Système nerveux

Pour savoir si un trouble de la coagulation aggrave une hémorragie cérébrale, 450 souris vont subir une chirurgie de trente minutes qui provoque un saignement dans leur cerveau. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une hémophilie ou une maladie de von Willebrand par modification génétique, et chaque animal passe deux IRM sous anesthésie, à quatre heures et à sept jours de l'induction. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner une perte d'appétit, une perte de motivation et une anxiété accrue à plus ou moins long terme, et prévoit, selon les points limites atteints, d'isoler l'animal, de le soigner ou de le mettre à mort.

Objectifs

Notre projet repose sur l'utilisation d'un modèle pré-clinique d'hémorragie intracérébrale (HIC) chez le rongeur, caractérisée par un saignement occasionné par la rupture de vaisseaux cérébraux. Cet accident vasculaire cérébral est l’un des plus dévastateurs, avec en 2018 un taux de mortalité de 50% la première année. Environ 30% des survivants deviennent dépendants 4 ans plus tard. Il n'y a actuellement pas de traitement. Des recherches précliniques et cliniques sont en cours. Mais dans les essais cliniques, les personnes atteintes d'anomalies de l'hémostase (hémophilie, maladie de Von Willebrand...) sont exclues d'emblée, du fait de risque accru de saignement. Ce modèle a été validé chez le rat (projet APAFIS numéro #14066-2018031312529642v3) mais nécessite d'être validé chez la souris pour pouvoir bénéficier de modèles hémophiles dans cette espèce. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelle mesure les troubles hémostatiques influencent la taille et les mécanismes inhérents à la survenue d'une HIC. de microhémorragies cérébrales (MHC) disséminées dans tout le cerveau du rongeur, modèle se rapprochant ainsi des cas cliniques retrouvées dans certaines maladies neurodégénératives. Ce modèle repose sur l’utilisation de cyclodextrines (CD) qui, à forte dose, ouvrent les barrières biologiques comme la barrière hématoencéphalique (BHE), en « érodant » les membranes cellulaires endothéliales jusqu'à obtenir des MHC disséminées. Ce modèle a été validé chez la souris (APAFIS n°19866-2019030701722644). Les MHC sont des constructions radiologiques qui se présentent sous la forme de foyers hypointense visibles et qui sont prédicteurs d'une future hémorragie intracérébrale (HIC), le type d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) le plus dévastateur sans traitement validé à ce jour. Le but de ce projet est d'évaluer dans quelles mesures les troubles hémostatiques influencent l'incidence des MHC et leur transformation en HIC. L'existence d'un trouble hémostatique favorise-t-il la transformation en macro-saignement? Par quels mécanismes? Les anomalies hémostatiques congénitales telles que l'hémophilie et la maladie de von Willebrand sont des situations uniques, dans lesquelles l'HIC est fréquente et dévastatrice. Grâce à l'utilsation de lignées murines d'hémophilie et de maladie de Von Villebrand, nous explorerons la transformation potentielle des MHC en HIC et étudierons le rôle de ces défauts hémostatiques sur la réponse inflammatoire autour du saignement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l'influence de troubles de l'hémostase (défaut de coagulation ou de l'hémostase primaire) sur la taille des HIC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur évolution, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. sur la fréquence et la taille des MHC, ainsi que les mécanismes impliqués dans leur transformation en HIC, notamment sur la réponse inflammatoire autour du saignement. L'identification des facteurs prédictifs d'une future hémorragie cérébrale est de la plus haute importance chez les personnes atteintes de graves déficiences hémostatiques et peut conduire à une modification du régime de traitement préventif des patients, et peut aussi, en cas d'HIC, leur permettre de bénéficier de traitements innovants pour lesquels ils sont actuellement exclus par principe de précaution. A partir d'un scénario plutôt caricatural d'une maladie génétique rare, ces nouvelles connaissances peuvent également profiter à tous les patients présentant d'autres anomalies hémostatiques (par exemple les personnes traitées par anticoagulants oraux).

Procédures

Tous les animaux subiront la chirurgie permettant d'induire les HIC (environ 30 min par intervention), ainsi qu'une IRM à 4h et à 7j de l'injection (chaque IRM dure 30 min).

Impact sur les animaux

L'induction des HIC MHC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gènes potentielles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Le cerveau sera ensuite prélevé dans le but de réaliser des études histologiques et immunohistochimiques.

