Système nerveux

Choisies pour leur faible variabilité, de même fond génétique, même âge et même poids, 68 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de paclitaxel ou d'oxaliplatine, deux anticancéreux neurotoxiques, une partie subissant en plus un gavage quotidien pendant huit jours et trois prélèvements sanguins par voie intraveineuse sur animal vigile contentionné. Toutes passent trois tests comportementaux nommés, un de sensibilité tactile et deux de sensibilité thermique, tous les trois jours pendant environ quatorze jours. Elles sont ensuite toutes tuées pour prélever peau, nerf et ganglions spinaux, le porteur précisant que les animaux montrant fatigue, troubles moteurs ou signes de souffrance sont retirés du protocole avant l'analyse.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hématotoxicité. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlures, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces neuropathies induites par la chimiothérapie constitue un enjeu de santé publique. Au cours d’un projet précédent, il a été mis en évidence que le récepteur à la cholécystokinine de type 2 (CCK2R) était exprimé par le système nerveux sensitif périphérique et que son blocage par un antagoniste industriel spécifique de CCK2R, prévenait le dévelopment de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin. La vincristine est un agent anticancéreux indiqué notamment dans la prise en charge des cancers hématologiques. L’objectif de ce nouveau projet est d’évaluer l’influence d’un traitement par cette molécule sur la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez des souris. Le paclitaxel est un agent anticancéreux notamment indiqué dans la prise en charge des cancers du sein et des poumons, et l’oxaliplatine dans la prise en charge des cancers colorectaux. La vincristine, le paclitaxel et l’oxaliplatine sont trois agents anticancéreux représentatifs de trois classes de chimiothérapie particulièrement neurotoxiques. Chacune de ces molécules présente un mécanisme d’action cytotoxique différent contre les cellules cancéreuses, ainsi que des mécanismes de neurotoxicité spécifiques. Nous souhaitons vérifier si l’effet préventif de ce bloqueur de CCK2R observé dans le modèle de neuropathie induite par la vincristine, se produit également dans le cadre des neuropathies induites par le paclitaxel et l’oxaliplatine.

Bénéfices attendus

Particulièrement présent dans le système gastro-intestinal et dans le système nerveux central, le récepteur CCK2R est impliqué dans la satiété, l’anxiété et la douleur. Dans un modèle précédant, la vincristine induit une hypersensibilité tactile et une dégénérescence des nerfs sensitifs, deux phénomènes totalement prévenus par l’administration du bloqueur de CCK2R. Nous supposons que cette molécule pourrait également présenter des effets préventifs (analgésique et neuroprotecteur) sur deux autres modèles de neuropathies chimio-induite, le paclitaxel, et l’oxaliplatine. La molécule d'intérêt fait aujourd’hui l’objet de plusieurs essais cliniques et présente un bon profil de sécurité. Ainsi, la mise en évidence d’un effet neuroprotecteur dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur les neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra des injections intrapéritonéales répétées tous les deux jours ou tous les trois jours pendant une période de 6 jours. Une partie d'entre eux recevront également le traitement par voie orale tous les jours pendant 8 jours, par gavage. Une partie des animaux subiront en plus trois prélèvements sanguins en intraveineux chacun à 7 jours d’intervalle, sur animal vigile contentionné. L'ensemble des animaux sera soumis à trois tests comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours environ.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales tous les deux jours ou tous les trois jours pendant 6 jours (maximun 4 injections par animal) induiront une douleur légèreet un stress de courte durée . Au cours de l'administration du traitement par voie orale, les animaux pourront ressentir un stress lié à la préhension, le gavage peut être associé à un risque de fausse route. Les prélèvements sanguins peuvent être source de stress lié à la manipulation et la contention. Le prélèvement induira une douleur légère de courte durée. Le volume sanguin prélevé n'aura pas d'impact sur l'état général et le bien être de l'animal. Au cours des trois tests comportementaux, les animaux seront isolés de leurs congénères sur une période de courte durée ; ces tests produiront un stress le temps de la manipulation. Les tests comportementaux, évaluant la sensibilité tactile ou thermique, génèreront une gêne au moment du stimulus (de l'ordre d'une seconde). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi deux modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet du traitement sur des neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 56 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus nerveux (peau, nerf et ganglions spinaux) seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si des signes de souffrance et/ou de toxicité sont observés, alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés au traitement et/ou au paclitaxel ou à l’oxaliplatine doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Des femelles gestantes sont opérées trente minutes pour injecter de l'ADN modifié dans leurs embryons, et une partie des souriceaux qui en naissent reçoit ensuite une injection intrapéritonéale. 834 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des cerveaux. Le projet exprime chez ces embryons des versions mutées de récepteurs NMDA identifiées chez des patients porteurs d'un syndrome de type autistique, afin d'en observer l'effet sur le développement cortical. Le RNT résume les nuisances à la chirurgie de la mère et à la douleur d'une piqûre, sans rien dire des effets attendus de ces mutations sur les souriceaux ni de la répartition des 834 animaux entre gestantes et petits.

