Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
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- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Développement d’un implant pour restaurer la préhension chez la personne tétraplégique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Une intervention de huit à dix heures sous anesthésie, sans jamais de réveil, attend dix des cochons du projet. Huit autres subissent une chirurgie d'implantation de quatre heures, puis quatre séances d'anesthésie de six heures à raison d'une par semaine, avec un prélèvement de sang hebdomadaire, avant d'être tués pour l'analyse des nerfs stimulés. 18 cochons au total vont être utilisés, dix dans des procédures conduites sous anesthésie sans réveil et huit dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour valider un implant de stimulation nerveuse destiné à restaurer la préhension chez des personnes tétraplégiques et à obtenir son marquage CE. Le porteur retient le cochon pour le diamètre de ses nerfs, l'épaisseur et l'absence de poils de sa peau et la proximité de son système immunitaire, après avoir mené un essai clinique de 28 jours sur quatre personnes tétraplégiques et des manipulations sur cadavre humain.
Objectifs
Notre projet contribue au développement d'un dispositif médical implanté de stimulation des nerfs périphériques (SNP), qui permettra de restaurer les fonctions du poignet et des doigts chez les personnes tétraplégiques. Nos objectifs sont les suivants : i) Aider à développer et valider un implant complet en vue de sa première implantation permanente, en analysant les risques biologiques et en validant le bon fonctionnement de l'implant avant les essais sur les humains. La finalité est d'obtenir le marquage CE du dispositif médical, ii) Permettre d'améliorer les mouvements obtenus en développant une méthode de réglage fin des paramètres de stimulation pour préparer le premier essai chez l'homme, iii) Explorer une approche complémentaire en testant l'efficacité d'une combinaison de la stimulations (nerfs périphériques et moelle épinière) pour obtenir à la fois un retour fonctionnel direct et améliorer progressivement les mouvements.
Bénéfices attendus
La perte bilatérale des fonctions des bras et des mains après une lésion complète de la moelle épinière cervicale a un impact considérable sur la capacité des personnes à vivre de manière indépendante. Au-delà des drames humains que cela représente, le handicap fait également peser un poids non négligeable sur le système de santé. Grâce au développement d’un dispositif innovant, notre projet pourrait permettre la restauration - a minima partielle - des fonctions du poignet et des doigts au quotidien chez ces patients. Pour cela il est nécessaire de valider et tester l’ensemble du système implanté dans sa version définitive avant la première implantation pérenne chez l’homme (essai clinique planifié fin 2025/début 2026). En développant des stratégies de traitement du signal, de modélisation et d'informatique, il sera aussi possible de permettre le réglage des paramètres de stimulation en temps réel afin d’affiner au maximum les mouvements évoqués. La stimulation du nerf périphérique étant pensée comme une solution générique, l’élaboration de tels algorithmes pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles solutions neuroprosthétiques ciblant un grand nombre d’applications cliniques (réhabilitation des membres supérieurs et inférieurs, dysfonctionnements uro-génitaux etc.). De même, bien que la stimulation du nerf périphérique et la stimulation de la moelle épinière n'aient jamais été testées conjointement, elles semblent complémentaires. En effet, combiner une récupération fonctionnelle immédiate (via la stimulation du nerf périphérique implantée) avec un renforcement durable de la plasticité neuronale (via la stimulation de la moelle épinière) devrait améliorer progressivement les mouvements et restaurer un plus grand nombre de fonctions (comme boire, manger, etc.) chez les personnes tétraplégiques. Enfin, la recherche et l’innovation dans le domaine du dispositif médical implantable étant peu répandues en France, ces expérimentations s’inscrivent dans une volonté de contribuer à la réindustrialisation d’un secteur stratégique de haute technologie, en pleine expansion et peu délocalisable.
Procédures
Deux procédures expérimentales sont planifiées dans le cadre de ce protocole. La première est une procédure sans réveil d'une durée de 8 à 10h , et qui prévoit 10 animaux. Une intervention chirurgicale permettra l'implantation d'électrodes autour du nerf périphérique, puis des tests de stimulation du nerf périphérique et de la moelle épinière seront réalisés, tandis que le prélèvement d’une portion de nerf sera réalisé pour analyse histologique après l'euthanasie des animaux. La deuxième procédure (classée modérée) consiste en une expérimentation chronique qui sera réalisée sur une période de 31 à 33 jours sur 8 animaux. Dans un premier temps une intervention chirurgicale (4h maximum) permettra d'implanter le dispositif de stimulation dans des conditions propres identiques à la chirurgie humaine, et comprenant la pose des électrodes sur les nerfs, et la réalisation d’une poche sous cutanée pour loger le boitier de l’implant. Suite à cette première intervention, les animaux seront anesthésiés une fois par semaine (pour un total de 4 sessions de 6h00 maximum) pour tester le fonctionnement de l’implant en chronique en limitant le stress de l’animal. Ces sessions s’accompagneront de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par semaine (2 tubes) pour analyse. Le dernier jour de cette procédure, des tests et explorations plus poussées (équivalentes à celles réalisées lors de la procédure sans réveil) seront réalisés, ainsi que l'euthanasie de l'animall, l’explantation du dispositif et de prélèvements des tissus environnants les différentes composantes de l’implant – incluant les portions de nerf périphérique stimulées – pour analyses anatomopathologiques.
Impact sur les animaux
Seule la procédure chronique pourra entraîner des nuisances chez les animaux, conséquences directes du protocole d’implantation et dans une moindre mesure du protocole de suivi chronique (sessions de stimulation du nerf périphérique et de la moelle épinière en transcutanée). Suite au protocole d’implantation : douleurs légères et difficultés posturales associées, inconfort transitoire lors de la phase de réveil, pose de pansement et courte période de privation des congénères sur 24 heures pour prévenir le risque infectieux tout en limitant l’inconfort de l’animal. Au cours du suivi chronique : inconfort transitoire (quelques heures) lors de la phase de réveil des animaux suite à la sédation (équilibre précaire, perte d’appétit, activité réduite) et phase de récupération de 24h avec perte de vivacité à prévoir, courbatures musculaires légères et transitoires (maximum une journée) liées à la sollicitation des muscles par la stimulation, rougeurs de la peau suite à la stimulation de la moelle épinière en transcutané (risque limité car stimulation pratiquée et très bien acceptée en routine chez l’homme). Pour chacune des procédures, le protocole anesthésique est conçu pour fournir une anesthésie et une analgésie suffisantes à la réalisation des expérimentations sans induire de stress ni de sensation de douleur chez l’animal.
Devenir
Nos procédures expérimentales incluent le prélèvement de tissus pour analyses histologiques, ce qui est sont incompatible avec la survie des animaux. L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures expérimentales.
Remplacement
Avant la mise en place de ces phases expérimentales, plusieurs mesures de remplacement ont d’ores et déjà été mises en œuvre : modélisation informatique de la stimulation du nerf périphérique, mise en œuvre d’une série d’investigations cliniques chez l’homme, essai clinique de 28 jours sur 4 individus tétraplégiques (électrodes implantées couplées à un stimulateur en externe). Dernièrement, des manipulations sur cadavre humain ont été réalisées pour affiner la procédure chirurgicale chez l’homme et valider le design du dispositif (surtout la partie implantée). Enfin, avant la mise en oeuvre de nos procédures in vivo, des manipulations sur carcasse de cochon sont prévues pour développer l’approche chirurgicale la plus fidèle possible aux conditions retrouvées chez l’homme mais également pour valider le lieu d’implantation et affiner le protocole histologique. Des test ex-vivo de l’ensemble des éléments de l’implant et de la chaîne d’acquisition des signaux biologiques ont aussi été réalisés. Néanmoins, le recours à l’expérimentation sur un modèle vivant de gros animal demeure nécessaire afin d’évaluer la conformité réglementaire du dispositif implantable (MDR 2017/745).