Remplacement

L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqés dans la survenue de MHC dans un contexte de troubles hémostatiques Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes donc la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.

Réduction

L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 450 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles). Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.

Raffinement

Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure BEA (Bien-Etre Animal) ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.

Choix des espèces

Le retentissement des conséquences neurologiques induites par cette ces procédures varie en fonction des espèces choisies. En accord avec ces données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité des lésions cérébrales contribuant à terme à réduire le nombre d’animaux opérés, nous avons choisi des souris C57bl6 homozygotes stables. Le choix de cette espèce de rongeurs repose sur les recommandations STAIR et est adapté à l’évaluation expérimentale. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois, âge nécessaire pour permettre la mise en place des troubles hémostatiques.

Une pompe osmotique est implantée sous la peau ou dans une veine, en dix à vingt minutes d'opération : 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infusion continue se poursuit ensuite sur animal éveillé, avec des prélèvements de sang répétés, puis une injection létale permet de prélever organes et tissus. Le projet est mené par une société privée qui teste ses propres vecteurs d'acheminement de médicaments vers le cerveau, à raison de six études par an et de groupes de quatre animaux. Le porteur retient la souris parce que sa physiologie est bien connue, et parce qu'à 27 ou 30 grammes elle est "particulièrement économique" en termes de posologies.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations, Il s’agira de contourner les problématiques de la pharmacologie (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de notre système de pompe autonome (délivrances prolongées et maîtrisées). Nous pourrons ainsi proposer de meilleures pharmacologies et optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher leurs meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces.

Procédures

Une première partie de mise en place de l’étude sur animaux éveillés, une seconde sous anesthésie et anti-douleurs (chirurgie) et enfin le suivi et manipulation jusqu’à la mise à mort de l’animal en fin de cinétique. -Constitution des groupes d'animaux (éveillés). -Analgésie (éveillé) : Administration simple et unique (5 secondes) sous la peau au niveau de la nuque. - Procédure chirurgicale et implantation des pompes osmotiques : implantation en sous-cutanée (10 min) ou intraveineux (20 min). -Prélèvements sanguins intermédiaires sur animal éveillé en cours de cinétique. -Mise à mort finale pour prélèvements de tissus et organes.

Impact sur les animaux

Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées : - Du stress et des douleurs légères de courte durée causées par les injections et les prélèvements sur animaux vigiles. - Du stress et de l’inconfort lors des anesthésies et de possible douleurs suites aux interventions chirurgicales Le composé injecté ne devrait pas avoir d'effets indésirables sur les animaux

Devenir

Afin de réaliser l'étude de l'efficacité pharmacologique, les organes et tissus d'intérêts doivent être prélevés. Pour cela, les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement étudiés in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des suivis pharmacologiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de contrôler le maintien de leurs efficacités directement sur leurs cibles (Récepteurs cellulaires), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pharmacologique pour l’infusion médicamenteuse, nous devrons réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de petits groupes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti de manière équivalente pour les deux procédures d’implantations, en sous-cutanée puis en intra-veineux. Les animaux seront répartis en petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 4 groupes tests par étude et 6 études par an, ce qui représente 96 individus/an et par procédure. C’est-à-dire pour les deux procédures, 192 animaux par an (mixité des groupes 96 mâles + 96 femelles). Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles. En expérimentation animale nous travaillons avec des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles que nous prendrons en considération lors des tests statistiques. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet d'obtenir des données précieuses sur le sang.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. Les opérations chirurgicales et implantations se feront sur animaux anesthésiés + anti-douleur, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se fera sur animal éveillé. Le contrôle des pesées et les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. .

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille (d'animaux) de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge présente un poids moyen de 27-30g environ, et qui s’avère particulièrement économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risques immunogènes).

Une injection dans le cerveau, à l'âge d'un jour, sur des souriceaux éveillés retirés de leur mère : 50 nouveau-nés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le geste dure quinze secondes, après application d'une crème anesthésiante sur la peau du crâne. Le projet porte sur l'apprentissage de ce geste par le praticien, avec une solution colorée, la thérapie génique du syndrome de Prader-Willi restant l'objet d'un projet ultérieur. Chaque souriceau est tué deux minutes après l'injection pour que son cerveau soit prélevé et la diffusion du colorant vérifiée.