Objectifs

Plus de 1 % des enfants naissent avec des troubles du développement du cerveau, comme l'autisme ou un retard de développement. Grâce au séquençage complet de l'ADN, on a fait d'importants progrès dans le diagnostic de ces troubles. Récemment, on a découvert que certains gènes liés aux récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le fonctionnement du cerveau, peuvent présenter des variations génétiques. Ces récepteurs, codés par les gènes appelés GRIN1, GRIN2A, et GRIN2B, sont importants pour la communication entre les cellules nerveuses. Des mutations dans ces gènes, notamment dans la partie des récepteurs qui organise leur position à la surface des neurones, peuvent entraîner un retard de développement. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment ces récepteurs NMDA fonctionnent dans le développement du cerveau et quelles sont les conséquences des mutations observées chez certains patients.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de caractériser des pathologies GRIN et de tester le potentiel thérapeutique de médicaments existants ou nouvelles molécules. Les pathologies GRIN sont un groupe de troubles neurologiques rares causés par des mutations dans les gènes GRIN (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, etc.). Ces gènes jouent un rôle crucial dans le fonctionnement des récepteurs NMDA, qui sont des protéines essentielles à la communication entre les cellules nerveuses du cerveau. Les mutations dans ces gènes peuvent perturber cette communication, entraînant des problèmes de développement et de fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes de pathologies GRIN peuvent présenter une variété de symptômes, tels que des retards de développement, des difficultés d'apprentissage, des problèmes moteurs, des crises d'épilepsie, et parfois des traits associés à l'autisme.

Procédures

Afin d’étudier le rôle de l’organisation des récepteurs NMDA dans le développement, nous mettrons en œuvre des approches chirurgicales pour injecter des préparations d'ADN modifiées dans les embryons (durée 30min) d'une femelle gestante permettant de visualiser les neurones et manipuler l’expression ou l’organisation des neurones corticaux afin de permettre une étude anatomique du développement cérébrale. Nous pourrons également caractériser l’impact de l’expression des sous unités du récepteur NMDA possédant une mutation identifiée chez un patient présentant un syndrome de type autistique sur le développement neuronal. Sur un nombre limité de souriceau, nous injecterons une molécule par voie intraperitonéale (durée 5min) pour induire des outils précedement electroporés. Pour cette étude, des souris gestantes et des souriceaux issus de ces souris gestantes mâles et femelles seront nécessaires. Nous analyserons les progénitures mâles et femelles en même temps pour exclure des effets sexes spécifiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances majeures que peuvent subir les souris sont liés principalement à la chirurgie de la femelle gestante et pour les souris une douleur correspondant à une injection intrapéritonéale, via une seringue.

Devenir

A l'issu de la procédure les animaux sont mise à mort pour réaliser une analyse des cerveaux.