Réduction
A la suite de discussion avec des statisticiens, nous prévoyons ainsi d’allouer 10 animaux à la procédure aiguë (à fort caractère exploratoire) et 8 animaux à la procédure chronique afin d’atteindre le seuil de reproductibilité statistique. Nous avons également réfléchi à l'optimisation des animaux utilisés. En effet,en plus des animaux engagés dans la procédure aiguë, le protocole terminal prévu à la fin de la procédure chronique sera calqué sur les expérimentations courtes afin de répéter les mesures et de collecter un maximum de données, augmentant ainsi la pertinence statistique des résultats. Les sessions de suivi chronique, réalisées une fois par semaine pour un total de 4 sessions par animal, permettront de solliciter régulièrement l’implant (stimulation des nerfs) et fourniront une quantité conséquente de données attestant de la fiabilité du dispositif. Enfin 3 objectifs distincts mais complémentaires seront poursuivis parallèlement sur les mêmes animaux tout au long des expérimentations menées dans le cadre du projet.
Raffinement
Les animaux seront inclus dans les différentes procédures par paires afin de respecter leur sociabilité et limiter leur stress. L’ensemble des procédures seront réalisées sous anesthésie générale, afin de maximiser la qualité des données en limitant une douleur et un stress aux animaux. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous la supervision de chirurgiens orthopédiques et neurochirurgiens et sera associée à la gestion de la douleur per-opératoire par des médicaments de type morphiniques, et postopératoire par l'administration d'anti-inflammatoires. De même la mise à mort sera réalisée en fin de procédure alors que les animaux seront anesthésiés. Pendant la phase post-opératoire et la période de suivi chronique, une grille de score sera utilisée pour évaluer l'état clinique des animaux, portant sur des critères d'absence d'infection en lien direct avec le modèle (cicatrice, suture…), sur des points généraux de comportement et des signes d'inconfort ou de douleur. Cette grille aidera à la prise de décision en cas d'atteinte des points limites. Un Intervalle de temps conséquent entre deux inclusions successives est prévu (2 à 4 mois) afin de tirer profit des observations/résultats précédents pour adapter le protocole si nécessaire.
Choix des espèces
4 pré-requis nous ont conduit à nous tourner vers le modèle porcin : A) Le dispositif – taille et géométrie – étant conçu pour une implantation chez l’homme, la phase de validation pré-clinique ne peut être réalisée que sur gros animal. B) Le transfert de données et d’énergie vers/en provenance de l’implant étant réalisé au moyen d’une communication radiofréquence sans fil en transcutanée, le recours à un animal présentant une peau proche de celle de l’homme (glabre et d’épaisseur comparable) est essentiel. C) L’évaluation du risque biologique, notamment les réactions de l'organisme liées à l’implant requièrent un modèle animal au système immunitaire proche. D) Les nerfs cibles (médian/radial ou sciatique) sont équipés d’électrodes dont le diamètre est défini pour l’humain. Le modèle animal choisi devra avoir des nerfs du même ordre de grandeur. Le modèle porcin remplit l’ensemble de ces critères. De plus, les caractéristiques anatomiques remarquables (diamètre des nerfs, épaisseur de la peau) permettront le test de l’implant dans des conditions proches de celles rencontrées chez l’humain. Pour la procédure courte, les animaux pèseront environ 45kg.Pour la procédure chronique, l'implantation sera réalisée sur des animaux de 25-30 kg. Nous testerons le dispositif sur une période de 31 à 33 jours sans que la croissance de l’animal ne mette en danger les composants de l’implant (e.g. tension excessive sur les câbles menant aux électrodes). De la même manière, lors de la mise en œuvre du protocole terminal à la fin de la procédure chronique, les animaux devraient atteindre un poids proche de celui des animaux utilisés dans la procédure aiguë (45 kg) permettant, le cas échéant, de fusionner les jeux de données et d’augmenter la preuve statistique.
Effets cérébraux des vésicules provenant de cellules du foie exposées à des polluants environnementaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
30 rats mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit huit injections dans la veine de la queue, deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis enchaîne une semaine de tests, activité locomotrice spontanée sur cinq minutes, mémoire immédiate sur dix minutes, deux mesures d'anxiété de cinq minutes chacune et une mémoire de travail évaluée trois matinées de suite. L'objet est d'observer si des vésicules produites par des cellules de foie en culture exposées à des polluants alimentaires provoquent anxiété et troubles de la mémoire, les biomarqueurs et les cibles thérapeutiques annoncés relevant de l'espoir que le porteur formule. Sur le remplacement, il indique avoir remplacé les animaux non-humains par des hépatocytes en culture pour produire les vésicules, et affirme que leur effet sur le cerveau ne peut pas l'être.
Objectifs
La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques associée à une inflammation. En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de cette maladie du foie. Les polluants qui seront étudiés ici sont présents dans l’alimentation et en raison de leurs propriétés lipophiles, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau, où ils peuvent générer des troubles de l’anxiété et des altérations cognitives. L’exposition à ces polluants modifie également la quantité et les caractéristiques des petites vésicules produites par le foie, vésicules qui peuvent perturber le fonctionnement d’autres cellules de l’organisme. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons chez le rat adulte les conséquences hépatique et cérébrale de l'injection de ces vésicules libérées et isolées à partir de cellules de foie en culture et exposées à des conditions enrichies en gras et aux polluants étudiés.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants choisis ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en étudiant le rôle des vésicules dans la progression de cette maladie du foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : d’étudier l’impact au niveau du foie et du cerveau de l’administration de ces vésicules chez des rats.
Procédures
La seule intervention pouvant être à l’origine de mal-être est l’injection des vésicules à la veine de la queue, injection qui sera répétée 8 fois pour chaque animal tout au long des 4 semaines de traitement. Chaque animal sera donc injecté 2 fois par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les tests comportementaux seront quant à eux effectués sur une période d’une semaine, entre 8h et 13h. Un premier test consistera à évaluer l'activité locomotrice spontanée de l’animal durant 5 minutes. La mémoire immédiate de l’animal sera également testée pendant une durée de 10 minutes. Deux tests complémentaires, chacun d’une durée de 5 minutes seront réalisés pour évaluer le niveau d'anxiété des animaux. Un dernier test se proposera d'évaluer la mémoire de travail des animaux. Il sera réalisé sur 3 jours consécutifs pendant 5 minutes par matinée. Ainsi chaque animal effectuera un à deux tests par jour pendant une semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus sont les suivants : stress de contention lié à l'injection des vésicules extracellulaires ainsi que le stress lié à l’introduction de l’aiguille dans la veine caudale . D’après les éléments de la littérature et l’expérience des porteurs du projet, aucun des tests comportementaux prévus ne provoque des signes de mal-être chez les animaux.
Devenir
Une fois les tests comportementaux réalisés, les animaux seront mis à mort et les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Nous avons remplacé l’utilisation d’animaux pour la production des VE par des hépatocytes en culture soumis à un environnement enrichi en graisse et/ou en polluants environnementaux. Cependant, l’impact de ces vésicules sur les fonctions du foie et du cerveau (activité, anxiété, mémoire de travail) ne peut pas être évalué sur des cellules de foie isolées, ni remplacé.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 27 animaux prévu a été déterminé pour une puissance statistique fixée a priori de 0,90, des effectifs égaux dans les 3 groupes expérimentaux (n=9/groupe) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. A ce nombre, nous nous laissons la possibilité d’ajouter 1 individu supplémentaire par groupe de manière à pallier à une éventuelle atteinte de seuils critiques irréversibles. Soit un total de 30 animaux au maximum (n=10 par groupe).
Raffinement
Les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation, placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires dans des portoirs ventilés avec des buchettes et frisure de papier kraft comme enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. En ce qui concerne les injections à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon avec un anti-douleur local et le stress induit par le tube de contention sera réduit par une habituation d'une durée d'une semaine.
