Système nerveux

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Etude du phénotype rétinien sur un modèle murin de dégénérescence rétinienne

(NTS-FR-988543v1 – 17/09/2024)

Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux

Souris : 120

Souffrances

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▲ 120

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Devenir

120

120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux examens d'imagerie de l'œil sous anesthésie gazeuse, un électrorétinogramme de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, et pour une partie d'entre elles une exposition à une lumière forte pendant trois heures, éveillées. L'objectif est de mesurer ce que devient la rétine quand une protéine protectrice manque, dans une lignée dont le porteur précise qu'elle ne développe pas de maladie grave. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit un trajet optique complet et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Les Rétinopathies Pigmentaires (RP) touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, les photorécepteurs à bâtonnets puis à cônes, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. Les études menées antérieurement par l’équipe sur les RP ont mis en évidence un gène qui code pour des facteurs ayant une fonction protectrice sur les cellules touchées. Une des deux protéines est sécrétée par un type de photorécepteurs, les batônnets et a une activité protectrice sur le 2ème type de photorécepteurs, les cônes. Le second produit du gène, joue un rôle protecteur contre l'oxydation. Pour ce faire, nous avons étudié les conséquences de l’absence d'un des produits du gène à l'aide d'un modèle de souris transgénique sur la fonctionnalité des photorécepteurs lié au stress oxydatif en comparaison avec des animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Les rétinites pigmentaires (RP), sont les formes les plus communes des dégénérescences rétiniennes congénitales. Elles touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer.

Procédures

- L’imagerie oculaire: examens réalisés sous anesthésie gazeuse sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée : 20 minutes par animal et par passage. Examen réalisé 2 fois par animal, espacé de 2 semaines. - Electrorétinogramme: examen réalisé sous anesthésie générale sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée 45 minutes. Examen réalisé une seule fois par animal. - Surexposition lumineuse pendant 3 heures sur animal vigile avec une seule mesure tout au long de l'expérience. Les animaux testés pour la surexposition lumineuse, auront avant le test, une injection sous-cutanée de sérum physiologique puis une pesée avant et après le test de surexposition lumineuse pour évaluer l'effet de cette surexposition sur une déshydratation éventuelle.

Impact sur les animaux

L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra-péritonéales et les examens phénotypiques de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent être considérées comme une nuisance de douleur légère et de courte durée dû à l'introduction de l'aiguille Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers. L'exposition des animaux à une lumière forte peut entrainer une déshydratation se traduisant par un poil hérissé dû au positionnement de la cage, placée en dessous des néons et séparés par une plaque en plexiglass.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale pour les analyses post-mortem. L’euthanasie est requise afin de procéder aux différents prélèvements nécessaires en vue des analyses à mettre en œuvre pour répondre à la question scientifique

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Il y a nécessité d'avoir la rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Dans ce projet, le modèle animal développé s'inscrit dans certaines caractéristiques de pathologies. Il n’y a donc pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement en fonction des naissances. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel adapté. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque groupe a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe, en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (rentabilité technique). Ce projet impliquera au maximum 120 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. L’application de cette échelle adaptée à nos expérimentations pourra nous amener à décaler dans le temps les actes prévus dans la séquence expérimentale. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale adaptée. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées avec un logiciel adapté. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Le raffinement réside aussi dans le fait de concevoir les expériences en limitant au maximum l'utilisation de groupes contrôles surnuméraires. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique permettant d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt. Cette souris ne présente pas de phénotype dommageable car elle n'entraine pas le développement d'une maladie grave. Nous avons sélectionné cette espèce car la rétine de la souris est semblable en plusieurs points à celle de l’Homme (organisation des couches neuronales, les membranes, la vascularisation, les circuits). Nous voulons commencer les études juste avant l’apparition de modification de la structure de la rétine (du fait du modèle animal). Les animaux auront environ deux mois à leur entrée dans les procédures expérimentales.

Acquisitions IRM longitudinales chez le babouin fœtal pour l’étude du développement cortical – EU 1/2

(NTS-FR-961022v1 – 17/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Babouins : 48

Souffrances

▲ -

▲ 48

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Devenir

48 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque femelle retenue passant dix fois deux heures sous anesthésie, intubée et sous myorelaxant, à raison d'une acquisition IRM par semaine pendant dix semaines. Vingt-quatre femelles gestantes sont d'abord anesthésiées pour dater leur gestation, avec un prélèvement de 12 mL de sang. Aucune n'est tuée, elles sont sorties de leur groupe social le temps des acquisitions puis réintroduites, et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Le porteur écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de façon répétée pendant plus de dix semaines, et applique précisément ce protocole à des babouines gestantes.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

Génotypage invasif des lignées transgéniques murines

(NTS-FR-727584v1 – 17/09/2024)

Maintien des lignées génétiquement modifiées
Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital

Souris : 90000

Souffrances

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▲ 90000

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Devenir

90000

Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.

Objectifs

Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.

Bénéfices attendus

Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.

Procédures

Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.

Devenir

Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.

Réduction

Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.

Raffinement

Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.

Choix des espèces

La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.

Etude des canaux potassiques dans l’activité neuronale du réseau locomoteur spinal chez les souris

(NTS-FR-560340v1 – 17/09/2024)

Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux

Souris : 540

Souffrances

▲ 32

▲ 64

▲ 444

▲ -

Devenir

508

Des souriceaux nouveau-nés sont retirés à leur mère pendant quatre heures au maximum, le temps qu'une injection virale soit faite dans leur colonne vertébrale, puis rendus à une femelle qui peut se montrer agressive à leur retour. 540 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 444 d'entre elles, léger pour 64, et menées sous anesthésie sans réveil pour 32. À partir du cinquième jour suivant l'injection, chaque animal passe trois sessions de tests comportementaux de trois à quarante minutes, et celles issues de la lignée génétiquement modifiée subissent une biopsie de l'extrémité de la queue. Le porteur indique qu'une mauvaise manipulation de l'injection rachidienne peut, rarement, léser la moelle épinière et paralyser les pattes arrière dès le réveil, 508 souris étant tuées pour prélèvement de tissus et 32 gardées vivantes pour l'élevage ou des prélèvements hors saisine.

Objectifs

L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'équilibre de la balance portée par les fibres nerveuses qui inhibent ou qui excitent le réseau de neurone innervant les muscles des pattes postérieures, est renforcé par les propriétés endogènes de ces neurones. C'est ce jeu d'influence qui dans sa finalité, conduira ou non à une contraction musculaire. L'un des projets de l'équipe est d'étudier, dans les conditions normales, les mécanismes moléculaires qui conduisent à cette réponse musculaire. Une protéine est principalement ciblée. Elle existe sous différentes formes et s'exprime à la surface des neurones. Ces différentes versions seraient susceptibles de jouer un rôle dans l'activité électrique de la cellule nerveuse. Des approches génétiques, biologiques, seront employées pour caractériser la contribution individuelle ou collective de ces protéines sur le modèle murin, des études comportementales analyseront leur effet global sur la posture et la locomotion de l'animal.

Bénéfices attendus

La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables de l'activité des cellules nerveuses dans un réseau sain. En ciblant spécifiquement une protéine d'intérêt par l'outil génétique sur le modèle de la souris, ces études approfondies fourniront des données solides sur le rôle de cette protéine dans les conditions normales. Enfin, ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté scientifique.