Remplacement

La validation des outils utilisé pour l'expérimentation in vivo sera réalisé in vitro soit sur des cellules hétérogogues et des neurones en culture, ce qui nous permet de remplacer un nombre important d'animaux juste qui aurait dû être utilisé pour valider nos outils. Toutefois les modèles animaux sont essentiels pour comprendre le développement car ils permettent de reproduire de manière plus fidèle et complète les processus biologiques complexes qui se déroulent dans un organisme vivant. Contrairement aux modèles cellulaires, les modèles animaux permettent l'étude des interactions dynamiques entre différents systèmes et organes au sein d'un environnement biologique entier. Grâce aux modèles animaux, il est possible de suivre l'évolution des cellules dans un contexte global, d'étudier des fonctions physiologiques complexes, et de comprendre comment des gènes spécifiques influencent le développement global d'un organisme. Les modèles cellulaires, bien que très utiles pour des études ciblées et mécanistiques, présentent des limitations importantes. Ils ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment en ce qui concerne les interactions multicellulaires. Les cellules cultivées en laboratoire peuvent se comporter différemment de celles dans un organisme vivant, ce qui peut limiter la transposabilité des résultats. De plus, les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler le développement complet d'un organisme, rendant difficile l'étude des processus qui nécessitent l'intégration de multiples signaux provenant de différents tissus et systèmes.

Réduction

L'utilisation de neurones en culture nous permet de faire un pre-screening des mutations GRIN. En l'absence de conséquences fonctionnelles sur nos tests in vitro, nous ne procèderons pas à des tests in vivo. Les femelles gestantes seront fournis par Janvier. Si cela représente une surcharge financière, cela a l'avantage d'éviter d'avoir un pool de mâles et de femelles dédiés à la reproduction et d'éviter également de produire des souris surnuméraires. L'exportation de cette compétence à l'avantage de laisser à notre fournisseur Janvier d'optimiser cette production à l'échelle de plusieurs clients. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Les souris gestantes en provenance de chez notre fournisseur seront acclimatés au moins 24h avant la chirurgie. Les femelles gestantes issues de chez Janvier ainsi que les animaux qui naitront, vivront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, de ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les bébés resteront avec leurs mères pendant toute la phase expérimentale. Les solutions injectées chez les bébés seront maintenus à 37°C et la procédure d'injection sera la plus courte possible pour réduire l'éloignement de la mère.

Choix des espèces

La distribution cellulaire et la maturation du cerveau est similaire entre la souris et l'homme. De plus, les mécanismes qui contrôlent le développement cérébrale ont été largement étudiés chez la souris, ce qui permet de pouvoir comparer nos résultats à ceux déjà publiés dans la littérature scientifique et d'utiliser les résultats que nous avons d'ores et déjà obtenu lors de la caractérisation de ce modèle. Nous travaillerons donc sur plusieurs stades de développement : au stade embryonnaire, mais aussi le jour de la naissance et 7, 14 et 21 jours après la naissance.

Avant toute étude sur des rats paraplégiques, 68 rats et rates sains vont être utilisés pour mettre au point les procédures, dans des conditions impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Vingt-quatre rates sont ovariectomisées et recevront une stimulation hormonale hebdomadaire pendant six mois au plus, pour servir de partenaires d'accouplement. Douze rats reçoivent un capteur de pression implanté dans le corps caverneux et douze autres dans les vésicules séminales, dix sont maintenus une heure en contention pour l'analyse du réflexe de dorsiflexion du pénis, dix reçoivent des électrodes dans le muscle bulbospongieux avant une heure de stimulation sensorielle du pénis sous anesthésie. Le porteur affirme que l'étude de la fonction sexuelle "nécessite un organisme entier" et qu'aucune modélisation ne permettrait de cribler les molécules visées.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière (LME) sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions provoquent des déficits sensoriels et moteurs (paralysie) bien connus, mais également une dysfonction du système autonome. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastro-intestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Chez les rats avec une lésion haute, l’administration chronique d’un traitement sérotoninergique favorise la récupération fonctionnelle. Outre ce rôle démontré dans le contrôle moteur, la sérotonine joue également un rôle ubiquitaire dans le système cardiovasculaire, puisqu’elle module entre autres, le tonus des vaisseaux sanguins, qui est un mécanisme important dans la fonction sexuelle. De plus, il a été montré que des fibres sérotoninergiques innervent des motoneurones responsables de l’érection. Pour ces raisons, nous souhaitons développer un protocole expérimental basé sur l’utilisation de ces molécules chez des animaux sains (non-lésés) pour mieux comprendre les mécanismes de la fonction sexuelle et mettre en place une étude chez les rats paraplégiques.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes spinaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.