Choix des espèces
Des rats adultes mâles ont été choisi pour être plus représentatif de la réalité humaine où les hommes présentent un taux d’incidence de stéatohépatite deux fois plus élevé que les femmes. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris subissent une biopsie de la queue, puis une anesthésie de cinq minutes avant la mise à mort. 176 souris porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance modéré, une partie à cinq semaines, l'autre à vingt semaines. Ce qu'elles subissent tient surtout à leur génotype, les mutantes grandissant moins vite que les témoins et portant une ataxie qui atteint chez les patients la marche, la coordination et l'équilibre. Le porteur annonce les tuer à vingt semaines "avant l'apparition des symptômes les plus sévères", sans nommer les symptômes moteurs qui apparaissent avant ce terme ni la manière dont il les mesure.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptômes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris contrôles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparition des symptômes Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : -Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de la queue pour génotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - anesthésie avant la mise à mort. Cette procédure dure 5 minutes. - injection des analgésiques et anesthésie avant la mise à mort. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris présentant une mutation de l’ataxine 1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de la queue ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 176 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale. Les animaux seront mis mort à 20 semaines avant l’apparition des symptômes les plus sévères du phénotype. Néanmoins, en cas de difficulté d’accès à l’alimentation,de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser les souris parce que ces présents des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptômes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptômes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Mécanismes neuronaux impliqués dans une période critique de développement du cortex chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du cerveau de 45 minutes est pratiquée sur des souriceaux d'un à sept jours, des juvéniles de quatorze à dix-sept jours ou des adultes. Une à deux semaines plus tard, un œil est suturé sous anesthésie, opération de dix minutes qui prive l'animal de la vision de cet œil pendant 36 à 72 heures. Un à trois jours après cette fermeture, une dernière chirurgie de cinq minutes est menée sans réveil. 1 620 souris passent par ces étapes, 300 dans des procédures conduites sous anesthésie sans jamais reprendre conscience et 1 320 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées parce que les prélèvements du cortex se font après la mort.
Objectifs
La plasticité (capacité de remodelage) du cerveau est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Cependant, cette perte de plasticité au cours du développement n’est pas un phénomène progressif. Le cortex présente une période de plasticité accrue dite « période critique », pendant laquelle les circuits sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une maladie touchant la vision binoculaire pendant la période critique chez l’enfant aura des impacts irréversibles sur l’acuité visuelle. Cette période critique a été identifiée chez un grand nombre de mammifères. La compréhension des mécanismes de la période critique ouvre aussi la perspective, à plus long terme, de pouvoir « réinstaurer » une plasticité de type juvénile au cerveau adulte et lésé. La période critique est généralement étudiée dans le cortex visuel en utilisant une fermeture d’un oeil. Cette augmentation des réponses neuronales (plasticité) ne se produit pas si la fermeture de l’œil a lieu avant ou après la période critique. Des études récentes ont pu mettre en évidence le rôle de certains types de neurones dans ce phénomène. Dans ce projet, nous étudions le développement des neurones impliqués dans la période critique du cortex visuel pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables du pic de plasticité au cours du développement du cerveau chez la souris.
Bénéfices attendus
Premièrement, le projet vise à comprendre les mécanismes qui préside à la plasticité très forte du cerveau au cours de la maturation du cerveau chez les mammifères (enfance chez l’humain), ce qui a un intérêt majeur en recherche fondamentale. Deuxièmement, nos expériences modéliseront chez la souris une condition pathologique courante chez l'homme. Les cataractes congénitales entraînant des entrées visuelles inégales pendant l'enfance peuvent provoquer l'amblyopie, une condition qui affecte deux à cinq pour cent de la population, dans laquelle la vision à travers un œil, "l'œil paresseux", est faible bien que l'œil lui-même soit parfaitement sain. Si le traitement précoce de l'amblyopie ou de l'œil paresseux est généralement simple et consiste à utiliser des lunettes ou des cache-œil, l'amblyopie ne peut pas être traitée chez les enfants de plus de 10 ans. L'application des travaux fondamentaux sur la période critique de la plasticité du cortex visuel pourrait permettre de traiter l'amblyopie chez les adolescents et les adultes. Troisièmement, ce projet aborde des questions de plasticité cérébrale qui ont un impact au-delà du développement du cortex. Des périodes critiques existent dans de nombreuses zones du cerveau et peuvent reposer sur des mécanismes communs. La découverte, ici dans des modèles murins, de voies par lesquelles des fenêtres de plasticité accrue pourraient être rouvertes chez les adultes pourrait avoir des implications pour la réparation des lésions cérébrales et la récupération sensorielle. Enfin, les périodes critiques de plasticité élevée sont aussi des périodes de vulnérabilité pour le cerveau en développement. Une perturbation précoce des expériences sensorielles ou sociales appropriées entraînera des circuits mal câblés qui réagiront de manière sous-optimale aux expériences normales à l'avenir. Il est probable que de telles perturbations sous-tendent des troubles neurodéveloppementaux tels que l'épilepsie, l'autisme et la schizophrénie.
Procédures
Pour un premier groupe d’animaux, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes). Pour un second groupe d’animaux, une chirurgie du cerveau sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie (45 minutes) soit au stade néonal, soit au stade juvénile, soit au stade adulte. Une à deux semaines après cette chirurgie, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes). Pour un troisième groupe d’animaux, une chirurgie du cerveau sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie (45 minutes) soit au stade néonal, soit au stade juvénile, soit au stade adulte. Une à deux semaines après cette chirurgie, une chirurgie par suture d’un œil sous anesthésie générale et analgésie (10 minutes) sera réalisée. Après un à trois jours de fermeture d’un œil, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes).
Impact sur les animaux
La fermeture d’un œil affectera la vision des souris pendant 36 à 72h. Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation et à des difficultés de mouvements. Un cannibalisme des petits par la mère peut, dans de rares cas, survenir après chirurgie chez le nouveau-né. Des douleurs postopératoires et un stress sont aussi possibles après chirurgie. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire.
Devenir
Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L’étude de l'impact de la fermeture d’un œil sur le fonctionnement du cortex nécessite de d'utiliser des animaux. En effet, l’interaction entre circuits neuronaux du cortex, circuits neuronaux des voies visuelles et exposition à des stimuli lumineux résulte de processus de développement complexes qui ne peut pas être modélisés in vitro. Ainsi, le modèle animal n’est pas remplaçable pour ce projet. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la plasticité du cerveau) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. Au total, 1620 animaux sont inclus dans le projet.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont hébergés dans des pièces dans lesquelles la température, l’hygrométrie, et le cycle de lumière (12/12) sont contrôlés, et ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal sont des souris jeunes à des stades de développement qui permettent d’étudier les conséquences de la modification d’expression de gènes sur les propriétés des connexions entre neurones à trois stades de développement qui permettent d’étudier la période de plasticité accrue du cortex : les souris seront incluses en procédure soit avant cette période (souris entre 1 et 7 jours), soit pendant cette période (souris entre 14 et 17 jours), soit après cette période (souris entre 40 et 100 jours).
Développement du faisceau corticospinal dans des modèles murins : rôle des gènes de mouvements miroirs congénitaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux nouveau-nés sont endormis par le froid, dans un gant posé au contact indirect de la glace, puis tués. Sur les femelles gestantes, une ouverture de l'abdomen de 45 minutes sous anesthésie permet d'introduire du matériel génétique dans les embryons. 2 396 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 344 d'entre elles et modéré pour 1 052, alors que le porteur affirme que les points limites sont respectés "de manière à éviter toute souffrance des animaux" et annonce dans le même document que certaines lignées présenteront peut-être une difficulté à se nourrir ou une absence de poche de lait dès la naissance. Toutes sont tuées, les surnuméraires nées avec le mauvais génotype, les femelles ayant porté les embryons manipulés, les souris dont le cerveau est prélevé pour analyse, et les mâles isolés pour les accouplements contrôlés qui ne peuvent plus réintégrer un groupe.
Objectifs
Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constitutant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations Mouvements Mirroirs de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour l'identification génétique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Une chirurgie au niveau abdominale de femelles gestantes, suivie de l'introduction de matériel génétiques dans les embryons sera réalisée une seule fois. Cette procédure chirurgicale s'effectue sous analgésie et anesthésie gazeuse générale et n'exède pas 45 minutes. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace (contact indirect) puis euthanasiés. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. L’anesthésie par le froid chez les jeunes même sous analgésie pourra générer un stress. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une hypothermie pendant l'anesthésie et une douleur pendant 24/48h. Certains animaux des nouvelles lignées présenteront peut-être un phénotype dommageable soit à la naissance (difficulté à se nourrir, absence de poche de lait), soit concernant leur locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux surnuméraires (génération de mauvais génotypes pour avoir les animaux avec les génotypes d’intérêt pour notre étude), des femelles ayant généré des animaux expérimentaux (E16 ou animaux électroporés), iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau, ou enfin des mâles qui ont été isolés et ne peuvent donc plus réintégrer un groupe de mâles.
