Système nerveux
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Étude du rôle des comorbidités liées au vieillissement dans la réparation post ischémique dans un modèle de souris d’accident vasculaire cérébral (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois de régime gras destiné à induire un surpoids, elles subissent un test d'intolérance au glucose par injection, puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt-et-un jours. Le porteur indique attendre une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une perte de poids et une déshydratation. L'objectif est de comprendre le rôle des comorbidités liées à l'âge dans l'AVC, le porteur justifiant le recours à l'animal par des mécanismes qui "ne peuvent s'envisager que dans un organisme entier".
Objectifs
Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).
Procédures
Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.
Impact sur les animaux
L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques
Remplacement
Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.
Etude des systèmes monoaminergiques chez un modèle de souris TS65Dn du syndrome de Down : implication de la modulation allostérique du récepteur aux cannabinoïdes CB1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
685 souris porteuses d'un modèle de trisomie 21 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections répétées par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée, jusqu'à cinq pour une partie d'entre elles, et sont hébergées en cage individuelle, source de stress que le porteur reconnaît. L'objectif est d'étudier la modulation d'un récepteur aux cannabinoïdes sur les réseaux de neurones, les pistes thérapeutiques annoncées restant qualifiées d'"inexplorées à ce jour". Sur le remplacement, le porteur indique avoir mené des analyses in silico et in vitro en amont, mais affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour l'étude de systèmes intégrés.
Objectifs
La trisomie 21 ou syndrome de Down est une maladie grave caractérisée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. La trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique affectant 60 millions de personnes dans le monde. Découvrir une thérapie pouvant atténuer les déficits intellectuels, notamment cognitifs, est donc un enjeu de santé publique. Le but de notre projet de recherche est d’ordre préclinique en utilisant un modèle animal. Des modèles du syndrome de Down ont été développés chez la souris et la lignée Ts65Dn est, à ce jour, la plus étudiée car ces souris ont une triplication de chromosomes (équivalent au chromosome 21), sont viables avec un développement non dommageable, et présentent des caractéristiques proches des symptômes observés chez les individus atteints de trisomie 21. Notamment, les souris Ts65Dn sont caractérisées par des déficits cognitifs (différents types de mémoire et apparition précoce de la maladie d’Alzheimer) et psychomoteurs. Des données scientifiques suggèrent un dysfonctionnement des réseaux de neurones chez les souris Ts65Dn et proposent des cibles potentielles pour le traitement des symptômes. L’objectif général de notre projet de recherche consiste donc à étudier les modifications des réseaux neuronaux chez les souris Ts65Dn présentant un syndrome de Down. Cette étude contribuera ainsi à mieux comprendre les mécanismes de régulation sur les réseaux de neurones dans le cadre la trisomie 21 afin d’identidier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
La trisomie 21 est une maladie génétique causée par la triplication de tout ou partie du chromosome 21. Elle se manifeste par différents symptômes dont les plus fréquents sont le retard mental et les déficiences cognitives. Des données issues de la littérature mettent en évidences de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de ces symptômes, bien qu’inexplorée à ce jour. En effet, une classes de composés pharmaceutiques sont capables d’inverser certains déficits d’apprentissage chez les souris trisomiques. Ce projet consistera ici à produire une meilleure connaissance des mécanismes fondamentaux sous-tendant la régulation des réseaux monoaminergiques par les récepteurs CB1 dans le cadre du syndrome de Down.
Procédures
L’ensemble des gestes techniques décrits ci-après sera réalisé par une personne compétente formée à l’expérimentation animale et aux gestes techniques, qui sera sous la responsabilité du porteur de projet et sera en contact régulier avec le personnel zootechnique de l’animalerie d’expérimentation et les responsables du bien-être animal. Dans ce projet, 400 animaux recevront une seule injection au cours de la procédure et 160 autres animaux recevront un total de 5 injections : une injection quoditienne pendant 4 jours puis une dernière injection 24h après ou 4 semaines après pour induire une anesthésie générale. Ces injections seront réalisées sur animal vigiles dans la limite des volumes d’injections préconisés pour la taille et l’espèce des animaux. La durée du geste technique pour effectuer une injection est d'environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’administration des substances par voie intra-péritonéale et sous cutanée, ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Des nuisances pourraient survenir à la mise en cage individuelle des animaux en raison du stress lié à l'hébergement individuel
Devenir
Au cours de ce projet tous les animaux seront mis à mort pour le prélèvement du cerveau afin de réaliser des analyses ex vivo immunohistochimique ultérieures.
Remplacement
Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Des analyses in silico nous ont permis d’identifier le site de fixation allostérique de la pregnenolone sur le récepteur CB1. De plus, des études in vitro ont permis de montrer l’effet régulateur de la PREG sur le récepteur CB1. Ce projet s’applique maintenant à l’étude de systèmes intégrés qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal. En effet, il n’existe actuellement pas de modèle in vitro et donc de méthode alternative à l’utilisation des animaux. De plus, l’organisation du système nerveux central de la souris est assez proche de celle de l’homme, ce qui permettra une extrapolation à l’homme des résultats obtenus dans le projet de recherche.
