Système nerveux
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Effet de l’irradiation sur la neurocognition chez l’enfant.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génotypées par biopsie à l'état vigile, irradiées au cerveau sous anesthésie à l'âge de 21 jours, injectées, puis soumises à six tests comportementaux évaluant le comportement social, la motricité et la mémoire, 728 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 440 d'entre elles et modéré pour 288. Quatre-vingts passent en plus deux heures d'imagerie par résonance magnétique sous anesthésie. Le projet cherche à savoir si le vieillissement prématuré des cellules du cerveau explique les troubles de l'attention et de la mémoire dont souffrent les enfants traités par radiothérapie pour une tumeur cérébrale, et le porteur attend chez les souris irradiées une anxiété accrue et de l'agressivité. Toutes sont tuées par chirurgie terminale sous anesthésie, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales sont les tumeurs solides les plus fréquentes chez les enfants, qui sont traitées généralement par radiothérapie, souvent précédée d'une chirurgie et d'une chimiothérapie. Le taux de survie à cinq ans varie de 70 à 99 %, selon le type de tumeur. Les effets tardifs à long terme chez les enfants traités pour des tumeurs cérébrales sont préoccupants. Ces patients souffrent de graves handicaps physiques, fonctionnels et psychosociaux, notamment de la fatigue et des altérations de certaines fonctions cognitives spécifiques telles que des troubles de l'attention, de la mémoire de travail et de la vitesse de traitement de l’information. De nombreuses études, ont montré que l'exposition aux rayonnements ionisants induit la sénescence (processus de vieillissement prématuré) des cellules du cerveau. L'impact de la sénescence cellulaire sur les lésions cérébrales et les déficits cognitifs après la radiothérapie chez les enfants ayant survécu à des tumeurs cérébrales n'a jamais été étudié. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la sénescence cellulaire dans le cerveau de jeunes souris irradiées, les déficits cognitifs induits par l’irradiation à l’aide de tests comportementaux et les lésions cérébrales, en utilisant des méthodes d’évaluation cognitives spécifiques telles que l’histologie (analyse des tissus) des cerveaux irradiés et l’imagerie par résonance magnétique. L’utilisation d’un modèle génétique permettant de bloquer ce processus de vieillissement prématuré sera utilisé pour étudier l’implication de la sénescence cellulaire dans les séquelles cérébrales induites par radiothérapie (RT) afin de les traiter. L’utilisation de molécules qui agissent sur les cellules sénescentes constitue une voie thérapeutique prometteuse et innovante dans la prévention et le traitement des tumeurs cérébrales. Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la sénescence et du dysfonctionnement cellulaire dans la propagation des lésions cérébrales induites par la radiothérapie. L’équipe projet espère proposer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l'apparition de séquelles cérébrales hautement délétères lors de la radiothérapie chez l'enfant.
Procédures
Etablissement Ulitisateur (EU1) élevage et irradiation : Le génotypage par biopsie sera effectuée sur l’animal vigile (durée de 2 minutes, sur 360 souris). L’irradiation sera effectuée sous anesthésie (durée de 5 minutes par animal, sur 160 souris). Les injections seront réalisées sur des animaux vigiles (durée de 1 minute par animal, sur 160 souris). Chaque souris effectuera 6 tests de comportement différents (durée d’un test estimé à 5 à 15 minutes par animal, sur 240 souris) afin d’évaluer leur comportement social, leurs capacités motrices ainsi que leur mémoire. EU 2 imagerie: L’imagerie par résonance magnétique sera réalisée une seule fois par animal, sous anesthésie (durée de 120 minutes par animal, nombre de souris 80). EU1 mise à mort des souris: elle sera effectuée par chirurgie terminale sous anesthésie pour permettre le prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : - des problèmes d’anesthésie entrainant la perte d’un animal, de l’hypothermie, des douleurs liées aux injections, des douleurs et des saignements liées au prélèvement pour le génotypage ; - un déficit mental et/ou social associé à un dysfonctionnement cognitif. Il est attendu que l’anxiété soit un peu augmentée et génère de l’agressivité ; - une perte de poids liée à un problème d’alimentation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires.
Remplacement
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la sénescence au cours du développement nécessite d’irradier le cerveau de souriceaux et d’étudier les conséquences sur le cerveau à l’âge adulte au niveau histologique, imagerie par résonance magnétique et tests comportementaux. Il n’existe pas d’alternative non animale permettant étudier l’effet de l’irradiation sur la sénescence sur le cerveau de souris au cours du développement (équivalent de l’adolescence chez l’homme) et d’évaluer les altérations cognitives à l’âge adulte.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. Cependant, nous prévoyons d’utiliser 15 souris par groupe afin d’assurer le nombre minimum d’animaux pour les analyses de comportement et réaliser des expériences complémentaires en : imagerie par résonance magnétique, histologie 2-3D et séquençage, de façon à corréler l’ensemble des résultats obtenus. Nous utiliserons également 5 souris par groupe pour des analyses en cytométrie en flux (méthode de tri des cellules en fonction de certaines propriétés).
Raffinement
Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis pendant les 24h suivant l’anesthésie (irradiation, IRM). Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Les animaux sont transportés entre les deux EU concernés par un transporteur agrée. Afin de préserver le bien-être des souris pendant le transport, celles-ci sont placées dans des boîtes de transport jetables contenant de la litière, du coton, de l’eau gélifiée, des croquettes ainsi qu’un enrichissement de type tunnel. La taille des boîtes est adaptée au nombre d’animaux et permet de conserver leur répartition initiale par cage.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain tout au moins pour notre approche, et qui permettra donc d’extrapoler les résultats. Les souris seront étudiées à l’âge de 21 jours, au moment du sevrage et de la première vague de spermatogenèse, avant la maturité sexuelle qui a lieu à 50 jours environ. Cet âge chez la souris correspond à la préadolescence chez l’homme qui marque une transition entre l’enfance et le début de la puberté. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social dans le modèle de souris transgénique qui permet de mettre en évidence facilement la sénescence.
Évaluation du potentiel thérapeutique d’un composé d’intérêt dans un modèle murin d’épilepsie du lobe temporal
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des points limites sont censés interrompre l'expérience avant la mort, mais environ 20 % des souris peuvent mourir directement des crises provoquées. 42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Jusqu'à neuf injections en quatre jours déclenchent chez elles un état de mal épileptique, puis une partie subit l'implantation de sondes cérébrales et vit isolée jusqu'à cinq semaines, avec vingt-quatre à trente-deux injections supplémentaires et des enregistrements allant jusqu'à dix heures par jour pendant douze jours. Le bénéfice annoncé pour les patients pharmacorésistants, éviter une résection chirurgicale du foyer épileptique, reste au conditionnel, quand l'état de mal épileptique, lui, est infligé d'emblée.