Remplacement
Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2396 animaux. Des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. La composition des groupes d'animaux a été optimisée en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge dans une condition, nous n’effectuerons plus de nouveaux accouplements contrôlés. Pour réduire le nombre d’animaux dont l’expression des gènes d’intérêt aura été modifié, nous utiliserons la technique d’électroporation (au lieu de générer de nouveaux modèles murins).
Raffinement
Les animaux sont sous la supervision de zootechniciens soigneurs et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE. Dans le cas des mâles isolés pour les accouplements contrôlés, des bâtonnets à ronger seront ajoutés à l'enrichissement déjà présent. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les portées des 5 nouvelles lignées seront surveillées plus spécifiquement dans les premiers jours postnataux (présence de lait dans l’estomac) et au moment de la mise en place de la locomotion (P12-P15) pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Les petits présentant des signes cliniques seront systématiquement euthanasiés. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulation. Concernant la procédure chirugicale, les femelles ne sont séparées que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale et placé sous un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant. Lorsque l’animal a récupéré, il réintégre sa cage d’origine. Son comportement est surveillé. Il reçoit une nouvelle dose d'analgésique 6 à 8h après son réveil. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience, notamment le jour de la mise bas afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation. Les nouveaux nés seront surveillés. En cas de rejet par la mère, ils seront euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant et recevront au préalable une injection d’analgésique.
Choix des espèces
Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, nous réaliserons des expériences d'injection chez l'embryon, au moment où les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins sont produits dans le cerveau. En parallèle, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. Juste après la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).
Caractérisation de nouveaux modèles de l’autisme chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses de mutations décrites comme identiques à celles trouvées chez des personnes autistes, 2 259 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 728 un niveau modéré. Les actes vont de la biopsie du bout de la queue et du tatouage jusqu'à une chirurgie de trente minutes, en passant par des gavages, des prises de sang avec risque d'hémorragie et six tests comportementaux dont l'un dure deux heures. Certains animaux reçoivent des substances qui peuvent provoquer un état cataleptique et épileptique pendant quarante minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés par biochimie et imagerie, le porteur ne consacrant qu'une phrase au remplacement, l'étude du comportement exigeant selon lui "l'organisme entier".
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme sont des troubles du neurodéveloppement qui touchent 1 à 2% de la population. Ils sont caractérisés, entre autres, par des altérations dans le développement des capacités cognitives, de communication et d'interaction sociales. Ils constituent un véritable handicap pour le patient et malheureusement, à ce jour, il n’existe aucun traitement curatif car les causes de cette pathologie restent encore mal connues. Notre objectif est de caractériser de nouveaux modèles de souris ayant des mutations identiques à celles observées chez les patients et d’identifier des mécanismes pouvant être à l’origine des troubles du spectre de l’autisme et qui pourront être ciblés à l’avenir pour le développement de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Notre travail vise à identifier les déficits présents chez des souris modèles des troubles du spectre de l’autisme. Ce projet apportera des données importantes pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans cette pathologie et ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour leur traitement.
Procédures
-Injections intra-péritonéales et sous-cutanées (entre 1 et 6 fois; durée 30 seconds) - identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue, prises de sang : stress et douleur légère de courte durée (1 fois, durée 30 seconds) - prises de sang : stress, douleur légère et risque d’hémorragie (1 fois, durée 1 minute) - chirurgie sous analgésie et anesthésie générale (1 fois, durée 30 minutes) - Administration de médicaments qui peuvent causer un état cataleptique et épileptique (1 fois, durée 40 min au maximum, généralement 10-20 mins) - Gavage: stress (1 fois, durée 10 seconds) - Tests de comportement : stress (6 tests, entre 5 min et 2h selon le test)
Impact sur les animaux
Injections intra-péritonéales et sous-cutanées, identification par tatouage, biopsie de l’extrémité de la queue : stress et douleur légère de courte durée Prises de sang : stress, douleur légère et risque d’hémorragie Chirurgie : douleur, perte de sang Injection de certaines drogues peuvent causer un état cataleptique et épileptique Gavage : stress et risque de fausse route Tests de comportement : stress
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience parce que nous aurons besoin d’analyser le tissue avec des méthodes biochimiques et d’imagerie.
Remplacement
Cette étude nécessite une approche comportementale qui n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier, nous devons donc faire appel à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats et a été déterminé grâce à une analyse de puissance statistique et aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthésie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logées à raison de 5 compagnons (frères, sœurs) par cage dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la Souris. Pour toutes maladies neurodéveloppementaux il est important de comparer des animaux adolescents avec des animaux adultes car certains phénotypes se manifestent seulement avant l’âge adulte. Donc, nous utiliserons des animaux seront injectés au stades adolescents (6 semaines) et adultes (3 mois).
Analyse développementale des dysfonctions neurovasculaires cérébelleuses dans un modèle murin de Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale (TCAF)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
De l'alcool est injecté sous la peau de souris gestantes, neuf fois entre le douzième et le vingtième jour de gestation, pour reproduire une alcoolisation fœtale. 1 921 souris, mères et petits confondus, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les souris vacillent après l'injection, l'alcoolémie étant mesurée trente minutes plus tard, et affirme qu'elles ne montrent pas de signe de souffrance au moment de l'injection. Toutes sont tuées, les mères anesthésiées puis mises à mort pour prélever les embryons, les souriceaux pour prélever leur cervelet à neuf stades de développement.
Objectifs
Les Troubles Causés par l’Alcoolisation Fœtale ou TCAF sont des troubles du neurodéveloppement liés à des consommations modérées ou discontinues d'alcool pendant la grossesse. Cette pathologie, dont la prévalence est évaluée à 1% des naissances, se traduit par l’apparition d’atteintes neurologiques chez l'enfant avec des répercussions fonctionnelles qui se révèlent progressivement avec l’âge. Dès lors, de nombreuses études visant à caractériser les anomalies du neurodéveloppement chez les enfants TCAF se sont portées sur des structures intégratives telles que le néocortex ou encore l’hippocampe. Celles-ci ont notamment révélées une tortuosité significative des vaisseaux sanguins induisant un mauvais positionnement des cellules nerveuses. Pour autant, plusieurs déficits observés chez ces enfants, tels que les troubles orthoptiques ou des défauts de motricité fine, suggèrent que le cervelet pourrait également participer aux déficits induits par une alcoolisation in utero. Les objectifs de ce projet seront donc (i) de caractériser la vascularisation et les interactions neurovasculaires au cours du développement du cervelet, puis ii) d’évaluer l’impact de l’alcoolisation in utero sur la mise en place vasculo-associée des cellules du cortex cérébelleux. A terme, nous pourrons ainsi déterminer si le cervelet participe aux déficits observés chez les enfants TCAF afin d'optimiser leur prise en charge.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra tout d'abord d’identifier pour la première fois le mécanisme de mise en place de la vascularisation dans le cervelet murin en développement. Ainsi, nous pourrons déterminer si une migration vasculo-associée participe à la mise en place du cervelet au cours de l'embryognenèse ou lors de la période postnatale et si celle-ci est altérée en condition d'alcoolisation foetale comme déjà démontré dans le cortex cérébral et la rétine. De plus, l’implication d'un service de pédiatrie néonatale dans ce projet nous permettra d’envisager une transposition de nos résultats immunohistochimiques à l’enfant. Dès lors, une corrélation entre les altérations histologiques du cervelet et les atteintes neurodéveloppementales observées chez les enfants atteints de TCAF pourra être envisagée et la prise en charge de ces enfants pourra alors prendre en compte les déficits neurologiques de manière plus intégrée, i) en orientant la thérapeutique vers la cible vasculaire et ii) en incluant la participation du cervelet lors des traitements symptomatiques.
