de ces mêmes circuits cérébraux. Ils subiront une première chirurgie n'excédant pas 45-60min, suivie, quelques semaines plus tard, d’une deuxième chirurgie dont ils ne se réveilleront pas car ils seront euthanasiés à leur réveil de cette deuxième chirurgie. Ces mêmes oiseaux pourront être isolés sur une période n’excédant pas 2-3 jours, et ce avant la première chirurgie. Enfin, 100 oiseaux juvéniles et adultes participeront à l’étude du rôle de ces circuits cérébraux dans la production et la plasticité du chant. Ils subiront une chirurgie pouvant durer de 1 à 6h suivie d’une période d’isolement n’excédant pas 3 semaines, nécessaire pour la collecte de l’activité neuronale relative au chant.

Impact sur les animaux

Les oiseaux impliqués dans ce projet subiront une à deux chirurgies, pouvant entraîner des douleurs. L’ensemble des chirurgies seront conduites sous anesthésie. De plus, les douleurs liées à la chirurgie seront prises en charge par des injections pré et post-opératoires de médicaments adaptés pour traiter la douleur sur de longues durées. Afin d’enregistrer l’ensemble des vocalisations de certains oiseaux impliqués dans ce projet, nous devons isoler certains oiseaux et les héberger en cages individuelles isolées phoniquement et visuellement de leurs congénères sur des durées variables (voir ci-dessus). Cet hébergement individuel affectera le bien-être de ces animaux sociaux en induisant un inconfort et un stress que nous réduirons en limitant la période d‘isolement au maximum et en fournissant un enrichissement adapté dans la cage (miroir, cloche, os de seiche). La durée de l’isolement est de 2-3 jours pour pouvoir enregistrer leur chant d’un individu, et de maximum 3 semaines pour les oiseaux dont l’activité neuronale est enregistrée pendant le chant. En dehors de ces périodes d’isolement, les oiseaux sont maintenus en contact visuel et auditif avec leurs congénères. Le système d'enregistrement chronique qui sera implanté sous anesthésie pour l'enregistrement de l'activité neuronale chez l'animal vigile induit un inconfort pour l'animal à son réveil. Le poids du dispositif (

Devenir

Les tissus (cerveau) devant être inspectés en fin de procédure, l'ensemble des animaux impliqués seront euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Les expériences proposées portent sur l’apprentissage d’un comportement complexe, la communication vocale, qui ne peut absolument pas être étudiée avec d’autres préparations impliquant des micro-organismes (bactéries, cultures cellulaires…), ou uniquement à l’aide d’études numériques sur ordinateur.

Réduction

En respect du principe des 3Rs, nous avons optimisé le protocole afin de REDUIRE au maximum le nombre d'oiseaux utilisés : des tests de puissance statistique ont été employés pour calculer le plus petit nombre d’animaux par groupe nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Les oiseaux hébergés en cages individuelles bénéficieront d'un milieu enrichi (miroir, cloche, os de seiche) pendant des périodes réduites au minimum. Le reste du temps ils seront maintenus en contact avec leurs congénères. Nous utiliserons un anti-douleur pour diminuer toute douleur potentielle pendant et après les chirurgies. Les animaux seront observés quotidiennement par un personnel qualifié pour détecter tout signe de douleur ou inconfort. Des points limites ont été définis (cumul d'au moins 3 signes extérieurs de mal-être important comme l'immobilité les yeux fermés en permanence, l'automutilation ou les plumes ébourrifés) et sont affichés dans la pièce expérimentale. L'expérimentation est interrompue en cas d'atteinte de point limite chez un animal.

Choix des espèces

L’apprentissage vocal est un trait rare dans l’évolution. Les oiseaux chanteurs sont parmi les rares espèces à apprendre leurs vocalisations et sont donc un modèle animal unique pour l’apprentissage de la parole chez l’homme. Les diamants mandarins sont une des espèces les mieux étudiées. Ils s’accouplent facilement. Le diamant mandarin se reproduit tout au long de l’année, apprend un chant unique, et la durée de l’apprentissage ne dépasse pas trois mois et peut être réduite à une semaine. Cette espèce représente donc un modèle animal particulièrement facile d’accès pour l’étude des mécanismes neuronaux de l’apprentissage vocal. Les oiseaux participant à l’étude du rôle de la protéine alphasynucléine dans le développement des circuits cérébraux responsables du chant auront 20 jours au début de l'expérimentation car nous étudions le développement du réseau du chant pendant la période d'acquisition du chant, qui se fait avant la puberté. La période critique du développement du réseau du chant se situe entre 20 et 40j après l'éclosion. Les autres oiseaux utilisés dans ce projet auront plus de 50 jours, âge auquel ils sont sevrés et indépendants de leurs parents.