Procédures

Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection du virus pendant 4h maximum car c'est toute la portée qui est concernée, l'injection proprement dit se fait en moins d'une minute mais la préparation en post injection et pré-injection nécessite 20 min par animal. Plus tard dès le 5eme jour post injection, les animaux injectés vont suivre des sessions d'expérimentations non invasives à une fréquence de 3 sessions par animal sur l'ensemble de l'étude, couvrant les 3 premières semaines postnatales. Ces tests comportementaux durent entre 3 et 40 min maximum en fonction des tests, les enregistrements vidéo durent 3 min maximum par animal. Chez les souris génétiquement modifiées, pour distinguer précocément celles qui le sont de celles qui ne le sont pas, il est nécessaire de faire un test génétique à partir d'un fragment (

Impact sur les animaux

Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection virale, puis plus tard lors des tests comportementaux et des enregistrements vidéos. Les manipulations et les changements de lieux des animaux pour ces tests peuvent également engendrer du stress. Bien que l'injection dans la colonne vertébrale soit généralement sûre, dans de très rares cas , une mauvaise manipulation peut entraîner une lésion de la moelle épinière, pouvant causer une paralysie partielle ou totale des membres postérieurs, visible dès le réveil. Les animaux injectés peuvent perdre du poids. La mère peut être stressée du fait de l'enlèvement de la totalité de ses petits et peut avoir des signes d'agressivité au retour des souriceaux qui auront subi une injection virale à la naissance. Le phénotype éventuel attendu serait un déficit moteur qui pourrait potentiellement se manifester par un affaissement de l'arrière train, des tremblements des pattes postérieures. La biopsie de l'extrémité de la queue des souriceaux provenant de la lignée de souris génétiquement modifiée, peut induire du stress chez l'animal et un léger saignement.

Devenir

les animaux sont mis à mort pour prélèvement tissulaire. Les 32 animaux gardés en vie seront potentiellement utilisés pour l'élevage ou pour des prélèvements tissulaires pour des procédures hors saisine.

Remplacement

Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal demeure essentielle, car nous étudions la complexité du réseau de neurones innervant les muscles des pattes postérieures dans les conditions normales d'une activité de locomotion où de nombreux paramètres rentrent en jeu.

Réduction

Ce projet nécessitera un total de 540 animaux. Il s'agit d'une poursuite des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. Les études comportementales seront menées longitudinalement, ainsi chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera le nombre d'animaux utilisés. A la fin de cette étude longitudinale, les tissus des animaux âgés de 21 jours seront prélevés, évitant ainsi de rajouter un lot d'animaux supplémentaire pour les études protéiques prévues à la 3eme semaine postnatale.

Raffinement

Une fois injectés, les animaux sont maintenus en fratrie et ramenés à la mère. Pour minimiser les épisodes d'agressivité de la mère envers les nouveau-nés injectés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements stéréotypés ou anxieux. De plus, nous pourrons utiliser des récompenses pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...). Que ce soit pour l'injection virale, les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. A partir du stade juvénile, du gel nourrissant ou des récompenses peuvent leur être fourni dès qu'ils sortent de la zone de stabulation. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur, en observant des points limites pour les jeunes animaux.

Choix des espèces

Cette étude est dans la continuité de nos projets scientifiques précédents. Nous avons une grande expertise de ce modèle, nous avons accumulé de nombreuses données sur lesquelles nous pouvons nous baser. L'injection virale est également un outil que nous maîtrisons sur ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement au cours des 3 premières semaines post-natales. La tranche d'âge de la première et deuxième semaines post-natales restent compatibles avec les techniques d'enregistrements de l'activité neuronale sur tissu prélevé tandis que la deuxième et troisième semaines post-natales sont des périodes clés pour l'acquisition de la marche et donc pour nos études comportementales chez l'animal. Nous postulons que le niveau d'expression des protéines d'intérêt est déjà détectable à la naissance, ce qui permet une étude protéique couvrant les 3 premières semaines de vie de l'animal.

Acquisitions IRM longitudinales chez le babouin fœtal pour l’étude du développement cortical – EU 2/2

(NTS-FR-235378v1 – 17/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Babouins : 48

Souffrances

▲ -

▲ 48

▲ -

Devenir

48 babouins sont comptés dans ce projet, 24 femelles gestantes et leurs fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué : les mères sont replacées dans leur groupe social et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Chaque femelle retenue est capturée puis séparée de son groupe, transportée une heure à une heure trente vers un second établissement, anesthésiée, intubée, ventilée, mise sous myorelaxant et maintenue deux heures dans un aimant d'IRM, dix fois de suite à une semaine d'intervalle, le porteur reconnaissant un risque d'avortement lié au stress et aux anesthésies. Il écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM chez une femme enceinte sans justification médicale, "encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines", et fonde sur cette interdiction le recours au babouin, l'espèce disponible dont le cortex se plisse le plus comme celui de l'humain.

Objectifs

Bénéfices attendus

Procédures

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

Remplacement

Réduction

Raffinement

Choix des espèces

Effet de l’irradiation sur la neurocognition chez l’enfant.

(NTS-FR-679390v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Souris : 728

Souffrances

▲ -

▲ 440

▲ 288

▲ -

Devenir

728

728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Le cerveau de 160 d'entre elles est irradié sous anesthésie à l'âge de 21 jours, 240 passent six tests comportementaux, 80 subissent deux heures d'imagerie par résonance magnétique, et toutes finissent par une chirurgie terminale destinée à prélever leur cerveau. La question posée est de savoir si le vieillissement prématuré des cellules cérébrales explique les séquelles cognitives des enfants irradiés pour une tumeur du cerveau. Le porteur retient la souris parce que sa neuro-anatomie lui paraît comparable à celle de l'être humain, et parce que le caractère social de l'espèce permet de mesurer un déficit d'interactions après irradiation.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.

Procédures

Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.

Remplacement

L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).

Raffinement

Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.

Etude de la formation de la myéline et de son rôle dans la physiologie et le comportement chez un modèle murin génétiquement modifié.

(NTS-FR-635008v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Souris : 950

Souffrances

▲ -

▲ 730

▲ 60

▲ 160

Devenir

950

Un fragment de queue est prélevé sur chaque souriceau vers sept à dix jours, une partie des souris est ensuite opérée du crâne pendant trente à soixante minutes puis hébergée seule jusqu'à dix jours, certaines dès l'âge de quatorze jours avec le risque d'être rejetées par leur mère au retour dans la portée. 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 730 d'entre elles, modéré pour 60 et sévère pour 160. Sont tuées aussi les reproductrices renouvelées et les souris nées sans la mutation recherchée. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de la myéline, protéine que le résumé désigne d'un bout à l'autre comme la "protéine A" sans jamais la nommer.