Procédures
Afin de mimer une alcoolisation foetale, de l’alcool sera administré par voie sous cutanée à des souris gestantes du 12ème au 20ème jour embryonnaire soit 9 injections au total Avant la procédure d'injection, les souris gestantes seront préalablement légèrement anesthésiées afin de limiter le stress. La manipulation dure environ 1 minute pour chaque injection. Ce protocole d'alcoolisation répétée par injection est décrit dans des cas d’alcoolisation maternelle. Lors des prélèvements des embyrons, les mères seront soumises à une anesthésie dans une chambre d'induction avant leur euthanasie. Lors des prélèvements des cervelets chez les souriceaux postnataux, les animaux sont également anesthésiés avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
A la suite de l’injection d’alcool chez les mères gestantes, les souris vacillent reflétant l’alcoolémie mesurée après 30 minutes comme observé chez l’humain après alcoolisation. Au cours de l’injection, les souris ne montrent pas de signe de souffrance. Les études déjà réalisées sur ce modèle murin TCAF n'ont pas démontré d'augmentation de fausses couches ou de mortalité précoce chez les embryons/souriceaux.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans cette étude sera euthanasié à la fin de l'expérimentation soit du fait du prélèvement d'organes ou d'embryons, soit du fait qu'ils auront reçu des injections journalières pendant 9 jours (de NaCl 0.9% ou d'alcool) et qu'ils ne pourront donc pas être réutilisés pour d'autres expérimentations (mères gestantes).
Remplacement
Certains déficits observés chez les enfants TCAF, tels que les troubles cognitifs, orthoptiques ou des défauts de contrôle de la motricité fine laissent penser que le cervelet pourrait participer aux déficits induits par une alcoolisation foetale. A l'appui de cette hypothèse, les images d'IRM montrent que ces enfants présentent un volume cérébelleux plus faible. De plus, plusieurs études réalisées sur des modèles animaux ont montré que les populations nerveuses du cervelet présentent une sensibilité importante à l'alcool. Cependant, au regard de ces travaux, il reste difficile d'évaluer l'impact d'une exposition prénatale à l'alcool sur le développement du cervelet. En effet, les modèles utilisés jusqu'alors sont soit des cultures cellulaires, ce qui ne permet pas d'obtenir un système intégré, soit des souris entre le 4ème et le 10ème jour postnatal, ce qui correspond au 3ème trimestre de gestation chez l'Homme, alors que les différents types cellulaires sont déjà présents au sein du cervelet, et ce qui implique d'étudier les effets directs de l'alcool et non l'effet d'une alcoolisation de la mère sur le développement du petit. De plus, il n'existe que peu voire pas de données sur la mise en place de la vascularisation et sur l'existence d'une migration vasculo-associée au cours du développement embryonnaire du cervelet, et, par voie de conséquence, l'impact de l'alcoolisation foetale sur ces événements précoces n'a jamais été étudié. Notre étude vise donc tout d'abord à décrire la vascularisation du cervelet chez des embryons de souris à différents âges pour déterminer si les cellules cérébelleuses utilisent les vaisseaux sanguins en tant que support de migration au cours de l'embyrogenèse. Puis, en utilisant un modèle animal TCAF, nous pourrons identifier les mécanismes impactés par une alcoolisation foetale afin de mieux appréhender la participation du cervelet aux déficits TCAF et d'adapter la prise en charge thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet et obtenir des résultats statistiquement interprétables à l'aide du test non paramétrique Mann-Whitney. 1. Pour la caractérisation de la vascularisation et de la migration vasculo-associée dans le cervelet au cours du développement, les âges d’intérêt ont été identifiés en s’appuyant sur la littérature afin qu'ils soient en corrélation avec les étapes clefs du neurodéveloppement cérébelleux humain. Ainsi 4 stades embryonnaires et 5 stades postnataux seront étudiés à raison de 4 animaux par stade pour obtenir une moyenne statistiquement interprétable des paramètres vasculaires et vasculo-associés. Ces 4 animaux devront être de portées différentes pour prendre en compte la variabilité inter-portée dans l'interprétation des résultats. Pour les marquages immunohistochimiques, 10 anticorps différents sont requis pour identifier l'ensemble des vaisseaux sanguins et des populations cellulaires cérébelleuses. En transparisation, les marquages immunohistochimiques sont obligatoirement réalisés sur des embryons ou cervelets postnataux entiers, ce qui nécessitera 4 animaux de portée différente par stade et par marquage. En revanche, pour l'immunohistochimie sur coupe, la taille du cervelet permettra de réaliser plusieurs marquages différents sur le même échantillon, permettant de réduire le nombre d'animaux. 2. Pour étudier l'impact d'une alcoolisation foetale sur la vascularisation et la migration vasculo-associée, il sera nécessaire de réitérer l'ensemble des marquages précédents sur des embryons « contrôle sham » dont la mère a reçu des injections de NaCl pour confronter les résultats obtenus avec les animaux « alcoolisés in utero » et éviter les biais expérimentaux liés à l'injection en elle-même. Pour les études de PCR et western blot, la taille du cervelet nécessitera un animal par condition et par technique jusqu'à l'âge de la naissance inclus. En revanche, pour les stades plus tardifs, ces 2 techniques pourront être réalisées en parallèle sur un même animal en divisant le cervelet en deux au moment du prélèvement. Enfin, pour la zymographie, un animal par condition sera nécessaire du fait de la préparation de l'échantillon.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Ils seront maintenus dans un environnement stabilisé (température 21 ± 1 °C, hygrométrie 55%, luminosité 100 lux avec photopériode régulée (cycle jour/nuit 12h/12h)). Ils auront libre accès à l’eau et à la nourriture, et un enrichissement sera mis en place (tunnel en carton, demi-sphère de cellulose et lanières de papier kraft). Ils seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et leur bien-être sera surveillé après les injections d’alcool/NaCl. En cas de dépassement des points limites identifiés (signe de douleurs extérieurs indexés sur Mouse Grimace Scale, manifestations de signe de détresse ou d’infection) ou de défauts significatifs de développement, les animaux seront mis à mort comme décrit précédemment. Lors de la procédure d'alcoolisation foetale, les mères seront conservées dans leur cage d’hébergement et amenées dans la pièce d’expérimentation 1h avant les injections pour limiter tout stress de l’animal. Cette pièce est calme et isolée d'autres animaux. Les mères ayant reçu l'injection seront surveillées en temps réel pendant 45 min avant leur retour dans leur hébergement. Lors des prélèvements, les animaux en attente de l'euthanasie sont placés à l'écart de la table d'expérimentation pour éviter tout stress environnant.
Choix des espèces
La Souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes physiologiques complexes dont les mécanismes sont similaires aux mammifères. C'est le cas du développement cérébral par exemple. Or le cervelet suit les mêmes étapes de développement que le reste du cerveau avec des séquences de prolifération, migraion, différenciation et apoptose. L'utilisation de ce modèle est donc tout à fait pertinent dans cette étude. De plus, la majorité des publications antérieures relatives aux TCAF a été réalisée chez la souris. Par souci de cohérence et de vision intégrée de l'effet de l'alcoolisation foetale sur le développement nerveux, il est donc nécessaire de poursuivre avec ce modèle murin avant la transposition clinique. Les stades de développement d’intérêt ont été déterminés sur la base des événements clefs de la neurogenèse du cervelet qui sont également bien identifiés chez l'Homme. Ainsi les stades embryonnaires choisis correspondent respectivement à la naissance des cellules de Purkinje, à l’émergence des précurseurs des cellules en grains puis des cellules de Golgi, et enfin à la mise en place de la couche granulaire externe. Puis, pour les études postnatales, les trois premières semaines postnatales représentent successivement une phase de prolifération des cellules en grains dans la couche granulaire externe, le développement de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje, la mise en place du circuit cortical cérébelleux et enfin la fin du développement du cervelet chez le jeune adulte. L'alcoolisation sera réalisée uniquement chez la mère gestante mais pas directement sur le souriceau postnatal.
Etude d’un traitement neuroprotecteur dans des modèles de rats parkinsoniens
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
786 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie sous anesthésie sans reprise de conscience et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une neurochirurgie de trente minutes pour reproduire une maladie de Parkinson, tous reçoivent ensuite l'implantation chirurgicale d'un dispositif censé protéger les neurones, et certains jusqu'à six prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur annonce que ce dispositif apportera "les dernières preuves d'efficacité" avant le passage chez les patients, alors que le projet doit encore vérifier que le modèle produit bien des symptômes. Il évoque un large panel de tests comportementaux moteurs, sensoriels, psychiatriques et d'apprentissage, un par jour pendant deux semaines, sans préciser lesquels.