Procédures

12 animaux seront implantés avec un capteur de pression télémétrique dans le corps caverneux (temps de chirurgie : 30 minutes), et 12 seront implantés dans les vésicules séminales (temps de chirurgie : 30 minutes). Ces animaux seront isolés pendant 10 jours pour qu’ils soient sexuellement matures et seront mis en présence de femelles ovariectomisées pour enregistrer les pressions intra-caverneuse et intra-séminale pendant l’accouplement. Ces animaux serviront également à faire un criblage neuropharmacologique. Ces procédures auront une durée maximale de 6 mois. 10 animaux devront être en contention pour analyser leur réflexe de dorsiflexion du pénis (temps de manipulation : 1 heure). Cette procédure aura une durée maximale de 3 mois. 10 animaux subiront une procédure chirurgicale : l''implantation d'électrodes dans le muscle bulbospongieux (30 minutes). Après récupération, ils seront sous anesthésie pour réaliser la stimulation sensorielle du pénis (1 heure). Cette procédure a une durée de 6 mois. 24 rates seront ovariectomisées (procédure chirurgicale), elles seront également sous stimulation hormonale pour faciliter l'accouplement programmé, à raison d'une fois par semaine pendant maximum 6 mois.

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales (implantations de capteur et d'electrodes, ovariectomies) peuvent conduire à de légères douleurs, normalement soulagées par des analgésiques. Les procédures nécessitant une anesthésie peuvent avoir des effets indésirables pour l'animal, mais nous prettons une attention particulière au raffinement de nos pratiques pour les limiter: tapis chauffant rétrocontrôlé à 37°C, utilisation de l'isoflurane qui est facile à contrôler en cas de sous ou sur anesthésie, hydratation de l'animal, analgésie. L'infection au niveau du site d'implantation ou au niveau de la suture est possible, mais encore une fois, le raffinement de nos pratiques chirurgicales permet de limiter fortement voire même supprimer le risque d'infection (travail en conditions stériles). L'isolement des animaux peut induire un stress chez les rats, mais le design de notre procédure est tel que la période d'isolement est trop courte pour induire un stress trop important. Les diverses injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés ne sont en aucun cas délétères pour l'animal. La stimulation hormonale en elle même n'induit aucun stress physiologique car les femelles étant ovariectomisées, nous ne faisons que restaurer les niveaux d'hormones produites normalement par les ovaires. Enfin, la contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal, mais le protocole que nous prévoyons met en place une phase d'habituation en douceur et avec récompense jusqu'à ce que l'animal ne soit plus stressé par l'expérience.

Devenir

Il est important de tirer un maximum d'information in vivo mais aussi ex-vivo afin de limiter l'utilisation des animaux. Ainsi, les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure, exceptée la procédure 5 où les animaux seront basculés en procédures 2 et 3 puis euthanaisés. Effectivement, nous récupérerons certains tissus afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

La fonction sexuelle est possible grâce à l’interaction de multiples systèmes : systèmes hormonal, sensoriel, autonome et moteur. L’étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, Il n’existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet. S’agissant d’un nouveau projet, nous avons besoin d’apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. C’est pour cela que nous avons fait des mises au point méthodologiques sur des cadavres de rats sortant d’expérimentation d’autres équipes, afin de maîtriser au mieux les méthodes avant de passer sur animal vivant. Le système nerveux central est complexe avec beaucoup de types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique : le groupe neuronal dont le neuromédiateur est la sérotonine, auquel nous nous intéressons particulièrement comporte une quinzaine de types ou sous-types de récepteurs différents. Il n'existe pas de modèle de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet.

Réduction

Notre équipe travaillant déjà sur la lésion de la moelle épinière depuis 5 ans, nous avons des retours d’expérience pour la détermination du nombres d'animaux dont nous avons besoin (afin de ne pas avoir trop, ni trop peu d’individus). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette DAP, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Enfin, Grâce à la télémétrie les injections pourront être faites sur le même lot d'animaux.

