Système nerveux

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Un score de douleur supérieur à quinze déclenche la mise à mort du rat concerné. 96 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever des tissus du système nerveux. Ils reçoivent des administrations répétées d'un anticancéreux jusqu'à développer une neuropathie, puis subissent chaque semaine un test d'allodynie tactile d'une heure au maximum par animal et un test d'allodynie au froid, avant une mesure de la conduction du nerf sciatique sous anesthésie. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée mais "indispensable", et retient le rat parce que son activité et son comportement spontanés conviennent à l'étude de la douleur par tests comportementaux.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max). La mesure de la conduction se fera sur animal sous anesthésie permettant la pose des capteurs au niveau du nerf sciatique (3-5 min max) avant euthanasie.

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à la mise à mort de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15.

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet.

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

Biopsiées de la queue vers six jours de vie pour le génotypage, 1 512 souris génétiquement modifiées subissent ensuite une chirurgie pouvant durer quatre heures sous anesthésie, puis une chirurgie terminale de dix minutes pour le prélèvement des tissus. Le niveau de souffrance déclaré est modéré. L'objet annoncé est de cartographier les connexions d'une structure cérébrale qui contrôle les neurones dopaminergiques, avec des retombées renvoyées aux "futures recherches" sur la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction. Ni le titre, "Identification de circuits anatomiques", ni le texte ne nomment cette structure, et l'effectif de 1 512 souris est dit "calculé mathématiquement" sans autre précision.

Objectifs

Les neurones dopaminergiques sont le point de départ du système de récompense du cerveau. Ces neurones ont des rôles multiples, allant de l'évaluation de la valeur gratifiante, aversive et motivationnelle d'un stimulus à la locomotion, et sont donc impliqués dans des pathologies telles que la dépression, la douleur chronique et la maladie de Parkinson. Il y a une quinzaine d'années, on a découvert une structure qui est aujourd'hui considérée comme le principal contrôle inhibiteur des neurones dopaminergiques. Cette structure a été initialement caractérisée chez le rat et, jusqu'à présent, son étude est restée non spécifique et limitée à cette espèce. Cette situation a maintenant changé : un marqueur sélectif de la structure a été identifié, ce qui a permis de localiser la structure chez la souris et de créer une colonie de souris transgéniques pour son étude spécifique. Ce projet vise à identifier spécifiquement les connexions anatomiques de la structure avec les régions cérébrales connues pour être impliquées dans le traitement des informations motrices, douloureuses et gratifiantes / aversives.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de cette étude est fondamental. Identifier et mieux comprendre la place de la structure dans les circuits impliqués dans les fonctions pour lesquelles elle semble avoir un rôle majeur, c'est-à-dire dans la motricité, la douleur, la récompense et l'aversion. Ceci nous permettra d'orienter les futures recherches, vers la compréhension du rôle physiologique de la région et par conséquent des pathologies associées à ses fonctions, telles que la maladie de Parkinson, la douleur chronique, la dépression et l'addiction.

Procédures

Les animaux seront soumis à une biopsie de queue (maximum 1mm) sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie de maximum 4h et une chirurgie terminale en vue de prélèvements de tissus ou organes (durée 10 min).

Impact sur les animaux

L’identification par tatouage et la biopsie de queue nécessaire aux génotypages des animaux (maximum 1mm, autour de 6 jours post natal) induisent une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire modérée et une inflammation locale transitoire.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement

Remplacement

Compte tenu du sujet de notre étude, il est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Il n'existe actuellement aucun modèle qui reproduise la complexité des réseaux de structures cérébrales. Les études neuroanatomiques nécessitent que l'animal entier soit vivant.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique. Le nombre d'animaux a été calculé mathématiquement pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargée du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies favorisant leur comportement naturel.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études anatomiques nécessitent des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés. Génotypage entre 6 et 8 jours (12 jours maximum), chirurgie à partir de 8 semaines.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de tissus destinés à la microscopie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Adultes comme nouveau-nées, elles subissent une chirurgie d'injection intracérébrale de quinze minutes, des injections intrapéritonéales, sept jours de restriction alimentaire destinée à les motiver pendant les tâches comportementales et sept jours d'hébergement individuel. Les tests annoncés portent sur la mémoire et l'anxiété, sans que soit précisé lesquels seront employés. Le porteur affirme que la souris est "l'espèce de choix" pour étudier le système nerveux des vertébrés et que les résultats en sont "très facilement transposables à l'homme", après avoir formé son hypothèse en culture de neurones.

