Système nerveux
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Etude de l’impacte des mouvements sur le traitement d’informations visuelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 2 196 d'entre elles, 44 étant tuées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une barre de fixation de la tête, des injections de vecteurs viraux dans le cerveau et des implants d'électrodes, une partie étant maintenue tête fixée et placée sous restriction alimentaire jusqu'à 80 % de leur poids pour les motiver à une tâche comportementale. Le porteur décrit des risques d'infection et un stress lié à l'immobilisation. Il conclut qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit fidèlement les circuits neuronaux d'un organisme en mouvement, pour une recherche sur l'intégration entre vision et déplacement.
Objectifs
Ce que nous percevons n’est pas nécessairement ce que nous voyons. Notre cerveau est capable de contextualiser ce que nous voyons. Ainsi, lorsque nous bougeons rapidement la tête, nous savons que ces objets qui entrent dans notre champ visuel ne sont pas des projectiles prêts à nous atteindre mais bien des éléments mis en mouvement par notre propre déplacement. Cette distinction est essentielle pour la survie de tout organisme. Le cerveau doit ainsi avoir connaissance de nos déplacements pour pouvoir correctement interpréter nos stimulations visuelles. Dans de nombreuses maladies neurologiques (maladie de Parkinson, trouble du spectre de l’autisme, par exemple) il est fréquent que cette intégration des informations visuelles avec nos déplacements soit défectueuse. Pour étudier ce phénomène, nous allons nous concentrer sur l’intégration de signaux venant de deux organes : les yeux, véritables caméras sur le monde extérieur, et l’oreille interne, semblable à un détecteur de mouvements de notre tête. Chez les mammifères, l’intégration de ces deux signaux s’effectue dans le cortex visuel, partie superficielle postérieure de notre cerveau. En revanche, les circuits neuronaux connectant l’oreille interne aux aires visuelles sont encore peu connus, tout comme leur capacité à intégrer simultanément nos mouvements de la tête avec les informations visuelles reçues. De plus, les études menées jusqu’à présent se heurtaient à des limites technologiques et n’étaient effectuées que sur des animaux immobiles. Pour ce projet, nous utiliserons la souris, modèle d’étude offrant de nombreux outils génétiques essentiels. Ce projet permettra de disséquer et mettre en lumière de nouveaux circuits neuronaux impliqués dans l’intégration sensorielle et ainsi apporter de nouvelles solutions thérapeutiques pour certaines maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Nos systèmes sensoriels sont notre principale voie d'accès au monde qui nous entoure. Certaines maladies touchant les systèmes moteurs, telles que la maladie de Parkinson ou les troubles de l'équilibre comme la maladie de Ménière, peuvent avoir un impact indirect sur notre perception du monde. De plus, il est aujourd'hui établi que certaines maladies cérébelleuses affectent nos capacités cognitives ainsi que notre perception. Par exemple, les lésions cérébelleuses à la naissance sont l'un des principaux facteurs de risque du trouble du spectre de l'autisme. Cette perspective est également cohérente avec les rapports anatomiques montrant une forte connectivité entre le cervelet et le reste du cerveau. À long terme, une compréhension plus approfondie des circuits connectant le système le cervelet au cortex aura certainement un impact médical, car les dysfonctionnements corticaux signalés dans plusieurs maladies proviennent peut-être de ces connexions ou sont exacerbés par ces dernières. Par conséquent, la compréhension de ces circuits et de leurs fonctions physiologiques fournit un nouveau point d'entrée pour le développement d'approches thérapeutiques pour des troubles du traitement sensorimoteur. L'un des plus grands mystères de la biologie est de comprendre comment le cerveau aide les organismes, y compris nous-mêmes, à relever le défi fondamental d'évaluer rapidement et efficacement notre environnement et d'agir en conséquence. Bien que ce projet ne résolve pas complètement cette énigme, comprendre comment le cerveau des rongeurs intègre rapidement et efficacement les informations visuelles et de mouvement est une étape importante vers la compréhension de la manière dont notre cerveau construit une représentation précise du monde extérieur. Mon équipe apportera une contribution significative à notre compréhension du traitement sensoriel et de la perception lorsque nous nous déplaçons. Bien que la vision soit l'un des sens les plus étudiées, les études se sont principalement concentrées sur des animaux immobiles, négligeant ainsi le rôle crucial de nos mouvements dans la perception du monde environnant. En comblant cette lacune, nous pourrons mieux appréhender la façon dont les organismes représentent et évoluent dans leur environnement, aussi bien en état physiologique normal qu'en période de maladie.