Objectifs
L’épilepsie est l’une des affections neurologiques les plus fréquentes avec une prévalence de près de 1 pour cent au niveau mondial. En particulier, l’épilepsie du lobe temporal mésial (mTLE) avec sclérose hippocampique est la forme la plus fréquente d’épilepsie focale chez l’adulte. Près de 30 pour cent des patients souffrant de cette forme d’épilepsie ne répondent pas aux traitements antiépileptiques conventionnels et sont dits pharmacorésistants. Une résection chirurgicale du foyer épileptique est alors parfois la seule option thérapeutique disponible pour ces patients. L’objectif du projet sera de tester spécifiquement l’effet et le potentiel thérapeutique d’une administration répétée d’une molécule dans un modèle murin d’épilepsie expérimentale. Spécifiquement, nous testerons l’effet de ce composé sur la fréquence des crises et des activités de type épileptique dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de valider le potentiel thérapeutique d’une nouvelle classe de molécules dans les épilepsies du lobe temporal, offrant une nouvelle piste thérapeutique pour les patients pharmacorésistants et leur évitant ainsi le recours à une procédure chirurgicale.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales et sous-cutanées, sur animal vigile (durée inférieure à 1 minutes par injection, 9 injections maximum réparties sur 4 jours) afin d’induire un état de mal épileptique jusqu’à la fin de la procédure (durée 9 semaines maximum). Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau (1 fois, durée 1h). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 5 semaines maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, les animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 6-8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24-32 injections intrapéritonéales maximum (durée inférieure à 1 minute). Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 12 jours consécutifs). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L'injection de la molécule permettant de mettre en place notre modèle chez la souris peut entraîner une perte de poids, une fatigue et une réduction de la mobilité pendant quelques jours. Environ 20 pour cent des souris peuvent mourir à cause de crises épileptiques sévères. Les injections peuvent causer une légère douleur au point d'injection. Les manipulations nécessaires pendant les procédures peuvent être stressantes pour les souris. L'implantation d'électrodes dans le cerveau peut causer une douleur temporaire et une légère perte de poids. Les souris implantées seront isolées pendant trois à cinq semaines, ce qui peut également être une source de stress pour elles.
Devenir
Une partie des animaux sont susceptibles de décéder spontanément des suites de l’état de mal épileptique. Le reste des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien prévue ou plus tôt en cas d’atteinte d’un point limite. En effet, ces animaux ayant subi un état de mal épileptique, il n’est pas possible de les réutiliser pour un autre projet.
Remplacement
Les composés utilisés dans cette étude ont déjà été testés sur des modèles cellulaires et des modèles humains (tissus postopératoires) afin d’en prédire le potentiel thérapeutique. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’en tester directement l’effet sur des crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux (42 souris) mis en œuvre dans ce projet est basé sur les travaux précédents du laboratoire et de la littérature. Ainsi un nombre de 10 animaux par groupe a été défini, en prenant en compte : - la mortalité liée à l’induction d’un état de mal épileptique (environ 20 pour cent) - le taux d’échec d’induction d’un état de mal épileptique (environ 25 pour cent) - l’absence de développement d’une épilepsie chronique (environ 15-20 pour cent) afin d’atteindre un nombre d’animaux expérimentaux minimal de 10 par groupe avec 2 groupes expérimentaux (test et contrôle). Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des locaux agréés, en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’un bâtonnet à ronger au minimum. Ils auront accès à l’eau et à une nourriture adaptée à leur stade physiologique ad libitum. Une observation quotidienne des animaux sera assurée par l’équipe de zootechnie. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront pris en charge avec les soins nécessaires ou exclus du protocole. Depuis plusieurs années, nous avons raffiné notre protocole d’induction d’état de mal épileptique chez la souris, nous avons testé et comparé plusieurs protocoles d’induction et retenu celui offrant le plus haut taux de succès (survie de l’animal et développement d’une épilepsie chronique). Un soutien nutritionnel et une surveillance de la récupération des animaux sont assurés lors de l’induction du modèle pathologique. La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température de l’animal durant toute la durée de l’anesthésie. Après la chirurgie la surveillance des animaux sera renforcée pendant au minimum une semaine. A partir de la chirurgie les animaux seront hébergés seuls afin d’éviter tout endommagement du matériel mis en place, ils bénéficieront alors d’un d’enrichissement complémentaire (lanière de kraft et maison en cellulose). Des points limites sont définis et seront respectés afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur est standard dans notre domaine de recherche. D’autre part, les paradigmes d’induction de crises que nous souhaitons tester ont été très bien caractérisés chez la souris. Enfin, nous avons conduit sur cette espèce des essais préalables dans ce modèle visant à l'optimiser, en réduisant notamment les doses de molécules injectées pour la mise en place du modèle, la mortalité et la fréquence des échecs d'induction, limitant ainsi le nombre d'animaux mis en œuvre. En outre, les procédures d’anesthésie et d’analgésie sont également très bien standardisées dans cette espèce. Les animaux seront étudiés à 8 semaines (stade jeune adulte) qui est le stade le plus proche des conditions de la pathologie humaine.
Rôle des cellules immunitaires et du nerf vague dans un modèle murin de fibrose hépatique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une section chirurgicale du nerf vague au cou, cinq gavages quotidiens, des injections dans l'abdomen trois fois par semaine et un régime qui attaque les canaux biliaires : 8 832 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La finalité déclarée est de comprendre les liens entre cellules immunitaires, nerf vague et cholangite sclérosante primitive, maladie rare qui touche six à dix personnes sur cent mille en France et pour laquelle aucun médicament n'a fait la preuve de son efficacité. Le porteur prévoit qu'une perte de poids de 20 % conduira à interrompre le régime quelques jours, avant de le reprendre pour atteindre la durée totale prévue. L'effectif est rapporté à un calcul de puissance, sans qu'un seul chiffre soit donné.