Objectifs
Ce projet a pour but d'étudier les effets d’un dispositif ayant des propriétés protectrices contre la mort des neurones impliqués dans la maladie de parkinson sur un modèle de rat parkinsonien. Il a pour but d'évaluer l'effet bénéfique de ce dispositif sur la perte de ces neurones, des marqueurs sanguins pathologiques observés dans la maladie de Parkinson ainsi que les performances des rats dans des tâches comportementales motrices, sensorielle, psychiatrique et d'apprentissage caractéristiques de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Cette procédure aura pour bénéfice d’apporter les dernières preuves d’efficacité d'un dispositif implantable sur tous les mécanismes pathologiques de la maladie de Parkinson. Ces résultats permettront de faciliter le passage aux essais cliniques directement chez le patient. La maladie de Parkinson, ainsi que de nombreuses maladies neurodégénératives, n’ont à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique autre que symptomatique. La réussite de ce projet apportera une possibilité de ralentir la perte des neurones observée dans cette maladie et ainsi, l’évolution des patients vers des stades de plus en plus handicapant pouvant aller jusqu’à la perte d’autonomie, la démence et une forte réduction de la qualité de vie des patients.
Procédures
1) Une partie des animaux subira une neurochirurgie pour générer le modèle de rats parkinsoniens (30 minutes incluant l'anesthésie). 2) Tous les animaux subiront une chirurgie d’implantation du dispositif protégeant les neurones (20 minutes, incluant l'anesthésie). 3) Une partie des animaux aura des prélèvements sanguins qui seront répétés à différentes étapes de l'expérience (5 minutes incluant l'anesthésie, 3 à 6 prélevements). 5) Une partie des animaux effectura un large panel de tests comportementaux (2 semaines avec un test par jour).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux seront : 1) la neurochirurgie pouvant induire une légère perte de poids post-chirurgicale. 2) La chirurgie d’implantation du dispositif protégeant les neurones pouvant induire une légère perte de poids post-chirurgicale. 3) Les modèles de rats parkinsoniens qui induisent de légers symptômes moteurs et non-moteurs. 4) Les prélèvements sanguins nécessitant une période de récupération pour permettre aux rats de récupérer de la réduction légère du volume sanguin. 5) Un large panel de tests comportementaux sera effectué afin d’évaluer l’impact des modèles de rats parkinsoniens et l’effet bénéfique du dispositif protegeant les neurones pouvant induire un stress léger dû au déplacement des animaux vers les pièces expérimentales
Devenir
Une partie des animaux sera mise à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses ou à la fin de l'expérience planifiée. Le reste des animaux sont mis à mort par injection léthal de pentobarbital pour les expériences sans reveil de prélévements de sang.
Remplacement
Il n'existe pas de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent d'évaluer l'impact du modèle de rats parkinsoniens et du dispositif protégeant les neurones sur les différents marqueurs cellulaires et moléculaire caractéristiques de la maladie de Parkinson et du modèle de rats parkinsoniens et sur le comportement des animaux.
Réduction
Les analyses du cerveau vont nous permettre de mesurer le pourcentage de perte des neurones dans le cerveau, un score de performances lors des tests comportementaux, et des taux d’expression de marqueurs sanguins de la pathologie. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été estimé à l'aide d'une approche statistique. Les animaux seront testés en différentes sessions successives incluant une partie des rats de chaque groupe. Si les résultats sont suffisants pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres décrits précedemment, il ne sera pas nécessaire de tester la totalité des animaux.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation est prévue à l’arrivée des rats avant l’expérience. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec de la neurochirurgie de classe modérée effectuée sous anesthésie générale. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire, une injection d’un anesthésique local sera effectuée avant incision ainsi qu’une injection d'un anti-douleur avant la procédure chirurgicale puis toutes les 24 heures si l’état de l’animal le requiert. Suite à la chirurgie, les rats sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les modèles de rats parkinsoniens impliquent une perte de poids modérée lors de la première semaine post-chirurgicale. Les animaux auront accès à une nourriture hypercalorique et hydratée fournie par l’animalerie. Des injections sous-cutanées d’eau saline seront également réalisées pour favoriser l’hydratation et la récupération. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale. Les tests comportementaux seront effectués à raison d’un test par jour maximum afin de minimiser l'impact du déplacement des animaux dans les salles expérimentales. Afin de réduire le plus possible toute douleur ou détresse que les animaux pourraient ressentir, ils seront observés au moins une fois par jour par le personnel compétent impliqué dans la réalisation des procédures expérimentales et/ou dans l'application de ces procédures et/ou dans le soin des animaux. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des parties du cerveau connues pour dysfonctionner dans la maladie de Parkinson, ce qui peut être reproduit chez le rat. Les modèles de rats Parkinsoniens seront réalisés sur des rats jeunes adultes (environ 300g en début d’expérience) afin de travailler sur des systèmes cérébraux matures et stables qui resteront stables tout au long des procédures expérimentales proposées.
Phénotype et sensibilité des souris exprimant une mutation génétique sur le canal TRAAK
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune isolée une heure par jour pendant vingt-huit jours de tests. Un agent inflammatoire est injecté dans le coussinet plantaire, puis une source de chaleur infrarouge et une force mécanique croissante sont appliquées quatre fois sur chaque patte arrière, à deux minutes d'intervalle, pour mesurer le seuil à partir duquel l'animal retire sa patte. Ces souris portent une mutation qui reproduit un syndrome humain rare associant épilepsie, déficience intellectuelle et dysmorphie faciale, et le projet cherche à voir si elles en présentent les symptômes. Le bénéfice avancé, la mise au point d'antidouleurs activant le canal TRAAK, reste une hypothèse, quand la douleur infligée aux souris est le cœur du protocole.
Objectifs
Les canaux TRAAK sont des canaux potassiques exprimés dans le système nerveux. Chez la souris, ils ont été impliqués dans la perception de la chaleur et du froid. Chez l'homme, des mutations sur TRAAK sont liées à un syndrome neuro-développemental appelé FHEIG (pour F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). Deux mutations ont été identifiées dans ce syndrome qui causent une augmentation de l'activité du canal TRAAK. La mutation A173E chez la souris, équivalente à A172E chez l’homme, entraine également une forte augmentation du courant. Nous avons donc choisi cette mutation pour créer un modèle de souris de la maladie FHEIG. Deux types de souris seront produites dans cette étude, une souris TRAAK FHEIG dont le gène TRAAK est muté dans toutes les cellules et une souris dont le gène TRAAK est muté seulement dans les nocicepteurs (TRAAK FHEIG TRPV1). Le comportement général de ces souris sera étudié dans le but d'évaluer dans quelle mesure ces modèles animaux peuvent récapituler la pathologie humaine. Nous évaluerons aussi leur sensibilité à différents stimuli en conditions standards et en conditions inflammatoires. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre le phénotype des patients atteints du syndrome FHEIG. Elle permettra aussi de déterminer si l’activation des canaux TRAAK dans les neurones sensoriels peut réguler le niveau de perception de la douleur dans le but d’envisager le développement d’activateurs de TRAAK comme traitement possible de la douleur.
Bénéfices attendus
Cette étude a un double intérêt à la fois pour la recherche fondamentale et translationnelle. En effet, il s’agit du premier modèle de souris de la pathologie humaine FHEIG. Cette pathologie est rare mais sévère et les symptomes sont très invalidants (F=dysmorphisme facial, H=hypertrichose, E=épilepsie, I=déficience intellectuelle/retard de développement et G=croissance gingivale). L’étude du phénotype de cette souris devrait nous permettre de savoir si le modèle animal récapitule tout ou une partie des symptomes humains. Si c’est le cas, il devrait permettre de mieux comprendre la maladie et d’envisager de tester des traitements potentiels. L’autre bénéfice concerne la compréhension des voies de la sensibilité à la douleur. En effet, s’il s’avère que l’activation du canal TRAAK au niveau des nocicepteurs peut diminuer la perception douloureuse chez la souris, la recherche d’activateurs pharmacologiques de TRAAK pourra être envisagée pour le traitement de la douleur.