Objectifs

Dans ce projet, nous cherchons à comprendre le rôle de certaines protéines qui interviennent dans les mécanismes de liaison cellulaire dans le cerveau. Nous voulons comprendre comment ces protéines connectent les cellules du cerveau les unes aux autres et leur permettent de communiquer. Plus précisément, nous nous concentrons sur des protéines appelées neuroligines, ainsi que sur d'autres protéines avec lesquelles elles interagissent, tels que les récepteurs impliqués dans la communication neuronale. Des études ont montré que la modification genetique sur ces protéines sont liées à des troubles neurologiques comme l'autisme ou la schizophrénie, qui impliquent des anomalies de connexions entre cellules cérébrales. A ce jour, nous ne savons pas exactement où sont localisées ces protéines de point de vue anatomique. Dans ce projet, nous avons deux objectifs principaux : (1) Visualiser ces protéines à différents moments du développement et dans des situations où les connectivités cérébrales changent. (2) Modifier l'expression ou la fonction de ces protéines dans le cerveau de souris, soit pendant leur développement, soit à l'âge adulte, pour mieux comprendre leur rôle dans la formation et le maintien des connexions cérébrales. Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui nous permettent de marquer ou de supprimer ces protéines dans des types spécifiques de cellules cérébrales

Bénéfices attendus

Visualisation et compréhension des mécanismes des protéines qui interviennent dans la liaison cellulaire dans le cerveau. Comprendre le rôle des proteines de liaisons impliquées dans des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie à différents stades de développement du cerveau.

Procédures

Les interventions sont: chirurgie d’injection Intra-cérébrale chez les souris adultes et souriceaux(15min), injection intra-péritonéal(2min), restricition caorique pour motiver l'animal durant les tâches comportementales(7 jours), comportement pour tester la memoire et le phenotype d'anxiété(10minutes par session), hebrgement indivuduel de souris adultes pendant des périodes determinées avec contact visuel et olfactif avec ces congénéres à chaque session de comportement (7 jours)

Impact sur les animaux

Les procédures post-opératoires et l'analgésie se feront en minimisant la douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids durant la restriction calorique, en cas de perte de poids trop importante l'animal est nourrit à volonté pendant 48H. 3/Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Mise à mort pour collecter les tissus pour les études histologiques et la microscopie

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept du projet a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 jour d'age jusqu'à 60 jours d'age

Des ultrasons focalisés ouvrent temporairement la barrière qui protège le cerveau de 36 souris, le temps d'y faire entrer une molécule radioactive. Ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, pour que soient recherchées les conséquences des ultrasons et la distribution du produit dans leur cerveau. Chacune fait l'aller-retour entre deux animaleries, subit une IRM de contrôle, reçoit le traceur par voie intraveineuse et enchaîne jusqu'à huit séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur signale que l'ouverture par ultrasons peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème, écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux, et limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables".

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Quarante-cinq minutes de chirurgie abdominale pour implanter une sonde de température, et quarante-cinq minutes de plus, pour une partie d'entre elles, pour poser une canule sur la tête : 3 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des structures cérébrales. Chacune reçoit ensuite jusqu'à trois injections espacées de deux semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse rétro-orbitale, sous-cutanée, intranasale ou directement dans le cerveau, chaque injection étant suivie d'un prélèvement de sang inférieur à 20 % du volume sanguin total. L'objectif est de repérer, parmi plusieurs nanocorps issus de lamas, celui qui transporte le mieux un peptide jusqu'au cerveau, la baisse de température corporelle servant d'indicateur du passage. Le porteur écrit que le choix de Mus musculus est "indispensable" parce que les nanocorps testés reconnaissent des cibles murines.

Objectifs

Le cerveau est protégé par des barrières naturelles qui servent de filtres limitant le passage de molécules entre le sang et les tissus cérébraux. Elles rendent difficile le développement de solutions thérapeutiques telles que des anticorps ou des peptides, pour traiter les maladies du cerveau. Or, avec l’impact socio-économique de ces pathologies, il devient urgent de développer des stratégies pour franchir ces obstacles. Dans une étude précédente, nous avons trouvé qu’un anticorps de llamas, généralement appelé nanocorps, pouvait servir de cargo pour faire entrer un peptide – la neurotensine – dans le cerveau. Celui-ci serait un potentiel médicament pour l’addiction, la maladie de Parkinson et la douleur. Lorsqu’elle est directement injectée dans le cerveau, la neurotensine induit une baisse de la température corporelle. Cependant, elle reste incapable de franchir seule la barrière sang-cerveau. Au vu de nos résultats encourageants, nous aimerions continuer notre investigation en testant d’autres nanocorps que nous avons au laboratoire. Nous continuerons à utiliser la variation de la température corporelle comme paramètre pour évaluer le transport de la neurotensine vers le cerveau. Ces nanocorps que nous testerons présentent différentes propriétés et ciblent différentes protéines dans le cerveau. L’objectif est d’identifier au moins un nanocorps qui serait le plus intéressant en termes de rapidité à atteindre le cerveau et de temps qu’il passe dans cet organe.