Raffinement

Les premières chirurgies seront faites en présence du vétérinaire pour limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. De plus, nous avons prévu une analgésie multi-modale pré-opératoire et post-opératoire afin de prévenir d’éventuelles douleurs. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous avons défini une grille de score avec un arbre décisionnel tenant compte de points limites adaptés et de critères d’arrêt de souffrance. Des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou douleur et nous prendrons contact avec le vétérinaire dès le lendemain ou le jour même suivant le problème rencontré. En cas de point limite, les animaux seront euthanasiés. Tant que possible le caractère grégaire du rat sera préservé (hébergement par 2 – femelle/femelle ou mâle/femelle ovariectomisée). Nous devrons cependant isoler les mâles arrivant sur site pendant 10 jours pour qu'ils soient sexuellement matures, ensuite pour chaque semaine lors de la procédure, ils seront hébergés tel que : avec une femelle ovariectomisée pendant 4 jours puis re-isolés pendant 3 jours. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et des matériels de nidification, ils seront tous hébergés dans la même pièce et pourront se voir et se sentir. Pour la contention des animaux, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place 7 jours avant le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologie reste malgré ses différences, proches de celle de l’humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies comme la pose d’implant, l’injection de virus et les SCI, que nous réaliserons plus tard dans notre étude. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l’humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (6 à 8 semaines au début des expérimentations)

348 rats et rates vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de pose de cathéter intraveineux à demeure puis une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour l'implantation de fibres de photométrie ou l'injection de vecteurs viraux, avant d'être entraînés à s'auto-administrer de la nicotine jusqu'au développement d'une addiction. Le porteur table sur une attrition de 20 % au bout de trois mois d'expérience et fixe pour cela les groupes comportementaux à quatorze individus. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, "ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires" et qu'aucun modèle in silico valide n'existe.

Objectifs

Le but de ce projet est d’étudier le rôle des différents sous-types neuronaux du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal chez le rat - une région du cerveau jouant un rôle clé dans le contrôle du comportement de recherche et de prise de drogue. Cependant, les mécanismes neuronaux locaux sous-tendant ces modifications d'activité du cortex préfrontal sont actuellement inconnus. Les réseaux corticaux du cortex préfrontal sont composés de neurones excitateurs mais aussi d'interneurones inhibiteurs locaux qui exercent un puissant contrôle sur l'activité du circuit du cortex préfrontal. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à étudier le rôle respectifs des neurones excitateurs et des interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Pour cela, les animaux seront tout d’abord entrainés à acquérir l’auto-administration intraveineuse de nicotine et à développer une addiction à la nicotine. Puis, nous mesurerons l’activité des différentes populations de neurones lors du développement de l’addiction à la nicotine. Enfin, nous chercherons à modifier l'activité de ces populations neuronales et à en évaluer les effets sur la consommation de nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de révéler les effets spécifiques de la nicotine sur les interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal qui pourraient expliquer le développement de l’addiction à la nicotine, et constituerait donc une percée dans le domaine de la dépendance. Le développement de stratégies visant à inverser ou à prévenir ces changements d'activité neuronale pourrait éventuellement conduire à la découverte d'un traitement efficace contre la prise de tabac et conduire à l’arrêt du tabagisme. Enfin, comme nous proposons d’examiner l'activité neuronale du cortex préfrontal avant, pendant et après l'escalade de la consommation de nicotine, nous serons dans une position idéale pour identifier les dysfonctionnements neuronaux préexistants. Ainsi, notre projet devrait également fournir des informations sur les marqueurs neurobiologiques de la susceptibilité à l’addiction à la nicotine.

Procédures

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...). Tous les animaux seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d’un cathéter intraveineux à demeure, puis à une chirurgie stéréotaxique pour la pose de fibres de photométrie ou pour l’injection de vecteurs viraux chémosensibles (45 min en moyenne). Toutes ces chirurgies sont effectuées sur une couverture chauffante en conditions aseptiques, sous anesthésie et analgésie profonde.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin soit de prélever leurs cerveaux pour des expériences ex vivo d’électrophysiologie sur tranche ou de transcriptomiques, soit d’effectuer des contrôles histologiques pour vérifier l’emplacement des fibres de photométrie et l’expression des virus.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; et 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales du projet et les différents objectifs à remplir. Les expériences seront réalisées chez des rats males et des rats femelles répartis dans 3 groupes (1 groupe qui ne développe pas d’addiction, 1 groupe qui développe une addiction à la nicotine, et un groupe témoin non exposé à la nicotine), soit 6 groupes expérimentaux au total. Pour les expériences comportementales, en tenant compte du taux attrition estimé à 20% au bout de 3 mois d’expérience, il faudra démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Pour les expériences d’enregistrement de photométrie et de mesures ex vivo, l’effectif sera plus petit (n = 10) mais sera compensé par un grand nombre de mesures enregistrées par animal. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera de 348 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de NaCl pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Lorsque l’un des critères ou point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit 70 minutes de chirurgie sous anesthésie pour la pose d'un cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie, avec dissociation du muscle masséter, puis deux passages en IRM de 34 minutes au total. L'objectif est de mesurer l'effet de traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale après un AVC provoqué, les tissus étant récupérés après la mise à mort pour analyse immunohistochimique. Le porteur indique avoir retenu "le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce", la souris étant selon lui l'espèce la plus étudiée dans ce domaine.