Objectifs

Dans le cerveau, l’information électrique est transportée le long des axones des neurones. Pour assurer sa bonne propagation, l’établissement de gaines isolantes est essentiel : ce sont les gaines de myéline qui ont une double fonction : assurer la survie et la fonction des neurones. La formation de gaines de myéline, appelée myélinisation, est effectué par des cellules appelées, les oligodendrocytes. La perte de la myéline dans le cerveau et l'échec de sa régénération contribuent à de graves troubles neurologiques, moteurs et cognitifs, qui sont les principales caractéristiques de plusieurs maladies de la myéline, dont la sclérose en plaques (SEP). La synthèse continue de la myéline au cours du développement et chez l’adulte est essentielle au maintien de plusieurs comportements dont l’apprentissage et les interactions sociales. Ainsi la compréhension des mécanismes moléculaires de sa formation est très importante. Nous avons récemment identifié une protéine A comme une protéine essentielle à la formation de cette myéline in vitro. Cette protéine est connue pour être liée à une pathologie humaine dont les patients présentent des défauts de substance blanche à l’imagerie, ainsi qu’une plus grande susceptibilité au développement de SEP que la population générale. L’objectif de ce projet est d’étudier précisément chez le modèle animal le rôle de la protéine A dans la myélinisation in vivo. La myéline étant une structure adaptative, l’identification de cibles moléculaires permettant d’actionner cette dynamique au cours du développement représente un espoir thérapeutique très important dans plusieurs pathologies de la myéline.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra d’apporter de nouveaux éléments à la compréhension des mécanismes impliqués dans la myélinisation du système nerveux central (SNC). Les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de stimuler la formation de la myéline au cours du développement. Nous pensons que les bénéfices de cette étude pourraient permettre une meilleure compréhension des circuits neuronaux, notamment dans le cadre de pathologies impliquants la myéline. A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de la myélinisation du SNC pourrait permettre la mise en avant de nouvelles pistes thérapeutiques pour diverses maladies de la myéline.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude seront prélevés d’un fragment de l’extrémité de la queue (prélèvement unique, moins d’une minute par animal) à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre leur patrimoine génétique. Un groupe de souris sera étudié dans trois tests comportementaux non-invasifs pour évaluer les capacités sociales, motrices et mémorielles des soucis à raison de 1test tous les 10jours (étude sur 30jours, test sur 4-5jours maximum en prenant en compte le jour d’évaluation et les jours d’habituations et d’entrainement précédents, suivis par 6- 5jours de repos), effectués du moins au plus stressant. Les tests (test de sociabilisation, test coordination motrice, test de mémoire) seront effectués le matin, avec une habituation de l’animal à la salle d’expérimentation pendant à minima 30min. Les tests seront effectués par une personne qualifiée. La durée maximale par test n’excédera pas 1h30 (temps d’habituation à la salle et test compris) et les tests ne seront réalisés qu’une seule fois chacun. Enfin, une partie des souris seront opérées sous anesthésie locale et générale (durée opération 30 à 60min par souris), et analgésie avant et après l’opération. Les animaux devront être hébergés de façon individuelle après la chirurgie afin de ne pas abîmer le matériel implanté et permettre le bon enregistrement des données. L’hébergement individuel des souris sera réduit au temps minimal nécessaire (10 jours maximum) et leur cage sera enrichie en coton et en kraft afin de limiter le stress. L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une technique réglementaire. Les animaux vigiles seront connectés à un système d’enregistrement (connexion simple et indolore) pour enregistrer l’activité électrique du cerveau en continu pendant 72h, une seule fois.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront un stress lors des manipulations et contentions nécessaires pour différentes étapes du projet. Ils pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement du bout de la queue pour connaitre leur patrimoine génétique, et un risque de saignement. La protéine que nous étudions est un gène suppresseur de tumeur, il est donc possible mais très peu probable que ces souris développent des tumeurs. En effet très peu probable car les patients ne développent pas de tumeur dans les oligodendrocytes (or notre modèle animal possède une perte partielle de la protéine dans les oligodendrocytes) et que des études précédentes utilisant le même type de modèle animal que nous ont montré le très faible développement de tumeur dans les cellules habituellement sujettes au développement tumoral chez les patients. Le risque zéro n’existe pas, mais il est extrêmement peu probable que notre étude produise des tumeurs chez les souris. L’anesthésie réalisée pour la chirurgie impliquera pour l’animal un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardio-respiratoire. La chirurgie impliquera quant à elle une douleur et un inconfort post-opératoire ainsi que des risques de complications inattendues telles que saignement ou infection. Les souris étant des animaux grégaires, l’hébergement individuel nécessaire pour les enregistrements électrophysiologiques pourra être source de stress. Pour les souris qui seront opérées jeunes, un risque de rejet par sa mère lors de leur retour dans la portée en post-chirurgie est possible. Les tests comportementaux peuvent également représenter un stress pour les animaux lié au changement d’environnement et aux manipulations. Un risque d’hypothermie est également possible dans le test impliquant un placement des animaux dans l’eau.

Devenir

A l’issue de ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié : - pour prélever leur cerveau en post-mortem, afin d’analyser de près la structure de la myéline et des neurones - à l’issue des tests comportementaux ou après la chirurgie puisque nous aurons d’ores et déjà obtenu le maximum de renseignements possibles sur ces animaux - les animaux reproducteurs renouvelés pour maintenir des capacités reproductives optimales - les animaux produits mais non porteurs de la mutation d’intérêt.

Remplacement

Le neurone, cellule nerveuse, comporte une partie très allongées appelée axone. Autour d’elle s’organise une structure particulière nommée myéline. Cette myéline est une structure en trois dimensions : une extension des membranes dites oligodendrocytaires qui s’enroule autour d’un axone électriquement actif. Suivant le principe de remplacement, nous étudierons en détail cette structure sur les cellules à l’origine de ces membranes, appelées oligodendrocytes, mis en culture (donc hors de l’animal) puisque même sans axone, ces cellules forment de la myéline. Or, il est essentiel dans le cadre de cette étude, de passer par une étude chez l’animal présentant une mutation jouant un rôle clé dans la formation de la myéline afin de pouvoir : (1) observer la formation de la myéline impactée par toutes les interactions cellulaires présentes dans le cerveau et surtout l'activité électrique des neurones, (2) étudier l'impact de la mutation sur le comportement de la souris.

Réduction

Afin d’appliquer le principe de réduction, nous fondons une grande partie de notre étude sur des expériences de cellules en culture. De plus, nous optimiserons l’utilisation de nos animaux. Le nombre d’animaux utilisés (950) sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables (taille des effectifs nécessaire établi grâce à un calcul de puissance permettant une interprétation fiable des résultats, étude faite en collaboration avec les statisticiens). Une marge de production est incluse dans ce nombre d’animaux mais nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos lots expérimentaux, nous utiliserons donc potentiellement moins d’animaux que prévu ici. Toutes les expériences mentionnées seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d'évaluer la présence éventuelle d'un sex-ratio. Toutes les quantifications se feront en aveugle, c’est-à-dire sans connaitre au préalable le génotype de la souris analysée pour limiter le biais lié à l’observateur, donc la variabilité et ainsi le nombre de souris nécessaire.

Raffinement

L’animalerie est agréée, ainsi les conditions d’hébergement (température,hygrométrie,éclairage et espace selon les recommandations) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (bâtonnet à ronger, neslet), d’alimentation et les soins (quand nécessaires) seront contrôlés quotidiennement. L’hébergement individuel des animaux sera automatiquement suivi d’une supplémentation d’enrichissement (kraft). Une période d’acclimatation de 7 jours pour les animaux provenant de l’extérieur sera effectuée avant toute procédure. Les animaux seront observés quotidiennement par la zootechnie et surveillés régulièrement et de manière adaptée aux différentes procédures par notre équipe. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé au calme dans une pièce dédiée, avec du matériel désinfecté et suivi d’une surveillance pour vérifier la bonne prise en charge des petits par leur mère. Sa taille sera limitée au strict minimum et il sera fait sur de jeunes animaux pour lesquels l’extrémité de la queue est peu sensible et cicatrise vite. Pour les tests comportementaux, une période d’habituation propre à chaque test sera réalisée avant chacun des tests et une période de repos sera assurée entre chaque test. Pour chaque test comportemental, un suivi adapté de la souris sera assuré pour limiter son stress et favoriser son bien- être. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec un maintien et un suivi de la température des animaux. Un suivi renforcé sur 7 jours sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Un suivi spécifique sera mis en place pour les animaux opérés à 14 jours d’âge. Afin d’évaluer les impacts phénotypiques des mutations étudiées, nous tiendrons un registre de suivi du bien-être des animaux : observation 2 fois parsemaine par notre équipe de la naissance à la mort des animaux à l’aide d’une grille d’évaluation (en fonction des critères, l’observation et le suivi de l’animal pourra devenir quotidienne). Des points limites sont mis en place et respectés pour éviter toute souffrance, avec décision et prise en charge rapide des animaux.

Choix des espèces

La formation de myéline est propre au développement des animaux vertébrés. Ainsi son étude nécessite l’utilisation de modèles animaux vertébrés. De plus, puisque nous étudions une voie moléculaire en particulier, celle de la ‘protéine A’, l’établissement de la myélinisation avec une visée thérapeutique future, il est indispensable que le modèle que nous choisissions ait une forte homologie de séquence génétique de cette protéine A avec l’Homme. Le modèle souris présente plusieurs avantages pour notre étude : c’est un vertébré dont les gènes codant la protéine A présentent une forte homologie de séquence avec ceux de l’Homme. Nous étudierons les animaux à différents âges depuis la naissance. Nous réaliserons un prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Une étude à différents âges au cours du développement post-natal permettra de suivre l’évolution de la myélinisation (à 14, 21, 30, 60, 120 et 180 jours). En parallèle, nous étudierons aux mêmes âges comment est affecté le fonctionnement du cerveau en enregistrant les ondes produites (étude dite électrophysiologique). Enfin, nous étudierons le comportement des souris chez le jeune adulte (entre 60 et 90 jours).