Procédures
Nous allons combiner des enregistrements électrophysiologiques et d'imagerie sur des souris possédant une barre de fixation de tête afin d’enregistrer l'activité du cerveau sur des animaux habitués à être tête-fixée (enregistrement ponctuels) et des animaux libres de leurs mouvements (enregistrement longitudinaux). Les souris pourront recevoir l'injection de vecteur viraux au de différentes zones du cerveau et une minorité de ces mêmes animaux seront utilisés pour des enregistrements électrophysiologiques in vitro. La combinaison de techniques ainsi que des enregistrements longitudinaux nous permettent de minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, tout en prenant en compte le bien-être de l'animal qui sera extrêmement bien habitué aux conditions expérimentales. Certains animaux seront aussi entrainés a effectuer une tâche comportementale et seront donc placé sous restriction alimentaire afin de les motiver à effectuer la tâche comportementale. Le temps pour effectuer la majorité de ces chirurgies se situe entre 30 et 90 minutes. Une souris ne peut pas être enregistrée plus de 2 fois par jour avec un intervalle d'au minimum 5 h entre ces deux enregistrements. La durée d'enregistrement varie entre 30-120 minutes en condition tête fixée et peu atteindre 5h quand l'animal est libre de ces mouvements avec accès à l'eau, la nourriture et nidification. La durée d'entrainement à la tâche comportementale n'excédera pas 90 jours.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet tels que l’implantation d’électrodes, le maintien de la tête fixée, et l’apprentissage de tâches comportementales, peuvent avoir des effets sur le bien-être des animaux et peuvent entrainer des nuisances ou des effets indésirables. Il est donc essentiel de minimiser ces impacts autant que possible tout en respectant les normes éthiques et de bien-être animal. Voici les effets indésirables les plus fréquemment rencontrés lors de ces interventions : 1. Anesthésie : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif. 2. Implantation d’électrodes et de fenêtres optiques: Infection/Inflammation de la zone implantée et inconfort du a l’implant. 3. Maintien de la tête fixée: Stress et inconfort liée à l’immobilisation. 4. Injection stéréotaxique: Suture qui s’ouvre, infection au niveau des suture, voir risques liés à l’anesthésie. 5. Tâche comportementale: Stress lié à la privation alimentaire, perte de poids, impact comportemental/hormonal/métabolique. Notez que ce sont les principales/aux nuisances et effets indésirables qui peuvent etre rencontrés lors de nos expériences. Ceci n'est pas une liste exhaustive et ces effets sont rares lors de nos manipulations.
Devenir
L’issue de chacune des procédures est la mise à mort des animaux afin de pouvoir procéder au prélèvement du cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, vérifier l’expression et la localisation des infections virales, vérifier les zones enregistrées, et d'effectuer des enregistrements electrophysiologiques in vitro.