Réduction
Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécéssaire pour les prélèvements et analyses ex vivo, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets traitement. Enfin, les études réalisées au cours du projet précédent et une connaissance accrue de la bilbiographie sur la pregnénolone et le récepteur CB1 nous permet de proposer des groupes expérimentaux pertinants avec des conditions témoins appropriées.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et ce dès leur réception. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur réception, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Les animaux seront alors placés dans des cages individuelles transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. La mise en cage individuelle est ici nécéssaire afin de minimiser l’impact potentiel de la hierarchie sociale sur le phénotype des et afin de reproduire les conditions d’hébergement dans le projet précédent. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie. Le cas échéant, un enrichissement supplémentaire pourra être apporté dans les cages d’hébergement afin d’optimiser le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de trisomie 21 chez la souris Ts65Dn est très bien caractérisé dans la littérature et représente le modèle de choix pour les études d’efficacité préclinique. En effet, c’est un des modèles génétiques les plus largement utilisés du syndrome de Down car les souris Ts65Dn sont trisomiques pour environ 2/3 des gènes orthologues au chromosome 21 humain. Ces souris triploïdes présentent les avantages d’être viables, d’avoir un développement non dommageable et d’exprimer plusieurs phénotypes qui reproduisent les symptômes des individus trisomiques, comme des déficits d'apprentissage et de mémoire; et elles développent précocement les signes pathologiques de la maladie d'Alzheimer. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie) présentant des déficits cognitifs d'apprentissage et de mémoire et avant le développement de signes pathologiques précoces comme la maladie d'Alzheimer.
Ciblage thérapeutique des cellules gliales dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modifiées génétiquement pour modéliser la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des injections sous anesthésie, passent six tests de comportement mesurant l'anxiété, l'anhédonie, la sociabilité, l'apprentissage et la mémoire, et subissent pour certaines un prélèvement de liquide céphalo-rachidien et de sang avant mise à mort. Le porteur vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines des cellules gliales, mais les retombées pour les 900 000 personnes concernées restent renvoyées à un horizon lointain. Sur le remplacement, il affirme que les interactions entre neurones et cellules gliales ne sont pas reproduites in vitro et conclut à la nécessité de comparer ces régions sur l'"organe entier".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative encore incurable, et dont l'apparition semble liée à des phénomènes d’inflammation dans le cerveau auquel participent les cellules gliales (astrocytes et microglies), qui sont des partenaires essentiels aux neurones. Ce projet vise à évaluer le bénéfice thérapeutique de deux protéines exprimées par les cellules gliales à des stades différents du développement de la MA, l’une étant exprimée lors de la phase précoce de la MA, l’autre ayant un rôle dans l’inflammation observée lors de la MA. La première protéine ciblée est exprimée à la surface des cellules microgliales, les cellules immunitaires du cerveau, c’est un récepteur microglial. La deuxième protéine ciblée est exprimée par les astrocytes. Ce projet cherche à évaluer l’impact d’une part de la perte d’expression du récepteur microglial et d’autre part de la surexpression de la protéine astrocytaire sur le comportement, et les atteintes affectant les tissus et organes, dans un modèle souris de la MA. L’objectif est de prévenir et ralentir le développement de certains symptômes comportementaux, déficits de la mémoire et altérations des cellules et du cerveau observés chez les personnes atteintes de la MA.
Bénéfices attendus
La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un problème sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les cellules gliales assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA. Cibler ces cellules pour les rendre plus bénéfiques aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Cette étude préclinique dans un modèle souris de la MA à de multiples niveaux (biochimique, cellulaire, tissulaire, comportemental), permettra d’établir le bénéfice thérapeutique à cibler les cellules gliales pour la MA.
Procédures
Certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de cinq minutes et seront analysées quatre mois plus tard par des tests de comportement. Certaines souris passeront six tests de comportement à deux âges espacés de 3 mois. Ces tests visent à évaluer l’anxiété, l’anhédonie (incapacité à ressentir le plaisir), la sociabilité, l’apprentissage et la mémoire des souris, ils durent entre cinq minutes et une heure chacun et seront réalisés sur six semaines en laissant deux-trois jours de repos entre chaque test. Enfin, toutes les souris seront euthanasiées par une méthode validée pour la réalisation d’une analyse post-mortem histologique ou biochimique. Certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalo rachidien et de sang sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de trente minutes maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux utilisés sont une douleur limitée (en intensité et dans le temps) liée à l’injection intraperitonéale avant l’euthanasie ou l’injection intraveineuse sous anesthésie, ainsi que le stress lié à la contention et des tests comportementaux. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. Le stress sera réduit au minimum par l’habituation à l’expérimentateur avant chaque session de comportement. La douleur lors des prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang et avant perfusion sera pris en charge par la mise en place de procédures d’analgésie et d’anesthésie adaptées. Les changements comportementaux liés à la modélisation de la MA (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportement habituels…
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la MA) et les cellules gliales partenaires. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus la vulnérabilité de certaines régions cérébrales (ici préfrontal cortex et hippocampe) nécessite de comparer sur l’organe entier ces différentes régions qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduite in vitro dans toute leur complexité. Les souris utilisées dans ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes-cellules microgliales dans le contexte génétique de la MA. Elles reproduisent le phénomène d’agrégation de peptides amyloïdes et différents symptômes histologiques, biochimiques et cognitifs caractéristiques de la MA.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 224 souris nées dans une animalerie agrée ou dans notre élevage. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par exemple certaines souris auront une analyse sanguine et du liquide céphalorachidien ainsi qu’une évaluation histologique complète de plusieurs régions du cerveau avec quantification de plusieurs paramètres par souris. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Des points limites sont établis pour chaque procédure, pour lesquels les souris seront euthanasiées. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à l’expérimentateur avant chacune des sessions de tests comportementaux permet de réduire le stress des souris à la manipulation. Un soutien thermique sera mis en place lors des anesthésies.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et cellules gliales ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la MA, utilisées pour ce projet, permettent d’étudier les interactions neurones-cellules gliales dans le contexte génétique de la MA. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de MA. La MA est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques et biochimiques, ainsi que les altérations du comportement apparaissant dans ce modèle de la MA vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 6 et 10.5 mois en fonction de l’évolution des symptômes analysés.