Objectifs

Nos travaux préliminaires ont permis d’identifier le rôle d’une famille de gènes dont l’absence est une cause principale du syndrome de Prader Willi. Il s'agit d'une maladie génétique rare sans traitement curatif qui réduit drastiquement l’espérance et la qualité de vie des patients - le syndrome de Prader Willi est suspecté après la naissance par des signes caractéristiques de faible tonicité, de difficulté de tétée puis des troubles de la croissance et comportementaux ; en cas de suspicion un test génétique permet de confimer ou infirmer la pathologie. Nos travaux sur cultures cellulaires ont permis de développer une molécule de thérapie génique qui semble capable d’exécuter les rôles des gènes manquants. Avant d'envisager des tests chez l'humain, il convient maintenant de tester cette thérapie sur la souris chez qui une modification génétique reproduit le syndrome de Prader Willi. Ces études sont indispensables avant d’envisager des essais chez l’humain. Pour être efficace, le traitement par notre thérapie génique doit se faire rapidement après la naissance. Cependant, du fait qu'elle ne peut être injectée dans le système sanguin, elle doit être injectée directement dans le cerveau des souris nouveau-nées. Le présent pré-projet vise à acquérir et valider dans notre structure le geste technique d’injection de solution chez la souris nouveau-née de un jour.

Bénéfices attendus

Acquisition d’un geste expérimental permettant l’injection d'une thérapie génique chez la souris nouveau-née, ce qui représente un intérêt pour les projets qui visent à la compréhension/correction de mécanismes cérébraux normaux et pathologiques.

Procédures

Une intervention : les souris subiront une injection intracrânienne à l'âge de 1 jour. Cette injection s'effectuera sur une durée de 15 secondes.

Impact sur les animaux

- Stress lié au retrait transitoire des souriceaux nouveau-nés de la portée - Stress léger maternel - Stress lié à la contention et douleur lié à l'injection intracranienne chez souriceaux nouveau-né vigile

Devenir

Deux minutes après l'injection intracrânienne, chaque nouveau-né sera mis à mort pour prélèvement du cerveau et observation de la bonne diffusion de la molécule colorée dans le cerveau.

Remplacement

Des études préalables sur modèles cellulaires ont permis de développer une thérapie génique du syndrome de Prader Willi. Il convient maintenant de l’administrer sur le souriceau nouveau-né chez qui l’efficacité du traitement sera évaluée en mesurant plusieurs paramètres biologiques et comportementaux, qui ne sont pas évaluables sur modèle non-animal. Ce pré-projet vise à acquérir et valider le geste expérimental d’administration intracranienne de cette thérapie génique chez le souriceau agé de un jour.

Réduction

Pour ce projet, il est prévu d’utiliser au maximum 50 nouveau-nés issus de 4 à 10 femelles souris. Nous estimons que deux vagues de dix nouveau-nés séparées d’au moins une journée seront nécessaires à la bonne acquisition du geste technique par le praticien. Si le rendement afin de valider le geste est de 90% dès la 2ième cohorte de 10 animaux (minimum 20 animaux en tout, vagues 1 et 2), le projet sera arrêté. Dans le cas contraire, une ou deux nouvelles vagues seront réalisées jusqu’à 50 animaux maximum avant de conclure au succès ou à l’échec de l’acquisition du geste.

Raffinement

Les mères seront hébergées avec des éléments d’enrichissement et de nidification (igloo en carton, bloc de coton) jusqu’à la mise bas, puis avec des éléments d'enrichissement classiques (buchettes; frisures de papier kraft) une fois le sevrage des nouveau-nés surnuméraires atteint. Pour les nouveau-nés utilisés, l’injection sera précédée d’une application sur la peau du crâne d'une crème anesthésiante. Dans le cas ou des juvéniles manifesteraient une agitation désordonnée continue considérée comme point limite, leur mise à mort sera réalisée sans attendre les 2 minutes de diffusion de la solution colorée.

Choix des espèces

La souris est l’animal pour lequel des modèles du syndrome de Prader Willi existent. Le développement pathologique chez la souris est proche de l’humain. Dans notre modèle animal, les animaux seront injectés dès le lendemain de leur naissance, afin de mimer le traitement précoce des patients SPW. En effet, le SPW implique des troubles neurodéveloppementaux dont les premières manifestations prennent place à la naissance.