Remplacement
Diverses alternatives non animales sont disponibles dans le domaine des neurosciences, notamment les approches in silico, in vitro, et ex-vivo. Dans notre projet, nous utilisons des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie optique pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le traitement sensoriel et la perception. Concernant l'approche in silico: Même si les modèles mathématiques peuvent fournir des hypothèses utiles afin de limiter le nombre d'expériences sur les animaux, ils ne peuvent pas remplacer les expériences réelles sur des animaux vivants, bien plus complexes que les modèles actuellement utilisés. Concernant les approches in vitro et ex vivo: Nous continuerons à explorer des alternatives in vitro et ex-vivo telles que la culture cellulaire ou les organoïdes cérébraux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité des circuits neuronaux – encore moins lors de mouvement chez l’animal éveillé. Ainsi, malgré les progrès dans le domaine des alternatives non animales, il n'existe actuellement aucune méthode entièrement substitutive qui puisse reproduire fidèlement les interactions neuronales complexes observées dans un organisme vivant en mouvement.
Réduction
Dans notre laboratoire, nous allons prendre des mesures pour réduire le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences. Pour y parvenir, nous avons adopté une stratégie de multiplication des mesures sur les mêmes animaux. Par exemple, nous réalisons des enregistrements éléctrophysiologiques répétées durant plusieurs sessions consécutives chez le même animal, et nous associons plusieurs méthodes d’imagerie, d’analyse du comportement, d’électrophysiologie et d’optogénétique sur le même animal. Nous allons quantifier et évaluer toutes les observations de manière statistique à l'aide de test non parametriques. Ainsi, nous réduisons le nombre de souris utilisées autant que possible tout en garantissant la possibilité d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. En adoptant cette stratégie, nous nous engageons à réduire au minimum le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences, tout en veillant à la qualité des données collectées.
Raffinement
Nous prenons des mesures pour garantir le bien-être des animaux utilisés dans nos expériences in vivo, tout en respectant les principes des 3R pour minimiser leur souffrance. Cela grâce à l'utilisation d'anesthésie et d'analgésie adaptés à chaque manipulation. Après les chirurgies, les animaux sont placés dans une chambre spécialement conçue pour le réveil post-opératoire afin de réduire leur stress. Après leur réveil complet, ils sont réintégrés doucement dans leur cage d'origine pour éviter l'isolement. Pour les expériences in vivo, nous effectuons un suivi quotidien en observant leur poids, leur état général, leurs expressions faciales, et leur comportement, et ce pendant plusieurs jours suivant les chirurgies. Si des signes de douleur sont détectés, nous administrons un traitement adapté. Nous utilisons une grille de suivi du bien-être des animaux afin de déterminer les points limites appropriés à chaque animal. En dehors du suivi post-opératoire, nous permettons aux animaux de s'habituer à l'environnement d'enregistrement avant les sessions d'enregistrement, réduisant ainsi leur stress global. Lors d'une restriction alimentaire au cours d'un apprentissage comportemental, le poids et l'apparence des animaux seront surveillés de façon quotidienne afin de veiller au bien-etre des animaux étudiés. Par exemple, si le poids corporel devient inférieur à 80 % du poids initial, les animaux ont un accès libre à la nourriture pendant au moins une semaine. Enfin, dans ce projet, nous veillons à ce que les animaux soient logés dans des cages spacieuses, enrichies, et adaptées à leurs besoins comportementaux et physiologiques. Ces mesures, conformes aux principes des 3R, sont essentielles pour assurer le bien-être des animaux dans nos expériences et diminuer la variabilité de nos résultats (notion de réduction).