Etude du rôle des récepteurs nicotiniques dans un ensemble de processus cognitifs altérés au cours de plusieurs pathologies neuropsychiatriques et identifications des circuits neuronaux mis en jeu
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1866 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ils subissent pendant des mois des tests comportementaux quotidiens, une restriction alimentaire, des tests d'anxiété et de locomotion, une chirurgie intracérébrale et des séances de contention forcée, pour étudier le rôle de récepteurs nicotiniques dans des troubles neuropsychiatriques. Le porteur qualifie les dommages de minimes en indiquant que les modèles employés n'induisent pas d'altération majeure de la santé. Il affirme que ces fonctions cognitives et émotionnelles ne peuvent s'étudier que sur des animaux au système nerveux entier et fonctionnel.
Objectifs
Un rôle important de certains récepteurs cellulaires a été mis en évidence par de nombreuses études dans un ensemble de pathologies neurologiques, neurodéveloppementales et psychiatriques, notamment dans les troubles cognitifs associés. L’objectif global du projet est de préciser ce rôle et d’identifier ses mécanismes sous-jacents qui ne sont pas encore élucidés, dans l’espoir d’ouvrir de nouvelles voies de recherche thérapeutique. Plus précisément les objectifs sont i) de mieux caractériser le rôle de deux sous-unités majeures d’un récepteur dans les processus cognitifs altérés au cours de différentes pathologies neuropsychiatriques, ii) de tester l’impact de molécules pharmacologiques agissant sur ces récepteurs sur certains de ces processus, et iii) d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans leurs mécanismes d’action, en utilisant des modèles précliniques présentant une forte valeur translationnelle.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des rôles de certains récepteurs aux neurotransmetteurs, exprimés dans différentes régions du cerveau, dans les fonctions cognitives impactées au cours de ces pathologies. De plus, ce projet devrait permettre d’identifier une étiologie commune potentielle à différents troubles neuropsychiatriques, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique. Grâce à l’implémentation de tests précliniques à forte valeur translationnelle, ce projet pourra ouvrir à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur des composés ciblant certains sous-types de récepteurs nicotiniques, tels que des modulateurs allostériques de ces récepteurs qui sont actuellement en voie de développement. Ce projet générera également des bases solides pour de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux quotidiens d’1h maximum par jour, pendant des mois, élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Ils seront également soumis, seulement une fois et pour 30 minutes maximum, à des tests d’anxiété et de locomotion, susceptibles d’entraîner un stress passager. Les animaux ne seront pas soumis à plus d’un test de comportement par jour. Les animaux seront soumis à une très légère restriction de nourriture pendant toute la durée de l’expérience mais ils auront accès à une récompense sucrée presque chaque jour, et l’eau sera laissée à volonté. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours de laquelle une infusion ou implantation intracérébrale sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales, ou infusions intracérébrales (qui dureront 3 minutes tout compris et auxquelles ils auront été progressivement habitués), de composés pharmacologiques, répétées maximum 9 fois par animal, avec au moins 3 jours d’écart entre chaque injection ou infusion. Enfin, certains animaux seront exposés à un stress de contention pendant 30 minutes pour un maximum de trois fois par animal avec une semaine d’écart entre chaque exposition.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests cognitifs. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour induire l’expression ectopique de gènes d’intérêt ou des symptômes de type neuropsychiatriques ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisis sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à une privation alimentaire légère, à un stress induit volontairement sur un temps court, ou à une chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les processus cognitifs associés à des pathologies neuropsychiatriques, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec un biostatisticien. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 15 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de rats sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront systématiquement prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des vérifications et mesures de marqueurs neurophysiologiques. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec des blocs de bois, et des tunnels en carton si un animal doit être isolé, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués au moins 30 min avant la chirurgie. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites. Des points limites sont identifiés et leur atteinte conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre ce projet). Le rat est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier des fonctions cognitives complexes et particulièrement pour des tests cognitifs basés sur la technologie dite ‘touchscreen’ et l'auto-administration de drogue sur une longue période qui présentent une forte valeur translationnelle. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la grande majorité (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement. Un groupe d’animaux sera utilisé ponctuellement dès une semaine après la naissance pour recevoir des injections d’un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau (une injection aux jours 7, 9 et 11), puis laissés sans manipulation jusqu’à l’âge adulte. Un groupe d’animaux sera exposé in utero à un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau à travers une injection réalisée chez la mère vers le milieu de la gestation.