Objectifs
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie hépatique chronique, rare (6 à 10/100 000 habitants en France) caractérisée par une inflammation du foie, une prolifération des cholangiocytes et une fibrose péri-portale. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. A ce jour, aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la maladie et la prévention des complications qui lui sont associées. Des études suggèrent que certaines cellules immunitaires pourraient induire les lésions hépatobiliaires au cours de la CSP, notamment la fibrose. Toutefois, les mécanismes, notamment ceux à l’origine de la fibrose, demeurent encore mal connus. Afin de mieux appréhender les interactions complexes opérant au cours de la CSP, une perspective globale en examinant le rôle potentiel de diverses populations cellulaires dans la mise en place de la fibrose sera adoptée. D’autre part, le rôle du nerf vague dans la CSP sera étudié. En effet, la modulation de l'activité vagale pourrait influencer la mobilisation des cellules immunitaires, notamment les monocytes, bien que les mécanismes précis de ces interactions restent encore mal compris. Pour mieux appréhender ces interactions complexes, une approche chirurgicale consistant à réaliser une vagotomie cervicale unilatérale chez des souris, qui seront ensuite soumises à un régime pour induire la CSP, sera réalisée. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre l’inflammation, le nerf vague, la pathogenèse de la CSP et sa résolution. En décryptant ces mécanismes, les bénéfices attendus du projet sont d'ouvrir de nouvelles perspectives permettant le développement de nouveaux traitements et ainsi contribuer à une meilleure prise en charge de la CSP. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important pour le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Bénéfices attendus
La Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) est une maladie rare qui touche entre 6 à 10 personnes pour 100 000 habitants en France. Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la CSP. Aucune approche pharmacologique n’a démontré son efficacité dans le traitement de cette maladie. Les stratégies thérapeutiques actuelles se concentrent sur le ralentissement de la progression de la maladie et la prévention des complications. Les informations obtenues grâce à cette recherche pourraient ainsi contribuer à une avancée significative dans la prise en charge de la CSP. La CSP constitue un facteur de risque important dans le développement de cancers des canaux biliaires, du foie et de la vésicule biliaire. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à cette maladie pourrait permettre de réduire l'incidence de ces cancers.
Procédures
Les souris seront soumises à : 1.une administration de molécule pour les modèles murins inductibles (via soit 5 gavages quotidiens pendant 5 jours, d'une durée de moins de deux minutes par gavage ; soit nourriture changée une fois par semaine ou eau de boisson changé tous les deux jours ; soit injection intrapéritonéale 3 fois par semaine, d'une durée de moins de deux minutes par injection, tout au long de la mise sous régime) 2.un régime alimentaire spécial (tous les jours pendant 28 jours maximum) 3.des traitements par injection d'anticorps en intrapéritonéale sur animal vigile (une à deux fois par animal, durée de quelques secondes) 4.une intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie (une fois par animal, durée de 10minutes) 5.un prélèvement sanguin sur animal vigile (une fois par animal, durée de quelques secondes) 6.Une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires spéciaux pourront entraîner une modification du poids pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. Le régime induisant la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) peut provoquer une perte de poids. Les manipulations des animaux pourront induire un stress de courte durée. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de l'oesophage. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. La procédure chirurgicale pourra induire une douleur en post-opératoire malgré la prise en charge prévue ainsi que des risques d'infections dans de rares cas. Les prélèvements sanguins pourront induire une douleur de courte durée aux animaux ainsi qu’un risque d’hématome ou d’hémorragie.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation de modèles murins est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.
Réduction
8832 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins.
Raffinement
Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long de la durée du projet, en minimisant la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés en groupe avec des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois au minimum). Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris sera effectuée en ouvrant chaque cage. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne devraient pas être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal. Une grille de suivi sera mise en place avec pesée hebdomadaire des animaux. En cas d'observation d'une perte de poids trop rapide (20 pourcents par rapport à l’initiation des régimes), des mesures appropriées seront prises. Plus spécifiquement, le régime sera interrompu pendant quelques jours afin de permettre une récupération, puis le régime induisant la cholangite sclérosante primitive sera repris pour atteindre la durée totale prévue du régime. Cette approche vise à assurer une tolérance optimale du régime, comme démontré dans des études antérieures.
Choix des espèces
Cette recherche vise à fournir des éclairages essentiels permettant une compréhension approfondie des liens entre les cellules immunitaires, l’inflammation, le nerf vague et la pathogenèse de la Cholangite Sclérosante Primitive (CSP). La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement de la CSP. En effet, le modèle murin permet de modéliser et d’intégrer les réponses immunitaires comme observé chez l’Homme. La souris offre l’avantage d’être un modèle bien établi pour l’étude de la CSP et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Les animaux âgés d’au moins 8 semaines seront utilisés pour l'entrée dans la procédure expérimentale afin que les animaux aient un métabolisme, un système immunitaire et vasculaire mature. Les souris pourront entrer en procédure dès leur 8ème semaine d’âge et en ressortiront après 1, 2 ou 4 semaines de régime.
Elevage d’une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7, une maladie neurodégénérative héréditaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sur 2 340 souris élevées, 600 seront transférées vers d'autres projets utilisant la même lignée et les autres tuées, aussi bien les surnuméraires d'élevage que celles dont on prélève les organes. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Un morceau de queue est coupé sur chaque animal pour le génotypage, et des mâles reproducteurs sont isolés une semaine afin d'obtenir des embryons d'âge daté. La lignée porte une maladie neurodégénérative héréditaire qui paralyse progressivement les souris homozygotes à partir de huit mois, aussi le porteur prévoit de toutes les mettre à mort avant sept mois pour éviter que ce phénotype ne s'exprime.
Objectifs
L’objectif du projet est d'élever une lignée de souris modèle de la lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 afin de mieux comprendre la maladie et de tester des approches thérapeutiques. La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie neurodégénérative rare qui est diagnostiquée vers l’âge de deux ans. Les enfants présentent rapidement des déficits moteurs puis cognitifs et meurent avant l’âge de dix ans car il n’existe aucun traitement curatif. Le modèle de la maladie que nous allons utiliser récapitule plusieurs aspects de la pathologie humaine dont l’altération progressive des fonctions motrices et la mort prématurée. Nous allons isoler des cellules à partir de différents organes des souris (peau, cerveau) afin de tester une nouvelle approche thérapeutique in vitro. Si nos résultats sont concluants, nous pourrons évaluer l'efficacité de notre approche in vivo dans ce même modèle de souris.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer in vitro la possibilité de traiter la céroide lipofuscinose neuronale de type 7 par une nouvelle approche de thérapie cellulaire. Si elle est concluante, nous pourrons poursuivre le projet in vivo chez la souris et ensuite chez l’Homme et ainsi nous pourrons proposer un traitement aux enfants atteints par cette maladie. De manière plus générale, cette étude pourrait ouvrir la voie au traitement de plusieurs maladies neurologiques héréditaires pour lesquelles il est nécessaire de délivrer ue protéine thérapeutique dans le système nerveux central.
Procédures
Un petit morceau de queue sera prélevé sur tous les animaux pour pouvoir réaliser une analyse génétique.