Microstructure du cycle veille-sommeil au cours du vieillissement chez les souris TgM83, un modèle préclinique de la maladie de Parkinson

(NTS-FR-502101v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Souris : 24

Souffrances

▲ 12

▲ -

▲ 12

▲ -

Devenir

Les souris de la lignée TgM83 portent une protéine humaine mutée qui déclenche chez elles, vers huit à dix mois, des troubles moteurs de type parkinsonien. 24 d'entre elles vont être utilisées, douze dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, douze dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. La moitié subit une chirurgie crânienne pouvant durer une heure, puis vit isolée une semaine sur deux pendant dix-huit semaines, le temps d'enregistrer leur sommeil de trois à dix mois d'âge. Toutes sont tuées par perfusion transcardiaque sous anesthésie terminale, pour que leur cerveau soit examiné avant l'apparition des signes moteurs de la maladie.

Objectifs

Le trouble comportemental en sommeil paradoxal anticipe d’une décennie la maladie de Parkinson dont il est considéré comme le meilleur marqueur précoce. Pendant le sommeil paradoxal, nous sommes naturellement paralysés. Cette paralysie est absente chez les patients atteints du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Nous faisons l’hypothèse que la zone cérébrale contrôlant cette paralysie serait une cible précoce des mêmes processus pathologiques que ceux responsables de la maladie de Parkinson et qui envahiraient au cours du veillissement l’ensemble du cerveau.Notre objectif est de tester cette hypothèse sur une souche de souris de type transgénique (TgM83), fréquemment utilisée pour la recherche sur la maladie de Parkinson, qui expriment une protéine humaine mutée responsable d’une forme génétique de cette maladie neurodégénérative. Différentes études comportementales indiquent que les souris TgM83 présentent des altérations motrices sévères de type parkinsonien dès l’âge de 8-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est perturbé en amont de ces signes cliniques, comme chez les patients parkinsoniens.Ce projet nous permettra de caractériser le sommeil des souris TgM83 porteuses de la pathologie, de prévoir l’émergence de la maladie de Parkinson à la détection de symptômes précoces durant le sommeil et enfin d’étudier la propagation cérébrale de la pathologie au cours du veillissement.

Bénéfices attendus

Le trouble comportemental en sommeil paradoxal est pour les médecins un symptôme neurologique précoce et fiable de la Maladie de Parkinson. En effet, il serait l’un des premiers signes visible et facilement identifiable à l’hôpital qui survient une dizaine d’années avant les symptômes moteurs invalidants bien connus. Par ailleurs, ceci suggère que ces deux pathologies sont chronologiquement liées et partageraient des mécanismes pathologiques communs qui envahiraient de façon lente, insidieuse et presqu’invisible, le cerveau au cours du vieillissement chez les patients. Notre objectif est de tester cette hypothèse en profitant de l’opportunité expérimentale que nous offre une souche de souris exprimant la protéine mutée qui est responsable de la maladie de Parkinson. Différentes études comportementales antérieures ont déjà établi que ces souris présentent des altérations motrices de type parkinsonien dès l’âge de 9-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est sévèrement perturbé en amont comme il est maintenant bien décrit chez les patients parkinsoniens. Plusieurs bénéfices importants sont attendus de ce projet de recherche qui visera d’abord à caractériser finement le sommeil de ces souris, de déterminer si elles développent, comme nous le prévoyons, un trouble comportemental en sommeil paradoxal précoce, voire d’autres biomarqueurs potentiels prédictifs de la Maladie de Parkinson, et d’étudier comment la pathologie se propage dans le cerveau au cours du vieillissement. Selon les résultats obtenus, cette souche de souris pourrait alors constituer un modèle préclinique pertinent de la maladie de Parkinson, mimant précisément et chronologiquement son développement au cours du temps. Ceci ouvrirait alors de nombreuses voies de recherche pour la mise au point à moyen terme de traitements préventifs pour ralentir la maladie, voire curatifs en la stoppant complètement dès la pose de son diagnostic.

Procédures

La moitié des souris (n=12) prévues pour ce projet de recherche subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d'une durée maximum de 60 minutes. Elles seront ensuite mises en isolement lors des phases expérimentales pendant 1 semaine toutes les 2 semaines, soit pour une durée maximale de 18 semaines. Pour le prélèvement des cerveaux en fin d’expérimentation, l’ensemble des souris (n=24) recevront successivement un traitement médicamenteux analgésique puis sédatif avant l’induction par voie intrapéritonéale d'une anesthésie chirurgicale terminale requise pour la perfusion transcardiaque de l’animal.

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des souris (n=24) prévues pour ce projet de recherche, de potentiels effets indésirables liés à l’aspect neurodégénératif du modèle animal sont à considérer et sont de fait attendus (objet du présent projet). Bien que les animaux soient mis à mort avant l’apparition de signes moteurs avant-coureurs de la maladie de Parkinson, il n’est pas à exclure une apparition précoce d’un trouble du comportement en sommeil paradoxal (objectif de ce projet), une perte légère de poids et quelques difficultés locomotrices à l’éveil sur certains individus. Pour la moitié de ces souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), les effets indésirables afférents sont très peu probables mais seront anticipés comme une hypothermie, une hémorragie locale, un arrêt respiratoire ou une infection post-opératoire entraînant une dégradation de l’état de santé. L’isolement des souris durant les phases d’enregistrement pourrait entraîner un léger stress et anxiété transitoire, sans impact sur nos paramètres d’intérêt.

Devenir

Toutes les souris prévues pour ce projet de recherche (n = 24) seront mises à mort en fin de procédure afin de prélever les cerveaux pour leur étude anatomo-pathologique et comparative.

Remplacement

L’intérêt d’étudier les mécanismes physiopathologiques responsables troubles du sommeil réside dans leur caractère prédictif et évolutif vers la Maladie de Parkinson. Or, il est encore aujourd’hui impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade, d’autant qu’aucun marqueur spécifique des mécanismes impliqués n’est encore validé en neuroimagerie. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés sur des biopsies issues de patients mais décédés des décennies après le déclenchement des processus pathologiques. Aussi, des modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire les observations cliniques, les comprendre et les modéliser. La souris est un animal adapté aux études longitudinales (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge). Par ailleurs, les réseaux neuronaux responsables du sommeil sont communs aux mammifères, incluant les rongeurs et l’homme, et sont bien identifiés. Enfin, des animaux de niveau phylogénétique inférieur (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité́/inactivité́) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal qui est spécifique aux mammifères et aux oiseaux (peut-être aux reptiles) et dont la complexité́ du système nerveux n’est en rien comparable avec celle des mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent régulièrement comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles pour aborder des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques sous-jacentes de pathologies évolutives et neurodégénératives comme la Maladie de Parkinson.