Etude d’une surnutrition sur la neurogenèse constitutive et régénérative chez le modèle poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des lésions du cerveau sous anesthésie et des injections, pour étudier l'effet d'une surnutrition sur la formation et la réparation des neurones. Le porteur affirme une mortalité quasi nulle et l'absence de signe visible de souffrance après lésion. Il conclut que la complexité de la réparation cérébrale ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de mieux comprendre l'impact d'une surnutrition sur les mécanismes de neurogenèse (création de nouveaux neurones) en condition constitutive et régénérative (sans et avec lésions cérébrales). Pour cela, nous avons pour sous objectifs de comprendre : (1) l'impact de désordres métaboliques (obésité/prédiabète) sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la neuroinflammation et l'angiogenèse (création de nouveaux vaisseaux sanguins), (2) par quels mécanismes la surnutrition impacte la régulation des gènes modulant la création de nouveaux neurones), (3) et enfin d'étudier l'impact de la surnutrition sur les mécanismes de réparation cérébrale (mort cellulaire, angiogenèse et neurogenèse régénératives).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment un déséquilibre nutritif entrainant une obésité et une dérégulation de la glycémie peut avoir des répercussions sur la plasticité cérébrale et les mécanismes de réparation (mort cellulaire, angiogenèse, neurogenèse). En situation non lésée, nous pourrons mieux comprendre l'impact de la surnutrition sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la vascularisation cérébrale et sur la neuroinflammation du tissu. De plus, nous pourrons étudier l'expression de facteurs clés dans les mécanismes de neurogenèse, plasticité et vascularisation cérébrales en situation dite homéostatique (non lésée). En outre, un focus particulier sera fait sur les voies de signalisation Notch, Id1 et des glucocorticoïdes. En situation de lésion, nous pourrons comprendre comment les désordres métaboliques induits impacte les mécanismes de réparation cérébrale impliquant entre autres la mort cellulaire associée à la lésion, le recrutement des cellules microgliales et la création de nouveaux neurones. A termes, cela pourra permettre d'identifier des voies thérapeutiques d'intérêt pour contrecarrer les effets délétères de désordres métaboliques sur le cerveau mais aussi sur les mécanismes de réparation à la suite d'accidents vasculaires cérébraux ou de traumatismes crâniens.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions - lésions du télencéphale (mortalité inférieure 1%) - Injections intrapéritonéales
Impact sur les animaux
Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, et une couleur anormale ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Peu voire pas d'effets indésirables sont attendus dans ces modèles. Bien que la surnutrition puisse entrainer des diminutions de plasticité cérébrale et de locomotion, les animaux surnutris dans ces conditions expérimentales ne semblent pas présenter de stress particulier dans de tels temps d'étude De plus, les lésions du télencéphale réalisées sous anesthésie générale sont rapides (moins de 30s) et parfaitement maitrisées. La mortalité associée est quasi nulle . De plus, après lésion cérébrale sous anesthésie, le poisson est remis immédiatement dans l'eau et se réveille en moins de 1 à 2 minutes. Il ne présente visuellement aucun signe de souffrance, de séquelles visibles ou de stress (cités précédemment). Il est presque impossible à l'œil de distinguer un animal qui a subi une lésion d’un non lésé car aucun différence notable et significative de locomotion ou autres paramètres de nage n’est perçu. Pour voir de subtils changements, il est nécessaire de monitorer l'activité avec des équipements comportementaux très fins. Ceci s'explique aussi probablement par le fait que le cerveau n'est pas innervé d'un point de nociceptif. Aussi, les injections de BrdU en intrapéritonéale sont maitrisées et se font sous anesthésies du poisson dans de la tricaine (MS-222). Elles n'induisent pas d'effets indésirables.
Devenir
A l'issue finale du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié. Si jamais les résultats scientifiques sont suffisamment etayés ou si un problème survenait, la segmentation du projet en sous-expérimentations indépendantes nous permettra de réduire le nombre d'animaux et de les utiliser pour d'autres expérimentations.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la surnutrition (obésité/situation prédiabétique) sur les effets du cerveau ne sont pas modélisables in vitro. Des facteurs périphériques et centraux sont modulés et ont un impact sur l'homéostasie cérébrale. De plus, lors de la réparation cérébrale les mécanismes ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Chaque expérimentation sera scindée en des expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. A noter que chaque expérimentation sera menée sur des groupes de 20 poissons par condition (4 x 20 poissons nourris normalement et 4 x 20 poissons surnutris). Cette segmentation de l'expérimentation en 4 expérimentations indépendantes permettra de stopper l'expérimentation en cas d'une souffrance insoupçonnée ou de données scientifiques suffisamment étayées.
Raffinement
Les poissons seront maintenus dans des conditions optimales. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, une couleur anormale et/ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Chaque situation d'animal montrant des signes de souffrances sera rapportée au vétérinaire responsable de l'animalerie (ou responsables du bien-être animal) pour conseils ou directives de traitement approprié, en général sédation profonde et euthanasie.
Choix des espèces
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 pour cent de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement . C’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères Mâles et femelles : à part égale afin d'avoir une meilleure appréciation des effets observées chez les mâles et femelles et étudier d'éventuels dimorphismes sexuels. Les animaux auront le même âge au sein d'un groupe contrôle et traité.