Impact sur les animaux
Certains animaux (homozygotes pour la mutation) présentent un phénotype dommageable qui apparait vers l'âge de huit mois sous la forme d'une paralysie progressive corrélée à une perte de poids qui évolue jusqu'à l'âge de 11 mois. La procédure de génotypage des animaux implique de réaliser une biopsie de queue qui peut povoquer un stress (contention) et une douleur de très courte durée et d'intensité faible. L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Pour obtenir des embryons d’âge défini, certains mâles reproducteurs devront être isolés dans des cages pendant une semaine avant la mise en accouplement.
Devenir
Les animaux de génotype d'intérêt seront mis à mort (prélèvement d'organes) ou transférés dans de nouveaux projets utilisant cette lignée. Les animaux surnuméraires d'élevage seront mis à mort.
Remplacement
La lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 est une maladie génétique qui atteint plusieurs organes dont le système nerveux central. Il n'existe aujourd'hui pas de lignée cellulaire "naturelle" (fibroblastes de peau de souris ou d'Homme immortalisés) ou obtenue par génie génétique dans laquelle on observe les défauts cellulaires caractéristiques de la maladie. Nous devrons travailler sur des cellules mises en culture à partir de tissus (peau, cerveau, foie...) prélevés chez des souris sauvages et mutantes adultes ou au stade embryonnaire tardif dans lesquelles les défauts cellulaires sont visibles. Ces cellules doivent être renouvelées régulièrement car elles ne peuvent pas être gardées longtemps en culture. Il n'existe pas pour le moment de modèle informatique de la maladie. Il s'agit d'une maladie rare assez peu étudiée et pour laquelle nous disposons donc de peu de données.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous prélèverons plusieurs organes simultanément sur les mêmes animaux (neurones et fibroblastes de peau sur embryons ; cerveau et foie sur adultes). La lignée sera maintenue avec un nombre minimal d'accouplements.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe sauf dans le cas des accouplements contrôlés nécessaires pour la mise en culture des cellules pour lesquels des mâles seront isolés. Pour que les cellules survivent en culture, les tissus doivent être prélevés sur des embryons d'âge défini. Pour cela il est indispensable de dater les accouplements. L'isolement préalable des mâles permet d'en augmenter la probabilité de réussite au cours de la nuit pendant laquelle les animaux sont mis ensemble et donc d'éviter de mettre à mort des femelles qui n'auraient pas été fécondées. L’isolement des mâles sera limité strictement dans le temps afin de minimiser le stress induit par l’absence de congénères et l’enrichissement sera augmenté dans les cages. Les animaux qui portent la copie délétère du gène sur les deux allèles (homozygotes) présentent un phénotype dommageable qui commence à se manifester vers l’âge de huit mois. Il n’est pas nécessaire dans ce projet d’utiliser des animaux homozygotes âgés de plus de sept mois. Ils seront donc tous mis à mort au plus tard à sept mois pour éviter l’expression du phénotype dommageable et ainsi du stress et des souffrances inutiles.
Choix des espèces
Le modèle murin de lipofuscinose neuronale céroïde de type 7 avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les cellules dérivées de ces souris devraient également présenter les phénotypes associés à la maladie et ainsi permettre de tester notre approche thérapeutique in vitro puis in vivo si notre preuve de concept est validée.
Squelette neuronal et dyskinésie
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie générale, puis reçoit des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines. 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dont 412 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif déclaré est de comprendre comment la L-Dopa s'intègre au squelette interne des neurones et provoque les mouvements involontaires des patients parkinsoniens traités au long cours. Le porteur ramène les atteintes à une perte de poids et à une perte d'autonomie pour boire et manger, compensées selon lui par les soins, et annonce des tests comportementaux moteurs tous les deux jours sans préciser lesquels.
Objectifs
La maladie de Parkinson est une affection cérébrale qui perturbe les mouvements et peut avoir un impact considérable sur la vie quotidienne. La L-Dopa, le médicament le plus couramment utilisé, aide à gérer les symptômes de la maladie de Parkinson, mais après un traitement prolongé, elle peut provoquer des effets secondaires très gênants tels que des mouvements involontaires anormaux nommés dyskinésies. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme en cause afin d’identifier un moyen de limiter ces effets indésirables. Nous avons découvert que la L-Dopa peut s'intégrer directement dans les structures qui composent le squelette interne des neurones, appelées microtubules. Ces microtubules sont importants pour la transmission d'informations d'un neurone à l'autre. Notre projet vise à comprendre le rôle des microtubules contenant de la L-Dopa dans le développement de la dyskinésie et à contribuer à mieux comprendre les défauts neurologiques chez les patients en traitement prolongé à la L-Dopa.
Bénéfices attendus
Étant donné que la L-Dopa est le traitement standard de la maladie de Parkinson et que son utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires tels que les mouvements involontaires (dyskinésie), il est très important de comprendre son impact sur le fonctionnement normal du squelette neuronal dans la communication entre les neurones. En étudiant les protéines impliquées dans la modification de ce squelette neuronal par la L-Dopa, nous pourrions trouver de nouvelles façons de minimiser les effets secondaires de ce traitement.
Procédures
Les souris subissent des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes. Nous administrons quotidiennement des substances par injections dans l'abdomen pendant deux semaines. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrices impactées par l'administration du traitement contre la maladie de Parkinson. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaines, avec un test tous les deux jours. Les souris peuvent subir une injection intraveineuse sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur affectant l'autonomie des souris à s'hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour l'étude de l'anatomie du cerveau.
Remplacement
Une première partie des expériences a été faite in vitro et sur des neurones en culture. Pour la suite du projet, il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau et les mouvements anormaux.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Pour permettre l'acclimatation, un minimum d'une semaine sera alloué lorsque les animaux seront transférés d'autres installations. Afin de donner la priorité au bien-être des animaux et de minimiser la douleur, la détresse ou la souffrance potentielles pendant les expériences, nous surveillons l'état de santé et de stress des souris tout au long de l'étude. Pendant les semaines de convalescence suivant l'opération, les souris seront surveillées et recevront de la nourriture supplémentaire. En cas de douleur ou d'inconfort, un analgésique sera administré. Nous utilisons des points limites adaptés permettant d’intervenir rapidement pour limiter la souffrance de l’animal. Étant donné que la procédure chirurgicale pour l'induction de la lésion qui générerait la maladie de Parkinson peut entraîner des problèmes d'alimentation et de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée d'une solution de glucose et de sérum physiologique immédiatement après l'opération et une fois par jour pendant la première semaine postopératoire. Compte tenu de la possibilité de complications postopératoires, un dossier complet d'évaluation de la santé sera tenu pour chaque souris pendant les 14 premiers jours suivant l'opération. Des tests comportementaux seront effectués après une période d'entraînement pour limiter le stress de la nouveauté.