Procédures
Pour une partie des animaux : isolement pour habituation dans la cage d'observation (45 min, aucun geste), puis injection intra plantaire unique puis remise en cage isolée pour observation (dure totale de la procédure : 1h45). Pour une autre partie des animaux : 2 testes réalisées en alternance séparés de 24h (durée totale de la procédure 28 jours) 1er test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de chaleur infra rouge avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. 2e test : injection intra plantaire unique d'agent inflammatoire puis application de force mécanique avec possibilité d'échappement/libre de ses mouvements, 4 fois sur chaque coussinet des 2 pattes arrière. Chaque mesure est espacée de 2 minutes minimum. Les injections unique intraplantaires seront réalisées en quelques secondes dans le coussinet de la patte de chaque animal. Chaque jour les animaux seront placés dans cages en plaxiglass et seront donc isolés 1h par jour, tous les jours, durant les tests mécaniques et thermiques.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter des signes de douleur spontanée notamment au niveau de la patte enflammée après injection des produits irritants. Dans certaines situations d'hébergement individuel ou d'isolement expérimental les animaux pourront également présenter des signes de stress, une mobilité réduite ou des stéréotypies, mais ils ne présenteront pas de comportements douloureux spontanés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer leurs organes pour des analyses histologiques, biochimiques et génomiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans la continuité des recherches déjà menées au laboratoire et vise à identifier de nouveaux acteurs importants dans les voies de la douleur. Il permettra également de mieux comprendre certains syndromes neurodéveloppementaux liés à un dysfonctionnement des canaux potassiques. Il n’existe pas d’alternative à l’expérimentation animale pour déterminer la sensibilité douloureuse. C’est un phénomène physiologique complexe impliquant plusieurs types de fibres sensorielles et fait intervenir très certainement plusieurs types cellulaires en interaction. Des études histologiques ont déjà été réalisées pour montrer l’expression des protéines d’intérêts dans les structures impliquées dans le contrôle de la douleur et des tests génétiques chez l’homme ont identifié des mutations spécifiques sur ces protéines dans une pathologie. Des expériences ex-vivo seront réalisées à partir des tissus et des cellules prélevées chez ces souris mais qui viendront compléter notre étude et en aucun cas se substituer aux tests sur animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques pour développer de nouveaux analgésiques.
Réduction
Nous avons pris plusieurs mesures de réduction du nombre d'animaux. Tout d’abord, le nombre d'animaux maximum a été défini par une analyse données statistiques. Puis, tous les animaux mis à mort à la fin de chaque procédure serviront également au prélèvements de leurs organes pour analyse, nous nous limitons à analyser les organes des animaux testés et nous n'utiliserons donc pas d'autres animaux pour ces analyses. Nous avons également conçu nos procédures de manière à utiliser le moins d'animaux possibles, nous utiliserons notamment les mêmes animaux pour différentes procédures divisant ainsi par 2 le nombre d'animaux.
Raffinement
Nous avons défini et mettrons en place de points limites précis précoces et adaptés pour chaque procédure afin de garantir une prise en charge adéquate des animaux en cas de souffrance/douleur ou inconfort. Plusieurs facteurs sont susceptibles de moduler la sensibilité, c’est pourquoi une attention particulière sera apportée à l’hébergement et au bien-être des animaux tout au long de leur vie. Les animaux sont hébergés à cinq par cage, dans des cages mis sur portoirs ventilés avec enrichissement adéquat, nourriture et boisson ad libitum et seront suivi tous les jours. Un des principaux enjeux sera de diminuer le niveau de stress des animaux, afin d’améliorer les conditions de vie des animaux et de maitriser les acteurs pouvant influencer la sensibilité. En cela, les animaux seront habitués plusieurs fois aux environnement des tests pour diminuer le stress des animaux aux nouveaux environnements. Nous avons également concu des procédures les plus courtes possibles pour étudier la douleur inflammatoire.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce constitue le meilleur modèle pour notre étude car les caractéristiques des souris de la souche utilisée sont largement documentées. La souris possède également une reproductibilité rapide et fiable, constituant un atout pour développer efficacement notre projet. Les tests de sensibilité sont bien adaptés pour les souris et suffisamment documentés. Nous possédons déjà les souris génétiquement modifiées indispensables à notre étude. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 12 semaines. Ce choix est motivé par la volonté de nous soustraire des variations dues aux processus développementaux ou liés au vieillissement.
Étude de l’impact d’une exposition chimique aux composés organophosphorés sur l’unité neuro-vasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une perte de poids de plus de 15 % ou un score supérieur à 7 sur l'échelle de grimace déclenche la mise à mort. 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. La moitié d'entre elles reçoit une prothèse crânienne posée en quarante-cinq minutes, puis toutes sont intoxiquées par un composé organophosphoré et passent une à trois heures par séance sous IRM ou imagerie ultrasonore. Le porteur indique que l'intoxication peut provoquer fasciculations, mâchouillements, chute du tonus musculaire, tremblements généralisés et mort, et présente ces travaux comme une réponse à la menace des armes chimiques et aux 300 000 décès annuels par pesticides.
Objectifs
Bien que très réglementée, l’utilisation de composés organophosphorés (OPs) est courante dans l’agriculture où sont utilisés des pesticides tels que le chlorpyrifos. L’incidence d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides OPs est associée à près de 300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés. Plus inquiétant, l’utilisation en 2017 d’armes de guerres neurotoxiques contenant des OsP (Sarin en Syrie et VX en Malaisie), démontre une menace toujours actuelle pour les populations civile et militaire. Sur le plan physiopathologique, l’intoxication aigue aux OP entraîne l’inhibition irréversible des cholinestérases augmentant la concentration d’acétylcholine dans l’ensemble de l’organisme ce qui conduit à une hyperactivité du système nerveux central (SNC) qui peut engendrer des œdèmes cérébraux, de la neurodégénérescence et des crises épileptiques voir la mort. Si le traitement d’urgence permet de stabiliser les victimes, son efficacité au niveau du SNC est limitée. De plus certaines victimes peuvent être exposées à de faibles doses d’OPs sans présenter les symptômes de la phase aigue mais présentent des déficits cognitifs à long terme. Très peu d’études se sont intéressées aux effets des faibles doses sur le système neurovasculaire. Ainsi, ce projet vise à mieux comprendre l’impact d’une intoxication aux OPs au sein de l’unité neurovasculaire (UNV) à court et moyen terme. De plus, améliorer nos connaissances sur ce domaine nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées sur la physiopathologie des intoxications aux composés organophosphorés. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Procédures
(Souris Mus musculus ; n=460) : Modèle d’intoxication - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation de l’inflammation cérébrale et de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par imagerie par résonnance magnétique (IRM) (durée : 1h/mesure). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie Doppler et functional ultrason imaging (fUS) sous anesthésie (durée : 1h/mesure). (Souris Mus musculus ; n=460 ) : Modèle d’intoxication vigile - Pose de prothèse crânienne/récupération (durée : 45min). - Induction de l’intoxication +/- traitements (durée : 1h). - Evaluation des conséquences fonctionnelles par imagerie fUS vigile (durée : 1-3h/mesure).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. De plus, l’intoxication aux organophosphorés est susceptible d’induire des symptômes caractéristiques tels que : l'arrêt d’activité, des fasciculations (contractions involontaires des muscles), mâchouillements/bâillements, chute du tonus musculaire, dos vouté, tremblements généralisés allant jusqu’à la mort de l’animal.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées concernant la physiopathologie d’une intoxication aux OPs.
Réduction
Avant de procéder à une telle étude, une approche statistique a été réalisée afin de s’assurer d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. De plus, des méthodes d’études non-invasives telle que l’imagerie (IRM, fUS…) sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes (type IV. La nourriture, la boisson et la litière sont changés une fois par semaine. Néanmoins, ces changements pourront être effectués plus fréquemment si nécessaire. De plus, une maison en carton et des produits nécessaires à la nidification seront placés dans les cages des animaux. La litière et les enrichissements du milieu d'hébergement des animaux permettront de réduire leur stress et de faciliter leur thermorégulation. Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies diagnostiques et de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour non seulement étudier les effets de l’intoxication aux composés organophosphorés sur le SNC mais également pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 10 semaines et auront un poids compris entre 35 et 40g lors de l’intoxication. Nous choisissons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer les données existantes au laboratoire et dans la littérature, puisque le modèle d’intoxication au NIMP a été développé chez des animaux ayant un stade de développement identique.