Choix des espèces
L'utilisation de la souris en recherche fondamentale est justifiée par plusieurs raisons essentielles. Tout d'abord, les souris partagent de nombreuses similitudes avec les humains au niveau neurologique et comportemental. Les souris sont utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents aux comportements humains. Ceci étant possible grâce aux nombreux outils génétiques disponibles uniquement chez la souris. En effet, les chercheurs ont développé de nombreux modèles de souris transgéniques et utilisent des approches virales pour cibler spécifiquement les circuits neuronaux d'intérêt, afin de révéler leur rôle sur des processus physiologiques et des comportements. En résumé, l'utilisation de souris dans notre projet est cruciale pour comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à la perception sensorielle et au comportement. L’étude ne comporte pas d’aspects liés au développement. Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 1 à 12 mois.Nous utilisons exclusivement des souris adultes dans notre projet pour plusieurs raisons fondamentales. Tout d'abord, la vision chez les souris adultes est déjà à un état stable et mature. De plus, en étudiant la vision chez la souris adulte, nous pouvons éviter les variations importantes qui sont courantes chez les jeunes souris en développement. Les souris en croissance subissent des changements constants dans leur cerveau et leur système visuel, ce qui est intéressant mais peut compliquer l'interprétation des résultats. En travaillant avec des souris adultes, nous minimisons ces variables. Enfin, les souris adultes sont plus faciles à entraîner pour des tâches comportementales, ce qui facilite la mise en œuvre de nos expériences et la collecte de données de manière efficace. En somme, l'étude de la vision chez la souris adulte est plus adaptée à notre projet afin de pouvoir liés mécanismes neuronaux et comportements.
Effets de la perturbation du rythme circadien sur le fonctionnement de l’axe reproducteur chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.
Objectifs
La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.
Bénéfices attendus
A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.
Evaluation des effets de la stimulation magnétique transcranienne du noyau sous-thalamique chez le modèle de primate non-humain de la maladie de Parkinson. (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour l'un et sévère pour trois d'entre eux. Ils reçoivent des injections d'une neurotoxine qui provoque un syndrome parkinsonien, avec akinésie sévère et perte de la capacité à se mouvoir et à se nourrir pendant deux à trois semaines, puis subissent une chirurgie du cerveau de trois à quatre heures pour tester des nanoparticules magnétiques, un test de rigidité musculaire en évaluant les effets. Le porteur reconnaît un risque d'hémorragie cérébrale et de douleurs post-opératoires. Il qualifie le recours au primate d'"indispensable" et invoque la "nécessité" de reproduire chez le singe une méthode déjà utilisée chez l'humain.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques d’une structure spécifique : la substance noire. Cette pathologie est caractérisée par des symptômes moteurs et non moteurs suite à une désorganisation du fonctionnement des circuits neuronaux. Une des structures cérébrales clés impliquées dans la physiopathologie de la MP est le noyau sous-thalamique (NST). Ce noyau a été la cible de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chez le singe, puis chez l’Homme afin de contrecarrer les symptômes moteurs de la MP. Notre projet a pour but de mimer les effets bénéfiques de la SCP chez des primates non-humain (PNH) rendus parkinsoniens en utilisant une autre stratégie, celle des nanoparticules magnétoélectriques (NME) injectées dans la structure cible : le NST. Il a pour objectif principal l’amélioration des symptômes moteurs caractérisant la MP après activation des NME chez un modèle de PNH rendu parkinsonien. Dans cette étude, l’utilisation du PNH, du fait de sa proximité avec l’Homme en termes d’anatomie cérébrale et de répertoire comportemental, nous permettra de transposer plus facilement les résultats à l’Homme, comme ce fut le cas pour la SCP.
Bénéfices attendus
Ce projet a une visée thérapeutique humaine. Il a pour but de développer une approche alternative moins invasive que la SCP qui pourra être utilisée chez le patient parkinsonien. En effet, cette dernière nécessite actuellement l’implantation d’électrodes au niveau du NST qui peut engendrer des hémorragies, des infections tout le long du câble et des cicatrices cutanées. Aussi, les NME fonctionnent sans connexion filaire et donc l’implantation d’un stimulateur sous-cutanée ne serait pas nécessaire. Outre, son bénéfice quant à l’amélioration des symptômes de la maladie de Parkinson, cette nouvelle technologie pourrait, si elle s’avère efficace, être utilisée comme une alternative à la SCP dans de nombreuses autres pathologies neurologiques et psychiatriques.