Réduction

Le nombre d'animaux est légitimé par l’organisation de l’étude autours de deux procédures expérimentales indépendantes mais conduites en parallèle. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos nombreuses études conduites chez la souris et publiées au cours de la dernière décennie par l’équipe, incluant nos travaux déjà réalisés dans le cadre de la demande d’autorisation de projet précédente sur le même sujet. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes des deux procédures expérimentales (chirurgie sous anesthésie générale, récupération post-opératoire, survie post-traitement, comportements anormaux, état de santé général), la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps (procédures de plusieurs mois) pouvant dès lors rendre leur interprétation aléatoire, en enfin la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques paramétriques ou non paramétrique adaptés aux petits échantillons). Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale avec mise à mort pour les analyses des cerveaux, éliminant toute possibilité de réutilisation.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie de notre centre de recherche, toutes les souris (n=24) seront classiquement hébergées en respectant des conditions optimales à 4 par cage favorisant des interactions sociales normales jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge requis pour les expérimentations. Des enrichissements environnementaux systématiques seront mis en place pour améliorer leur bien-être, tels que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des batônnets de bois à ronger. Pour évaluer le bien-être, le poids et l’état du pelage seront mesurés quotidiennement. Si un animal dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales, il sera retiré́ et euthanasié sans délai. Pour les souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), une attention quotidienne leur sera portée lors de la phase post-opératoire pour optimiser la récupération (ajout d’anti-inflamatoires non-stéroidiens si nécessaire, suivi pondéral, mobilité et comportements) grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Pendant les périodes expérimentales (1 semaine sur 2 pendant 18 semaines), notre préoccupation sera d’analyser régulièrement grâce à des fiches de scorage l’évolution des paramètres physiologiques et le comportement locomoteur pour détecter au plus tôt les perturbations caractéristiques du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Celles-ci constitueront de-facto le point limite des expérimentations, tout en établissant la preuve de concept recherchée. Dans les cas où aucun trouble comportemental en sommeil paradoxal ne se déclencherait avant l’apparition spontanée des signes cliniques moteurs de type parkinsonien (9-10 mois d’âge), la mise à mort sera programmée pour prévenir toute souffrance.

Choix des espèces

Nous souhaitons valider un modèle préclinique d’une pathologie neurologique prédictive de la Maladie de Parkinson, en reproduisant chez la souris les mécanismes évolutifs sous-jacents se déroulant sur plusieurs décennies chez les patients, bien avant leur décès. Aussi, les analyses anatomo-pathologiques des cerveaux de patients décédés ne permettent pas d’aborder ces mécanismes qui débutent de façon précoce, bien avant l’apparition des problèmes moteurs bien connus de la Maladie de Parkinson. Il n'existe pas de marqueurs qui permettraient l’exploration fonctionnelle par neuroimagerie. La compréhension de mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par la mise en œuvre de techniques inapplicables chez l’homme mais possible chez la souris présentant de grandes similitudes d’organisation de leur cerveau. Par ailleurs, le sommeil paradoxal est propre aux mammifères. Des modèles d’animaux moins évolués sont parfois utilisés pour l’étude de la vigilance mais ils ne sont pas pertinents pour ce projet. Nos travaux ont permis d’identifier chez le rongeur les structures cérébrales potentiellement ciblées par la pathologie. Ceci rend évident le choix de la souris, particulièrement la souris TgM83 pour induire l’expression de la protéine mutée impliquée dans la pathologie qui nous intéresse. Cette étude longitudinale de la période présymptomatique chez ce modèle murin durera 7 mois environ, débutant chez des souris jeunes adultes asymptomatiques âgées de 3 mois pour s’achever dès qu’apparaitront les premiers signes prédictifs de la maladie de Parkinson (mais avant la mise en place de la pathologie), à l’âge de 9-10 mois. Pour ce type d’étude physiologique et comportementale de longue durée, la souris s’avère à nouveau plus adaptée que le rat (pas de prise de poids et de volume corporel significatif avec le vieillissement, cerveau de plus petite taille avec des processus évolutifs plus rapides) augmentant la faisabilité du projet.

Evaluer le rôle d’un récepteur de la sérotonine et l’intérêt de ses ligands pour traiter les troubles cognitifs et sensoriels

(NTS-FR-415675v1 – 12/09/2024)

Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Recherche fondamentale
- Système nerveux

Souris : 872

Souffrances

▲ -

▲ 72

▲ 800

▲ -

Devenir

872

Quarante-deux gavages, un par jour pendant quarante-deux jours, voilà ce que subissent 480 des souris de ce projet, 800 d'entre elles passant par ailleurs des tests comportementaux répétés jusqu'à cinq jours d'affilée. 872 souris vont être utilisées en tout, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 72 d'entre elles et modéré pour 800. La démyélinisation est provoquée par un produit ajouté à la nourriture, afin de tester si des molécules ciblant un récepteur de la sérotonine corrigent les troubles cognitifs et sensoriels associés à la sclérose en plaques. Le porteur retient la souris pour son homologie génétique de 90 % avec l'être humain et parce qu'il dispose déjà de lignées transgéniques dépourvues de ce récepteur, hébergées chez un prestataire d'élevage.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde. La maladie se manifeste par une grande variété de symptômes qui se caractérisent par une atteinte des voies motrices, une baisse de la sensibilité et l'apparition de troubles cognitifs et émotionnels. Ces symptômes sont liés à la perte de la gaine de myéline (processus de démyélinisation) qui entoure les neurones et qui permet à l'information de voyager rapidement et efficacement le long des nerfs. De plus, plusieurs résultats de la littérature soulignent l'intérêt de cibler un récepteur de la sérotonine pour le traitement de maladies neurodégénératives. Sachant qu'il est connu que des molécules qui se lient à ce récepteur ont des effets bénéfiques pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques, l'idée principale de ce projet est de vérifier si ces molécules peuvent aider à traiter différentes facettes de la maladie, comme les problèmes de perte de myéline ainsi que des troubles cognitifs et sensoriels dans un modèle animal de maladie qui reproduit ses symptômes. Nous réaliserons des études comportementales et des analyses biochimiques et histologiques pour évaluer le rôle du récepteur dans cette maladie. Dans cette étude nous utiliserons 872 animaux.

Bénéfices attendus

Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable de restaurer les déficits sensoriels et cognitifs. Nous espérons faire progresser l'état des connaissances quant au rôle du récepteur de la sérotonine dans les effets cognitifs de la démyélinisation dans le modèle de sclérose en plaques .

Procédures

Afin de réaliser le génotypage, un poinçonnage de l'oreille sera effectué après l'âge de 14 jours. Cette intervention n'est réalisée qu'une fois par animal et dure moins de 30 secondes. Le génotypage ne sera pas systématique puisque l'élevage sera maintenu avec des croisements homozygote x homozygote. Ainsi, seulement une partie des animaux sera prélevée pour le génotypage. Au total, 42 administrations (1 administration par jour pendant 42 jours) par voie orale (1 min/gavage/jour) seront réalisées sur 480 animaux vigiles. 800 animaux effectueront des tests de comportement n'excédant pas 10 minutes par test et deux tests maximum par jour. Une période d'habituation de 20 minutes pourra parfois être nécessaire soit de 5 à 30 min/jour/animal. Certains tests pourront être répétés tous les jours pendant maximum 5 jours pour mesurer les comportements sociaux. L'ensemble des animaux recevra une dose sublétale d'anesthésique/antalgique (1 min/injection intrapéritonéale) avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet sont identifiés par les bagues à l'oreille et une partie est prélevée de l'autre oreille pour le génotypage (DAP générique pour les prélèvements pour le génotypage). Les souris pourraient ressentir une légère nuisance due à ces prélèvements (douleur légère de courte durée). Contrairement au modèle EAE (Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale), le modèle de démyélinisation par la cuprizone n’induit pas de paralysie des animaux et n’engendre pas de perte de poids. Cependant, ce modèle est connu pour entrainer des déficits cognitifs et sensoriels. Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajouté dans la nourriture. L'objectif de ce projet est essentiellement thérapeutique et a pour but de tester les propriétés des ligands du récepteur 5-HT7 synthétisés par nos collègues chimistes dans un modèle de sclérose en plaques. Nous avons déjà montré qu'une des molécules testées (Serodolin) possède des propriétés anti-inflammatoires et antalgiques. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après administration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple). De même, la manipulation des animaux dans plusieurs tests comportementaux peut induire un stress. Les procédures mises en œuvre seront de classes légères ou modérées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des trois procédures pour réaliser des dosages et analyses immunohichimiques.