Neurobiologie de la balance énergétique entre l’activité physique et la prise alimentaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin des expériences comportementales pour des analyses histologiques de leurs tissus, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est isolée en cage individuelle dès huit semaines, pour six à sept semaines dans le cas de 1 224 d'entre elles, et 1 176 subissent trois jours de restriction alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids. 576 souris reçoivent en plus une chirurgie d'injection intracérébrale d'environ quatre-vingt-dix minutes. Le porteur reconnaît que l'absence d'interaction sociale peut être une source de stress, tout en présentant l'isolement comme la condition pour mesurer la prise alimentaire individuelle et pour éviter les bagarres "fréquentes chez les souris mutantes", et conclut que ses études comportementales ne sont pas aversives.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouvelles données concernant les mécanismes qui régulent la balance énergétique ainsi que les processus motivationnels pour des récompenses naturelles. Ce projet permettra de disséquer les circuits impliqués dans la motivation pour l'exercice physique et d’étudier des cibles potentielles dans le traitement des troubles alimentaires (obésité, anorexie).
Bénéfices attendus
Ce projet vise une meilleure compréhension de la régulation de la balance énergétique d’un point de vue motivationnel et des circuits jouant un rôle dans ce mécanisme. L’utilisation de notre modèle comportemental permettra d’approfondir les connaissances au sujet de la neurobiologie des troubles alimentaires (anorexie, obésité). A long terme, ces données pourront être utilisées pour investiguer les cibles potentielles dans le traitement de ces troubles alimentaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à : (1)Hébergement individuel : cette condition concernera tous les animaux (1368). La durée de l’isolement sera de 6 à 7 semaines pour 1224 animaux et de 1,5 semaines pour 144 animaux. (2)Chirurgie pour injection intracérébrale : cette intervention concernera les animaux des procédures 1 et 3 : 576 animaux. La durée de ces chirurgies sera d’environ 90 min. (3)Injection sous cutanée : Les animaux ayant reçu des chirurgies pour injection intracérébrale (576 animaux) recevront 2 injections sous cutanée (analgésique et anesthésique local au niveau du crâne). Dans la procédure 4, 144 animaux recevront 1 injection (injection de micropuces permettant d’identifier les différents animaux). (4)Injection intra-péritonéale : ce geste concernera tous les animaux ayant reçu une chirurgie, soit 576 animaux. Les animaux recevront 4 injections d’analgésique (1 durant la chirurgie et 3 en post-opératoire). 192 animaux parmi ces animaux recevront aussi 2 injections durant l’étude comportementale. (5)Test comportemental : tous les animaux de cette étude seront concernés, soit 1368 animaux. Cette étude va durer 2 semaines pour les 192 animaux de la procédure 1 et 3,5 semaines pour les 1176 animaux des autres procédures. (6)Restriction alimentaire : Cette restriction sera de 3 jours et correspond au maintien à 90% de leur poids initial. Elle concernera les animaux des procédures 2, 3 et 4, soit 1176 animaux.
Impact sur les animaux
Les différents tests utilisés dans ce projet nécessitent de pouvoir étudier la prise alimentaire individuelle des souris. Celles-ci seront donc hébergées de manière individuelle dès l'âge de 8 semaines et ce jusqu'à la fin des procédures. Cette absence d’interaction sociale peut être une source de stress pour les animaux. Les injections avant les tests comportementaux peut également entrainer une douleur. Afin de diminuer la gêne engendrée par ces injections, le côté de l'animal qui sera injecté sera interverti chaque jour. La restriction alimentaire, permettant de faciliter l’apprentissage des animaux, pourrait entrainer une perte de poids supérieure à 15%. Dans ce cas, la restriction serait immédiatement arrêtée. Cependant, cette restriction ne devrait théoriquement pas entrainer cet effet indésirable parce qu’elle sera limitée à 3 jours. L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Les traitements médicamenteux, les injections intrapéritonéales, et produits utilisés (et les doses) sont bien contrôlés en laboratoire et tolérés par les animaux.
Devenir
Les animaux de toutes les procédures seront mis à mort à la fin des expériences comportementales et des tissus seront récupérés pour procéder à des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico. De plus l'utilisation d'invertébrés, serait incompatible avec l'étude de la motivation pour une récompense telle que l'activité physique ou la prise alimentaire.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux à inclure sera de 12/groupe. Ce nombre d’animaux/groupe a été fixé (1) en utilisant des calculs de puissance nous permettant d’obtenir une différence significative pour les différentes variables d’intérêt qui seront évaluées dans l’étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (2) en se référant à des publications du domaine (3) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. Nous utiliserons 2 cohortes d'animaux (n=12/groupe/cohorte) afin de valider la reproductibilité des résultats. Nous avons regroupé dans la mesure du possible différents tests comportementaux sur les mêmes lots de souris, et avons conçus nos expériences de manière à obtenir un maximum d'informations à partir des mêmes animaux.
Raffinement
Pour le raffinement, plusieurs précautions seront prises en compte. Les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour contrôler la consommation de nourriture et pour éviter les bagarres, fréquentes chez les souris mutantes. Les cages d’hébergement des souris seront enrichies en matériel de nidification (7 carrés de cellulose), ainsi que d’un morceau de bois à ronger et d’un tunnel en carton (comme prévu par la directive 2010/63/CE). Durant les études comportementales, les animaux seront manipulés grâce au tunnel en carton présent dans leur cage d’hébergement afin d’éviter la préhension par la queue. Les animaux, vivant dans les chambres opérantes, auront du nid provenant de leur cage d’hébergement, ainsi qu’un abri/jouet. Les chirurgies intracérébrales seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux recevront un traitement analgésique. Suite à la chirurgie, chaque animal est suivi quotidiennement (poids, prise alimentaire, aspect général) et une étiquette est accrochée au dos de sa carte de cage individuelle pour le personnel animalier, avec l’ensemble des informations concernant son suivi post-opératoire sur une semaine. Des points limites ont été définis par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, nous préviendrons immédiatement la vétérinaire de l’établissement afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (comme la poursuite du traitement analgésique). En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort par dislocation cervicale afin de lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions pas soulager. Nos études comportementales ne sont pas aversives, nous ne devrons donc en théorie jamais atteindre ce point limite.
Choix des espèces
1) Ce projet nécessite l’utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement chez les modèles de souris. 2) Reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Des modèles animaux moins évolués (par exemple, ver C. elegans ou poisson zèbre) ne peuvent convenir pour nos observations comportementales (course et prise alimentaires). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) qui se justifie par l’immaturité du système nerveux au cours de l’adolescence.
Rôle de l’activité d’une protéine membranaire dans un modèle épileptique chez la souris. 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux injections dès le premier jour après la naissance, une biopsie avant le sevrage, quinze injections de traitements entre le dixième et le vingt-cinquième jour, puis deux chirurgies à l'âge adulte dont une sans réveil. 2 605 souris vont être utilisées dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le modèle repose sur la modification d'un canal ionique dans le cerveau pour provoquer des crises d'épilepsie et étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur justifie son effectif par un calcul donnant six individus par groupe, sans dire comment on passe de six à 2 605, et n'annonce comme atteintes que la "survenue de crises d'épilepsies" et des "irritations dues aux injections répétées", alors qu'une partie des procédures est classée en souffrance sévère.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs d'un canal modifié dans le cerveau. Ces modèles nous permettront de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement du cerveau et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
-2 injections chez le nouveau-né à P1 (2 min) -biopsies avant le sevrage à P21 (10 secondes) -15 injections de traitements pharmacologiques entre P10 et P25 (3 minutes) -chirurgie pour installation d’un transmetteur de 30 min à l’âge adulte -chirurgie sans réveil de 10 minutes à l’âge adulte
Impact sur les animaux
-survenue de crises d’épilepsies -irritations dues aux injections répétées
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus.
Remplacement
Le développement du cerveau et l’épilepsie sont des processus biologiques complexes où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes et le système immunitaire.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. En se basant sur les résultats de la litterature et notre expérience au laboratoire nous avons calculé que n=6 individus par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats exploitables et signitificatifs.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres formés et qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie ainsi que les weekends par les personnes d'astreinte. Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet formés aux gestes tiendront une fiche d’observation des points limites au cours de la procédure. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. Pendant les différentes chirurgies, les animaux seront sous anesthésie générale avec analgésie.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérêt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans; 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.