Elevage de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
6000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour gérer un élevage de souris génétiquement altérées. Chaque animal subit sous anesthésie un prélèvement au bout de la queue ou de l'oreille pour son génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype voulu sont versées en continu dans d'autres projets et que celles au génotype non requis sont mises à mort ou réutilisées. Il présente cet élevage comme une "réduction" du nombre d'animaux, tout en programmant le génotypage de 6000 individus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la caractérisation génétique des rongeurs (souris) dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés. L'élevage est réalisé par une plateforme au service des activités de recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques comme modèle expérimental dans le domaine des neurosciences, de la physiologie, la compréhension de la réponse immunitaire dans certaines pathologies humaines ou encore dans les mécanismes liés au développement de cancers. Certains de ces projets sont amenés à utiliser des animaux génétiquement altérés (génétiquement modifiées ou avec des mutations spontanées) en l'absence de solutions alternatives disponibles n'utilisant pas d'animaux. L'élevage des animaux génétiquement modifiés nécessite la détermination de la constitution génétique (appelé génotype) de chaque individu par une amplification précise et localisée des séquences d’ADN modifiées à partir des cellules de tissu facilement accessible et avec une approche la moins invasive possible. Cette caractérisation précoce au moment du servage ou plus tardive des animaux nés sur site, est indispensable et contribue au respect de la règle des 3R, notamment en termes de réduction.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet repose sur la réduction du nombre d'animaux utilisées. La mise en place d'une procédure de caractérisation génétique fiable et reproductible permet: d'utiliser des individus avec un génotype défini et requis dans les projets scientifiques, de maitriser la production du nombre d'individus au strict minimum et la qualité génétique des animaux élevés sur site.
Procédures
un prélèvement tissulaire (extrémité de la queue ou pavillon de l'oreille de 2mm) sous anesthésie générale pour 6000 souris; durée inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront en utlisation continue dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées. Les individus ne possédant pas le génotype requis seront mis à mort ou seront réutilisés dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Les animaux élevés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Il n'existe pas non plus de technique in vitro ou in silico pour déterminer le génotype d'un animal sans prélèvement de son ADN contenu dans ses propres cellules. L'ADN est spécifique à chaque individu.
Réduction
La stratégie d'accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter la production d'animaux au strict minimum. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Selon les lignées et les projets, un certain nombre d’animaux n'ont pas le patrimoine génétique requis. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype. La réutilisation participe à la réduction du nombre d'animaux utilisés globalement pour les projets scientifiques. De plus, le génotypage en amont des projets et non pas à la fin des projets scientifiques participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une alternative non-invasive pour la récupération de cellules (prélèvement buccal) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables et reproductibles. Des techniques alternatives de biopsie non invasives n'ont pas permis à ce jour d'obtenir des résultats satisfaisants. Le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Pour les jeunes individus, ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue précocement, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisées dans l'animalerie. Ils font appel à des souris génétiquement modifiées. Pour les individus nécessitant une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage, ils sont âgés de 21 à 30 jours maximum. Pour les individus nécessitant un prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille, ils sont agés de plus de 6 semaines.
Etude de la toxicité neurorespiratoire d’un traitement antalgique seul ou en association chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'une sonde de télémétrie, des gavages et des injections, une partie recevant de la morphine pendant neuf jours, pour étudier la toxicité respiratoire de la gabapentine seule ou associée à des dépresseurs du système nerveux. Le porteur indique que ces molécules peuvent provoquer une sédation allant jusqu'au coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Il justifie l'étude par l'usage détourné croissant de la gabapentine et affirme que la fonction respiratoire intégrée ne peut être évaluée in vitro.
Objectifs
Notre objectif global est de mieux comprendre les besoins non satisfaits des personnes atteintes de cancer et souffrant de douleurs chroniques neuropathiques, ainsi que les mécanismes de toxicité liés à la surconsommation ou à l’association des traitements habituellement utilisés (dont les gabapentinoïdes). Du fait de l’augmentation du taux de prescription de la gabapentine, notamment pour les douleurs neuropathiques, et de son usage illicite dans le monde et surtout aux Etats-Unis, ainsi que la tendance émergente de son association aux dépresseurs du système nerveux central, les inquiétudes sont de plus en plus grandes vis-à-vis de sa toxicité et de ses mécanismes. Même à doses thérapeutiques, les effets respiratoires de ces composés associés représentent un risque important pour les utilisateurs pouvant même aller jusqu’à engager leur pronostic vital. Les objectifs de notre étude sont ainsi de caractériser par une approche préclinique chez le rat, les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de gabapentine seule, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique. Et dans un second temps, d’évaluer le potentiel de la gabapentine vis-à-vis d’une levée de la tolérance respiratoire suite à une administration prolongée d’opioïdes. La tolérance respiratoire est un processus d’adaptation de l’organisme caractérisé par une diminution des effets respiratoires produits par la même dose d’opioïde après un usage prolongé. La levée de tolérance respiratoire induit par la gabapentine pourrait donc expliquer la toxicité de ce traitement.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité et les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de la gabapentine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre les gabapentinoïdes et les psychotropes étudiés que l’on retrouvent de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients souffrants de douleurs chroniques neuropathiques et plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi alerter, prévenir et proposer des stratégies de prise en charge de ces effets toxiques ayant des conséquences potentiellement fatales.