1 100 souris mâles âgées de 15 à 18 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe injecte dans le crâne de chaque souris, sous anesthésie, une protéine Tau destinée à déclencher une pathologie de type Alzheimer, puis administre un traitement quotidien, prélève du sang une fois par mois et fait passer des tests de mémoire de trente minutes par jour, du troisième au quinzième jour. Le porteur signale que l'induction peut provoquer pertes de mémoire et agressivité, et que l'âge avancé des souris augmente la mortalité attendue. Il annonce en une phrase que le projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements, et justifie l'ensemble en écrivant qu'il paraît "indispensable" de développer de nouveaux médicaments contre cette maladie.

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 minutes sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum une fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 minutes maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux durant la phase d'évaluation comportementale peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 15 à 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 15 à 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Les petits sont tués avant ou peu après la naissance, au stade embryonnaire, le jour de la mise bas ou sept jours plus tard, pour prélever leur cerveau. 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie, au plus tard quatre jours avant la mise bas, pour électroporer dans l'utérus deux plasmides différents selon les embryons, ce qui permet au porteur de diviser par deux le nombre de femelles utilisées. Il indique que cette chirurgie peut entraîner douleur, infection, hypothermie et difficultés lors de la mise bas, et conclut que l'étude de la formation du cerveau "nécessite" l'utilisation d'animaux.

Objectifs

L'objectif général de ce projet est de comprendre, gràce à la souris, l'origine de certaines malformations cérébrales qui ont lieu durant l'embryogenèse et conduisant à des troubles du comportement chez l'adulte (autisme).

Bénéfices attendus

Une meilleure comprehension des mécanismes impliqués dans la migration, la maturation et l'activité des neurones de cortex. De nouveaux champs d'étude pour les neurosciences et les pathologies qui y sont associées (autisme).

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie (durée de l'intervention 30-45min).

Impact sur les animaux

Une chirurgie sur des femelles gestantes peut entrainer des complications à court terme (douleur, infection, hypothermie) et à long terme (difficultés lors de la mise bas).

Devenir

Mise à mort requise pour prelever le cerveau des animaux afin de réaliser des études histologique et electrophysiologique.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou électrophysiologique au comportement. De nombreuses études « in-vitro » ont donc été effectuées au laboratoire sur des neurones en culture en amont de l’utilisation d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Néanmoins, l'étude de la formation du cerveau nécessite l'utilisation d'animaux.

Réduction

Pour réduire de moitié le nombre de femelle gestante utilisée, nous avons choisi d'injecter deux plasmides par portées d'embryons. La moitié des embryons recevront le plasmide portant le gène muté et l'autre moitié le plasmide contrôle. Les embryons seront utilisés pour deux études : une étude histologique et une étude électrophysiologique des neurones du cortex.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’une anesthésie générale (induction par un mélange isoflurane et d’un traitement analgésique pre/post-opératoire. Après l’acte chirurgical, les animaux sont observés sur 72h, deux fois par jour (matin et après-midi), y compris le week-end. Lors de ces observations, on vérifie son comportement, l'état de la plaie, que la souris est capable de s’alimenter, de se redresser, de reconstruire et entretenir son nid. Si un signe anormal est repéré, un des responsables du bien-être des animaux interviendra afin de l’examiner et prendre les décisions qui s’imposent (mise en place de mesures conservatoires, euthanasie). Le vétérinaire référent sera également contacté. Si l’animal ne présente aucun signe d’amélioration après mise en place des mesures, il sera alors mis à mort. La décision de mise à mort sera prise par le responsable du projet en concertation avec la vétérinaire, si le responsable du projet est injoignable la vétérinaire prendra seule cette décision.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car l'étude du developpement du cortex cérébral necessite d'analyser un cerveau qui peut être comparé à celui de l'homme. Une majeure partie des études in-vitro ont été réalisées sur des neurones en culture provenant de cette même espèce et nous avons l'expertise de la technique chirurgicale (électroporation in-utero) chez la souris. Les animaux sont des femelles gestantes adulte. Le stade adulte est indispensable pour atteindre une maturité sexuelle indispensable à la mise en reproduction des futures femelles gestantes. La chirurgie est réalisée au plus tard 14.5 jours après l'accouplement, c’est-à-dire 4 jours avant la mise bas. Cette procédure a pour but de marquer les neurones du cortex durant leur migration afin de mieux comprendre le développement du cerveau des mammifères. Les embryons seront mis à mort soit au stade embryonnaire E17.5, à la naissance ou au stade post-natal P7. Ces trois stades nous permettent d'étudier, par histologie et electrophysiologie, la morphologie et l'activité des neurones au cours de leur developpement.

1 100 souris mâles âgées de 18 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quinze minutes pour recevoir le peptide bêta-amyloïde qui déclenche la pathologie, puis un traitement quotidien, des prélèvements sanguins jusqu'à deux fois par mois et des tests de mémoire de trente minutes par jour, du troisième au quinzième jour, en cage individuelle. L'âge des animaux augmente la mortalité attendue, et l'induction de la maladie peut provoquer pertes de mémoire et agressivité. Les bénéfices annoncés se limitent à la possibilité de faire apparaître de nouveaux traitements, sans que les molécules testées soient nommées ni l'étape suivante décrite. Sur le remplacement, le porteur affirme que seuls des tests sur animaux vigiles répondent à la question posée, les approches in vitro et in silico ne permettant pas selon lui de prédire l'effet d'un traitement sur des troubles cognitifs.