Choix des espèces
La souris est un mammifère génétiquement modifiable, dont l'anatomie et la physiologie sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. En outre, l'élevage des souris et les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. Des modèles génétiquement modifiés d'intérêt existent déjà dans notre laboratoire et les échelles de dyskinésie pour les souris sont maintenant bien validées et largement utilisées. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines.
Rôle de forces mécaniques dans le développement du système nerveux chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.
Objectifs
Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).
Impact sur les animaux
La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).
Remplacement
L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.
Réduction
Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.
Evaluation de l’implication de l’urocortine et de ses récepteurs sur la survenue des neuropathies induites par le paclitaxel, la vincristine et l’oxaliplatine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher un moyen de prévenir les douleurs neuropathiques provoquées par trois chimiothérapies anticancéreuses, 102 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse de leurs tissus. Pendant huit jours, elles reçoivent des injections intrapéritonéales de vincristine, de paclitaxel ou d'oxaliplatine, seules ou associées à un bloqueur. Trois tests d'évitement mesurent tous les trois jours leur sensibilité au toucher et à la chaleur, chaque animal restant jusqu'à quarante minutes isolé de ses congénères. Le porteur affirme qu'en dehors des tests ces souris se comportent comme les témoins, et précise qu'une valeur limite retire l'animal du stimulus même lorsqu'il ne montre aucun signe d'évitement.
Objectifs
Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent induits par les agents anticancéreux. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlure, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive efficace. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces NPIC constitue un enjeu de santé publique. Une analyse transcriptomique réalisée sur les ganglions spinaux de souris exposées à des agents anticancéreux neurotoxiques mettaient en évidence une très forte surexpression de l’urocortine. L’urocortine est une neurohormone qui agit sur deux types de récepteurs. Il a été montré que les activateurs naturels de ses récepteurs jouaient un rôle dans l’éxagération de la douleur en particulier viscérale et que le blocage de ces récepteurs pouvaient abolir cette hyperalgésie. Ces récepteurs pourraient constituer une cible thérapeutique potentielle intéressante pour prévenir et/ou traiter les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie. Notre objectif principal est d’étudier l’implication de l’urocortine 1 et de ses récepteurs, dans le développement de la neuropathie induite par la vincristine, par le paclitaxel et par l’oxaliplatine dans nos modèles murins. Pour cela, une étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs sur le développement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les récepteurs de l’urocortine sont présents à la fois au niveau du système nerveux central (cortex et moelle spinale) et au niveau du système nerveux périphérique (terminaisons nerveuses cutanées, ganglions spinaux). Il a été démontré que l’urocortine injecté dans la moelle spinale chez la souris induisait une éxagération de la douleur en réponse à un stimulus tactile, ce qui confirme le rôle important de l’urocortine et de ses récepteurs dans la modulation de la douleur neuropathique. De plus, un lien étroit existe entre l’exacerbation de la douleur et le stress. Le système urocortine/récepteurs participe à ce phénomène et se présente comme une cible intéressante pour la modulation de la douleur. Cette étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs des récepteurs à l'urocortine sur le dévellopement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine pourrait permettre de mettre en évidence une nouvelle cible d’intérêt pour la prise en charge d’un effet secondaire des chimiothérapies, lourd de conséquences sur la qualité de vie des patients et contre lequel il n’existe à ce jour aucun traitement préventif efficace.
Procédures
Au cours des procédures, les animaux recevront leurs traitements (véhicule, bloqueurs et /ou chimiothérapie) par des injections intrapéritonéales répétées tous les jours, tous les deux jours ou tous les jours selon l'agent anticancéreux et sur une période de 8 jours. L'ensemble des animaux sera soumis à trois test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours.
Impact sur les animaux
L'administration des agents anticancéreux et des traitements par voie intrapéritonéale induira une douleur légère à modérée de courte durée (30 minutes max), pouvant générer un stress. L'administration des agents anticancéreux induira une hypersensibilité caractérisée par une gène observable au cours des tests comportementaux, et en réponse à un stimulus. Au cours des tests comportementaux, les animaux se retrouveront isolés de leurs congénères pendant une courte période (40 minutes max.) pouvant générer un stress. En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine, du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées à la vincristine, au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de la douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi trois modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur des neurones sensitifs humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensitifs, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 6 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé à l'aide d'un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 78 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), distribués en 13 groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le blocage des récepteurs présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés aux traitements doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de neuropathies induites par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utiliserons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.
Rôle de l’activateur tissulaire du plasminogène au cours de l’allaitement et son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
3 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance sévère. 720 souriceaux subissent une chirurgie de 45 minutes destinée à poser des prothèses de contention qui immobiliseront leur tête pendant l'imagerie, puis jusqu'à 50 minutes d'IRM et une heure d'échographie fonctionnelle. Pour injecter l'agent de contraste, 600 d'entre eux reçoivent une piqûre intracardiaque sous anesthésie, 960 autres souriceaux étant utilisés uniquement pour des prélèvements de tissus entre le 7e et le 60e jour de vie. Les 750 femelles allaitantes comptées dans le projet ne subissent aucune intervention, le porteur ne retenant pour elles que le stress de la séparation répétée d'avec leurs petits. Le bénéfice annoncé reste d'acquérir des données fondamentales sur l'influence du lait maternel sur le développement du cerveau.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (tel que l’activateur tissulaire du plasminogène) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central et peuvent jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, elles peuvent jouer un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral. Notamment, l'absence de l'activateur tissulaire du plasminogène au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline qui entoure les neurones, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette protéine présente dans le lait maternel, au cours de l’allaitement, sur le développement cérébral post natal. Pour ce faire, des souriceaux déficients en activateur tissulaire du plasminogèneseront adoptés et élevés dès leur naissance (jour post natal 0 ; P0) par une mère ayant conservé le gène codant la protéine. De la même façon, nous utiliserons également des souriceaux nés d’une mère exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène, élevés par une mère déficiente en cette protéine. Deux groupes de souriceaux contrôles seront également utilisés : un groupe de souriceaux exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène et un groupe ne l'exprimant pas resteront avec leur mère biologique respectives. Des analyses comportementales, en imagerie par résonnance magnétique anatomique ainsi qu’en imagerie fonctionnelle échographique seront réalisées à plusieurs stades de développement post-natal, jusqu’à l’âge adulte. Des études transcriptomiques et protéiques seront également conduites à partir de prélèvements de tissus.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude du rôle des protéines du système d’activation du plasminogène doit se faire au cours de la phase d’allaitement sur des souriceaux in vivo, afin d’observer leur trajectoire neurodéveloppementale, d’un point de vue fonctionnel et morphologique.