Objectifs

Cette étude vise à comprendre l'implication de traitements thrombolytiques dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral ainsi que sur l’apparition des transformations hémorragiques. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse), le traitement actuel de la phase aigue des AVC ischémiques, pour permettre la lyse du caillot sanguin et induire une reperfusion du tissu cérébral peut également moduler l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébral ainsi qu’une augmentation des transformations hémorragiques. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. Dans ce projet, nous allons également nous intéresser à l’impact d'autres traitements thrombolytiques. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et les transformations hémorragiques à la suite des AVC ischémiques. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de ces traitements thrombolytiques sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromboembolique où l'injection i.v. de traitements thrombolytiques permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de traitements thrombolytiques est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de ces traitements sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précoce et tardive afin de mimer les différents contextes possibles en clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'impact des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en pour améliorer la thrombolyse lors des AVC ischémiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h et à 5 jours après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC. Des déficits fonctionnels pourraient également survenir suite à l’AVC.

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (480 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 480 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total :480) a été évalué via un test statistique.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le reveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.

Une injection sous la peau de la patte ou de la face suffit à provoquer chez eux une inflammation, puis une hypersensibilité douloureuse au toucher. 200 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués sous anesthésie profonde pour prélever les tissus nerveux. L'objectif est de comprendre comment cette inflammation dérègle un canal des astrocytes, un travail qui prolonge des résultats déjà obtenus au niveau trigéminal. Le porteur programme sept séances de tests comportementaux de trente-cinq minutes chacune, sans dire lesquels, et qualifie ces mesures de peu douloureuses puisque l'animal peut retirer sa patte.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la genèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Les objectifs de ce projet est d'étudier si il y aussi une dérégulation en condition inflammatoire au niveau de la patte et de la face.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 1 : Injection sous-cutanée (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face ou de la patte selon le modèle). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après les données antérieures le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux sont stabulés de façon à avoir un enrichissement social. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à partir de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale d'anestésique sous sédation profonde. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Enfin, comme énoncé précédemment, ce projet fait suite à d'autres études et doit donc être réalisé sur la même souche de rat. Pour les expériences comportementales et l'étude protéique, nous utiliserons des animaux âgés de 5 à 8 semaine, comme dans les projets précédents (125g à 250g).

Pour constituer une banque de tissus et de fluides partagée entre laboratoires, 150 souris et 30 rats, chez qui des maladies neurodégénératives sont modélisées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soixante d'entre eux subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie, dès l'âge de quatre semaines. Tous sont tués par perfusion à travers le cœur, à partir d'un mois, pour l'examen histologique du cerveau. Le porteur annonce un risque de paralysie lié à la maladie modélisée et présente la banque comme un moyen de "ne pas générer des animaux supplémentaires", alors qu'elle repose sur 180 animaux tués pour la remplir.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont des troubles neurodégénératifs. Les similitudes et les différences entre les maladies neurodégénératives (MN) sont définies en fonction du statut pathologique des zones et des types de neurones affectés. Cependant, on ne sait toujours pas quelles altérations sont les causes ou les conséquences de ces maladies. Ce projet de recherche permettra de mettre en commun nos forces et notre matériel biologique afin d'élucider les points communs et les spécificités des pathologies. Pour ce faire, nous devons construire une bio banque (base de données) de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de MN qui sera utilisée et partagée par tous les investigateurs. Cet effort permettra de réduire le nombre d'animaux générés et utilisés indépendamment par chaque chercheur dans une seule bio banque utilisée et ouverte à tous ceux qui s'intéressent aux MN dans la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Construire une biobanque disponible de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de maladies neurodégénératives Cette biobanque disponible pour tous les laboratoires du departement et aura pour bénéfice de donner un accès aux tissus et aux prélèvements. Cette action permettra leur mutualisation, et ainsi de ne pas générer des animaux supplémentaires.