Procédures
Pour les animaux inclus dans l'une des 4 procédures: Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie (2 injections de chacune 5-10 secondes) + chirurgie (20 à 30 mins) + administration par gavage de molécule (1 gavage; 30 secondes – 1 minute) et 1 injection sous-cutanée de substances (1 injection : 5 -10 secondes). De plus, pour les animaux de la procédure 2 : prélèvements de sang (23 prélèvements ; 1 prélèvement durant 30 secondes). Les animaux de la procédure 4 seront soumis en plus à : Injections intrapéritonéales de morphine (2 injections/jour pour 9 jours, soit 18 injections durant chacune entre 5-10 secondes)
Impact sur les animaux
On s’attend à la suite de l’administration des différentes molécules à des effets indésirables pouvant aller d’une légère sédation jusqu’à un coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Les injections et les prélèvements sanguins induisent une douleur légère. Un stress lié au gavage avec risque de fausse route, quoi que rare, est à prendre en compte. De plus, suite à la chirurgie permettant l’implantation la sonde de télémétrie pour la procédure d’électromyographie, les rats seront hébergés en cage individuelle jusqu’à récupération post-chirurgicale complète pouvant être à l’origine d’un certain stress.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite requérant la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique de la fonction respiratoire intégrée sur animal entier ainsi que de la pharmacocinétique dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux (6 animaux/groupe) a été prédéterminés à l’aide de tests de puissance afin de permettre l’analyse des résultats entre les différents groupes expérimentaux en utilisant un test non paramétriques pour s’assurer de leur validité et l’atteinte du seuil de significativité fixé à 5%. De plus, à l’aide d’une technique de dosage sur microprélèvements, les prélèvements sanguins pour la mesure des gaz du sang artériel et la pharmacocinétique s’effectueront sur le même animal. Enfin, en cas de l’absence d’effets ventilatoires significatifs suite à l’administration concomitante de certains traitements en pléthysmographie corps-entier, ces associations médicamenteuses ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant des bâtonnets et des bandelettes de papier kraft à titre d’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.
Choix des espèces
Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est le modèle de référence dans le domaine de la toxicité respiratoire, notamment du fait de sa physiologie respiratoire qui est très proche de la physiologie humaine. De plus, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera les études pharmacocinétiques. Des rats âgés de 6 à 9 semaines seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec les expériences déjà faites au sein du laboratoire et les articles publiés dans la littérature, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances.
Décryptage du rôle des récepteurs à un facteur de guidage axonal au cours du développement du système nerveux central.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1755 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail porte sur des embryons pour étudier le rôle de récepteurs d'un facteur de guidage neuronal, les femelles gestantes recevant une injection destinée à bloquer l'action d'hormones sexuelles et les animaux étant identifiés par prélèvement d'un fragment d'oreille. Le porteur affirme que ces souris génétiquement modifiées ne développeront pas de douleur, ce qui contraste avec la gravité modérée déclarée pour l'ensemble. Il conclut que la complexité du développement cérébral ne peut être reproduite in vitro et que la souris partage 98 % de son patrimoine génétique avec l'humain.
Objectifs
Dans le monde animal, la plupart des espèces possèdent un axe de symétrie avec des extrémités avant/arrière et des faces ventrale/dorsale. Le système nerveux central (SNC) de ces espèces est composé de 2 hémisphères qui sont reliés par des neurones particuliers, les neurones commissuraux. Ces neurones projettent leur fibre sur des neurones cibles situés du côté opposé. Au début du XXième siècle, S. Ramon y Cajal avait déjà décrit en détail ces connexions reliant les deux moitiés du cerveau, et observé que les fibres nerveuses croissent en direction d’une structure ventrale et médiane, la plaque du plancher. Des études biochimiques ont identifié la protéine responsable de cette croissance. Enfin, des études ultérieures identifièrent plusieurs récepteurs à ce facteur de guidage neuronal. Toutefois, ces études sont contradictoires et sont soumises à controverse. Ce projet vise à trancher définitivement quant aux rôles de ces différents récepteurs à l’aide de modèles murins permettant de « casser » spécifiquement des gènes avec un contrôle spatial (tissu spécifique) et temporel (au moment voulu).
Bénéfices attendus
Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle de différents récepteurs à un facteur de guidage neuronal pendant le développement du système nerveux central. Une meilleure compréhension des mécanismes développementaux impliqués dans la mise en place du système nerveux central pourrait faciliter la compréhension de troubles psychiatriques comme l’autisme ou l’épilepsie ou des problèmes moteurs (strabisme). En effet, ces pathologies sont associées à des défauts de connexions neuronales qui mettent en jeu les gènes étudiés dans ce projet.
Procédures
Tous les animaux seront marqués par la pose d'une bague auriculaire et un prélevement d'un bout d'oreille sera réalisé à l'aide d'un poinçon. Ce geste d'identifcation/genotypage est réalisé en moins de 10 secondes. Les femelles gestantes de la procédure 2 et 3 recevront une injection intrapéritonéale d’un produit dont l’activité prévient l’interaction entre des hormones sexuelles et leurs récepteurs.Il n’est pas connu de nuisances associées à ces injections et ce geste est bref (5 secondes). Pour les animaux de la procédure 1 seul un geste réalisé (identifaction/prélevement pour génotypage) et pour les animaux des procédure 2 et 3 un second geste est réalisé (injection intrapéritonnéale).