Bénéfices attendus

Les potentiels médicaments biologiques tels que des anticorps thérapeutiques, rencontrent de grandes difficultés à entrer dans le cerveau. Nos études ont montré jusque-là que des nanocorps, 10 fois plus petits que les anticorps classiques, passent dans le cerveau. Ce projet vise à déterminer si ces nanocorps peuvent servir de cargo pour transporter des molécules d’intérêt thérapeutique dans le cerveau, en l’occurrence le transport de la neurotensine qui présente un potentiel dans le traitement de l’addiction, la douleur, la maladie de Parkinson et l’accident vasculaire cérébral. Grâce à ce projet, nous pourrions proposer de nouvelles stratégies pour franchir les obstacles que forment les barrières physiologiques du cerveau et accélérer le développement de médicament pour cet organe.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une opération chirurgicale. Une partie sera soumise à une simple opération de 45 minutes dans l’abdomen pour l’implantation d’une sonde de suivi de la température corporelle. Pendant 45 minutes supplémentaires, le reste des animaux sera soumis en plus à une chirurgie d’implantation de canule sur la tête pour l’administration des nanocorps par voie intracérébrale. Les animaux auront des injections périphériques (intrapéritonéale, intraveineuse en rétro-orbital, sous-cutanée, intranasale) ou directement dans le cerveau selon le groupe. Ces injections dureront 2 à 10 minutes sous anesthésie ou sur animal pris en contention. Elles seront répétées trois fois sur un même animal, avec un espacement d’au moins deux semaines. Des prélèvements sanguins inférieurs à 20% du volume sanguin total de l’animal d’une durée de 2-3 minutes seront réalisés sous anesthésie à la suite de chacune de ces injections, donc à un intervalle de deux semaines.

Impact sur les animaux

Sont attendus : - une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des analgésiques et des nanocorps ; -des douleurs post-chirurgicales liées à la suture de la peau du ventre ; - une gêne liée à la chute de température (sensation de froid concomitante à baisse d’activité).

Devenir

L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures d’intérêt pour analyse.

Remplacement

Nous étudions l’entrée des nanocorps dans le cerveau à partir d’une administration hors de cet organe Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. Le cerveau est un organe complexe dont l’accès est principalement contrôlé par la barrière sang-cerveau. Mais, d’autres potentielles voies d’entrée existent et elles ne peuvent être représentées de manière exhaustive par des modèles isolés de barrière. D’ailleurs, d’après la littérature, ces modèles ne permettent pas de prédire systématiquement cette capacité d’entrée chez l’animal.

Réduction

L’étude sera réalisée sur un total de 3750 souris (3175 souris de phénotype sauvage et 575 souris génétiquement modifiées). Dans une logique de réduction, les expérimentations sur la majeure partie de l’étude (3250 souris) seront réalisées en longitudinal afin d’utiliser un seul animal pour tester plusieurs nanocorps différents. Le nombre de sujets nécessaire par groupe est proposé à partir d'un logiciel et sont cohérents avec les tests statistiques déjà publiés pour cette procédure expérimentale. Notre précédente étude ne montre aucune différence d’entrée de nanocorps entre les sexes. Par conséquent, nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos cohortes.

Raffinement

Cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées. Elles présentent une déficience pour le récepteur d’un neurotransmetteur cérébral, sans impacter sur leur comportement et leur bien-être. Cependant, tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi (bâtonnets de coton et abri en carton) avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum, sous surveillance régulière. La procédure ne débutera que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront suivis quotidiennement après l’opération. Les injections ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les nanocorps à tester reconnaissent des cibles murines. Afin que leur passage à travers les différentes voies possibles d’entrée soit évalué, le choix de l’espèce Mus musculus est indispensable. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d’âge correspondant à l’âge adulte où la formation de la barrière sang-cerveau est complétement achevée.