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Les études in vitro nous permettent aussi de vérifier l’affinité des molécules pour le récepteur et ainsi de définir la dose utilisée in vivo. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation/remyélinisation induite par la cuprizone. L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement de médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet d’une molécule résulte de son action au niveau de l’ensemble de l’organisme. A ce jour aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de prédire et rendre compte de l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’action d’un médicament et en particulier ceux qui conditionnent le comportement.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Les approches décrites nécessitent des cohortes de 6 animaux minimum par groupe et 10 animaux maximum par groupe pour les études de comportement. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats. En ce qui concerne l’analyse des données comportementales, des procédures statistiques adaptées à l’analyse des variables dépendantes relevées seront utilisées.

Raffinement

Nous réaliserons une période d'acclimatation d'une semaine des animaux avant le début des expériences. Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec entre autres, des bâtons de bois à ronger de deux tailles différentes et/ou du celluron et/ou des disques de papier kraft compactés et/ou tunnels en carton ou dômes en cellulose et/ou une pyramide polycarbonate où sont placées les capsules de nourriture. Les animaux seront suivis tout au long des procédures quotidiennement (observation de l’aspect général extérieur de l’animal : posture, qualité du pelage, faciès, yeux). Un suivi deux fois par semaine avec la grille de scoring au moment de leur pesée permettra d’appliquer un point limite prédictif et aboutira à la décision de mise à mort par les responsables de bien-être animal si les points limites sont atteints. En fonction du score total, la grille de scoring pourra être appliquée quotidiennement. Dans le cas où un animal présente un ou des signe(s) clinique(s) lors des visites quotidiennes, nous effectuerons une surveillance renforcée. Le suivi des animaux est conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Des données de la littérature indiquent que des préparations de croquettes commercialisées n'induisent pas toutes une démyélinisation, aussi nous avons choisi de préparer notre nourriture. Une étude antérieure nous a permis de montrer que la nourriture faite maison induisait bien une démyélinisation. Cependant, sachant que la nourriture préparée ne permet pas aux animaux de ronger, dans ce projet et pour le confort des animaux, nous souhaitons évaluer si les croquettes commerciales induiront bien une démyélinisation. Si tel est le cas, les croquettes commerciales contenant l'agent de démyélinisant seront utilisées dans les procédures suivantes. Dans le cas où nous utilisons la nourriture faite maison, elle sera préparée tous les 3/4 jours et renouvelée 2 fois/sem et nous ajouterons des bâtons de bois à ronger dans la cage pour limiter la pousse continuelle des dents.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études précliniques. Nous utiliserons des souris C57BL/6 car nous disposons actuellement de souris transgéniques qui n'expriment pas le récepteur 5-HT7 sur ce même fond génétique. Ces souris sont actuellement hébergées dans un établissement prestataire d'élevage, ce qui donne de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est : - un mammifère proche de l'Homme (homologie de 90%) - l’animal de laboratoire le plus utilisé par la communauté scientifique et pour les études précliniques Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 à 12 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature. Cet écart d'âge se justifie pour pouvoir constituer nos cohortes et réduire le nombre de portées nécessaires. Nous veillerons à ce que l'âge moyen des animaux par groupe soit homogène.

Remodelage des cartes corticales somesthésiques et motrices après déafférentation vestibulaire

(NTS-FR-361704v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux

Rats : 480

Souffrances

▲ -

▲ 480

Devenir

480

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une solution chimique injectée à travers le tympan détruit leurs capteurs d'équilibre et provoque vertiges, pertes d'équilibre et troubles de la marche, puis neuf séances de tests comportementaux s'échelonnent sur trente jours, avant une cartographie du cortex de cinq à huit heures, crâne ouvert sur cinq millimètres de côté, dont les rats ne se réveillent pas. Le projet décrit la réorganisation de deux zones cérébrales après la lésion, avec l'idée d'améliorer un jour la rééducation des patients atteints de troubles vestibulaires. Le porteur conclut que le recours aux rats est "nécessaire et incontournable" et qu'il n'est "pas remplaçable" par d'autres modèles.

Objectifs

La déafférentation des capteurs vestibulaires de l’oreille interne est à l’origine de pathologies appelées « vestibulopathies périphériques » (VP). Ces pathologies provoquent des troubles de l’équilibre et de la marche, mais également visuels, perceptifs et cognitifs associés à des vertiges. Les VP ont une forte prévalence dans la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal important. Dans ce projet, nous allons réaliser un modèle de lésion de l’oreille interne à l’arsanilate qui est un modèle animal de vestibulopathie représentatif de la pathologie vestibulaire chez le patient. Dans le cadre de ce projet nous allons étudier les modifications cérébrales induites dans deux zones du cerveau : une qui reçoit les informations de la surface du corps en lien avec le sens du toucher (cortex somatosensorielle primaire), et une autre zone qui contrôle les mouvements volontaires (cortex moteur primaire). À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée précisémment à ces deux zones cérébrales après une lésion de l’oreille interne et nous faisons l’hypothèse qu’il y aura des modifications cérébrales importantes après la lésion vestibulaire. En effet, après une lésion de l’oreille interne, avec le temps le cerveau va s’adapter et compenser la perte d'équilibre permettant ainsi de retrouver une stabilité posturale. C’est ce qu’on appelle la compensation vestibulaire. Ainsi, les modifications cérébrales dans les deux zones du cerveau seront étudiées à 3 délais post-lésionnels : 4 jours après la lésion vestibulaire, 15 jours ou 30 jours. Ces différents délais nous permettrons d’évaluer comment la perte des informations vestibulaire et la compensation vestibulaire modifient nos deux zones cérébrales d’intérêts. Comprendre ces mécanismes est crucial, non seulement pour la science fondamentale, mais aussi pour améliorer les méthodes de rééducation sensorielle et motrice en clinique.

Bénéfices attendus

En France, les déficits vestibulaires représentent 5% des urgences à l’hôpital et 300 000 consultations par semaine. La perte de l’équilibre constitue un vrai handicap sensoriel et moteur et les déficits vestibulaires impactent grandement la vie quotidienne des patients. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la compensation vestibulaire restent en partie méconnus, notamment dans les zones cérébrales motrices et sensorielles qui nous intéressent dans ce projet. Comprendre ces mécanismes est crucial, non seulement pour la science fondamentale, mais aussi pour améliorer les méthodes de rééducation sensorielle et motrice en clinique.

Procédures

Injection d’une solution chimique à travers le tympan sous anesthésie générale pour induire le syndrome vestibulaire (vertige, déficits de la posture et de la marche) : de 40 à 90 min. Test comportementaux à J1, J2, J3, J4, J7, J10, J15, J21 et J30 après la lésion vestibulaire: 15 min par session. Cartographie (sous anesthésie générale – de 5 à 8h) : - Ouverture du crâne (5 mm x 5 mm) pour implantation d’électrodes permettant l’enregistrement des signaux cérébraux. - Stimulation de la patte et enregistrements cérébraux. - Stimulation cérébrale et enregistrements des mouvements de la patte. Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale pour récupérer les tissus d'intérêts.

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à une lésion vestibulaire peuvent avoir un déficit d’hydratation dans les 24-48 heures après l’atteinte vestibulaire. Une perte de poids attendue chez les animaux les premiers jours après la lésion vestibulaire (environ 5 à 10%). L’introduction d’un liquide dans l’oreille moyenne (pour la lésion vestibulaire) peut être source d’inconfort. Les déficits vestibulaires conduisent à d’autres effets indésirables tels que des problèmes de maintien de la posture, une perte d’équilibre et de la fatigue. Les tests comportementaux peuvent être source de stress pour les animaux car ils sont séparés temporairement de leurs congénères (5 à 10min). Pour la lésion vestibulaire et les enregistrements cérébraux les animaux sont sous anesthésie générale (40 à 90min pour la lésion vestibulaire, 5 à 8h pour les enregistrements). Il est nécessaire de réaliser sous anesthésie générale l’ouverture du crâne (5 mm x 5 mm) pour une implantation d’électrodes afin d’enregistrer les signaux cérébraux. Les animaux ne seront pas réveillés à la fin de cette chirurgie mais de nouveau anesthésiés profondément afin de récupérer le cerveau pour différentes analyses.