Impact sur les animaux
Les animaux génétiquement modifiés utilisé dans cette demande de projet ne développeront pas de problèmes pouvant être à l’origine de douleur. En effet, nous utilisons un système génétique permettant d’invalider spécifiquement les gènes étudiés dans un tissu et à un temps voulu. Ce modèle murin permet de définir la localisation où les gènes sont invalidés et le moment désiré. Il permet de contourner les problèmes associés à la perte total du gène
Devenir
Ils seront tous mis à mort pour analyse des tissus.
Remplacement
La compréhension du développement du système nerveux central ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du tissu cérébral est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions cellulaires et de la communication intercellulaire. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.
Réduction
Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur une analyse en microscopie et ne fera pas intervenir de tests statistiques. Les tissus seront techniqués de manière à pouvoir analyser de nombreuses caractéristiques sur un individu. Les analyses ex vivo seront réalisées sur un nombre défini d’échantillons déterminé par l’utilisation d’un test de puissance statistique.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Les modèles murins utilisés dans cette demande de projet permettent un contrôle spatial et temporel de l’invalidation des gènes. Grâce à ces modèles génétiques, nous restreignons l’effet de la perte de ces gènes aux structures étudiées. De plus, les embryons sont analysés avant que les structures responsables de la douleur soient mises en place.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Nous travaillerons sur les embryons car c’est à ce moment-là que le système nerveux central se développe.
Etude de la modification des membranes cellulaires dans la neuropathie toxique induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.
Objectifs
L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.
Procédures
Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).
Impact sur les animaux
L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).
Choix des espèces
Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.
Exploration des bases moléculaires de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections de tamoxifène, d'autres sont rendues obèses par un régime gras pendant quatre mois, avec des phases d'hébergement individuel, pour étudier l'inflammation cérébrale déclenchée par un repas gras. Le porteur qualifie l'obésité induite et l'isolement de nuisances sans "signes comportementaux" d'inconfort, en s'appuyant sur ses publications passées. Il affirme que la satiété et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, ou PIR) systémique est maintenant bien documentée mais ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. La PIR cérébrale n’est pas déclenchée par un repas équilibré standard. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas gras. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques futurs après consommation d’un repas hyperlipidique hypercalorique. Toutefois, les bases moléculaires de ce phénomène biologique sont encore totalement inconnues. Pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la PIR cérébrale et en comprendre les déterminants, nous allons étudier des souris transgéniques particulières permettant de recueillir des informations biologiques nouvelles, avec une très grande précision, au sein des cellules microgliales spécifiquement. Les animaux seront étudiés dans différentes phases prandiales : avant ou après un repas, et en fonction de la nature des repas consommés (standard ou gras), et en fonction de leur état métabolique (sain ou obèse). Après étude du comportement alimentaire, des analyses de biologie moléculaire seront faites post-mortem sur des biopsies cérébrales. Au total, 1850 souris seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur processus cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété. Ainsi ce projet qui apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
L’obtention de souris mutantes A nécessite un traitement au tamoxifène durant 5 jours par une injection péritonéale quotidienne à l’âge de 5 semaines. La procédure 1 implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours au maximum, afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées pendant les expériences afin de mesurer le poids corporel et en fin d’expérience afin d’anesthésier les animaux avant mise à mort. Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant la mise à mort sous sédation.
Impact sur les animaux
Le traitement par le tamoxifène des souris mutantes A peut induire des signes d’inconfort et de mal-être. Obésité nutritionnelle induite Les principales nuisances sont liées à la production de lots d’animaux obèses, dont l’obésité sera induite par exposition à un régime gras hypercalorique pendant 4 mois. Nous utilisons ce modèle depuis plus de 15 ans. Cela provoque une obésité associée chez certains individus à une résistance à l’insuline. Une accumulation de graisses ectopique peut être observée au niveau des muscles ou du foie. En revanche, il n’y a pas de signes particuliers comportementaux suggérant un inconfort, une douleur ou un mal-être. Hébergement individuel pendant 3 jours Pour assurer contrôler les prises alimentaires individuelles lors de ces études, les animaux seront placés en cage individuelle. Cette condition de vie imposée est brève et ne produit aucune gêne ni aucun changement hormonal visible, comme nous l’avons attesté et publié , mais reste un acte pouvant affecter le bien-être des souris. Contention et injection intrapéritonéale En fin d’expérience, la contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent des nuisances potentielles. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal , l'ensemble de la manipulation durera 5 minutes.
Devenir
Les 1850 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses de biologie moléculaire.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.
Raffinement
Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Pendant les expériences, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles à l’échelle d’un repas (induction des états prandiaux contrôlés sur 3 heures), une observation directe des animaux sera faite. L’induction des états prandiaux se fait en cohérence avec la physiologie des animaux (introduction des repas à l’extinction des lumières, en début de phase active).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.