Procédures
L’anatomie du système nerveux central sera observée en imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 720) et en imagerie fonctionnelle échograpghique (1 heure maximum, n = 720) aux jours post-nataux (P) 7, 10, 15, 21, 30 et 60. Cette dernière technique nécessitera l’administration d’un agent de contraste par voie intra veineuse. La méthode la plus efficiente pour cette administration jusqu’à P30 est en intracardiaque, sous anesthésie (n=600), et par pose d’un cathéter sur la veine caudale de la queue à P60 (n=120). Une procédures chirurgicale d’une durée de 45 minutes sera réalisée afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie (n = 720). Le développement des capacités sensorimotrices, cognitives et émotionnelles sera également évalué, de manière longitudinale à P7, P10, P15, P21, P30 et P60 (n = 600). 960 souriceaux serviront uniquement à prélever des tissus à P7, P10, P15, P21, P30 et P60. Les 750 gestantes ne subiront aucune intervention et la seule nuisance qu'elle pourraient recevoir serait liée à un éventuel stress lors de la séparation avec leur souriceaux lors des évaluations comportementale de ces derniers.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. De plus, nous disposons au laboratoire d’une souche de souris très bien caractérisée, qui sont déficientes en activateur tissualire du plasminogène, ce qui en fait le modèle le plus adapté à ce projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies neurodéveloppementales humaines.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, afin de ne pas biaiser les résultats, les analyses comportementales ne seront pas suivi d’analyses morphologiques afin d’éviter les effets de la récupération fonctionnelle en réponse à la plasticité cérébrale. Dans la même idée, aucune évaluation comportementale ou histolgique ne sera réalisé consécutivement aux imageries qui nécessitent une anesthésie générale. En effet, des travaux récents mettent en évidence que l’anesthésie agit sur l’intégrité cérébrale, surtout lorsqu’elle est pratiquée précocement au cours du développement. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches génétiquement modifiées disponibles au laboratoire comme celles déficientes en activateur tissulaire du plasminogène. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur l’étude du neurodéveloppement post-natal, il est donc nécessaire de se procurer des femelles allaitantes avec leurs souriceaux. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques, comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (P7 / P10 / P15 / P21 / P30 / P60) est nécessaire afin d’identifier des différences significatives dans la trajectoire développementale des différents groupes.
Effets des perturbateurs endocriniens dans la (re)myélinisation du nerf optique chez le têtard de Xenopus Laevis transgénique.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
16 800 têtards de xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 240 individus par molécule testée pour trente-cinq molécules. Ils baignent dans une eau contenant les perturbateurs endocriniens pendant trois jours ou jusqu'à trente jours, après dix jours d'exposition au métronidazole en incubateur opaque pour une partie d'entre eux, et sont anesthésiés jusqu'à quatre fois pour le comptage des cellules du nerf optique. Le porteur estime la mortalité liée à l'exposition à 10 % sur trois jours et 20 % sur un mois, à quoi s'ajoutent 10 % de morts prématurées pendant le développement. Il retient le xénope entre autres parce que l'espèce "génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d'animaux".
Objectifs
Au cours de ces 40 dernières années, des milliers de produits chimiques ont été introduits dans notre environnement. Connues sous le nom de perturbateurs endocriniens (PE), ces molécules ont des effets néfastes sur la santé en agissant sur le système endocrinien, en mimant l’action physiologique des hormones. Les PE agissent sur certaines hormones, qui agissent sur des cellules présentes dans le cerveau. En sachant que l’exposition chimique influence, dans le cerveau en développement et chez l’adulte, le destin des cellules, nous pensons que les PE auraient un impact sur des cellules spécifiques appelées les oligodendrocytes, qui forment une gaine isolante autour des axones (prolongement des cellules nerveuses) appelée la myéline. Ces cellules sont impliquées dans des mécanismes de myélinisation (processus de formation de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). L’objectif de notre projet est donc d’évaluer chez le têtard de Xenopus Laevis les effets des perturbateurs endocriniens sur la myélinisation et la remyélinisation et ainsi vérifier s’il existe une corrélation avec certaines maladies comme la sclérose en plaque, dont les cas ont augmenté depuis l’apparition de ces molécules.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les effets des substances identifiées comme ayant des propriétés perturbatrices sur le système endocrinien, et les conséquences qu’elles peuvent avoir sur la myéline (membrane qui protège les axones de nos neurones) dans différentes conditions. Premièrement, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de myélinisation (processus de la formation de la myéline), permettrait de comprendre quelles molécules impactent ce processus et de voir s’il existe une corrélation avec les troubles neurodéveloppementaux observés chez les enfants ayant été exposés à ces molécules. Ensuite, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de remyélinisation (processus de régénération de la myéline) permettraient dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaque (où la myéline est détériorée, SEP), de comprendre s’il existe une corrélation entre l’augmentation du nombre de cas de SEP et celle de l’utilisation des PE. De plus, notre implication dans un projet international permet de répondre aux besoins réglementaires, scientifiques et sociétaux pour une meilleure évaluation des dangers et des risques chimiques des substances identifiées comme PE.
Procédures
Afin de procéder à un comptage des cellules d'intérêt dans les nerfs optiques, les animaux seront anesthésiés au maximum 4 fois pour une durée de 15 minutes maximum avec un minimum de 3 jours entre chaque anesthésie. Une partie des têtards sont mis en contact avec une molécule permettant de mettre en place le modèle pendant 10 jours, dans leur eau de balnéation. Puis ils seront exposés pendant 3 jours aux perturbateurs endocriniens pour étudier leur effet. Une autre partie des têtards sera mise en contact direct avec les perturbateurs endocriniens pendant 30 jours maximum pour étudier leur impact sur le développement. Les perturbateurs endocriniens sont aussi préparés dans l’eau de balnéation des têtards. Tous les têtards sont euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire pour la réalisation d’analyses sur leurs tissus.
Impact sur les animaux
L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines concentrations de perturbateurs endocriniens testées soient toxiques et entrainent la mort des têtards. Nous estimons cette perte liée à l’exposition aux perturbateurs endocriniens à 10 pour cent pour 3 jours et 20 pour cent pour 1 mois d’exposition. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent. Lors des différentes procédures, les animaux sont délicatement attrapés avec une pipette. Cette manipulation induit un léger stress. Lors des tests comportementaux, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac ce qui peut provoquer un léger stress chez nos animaux lors du déplacement (bacs sur un chariot).
Devenir
Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux perturbateurs endocriniens testés, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immuno-histologiques plus poussées sur leurs tissus pour compléter les observations faîtes du vivant de l’animal.