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 min sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum deux fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 min maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux peut conduire à un stress transitoire par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Deux chirurgies de dix minutes séparées par trois injections, et entre les deux une douleur neuropathique installée pour deux semaines sans possibilité d'analgésie : 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un récepteur identifié récemment interagit avec le système opioïde dans les réseaux nerveux de la douleur, pour ouvrir la voie à de nouveaux traitements. Le porteur signale une mobilité modifiée, des réactions exagérées ou diminuées et une perte de poids chez les animaux lésés, et indique que les points limites ont été établis de façon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance. Ni les tests employés pour mesurer ces comportements ni le calcul qui aboutit à 360 souris ne sont précisés.

Objectifs

La manière dont la douleur aiguë se transforme en douleur pathologique chronique fait toujours l'objet de recherches approfondies afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Il est bien connu que la chronicisation de la douleur reflète un déséquilibre entre les systèmes sensoriels excitateurs et inhibiteurs en faveur des systèmes excitateurs (sensibilisation à la douleur). Plusieurs données de la littérature démontrent l'importance du système opioïde inhibiteur dans l'adaptation à la douleur après une blessure et sa perte d'effet analgésique dans des situations de douleurs neuropathiques. Un recepteur a recemment ete identifié comme jouant un role important dans la perte d'effet des opioides. Ce recepteur est donc une cnouvelle cible therapeutique prometeuse dans le traitement des douleurs neuropathiques.Le but de ce projet est d'etudier l'interaction de cette nouvelle cible therapeuthique avec le systeme opioide dans les reseaux neuronaux centraux impliqués dans l'integration des informations douloureuses.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la chronicisation des douleurs neuropathiques périphériques et de la perte d'effet analgésique des opioides. Ainsi une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la mise en place et la chronicisation des douleurs devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d'une durée de 10 minutes, 3 injections (1 minute max) puis une autre chirurgie d'une durée de 10 minutes. Les chirurgies sont réalisées sur aninal anesthésié et les injections sur animal vigil préalablement habitué a la manipulation.

Impact sur les animaux

Modèle neuropathique : -douleur sans possibilité d'analgésie -comportements et stress associés à la douleur. Ces comportements associés à l'état douloureux sont notammant: augmentation ou diminution de la mobilité (comportement spontané), hyporéaction ou hyperréaction (comportement provoqué). Le tout d'une d’une durée de 2 semaines. -perte de poids -irritation et inflammation au niveau de l'intervention Traitement par voie i;p : le stress de contention et l'inflammation du aux injections répétées

Devenir

mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes spinaux responsables du développement des douleurs inflammatoires et du développement et du maintien des douleurs neuropathiques. Le réseau neuronal spinal est encore mal identifié et n’est pas modélisé à ce jour. Les connaissances actuelles ne permettent donc pas de réaliser des études par modélisation, sans avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été établi en fonction de la dispersion des données mésurées lors des expériences précédemment publiées par l’équipe et afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Le raffinement est assuré en offrant un hébergement approprié aux souris, permettant de respecter leur éthogramme : les animaux sont hébergés dans des cages collectives enrichies avec des barrots de bois, et du matériel de nidification (coton et frisure). Lors des procédures invasives de réalisation du modèle douloureux (opération pour le modèle neuropathique) et lors du prélèvement de moelle épinière, les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde. Les points limites ont été établis de facon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont largement utilisées en recherche sur le système nociceptif et sur la douleur. En effet, le système nociceptif de ces animaux étant evolutivement analogue à celui des humains (ce système est apparu chez l’ancêtre commun des rongeurs et des primates). Les souris représentent donc un bon modèle pour l’étude du système nociceptif. De nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles, et pourrons dans le futur nous permettre de disséquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons ; ce qui justifie l’utilisation du modèle murin. Tous les animaux utilisés seront adultes âgés de 6 à 12 semaines. Nous avons décidé de cet âge afin que toutes les études soient réalisées sur le même stade développemental, correspondant à un système spinal mature. De plus, ceci nous permettra de mettre nos résultats en parallèle avec les études disponibles dans la littérature (études comportementales, études histologiques, etc).

La barrière qui protège le cerveau est ouverte par ultrasons focalisés, geste qui peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème visibles à l'imagerie. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après la dernière séance d'imagerie. Elles font l'aller-retour entre leur animalerie et une plateforme d'imagerie, reçoivent une molécule radioactive par voie intraveineuse et passent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie, d'une heure au maximum chacune, l'enjeu étant de mettre au point un traceur pour diagnostiquer plus tôt la maladie d'Alzheimer chez l'être humain. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque les souris sont anesthésiées pendant l'imagerie, et annonce des points limites "adaptés aux modèles" sans dire lesquels.

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.