Devenir

La totalité des animaux du projet (n=480 ; 14 groupes) auront une perfusion intracardiaque afin de récupérer les tissus pour des marquages immunohistochimiques.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle informatique mimant de manière aussi complexe la physiologie et la physiopathologie du syndrome vestibulaire. De manière identique, les modèles in-vitro ne peuvent pas s’appliquer dans le cadre de ce projet puisque nous avons besoin de l’individu dans son ensemble, autant au niveau du système nerveux central (pour les modifications au niveau cortical) qu’au niveau périphérique (informations quant à l’équilibre postural et locomoteur, et la compensation des déficits vestibulaires). Les objectifs même de cette étude axée sur la compréhension des mécanismes de plasticité mis en jeu après une atteinte vestibulaire et leur corrélation avec la récupération fonctionnelle nécessitent le recours à des animaux. Par ailleurs, l’étude des mécanismes neurochimiques nécessite une approche post-mortem sur coupes histologiques. Nos approches invasives ne pouvant être utilisées chez l’humain, l’utilisation de rats est donc nécessaire et incontournable et n'est pas remplaçable par d’autres modèles alternatifs.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est limité à son strict minimum. Le nombre d’animaux par groupe a été fixé au regard de la littérature sur les modifications cérébrales à savoir n=10/groupe/sexe. Certains animaux pourraient probablement être écarteés de notre étude pour l’une des causes suivantes : une défaillance physiologique de l’animal, une mauvaise diffusion de la solution chimique à travers le tympan, des problèmes techniques (parasitage des enregistrements cérébraux…). Ce qui nous amène à fixer le nombre de rats par groupe à n=12/sexe mais nous pourrons réduire le nombre d’animaux à n=10/sexe si aucun animal n’est écarté.

Raffinement

Avant l’administration d’une solution chimique à travers le tympan pour induire les déficits vestibulaires, les animaux sont sous anesthésie générale. La température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée, et une solution est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire. Avant le réveil de l’animal, une solution sera injectée pour sa réhydratation et ainsi compenser les pertes liquidiennes lié à la chirurgie. Les biberons des cages des animaux seront équipés d’une pipette allongée et une solution nutritionnelle complète sera fournie dans la cage des animaux pour faciliter l’hydratation et l’alimentation durant la première semaine post-lésion. Le suivi de poids, ainsi que l’évaluation de l’apparence et du comportement des animaux (réalisée avec une grille de score adaptée pour reconnaitre les points limites et actions à entreprendre mais également les points d’arrêts de l’expérimentation), sont effectués quotidiennement durant la première semaine, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin des tests comportementaux. Les animaux sont habitués à l’expérimentateur et à la salle d’expérimentation pendant 1 à 2 semaines pour limiter le stress. Une récompense (riz soufflé chocolaté) est donnée aux animaux après les tests comportementaux avant leur retour dans l’animalerie. Avant de réaliser les enregistrements cérébraux, les animaux sont sous anesthésie générale. L’hydratation de l’animal est maintenue et renouvelé toute les heures grâce à une solution injectable. Pour faciliter la miction de l’animal pendant la chirurgie, un palpage de la vessie sera réalisé. Un analgésique sera également administré à l’animal avant incision au niveau du crâne pour pouvoir accéder au cerveau. Une solution est appliquée sur les yeux pour l’hydratation oculaire et la température de l’animal est maintenue avec une couverture chauffante thermorégulée. Tout au long de la procédure chirurgicale des points limites ont été définis visant à éviter, réduire ou supprimer la douleur ou la souffrance de l’animal. Une fois les enregistrements cérébraux terminés, les animaux sont de nouveau anesthésiés profondément avant de réaliser une perfusion intracardiaque et de récupérer leurs cerveaux.

Choix des espèces

Les études antérieures dans le domaine de la plasticité post-lésionnelle du cortex cérébral ont été menées chez l’humain, le primate non-humain et, majoritairement, chez le rat. Par ailleurs, les études développées dans le laboratoire au niveau du cortex somesthésique ont été réalisées chez le rat avec des approches électrophysiologiques, immunohistochimiques et comportementales. Les études du laboratoire dans ce domaine constituent des études de référence importantes pour l’avancée de notre projet. De même, les tests comportementaux visant à évaluer les déficits vestibulaires et leur récupération sont bien standardisés dans les études conduites chez le rat et sont maîtrisés dans notre laboratoire. Afin d’étudier la plasticité post-lésionnelle du système nerveux, les animaux utilisés seront âgés de 3 mois (± 15 jours), chez qui le système nerveux est considéré comme mature.

Étude de l’influence des neurones sensoriels Nav1.8+ sur l’effet antitumoral des chimiothérapies dans des modèles murins de tumeurs mammaires

(NTS-FR-315343v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux

Souris : 3600

Souffrances

▲ -

▲ 3600

Devenir

3600

Certaines des souris utilisées développent spontanément des tumeurs sur leurs dix glandes mammaires vers quatorze à seize semaines, d'autres reçoivent à quatre semaines une toxine qui détruit une partie de leurs neurones de la douleur. 3 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des adénocarcinomes mammaires, subissent des chimiothérapies, des injections péritumorales et l'implantation chirurgicale d'une micropompe, sans qu'aucun analgésique puisse leur être donné puisque le projet porte justement sur les neurones de la douleur, et le porteur affirme pourtant qu'en respectant les limites de taille des tumeurs elles n'atteindront jamais le stade de la souffrance. La mise à mort, entre seize et vingt-huit semaines, sert à prélever les tumeurs, les poumons, la rate, les ganglions lymphatiques et les ganglions rachidiens.

Objectifs

Il apparait de plus en plus évident que les systèmes nerveux et immunitaire travaillent de concert pour détecter les menaces, assurer la défense de l’hôte et maintenir ou restaurer l’homéostasie. Leur interaction repose sur l’action de molécules libérées par les fibres nerveuses innervant les tissus, capables de moduler les fonctions des cellules immunitaires, et vice-versa. Les glandes mammaires saines et les tumeurs mammaires murines sont innervées par ces fibres nerveuses impliquées dans la perception de la douleur et pourraient influencer la progression tumorale en fonction du statut inflammatoire des tumeurs. L’objectif principal de ce projet est donc d’examiner en détail l’influence potentielle de certaines de ces fibres nerveuses (Nav1.8+) sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire antitumorale, en particulier lors de traitements chimiothérapeutiques.

Bénéfices attendus

L’influence des fibres nerveuses Nav1.8+ sur la régulation de la réponse immunitaire antitumorale et l’effet thérapeutique des chimiothérapies reste peu exploré. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous-tendant cette régulation permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques combinées aux chimiothérapies. L’étude de l’influence des nocicepteurs sur la croissance tumorale et la réponse immunitaire anti-tumorale lors de traitement chimiothérapeutiques revêt donc une pertinence clinique évidente. Notamment, cette étude pourrait apporter des éclaircissements sur la prise en charge de la douleur provoquée par ces traitements, et déterminer si celle-ci influe sur la réponse antitumorale.

Procédures

Certaines souris seront soumises à une procédure chirurgicale afin de d'implanter une micro pompe osmotique. L'ensemble des injections (Intrapéritonéales, sous-cutanées, péri-tumorales) seront réalisée sous anesthésie gazeuse légère (isofluorane) et n’excèdent pas 10 secondes. Les souris subiront des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse sans nuisance pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux seront porteurs d’un ou plusieurs adénocarcinomes mammaires et seront soumis à des traitements chimiothérapeutiques, susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Certaines lignées de souris utilisées dans ce projet développent des tumeurs mammaires au niveau des 10 glandes mammaires aux alentours de 14-16 semaines. Cependant, par expérience, en respectant les limites de taille des tumeurs, les souris n’atteindront jamais le stade de souffrance ou de difficulté de mouvement aux temps auxquels elles seront mises à mort (entre 16 et 28 semaines). Dans ce projet, les souris seront soumises à diverses interventions (injection de cellules, agents chimiques, actes chirurgicaux) susceptibles de provoquer des douleurs allant de modérées à sévères, ainsi qu'un stress de durée variable, allant de courte durée (10 secondes) à plus longue durée (1 heure).