Remplacement
Les perturbateurs endocriniens sont connus pour avoir un effet toxique sur les cellules en culture, ce qui explique pourquoi ce modèle ne peut pas être utilisé dans notre cas. L ’intérêt est de comprendre les effets des perturbateurs endocriniens au sein d’un organisme vivant, et d’étudier leurs impacts sur le comportement et les processus physiologiques. Le recours à des têtards, qui ont un système nerveux comparable (présence et importance de la myéline dans le fonctionnement) à ce qui est retrouvé chez l’Homme, peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo, ce que les modèles cités précédemment ne permettent pas. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus Laevis repose donc sur les arguments suivants : -Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro -La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal sans euthanasie à des temps donnés pour prélever des échantillons -Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux pour leur interprétation -Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus Mammifères) pour transposer nos observations sur cette espèce à l’Homme.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules qui nous intéressent dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards. Nous estimons qu’il faudra environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée deux fois à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle, ce qui fait un total de 8 groupes, avec 15 têtards par condition, donc 240 têtards au total. Le nombre de 15 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée des têtards liée au développement et celle liée à l’exposition aux molécules (molécule qui permet la mise en place du modèle et celles à évaluer). 35 molécules sont à tester suivant ce modèle, soit au total environ 8 400 têtards pour la myélinisation, et 8400 pour la remyélinisation, ce qui fait un nombre total de têtards de 16 800 têtards pour ce projet.
Raffinement
Au cours de leur développement, les têtards sont placés dans un bac de 4L d’eau adaptée à leur physiologie (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à 23degrès Celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée de façon hebdomadaire pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets (un changement d’eau trop fréquent entraine un stress avec une perte de nos têtards). Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les déchets liés au surplus de nourriture sont retirés de l’eau quotidiennement pour maintenir de bonnes conditions environnementales. De plus, des bûches flottantes artificielles sont placées dans les bacs, ce qui permet de complexifier leur milieu (enrichissements). Enfin, nous utilisons une alimentation, majoritairement composée de végétaux et d’algues, adaptée à leur développement. La profondeur de l'anesthésie est surveillée et est adaptée à nos besoins pour garantir une immobilisation et limiter le stress des animaux. Pour optimiser le réveil et la bonne récupération des animaux, nous favorisons une oxygénation de l'eau avec un bulleur et réintégrons les têtards auprès de leurs congénères pour limiter le stress Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations la préhension des animaux est faite délicatement avec une pipette, Pour le comportement, les têtards sont amenés dans leur bac jusqu’à la pièce dédiée, et attrapés par une pipette pour les placer dans une large boite de Pétri avec leur milieu de nage pour limiter le stress. Les têtards sont isolés très peu de temps (5 min) avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit ne semble pas leur être préjudiciable vue que cette espèce a une préférence naturelle pour les zones peu éclairées. Afin de déterminer les concentrations optimales non toxiques lors du passage au modèle animal, les effets des perturbateurs endocriniens sont d’abord étudiés, sur des tranches de cervelet de souris.
Choix des espèces
La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre 3 jours (stade 21) et 1 mois (stade 50) post-fertilisation. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des cellules d’intérêt (oligodendrocytes in vivo) et sans recours à l’euthanasie des animaux.
Etude du rôle thérapeutique de la modulation de MT5-MMP dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Au premier jour de leur vie, des souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau sous anesthésie générale, avant un prélèvement de queue à quatre semaines. 448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois, elles passent quatre tests comportementaux, dont la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, censés mesurer mémoire et anxiété, puis sont tuées à cinq mois pour prélever sang et cerveau. Le porteur admet que la manipulation des nouveau-nés peut conduire la mère à rejeter un ou deux petits, avec absence de tétée ou cannibalisme, atteintes qu'il classe pourtant dans un niveau de souffrance modéré.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer MA est une maladie neurodégénérative, au cours de laquelle les cellules du cerveau dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Notre activité de recherche est dédiée à l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la MA. L’objectif est de comprendre le fonctionnement de cette maladie, afin de trouver des moyens d’action dans le système nerveux qui permettront de ralentir le développement de la MA.
Bénéfices attendus
L’objectif final est d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par la maladie d'Alzheimer. Les bénéfices à plus court terme, concernent d'une part la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la MA et d'autre part de trouver des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA.
Procédures
Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau sous anestésie générale et à 4 semaines un prélèvement de bout de queue (
Impact sur les animaux
Les nouveaux-nés subiront au premier jour post-natal une injection de virus dans le cerveau. Compte tenu de la manipulation des bébés, il est possible que la mère rejette un ou deux petits, se traduisant par l'absence de tétée et /ou du cannibalisme. Un prélèvement de bout de queue est réalisé pour le génotypage à l'âge de 4 semaines. A l'âge de 4 mois tous les animaux subiront 4 tests comportementaux tels que la reconnaissance d'objet et l'interaction sociale, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété. A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie profonde et analgésie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. Le sang et le cerveau sont prélevés pour effectuer des explorations biochimiques et histologiques.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, nous développons aussi des approches expérimentales in vitro dont les résultats doivent dans tous les cas être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle souris de la maladie d'Alzheimer. Ces souris représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).
Réduction
Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - souris sauvages (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 -souris modèle de MA (mâles+ femelles) n= 7groupes x32 souris = 224 Soit 448 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions.
Raffinement
Tous les petits de la même fratrie seront injectés. Le génotypage permettra 4 semaines plus tard de les identifier. Les nouveau-nés opérés sont réchauffés sur une couverture chauffante de type bouillotte, et remis à leur mère. Les mères et leur nouveau-nés opérés seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (nids végétaux à base de fibres courtes de coton). Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Afin d'éviter un maximum la manipulation des petits et le possible rejet par leur mère nous éviterons de les peser, mais nous observerons tous les jours leur comportement, s'ils sont vigoureux, s’ils tètent, ainsi que leur taille en comparant tous les petits de la même fratrie.
Choix des espèces
Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour nos études, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées modèle de la maladie d’Alzheimer. 1) Stade premier jour post-natal, dans lequel les injections de virus seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de protéines d’intérêt dès les premiers jours de vie post-natale dans les neurones. 2) Stade juvénile 1 mois et adulte 2 mois, afin de tester des stades intermédiaires 3) Stade adulte à l’âge de 4 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle nous observons des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique. Le comportement des animaux sera testé à partir de 4 mois, et ce pendant environ 15 jours. 4) Stade adulte à l'âge de 5 mois. A ce stade les animaux seront mis à mort. Tous les animaux reçoivent une injection de virus à la naissance mais certains d'entre eux seront mis à mort à 1 et 2 mois sans participer aux tests comportementaux.