Mise au point et utilisation d’un modèle expérimental d’inflammation cérébrale dans des souris immunodéficientes humanisées.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
358 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intraveineuses, une injection dans le cerveau et des injections répétées dans l'abdomen, ainsi que des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour analyser les organes touchés. Le porteur met au point un modèle d'inflammation cérébrale médiée par des lymphocytes humains, présenté comme une alternative à l'usage de primates. Il affirme que cette étude animale est "la seule" à pouvoir valider son hypothèse.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point un modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par des lymphocytes T humains. Une fois le modèle mis au point, nous pourrons questionner le rôle d’une autre population lymphocytaire présentant in vitro un caractère cytotoxique et que nous avons trouvé accumulé dans le sang, le liquide céphalorachidien et les zones inflammatoires de patients atteints de maladie neurodégénérative. In fine, nous évaluerons une thérapie à base d’anticorps pouvant spécifiquement cibler cette population lymphocytaire agressive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront doubles : (1) mise au point d’un nouveau modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par les lymphocytes T humains qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant particulièrement les cellules humaines. (2) évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant une population lymphocytaire exacerbant les signes d’inflammation cérébrale chez l’homme.
Procédures
Les souris anesthésiées seront injectées en intraveineuse (i.v.), cet acte est rapide (
Impact sur les animaux
Effet de l’injection en i.v. et de la prise de sang sur les souris=> stress lié à l’anesthésie. Effet de l’injection i.p. =>stress lié à la contention. Effet lié à l'induction de l'anesthésie profonde pour l’injection intracérébrale sur les souris => stress lié à la contention. Douleurs post-opératoires potentielles minorées par des antalgiques =>stress lié à la contention pour l'injection d'antalgiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cibles de la maladie induite.
Remplacement
In vitro, nous avons observé une accumulation de cellules immunitaires particulières dans des d’échantillons biologiques de patients atteints de sclérose en plaque (sang, liquide céphalorachidien, coupe de cerveau). Cette observation nous amène à émettre l'hypothèse qu’elles pourraient avoir un rôle délétère dans la maladie. Cette étude chez l’animal est la seule à pouvoir nous permettre de répondre à l’hypothèse dans sa complexité et à valider la stratégie thérapeutique envisagée sans avoir recours aux grands animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Deux études pilotes sont envisagées afin d'établir le protocole expériemental dans lequel seront évaluées nos hypothèses. Les procédures de cette DAP ne seront envisagées que si (1) les études pilotes sont validées et si (2) les GO/No GO inclus à la fin des expérimentations conduisent à des GO permettant de continuer l'étude pour vérifier les hypothèses. Enfin, les groupes ont été constitués grace au travail récent de scientifiques ayant présentés leurs résultats dans des journaux spécialisés et sujets à une évaluation par les paires. Les expériences pilotes et les GO/No GO permettront ainsi de réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur un certain nombre d’actes se feront sous anesthésie, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général, administration d'antalgique) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. On parle alors de souris humanisées. Le modèle expérimental proposé ici : l’humanisation de souris immunodéficientes (mâles et femelles) de 8-12 semaines de vie par l'injection de lymphocytes T CD4 +/- T CD8 humains est le seul qui nous permette de confirmer in vivo le pouvoir aggravateur des cellules CD8-NK-Like. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Etude de l’impact de l’utilisation des biomatériaux dans la greffe de neurones corticaux issus de cellules souches humaines dans le traitement de lésions corticales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une lésion du cortex moteur et une greffe de neurones humains associés à un biomatériau, puis des pesées et des tests moteurs sur plusieurs mois, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique appliquer un jeûne de quinze heures avant le test de préhension de nourriture pour motiver les animaux. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de modéliser un cerveau de mammifère in vitro et présente le recours aux modèles animaux comme "essentiel".
Objectifs
Du fait de la très faible capacité du cerveau à s’autoréparer, les traumatismes craniens sont dévastateurs. La lésion du cortex moteur est une caractéristique commune de nombreuses conditions neuropathologiques telles que les tumeurs, les lésions (traumatisme, accident vasculaire cérébral) ou les maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique, ataxies scérébeleuses, maladies de Huntington, d'Alzheimer...). Afin de pallier les capacités de régénération limitées du cerveau adulte, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques. La transplantation neuronale a été explorée comme une approche potentielle permettant de rétablir les fonctions cérébrales en remplaçant les neurones perdus par de nouveaux neurones. Il est déjà démontré que des neurones issus de cellules souches, transplantés dans des cerveaux de souris, peuvent efficacement rétablir des connexions spécifiques après une lésion corticale. Une réparation des réseaux neuronaux est donc possible chez la souris, mais l'efficacité de cette approche doit encore être améliorée avant de pouvoir être envisagée chez l'Homme. Dans cette étude, nous souhaitons coupler la greffe de neurones humains avec l'utilisation d'un biomatériau naturellement présent dans l'organisme: l'acide hyaluronique. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les potentiels effets du biomatériau incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions du cerveau. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à des traumatismes crâniens ou des AVC.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale : 1 fois (10 minutes par animal, 160 animaux); -intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 120 animaux); -intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 40 animaux). Sur animaux vigiles : - au maximum une soixantaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 160 animaux); -au maximum 10 sessions de 2 tests de comportement moteur (15 minutes par souris et par test, 160 animaux).
Impact sur les animaux
Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisés par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieur gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.
Remplacement
L’impact de la composition du biomatériau utilisé dans cette étude a été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumas crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 10 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles.
Raffinement
Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les souris ont un phénotypes dommageable (immunodéficience), mais ce phénotype ne s'exprime pas dans nos conditions d'hébergement. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle. De plus, elles seront réalisées par un binôme compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) à l'aide d’une grille de score. Des points limites adaptés et gradés et un arbre décisionnel comprenant des critères d'arrêt de souffrance ont été définis en amont de la réalisation du projet.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.