Procédures

Chirurgie à partir de 4 semaines (2heures sur animal anesthésié) pour 60 animaux Perfusion intracardiaque (sur animal anesthésié) et euthanasie à partir de 1 mois d'âge pour l'ensemble des animaux

Impact sur les animaux

1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie ce risque est compensé par l’analgésie 2/Risque de paralysie du à la MN

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau

Remplacement

La souris et le rat sont les espèces de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement des maladies neurodegenratives. Néanmoins, toutes les étapes préliminaires pouvant être réalisées in vitro, telles que les validations des constructions moléculaires qui seront injectés en intra cerebral le seront sur cultures cellulaires

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat sont deux espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à partir de 4 semaines. Afin de travailler sur des modèles cohérents avec la mise en place de phénotypes pathologiques

Pour répondre à une revue scientifique qui réclame les mêmes expériences sur des femelles ovariectomisées avant de publier un article en révision, 80 rattes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux chirurgies, l'ablation des ovaires en dix minutes puis une ouverture du crâne de trente à quarante-cinq minutes pour implanter une canule à la surface des méninges. Jusqu'à quatre injections de substances inflammatoires y sont faites, une tous les deux jours, suivies de mesures de la sensibilité de la face au filament pendant trois heures, et chaque ratte reste seule en cage jusqu'à deux semaines pour ne pas arracher la canule. Le porteur écrit que la procédure ne permet pas de réutiliser les animaux, toutes sont donc tuées à la fin.

Objectifs

L'objectif général du projet est d'étudier l'influence des hormones dans la migraine, dans un modèle animal qui consiste en l'injection de substances inflammatoires (SI: bradykinine, prostaglandines, sérotonine, et histamine) à l'aide d'une canule positionné à la surface des méninges des rats. Nous avons déjà montré que les males et les femelles à différents cycles hormonaux avaient une douleur migraineuse différente et une sensibilisation des neurones du complexe trigémino-cervical (TCC ) dépendante du cycle hormonal. Ces résultats font l'objet d'un article en révision dans une revue scientifique qui nous demande de réaliser les mêmes séries d'expériences mais avec des femelles contrôles ovariectomisées. Nous souhaitons donc i) évaluer l'intensité de la douleur ressentie, ii) étudier l'activation globale des neurones impliqués dans la migraine, et iii) enregistrer les propriétés électrophysiologiques des neurones du TCC suite à des injections répétées de substance inflammatoire au niveau des méninges et ceci chez des femelles contrôles ovariectomisées.

Bénéfices attendus

Même si la migraine touche plus les femmes que les hommes et est fortement corrélées aux cycles hormonaux, la plupart des études précliniques ont été réalisées chez les mâles. Ainsi, à moyen terme, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiologiques d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux central chez les mâles et les femelles selon le cycle hormonal. A plus long terme, mieux comprendre cette pathologie pourra nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes et cycle menstruel.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales qui consistent en une ovariectomie et en une craniotomie, pour pouvoir implanter une canule pour appliquer à la surface des méninges une inflammation (mimant ce qui se passe pendant les crises de migraine). Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. L'ovariectomie dure 10 minutes et l'implantation de la canule dure environ 30 à 45 min. Les injections des molécules sur les méninges afin de mimer les crises de migraine seront de 1 injection tous les 2 jours avec 4 injections au maximum ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Une mesure de la sensibilité cutanée de la face sera réalisée à l’aide de filament de Von Frey. Les jours d’injection de subsatnces inflammatoires ou de solution physiologique, la mesure des seuils se fera avant et toutes les 45 min pendant 3 heures après l’injection de soupe inflammatoire pour vérifier l'apparition et/ou l'aggravation de l'allodynie.

Impact sur les animaux

La douleur suite aux chirurgies est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie pendant 2 h après l’injection, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour garder en place la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines maximum.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe.

Raffinement

Les rates bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur :si l’animal perd plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit la chirurgie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données que nous avons obtenues et ceux de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.