Devenir

Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (tumeurs, poumon, ganglion lympahatiques, rate, ganglions de la corne dorsale)

Remplacement

Notre hypothèse est que les fibres nerveuses Nav1.8+ pourraient influencer l’effet thérapeutique des chimiothérapies et la réponse immunitaire antitumorale. Compte tenu de la nature même du projet, qui nécessite d’effectuer des traitements de chimiothérapies sur des individus malades, seuls des modèles animaux sont utilisables pour répondre à ces questions. De plus, la tumeur est un micro-environnement complexe qui ne peut pas être modélisée in vitro et in silico, particulièrement en ce qui concerne son innervation sensorielle. Cependant, pour la recherche des mécanismes de l’interaction neurone-cellules immunitaires-cellules tumorales, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones, de cellules tumorales et de cellules immunitaires. De même, pour comprendre l’effet spécifique des chimiothérapies sur l’activation neuronale, nous tenterons d’effectuer ces traitements sur des cultures de neurones

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris au maximum. Le modèle d’induction d’un adénocarcinome mammaire est très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire. Ainsi, la pousse tumorale aura lieu dans quasiment 100% des souris. Des expertises antérieures de certains membres de l’équipe, enrichies par des recherches bibliographiques, nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience. Ce nombre a été également déterminé afin de répondre aux exigences de tests statistiques permettant d’obtenir une différence clinique et significative. Pour chaque groupe d'animaux utilisé, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la tumeur, marqueurs sanguins, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (tumeur, rate, foie, poumons, ganglions lymphatiques drainant et ganglion rachidien de la racine dorsale (DRG)) afin d'éviter de répéter des expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement tumoral et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de même portée respectifs et non avec des souris de type sauvage.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et boivent ad libitum et sont libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne est réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant le développement tumoral et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage et du comportement général des animaux, ainsi que de la taille et de l’aspect de la tumeur. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux à partir du moment où la taille des tumeurs atteindra 200mm3 pour faciliter au maximum l'alimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature. Certaines souris seront traitées à la résinifératoxine et à la toxine diphtérique, respectivement, à l’âge de 4 semaines. En effet, l'injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d'obtenir une déplétion optimale et spécifique de cette sous-population neuronale.

Importance du sens trigeminal pour la perception des odeurs

(NTS-FR-230689v1 – 12/09/2024)

Recherche fondamentale
- Système nerveux

Souris : 582

Souffrances

▲ -

▲ 582

▲ -

Devenir

582

Comprendre comment le cerveau décode l'intensité des odeurs, en démêlant ce qui revient à l'olfaction et ce qui revient aux fibres nerveuses trigéminales : pour cette question, 582 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une biopsie de la queue vers six jours sert au génotypage, puis viennent une heure de chirurgie sous isoflurane pour injecter un virus et implanter des fibres optiques dans le cerveau, et des séances quotidiennes de discrimination olfactive de vingt minutes pendant huit à dix jours. Pour que les souris travaillent, leur eau de boisson est additionnée d'acide citrique afin qu'elles boivent moins et cherchent la récompense, ce qui fait baisser leur poids. Le porteur annonce des points limites "établis préalablement" sans dire lesquels, et ne précise pas combien des 582 souris passent par la chirurgie.

Objectifs

L'odorat joue un rôle essentiel dans l'interaction avec le milieu environnant, la détection des sources d'alimentation potentiellement dangereuses et l'évaluation de la comestibilité des aliments. Ces dernières années, l'importance de l'odorat est devenue de plus en plus évidente, en raison de l'augmentation des troubles de l'odorat provoquée par les infections par le SRAS-CoV2. Par rapport à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a attiré peu d'attention en partie parce qu'il s'agit d'une condition socialement « invisible ». La pandémie de COVID-19 a considérablement augmenté l'incidence de cette maladie et a également sensibilisé le grand public à ce sujet. Pourtant il n'existe aucune intervention thérapeutique permettant de récupérer ou d'améliorer les capacités olfactives. Cette absence de solutions découle d'un manque de connaissances sur les mécanismes physiologiques qui régissent le système olfactif. Les principes fondamentaux qui déterminent la perception de mélanges d'odeurs complexes, les stimuli olfactifs les plus courants dans la nature restent non élucidés. La plupart des odeurs à des concentrations spécifiques peuvent activer les fibres nerveuses trigéminales dans l'épithélium olfactif provoquant des sensations telles que le froid, le chaud ou l'irritation, dont on sait qu’elles interagissent avec le système olfactif. Ce projet vise à comprendre comment le bulbe olfactif décode l'intensité des odeurs en étudiant comment sont intégrés les signaux olfactifs et trigéminaux déclenchés par les odorants.

Bénéfices attendus

Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. Toutefois, comparée à d'autres pertes sensorielles telles que la cécité ou la surdité, l'anosmie a souvent été négligée par les institutions médicales et gouvernementales. Pourtant l’anosmie est fréquemment associée à une nette détérioration de la qualité de vie amenant très souvent à une dépression. Notre étude permettra de mieux comprendre le lien entre olfaction et sens trigeminal et de mieux connaître le traitement cérébral des odeurs, résultats qui seront utiles pour améliorer la qualité de vie des patients ayant des troubles de l'odorat.

Procédures

Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours. Nous réaliserons des chirurgies pour l'injection virale et l’implantation chronique de fibres optiques d'enregistrement chez la souris éveillée (chirurgie environ 1h sous isoflurane). Pour le test comportemental de discrimination olfactive (environ 1 séances de 20 min par jour pendant 8-10 jours) les animaux auront de l'acide citrique dans leur eau de boisson afin de limiter leur prise hydrique, diminution contrebalancée par la récompense obtenue dans la cage de comportement, la nourriture est donnée ad libitum. Le poids des animaux est mesuré plusieurs fois par semaine. Les odorants et le CO2 sont présentés à des intensitées non aversives pour les animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours ce qui peut entraîner une légère douleur de courte durée. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer une douleur et des problèmes de récupération (modérée). Les tests olfactifs seront réalisés en donnant de l'acide citrique dans l'eau de boisson ce qui permettra de les laisser ad libitum. Cela fera baisser leur poids (car ils boivent moins). La présentation de CO2 peut être aversive à forte dose, toutefois nous resterons dans une gamme de dosage sans effet pour l'animal. Les effets indésirables pourront se produire lors de l'injection de methimazole. Les données de la littérature indiquent que l'inflammation à court terme est spécifique de l'épithelium olfactif. L’anosmie transitoire peut perturber la prise alimentaire ainsi que le poids des animaux (légères).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements du cerveau à la fin de la procédure.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus, selon le protocole nous utiliserons des tests de two-way ANOVA suivis de tests post hoc Sidak pour les comparaisons 2 à 2, ou des t-test ou leur équivalent non paramétrique. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Les animaux non utilisés à l'issue du génotypage seront proposés au don. Nous avons prévu une étude pilote en amont des expériences afin de valider les sites précis d'injection et ainsi réduire le nombre total d'animaux utilisés. Lors du prélèvement des tissus, certains tissus non utilisés pourront être récupérés par d'autres membres de l'équipe.

Raffinement

Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris, et de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton et des batons de bois. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Les comportements olfactifs, alimentaires, de recherche de récompense peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet également de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Nous utiliserons des mâles et des femelles. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2-3 mois) afin que les réseaux neuronaux soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale accrue.