Evaluation du profil pharmacocinétique de candidats médicaments sur des rongueurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 408
Des candidats médicaments sont administrés en une fois ou chaque jour pendant quatorze jours, puis les animaux sont tués pour prélever leur cerveau. 612 souris et 408 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Il s'agit de mesurer comment les molécules se répartissent dans l'organisme et de choisir la voie d'administration la plus adaptée pour de futures études sur des modèles de maladies neurodégénératives. Le porteur annonce des points limites déclenchant la mise à mort sans en nommer un seul, et justifie six échantillons par groupe pour l'analyse par spectrométrie de masse sans expliquer comment on arrive à 1 020 animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de générer des échantillons biologiques pour déterminer comment évolue la concentration, et la répartition de candidats-médicaments dans l'organisme en fonction du temps. Ce projet permettra également de déterminer la voie d’administration la plus adapté pour un candidat-médicament, pour de futures études d'efficacité dans des modèles pré-cliniques de maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour des maladies neurodégénératives. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats-médicaments pourra se poursuivre.
Procédures
Les animaux subiront des administrations de candidats médicaments, une seule fois ou quotidiennement sur 14 jours. Les stratégies d'anesthésies et d'analgésies impliquent des injections intra-péritonéales et souscutanées, ce qui peut induire à stress, juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Les administrations de candidats-médicaments ou d'anesthésiques peuvent engendrer un stress lors de l’acte, notamment lors administrations chroniques. L’administration chronique de composé peut induire des nuisances en cas d’effets néfastes, pour cette raison, les animaux seront suivis quotidiennement
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. La mise à mort est nécessaire pour collecter les cerveaux.
Remplacement
Le profil de distribution tissulaire des candidats-médicaments dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide céphalorachidien, sa capture par différents types cellulaires et son élimination. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux a été déterminé pour minimiser le nombre d'animaux, en lien avec le laboratoire d'analyse qui traitera les échantillons biologiques. L'analyse par spectrométrie de masse sera réalisée avec 6 échantillons par groupe. Pour maintenir les relations sociales et limiter le stress, les animaux seront hébergées à plusieurs par cage (entre 2 et 4), et auront accès à des objets d'enrichissements
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les rats seront hébergés par 2, et les souris seront hébergées, au minimum par 2, et, au maximum par 4, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Les procédures expérimentales utiliseront soit des souris, soit des rats. Le choix de l'espèce est motivée par la nature du projet et de la suite éventuelle en cas de résultats significatifs (pour évualier l'efficacité du composé, des modèles précliniques basés sur des souris ou des rats pourront être utilisés). Le type d'échantillons à collecter (ex. le volume de liquide céphalorachidien est plus important chez le rat, en comparaison avec la souris) pourra également orienter le choix du modèle. Les rongeurs, dont les souris et les rats, possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Les rongeurs sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Nous disposons d'équipements dédiés aux études impliquant des souris ou des rats. Les candidats-médicaments visent à traiter des maladies humaines apparaissant à l'âge adulte. Les rats seront âgés de 8 à 10 semaines, et les souris seront agées de 8 semaines, ce qui correspond à un stade de développement adulte.
Etude fonctionnelle in vivo d’un modèle murin de myopie
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Implantation d'un casque sur le crâne sous anesthésie, port prolongé d'un cache ou d'une lentille, treize anesthésies gazeuses en trois semaines, une heure d'anesthésie par injection pour l'électrorétinographie : 330 souris vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'étant génétiquement modifiées elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction, et leurs yeux sont prélevés. Le projet cherche à comprendre le rôle d'un gène dans la cécité nocturne congénitale stationnaire, maladie qui s'accompagne souvent d'une forte myopie. Un test comportemental est annoncé, décrit seulement comme un "changement de milieu sur une courte durée", sans que sa nature soit précisée.
Objectifs
La cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS) est un groupe de pathologies rétiniennes cliniquement et génétiquement hétérogène. La plupart des personnes atteintes ont une acuité visuelle basse, associée à des difficultés d’orientation en condition de faible luminosité. De nombreux patients présentent également d’autres anomalies oculaires telles qu’une forte myopie (inférieure à moins 6 dioptries), un strabisme ou un nystagmus. Parmi les différentes formes de CNCS, la forme complète, CNCSc, se caractérise par un dysfonctionnement de la transmission du signal entre les photorécepteurs et une classe de cellules bipolaires. Ce mécanisme n’est actuellement toujours pas bien compris. Dans ses études précédentes, notre équipe a identifié que des mutations dans différents gènes étaient associés à la CNCSc. Nous avons aussi pu mettre en évidence que les modèles murins de CNCSc présentent des déficiences génétiques communes dans certains gènes. Le rôle précis de ces gènes dans la rétine et leur impact sur la CNCSc et la myopie sont encore mal connus. Dans ce projet, nous proposons d’élucider le rôle de l'un de ces gènes par une analyse fonctionnelle in vivo et ex vivo d’un modèle de souris privée dudit gène
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire est une maladie visuelle handicapante provoquant des symptômes variés pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.
Procédures
Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) plus 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) plus Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Certains animaux seront soumis à un test comportemental impliquant un changement de milieu sur une courte durée. Anesthésie par injection le jour de l’électrorétinographie (une fois/animal, pendant une heure). Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). Les animaux seront répartis en 3 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe se verra analysé par électrorétinographie, le troisième groupe verra son environnement lumineux changé.
Impact sur les animaux
Certains animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées et relativement longues, entrainant un stress. Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-œil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Durant les tests comportementaux, certains animaux seront placés sur une plateforme durant une heure. L’arrivée dans un milieu inconnu peut stresser l’animal. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés selon la procédure réglementaire car il s'agit d'animaux OGM ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.
Remplacement
L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir des yeux en 3D.
Réduction
Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire et la myopie. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés, possédant donc le gène testé sur leurs 2 chromosomes. Nous comparerons aussi les résultats avec des animaux contrôles hétérozygotes afin de renseigner le potentiel impact de la perte du gène sur un chromosome. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (taux de réussite des expériences), des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires : 330 animaux.
Raffinement
Les animaux utilisés naîtront et seront hébergés en animalerie extérieure jusqu’à expérimentation. Ils seront alors hébergés dans notre animalerie où ils observeront une période d’acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 au maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’œil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’œil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents. Certaines expériences consistent en la caractérisation phenotypique (ie les symptômes)des animaux, nous travaillerons sur des animaux sur 2 stades adultes différents (6 semaines, 6 mois) pour documenter un possible phénotype progressif.