Procédures
- Le modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez le singe est obtenu par 5 injections (1 par jour, durée moins de 30 secondes) d'une neurotoxine - La chirurgie stéréotaxique est d’une durée de 3 à 4 heures (1h pour l’anesthésie l’intubation et l’installation de l'animal, 45 min pour la ventriculographie et l’injection stéréotaxique, puis 1h en fin de chirurgie pour nettoyer la plaie, recoudre, et surveillance du réveil). - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique dure quelques minutes, elle est réalisée avant et après la chirurgie. - Le test comportemental consiste à évaluer la rigidité musculaire qui quantifiera l’activité des muscles flexeurs et extenseurs du bras de l’animal en réponse à un mouvement répétitif passif de l’avant-bras. Ce test durera au maximum 15 min.
Impact sur les animaux
- L’induction d’un modèle parkinsonien par injection de MPTP provoque une akinésie sévère chez les NPH (symptômes de la maladie de Parkinson). Elle a pour conséquence d’induire une bradykinésie, entrainant une diminution ou une perte de la capacité à se mouvoir et se nourrir eux-mêmes et une perte de poids. Ces effets peuvent durer entre 2 et 3 semaines. - L’administration d’anesthésique chez le singe peut induire une accélération du rythme cardiaque ou encore des problèmes respiratoires. - L’injection des NME par stéréotaxie pourrait induire une hémorragie cérébrale, des douleurs post-opératoires ainsi qu’une infection de la plaie. - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique n’induit aucun effet délétère à l’animal.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour réaliser les analyses histologiques
Remplacement
Le choix de cette espèce s'explique par le fait que l'anatomie et le fonctionnement du cerveau, ainsi que la motricité, sont proches de ceux de l'homme. De plus, le PNH possède un répertoire comportemental complexe et proche de celui de l'homme, ce qui est indispensable pour étudier des processus cérébraux complexes tels que les différents comportements moteurs étudiés, classiquement observés chez les patients souffrant de la maladie de Parkinson. De plus, la SCP a été premièrement mise au point chez le singe avant son utilisation chez l’Homme d’où la nécessité de répéter ce schéma.
Réduction
4 animaux seront utilisés afin de réduire au maximum le nombre d’animaux dans cette étude. Ce nombre correspondant au nombre minimal d’animaux qui permet d’obtenir une analyse statistiquement valable des résultats. Aussi, le suivi dans le temps des animaux permet de collecter plusieurs données ce qui réduit le nombre total d'animaux. Nous allons réutiliser un animal venant d’une autre étude pour le groupe contrôle, et réduire à n=3 le groupe expérimental afin de respecter au maximum la règle des 3R.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc). Les deux premiers mois constitueront la phase d’habituation (manipulation par l’expérimentateur et évolution dans l’environnement de travail). Pour s'assurer au mieux du bien- être des animaux, leur état de santé sera évalué quotidiennement par le personnel compétent sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition, etc. Enfin, pour limiter le stress des animaux, des stratégies d'habituation sont mises en place pour qu'ils participent activement et volontairement aux différentes procédures. L’IRM et la chirurgie stéréotaxique seront réalisées après sédation et sur animal anesthésié. Différents paramètres vitaux sont surveillés tout au long de la chirurgie (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation en oxygène, température par sonde intra-rectale). Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident avec le vétérinaire de la conduite à tenir en fonction des points limites généraux comme la perte de poids qui sera évaluée sur une période hebdomadaire et pratiquée sans contention. Selon le scorage de l’animal il recevra une surveillance accrue et les mesures nécessaires sont prises pour améliorer son bien-être. Des points limites spécifiques sont mis en place suite à l’injection de la neurotoxine: MPTP (obtention d’un modèle expérimental de la MP modéré à sévère). L’akinésie sera surveillée et l’animal sera alimenté avec un supplément nutritionnel riche en calories 2 fois/jour, pendant 7j. L'utilisation de matelas souples/changements fréquents de position seront effectués pour prévenir les escarres à titre préventif. Le traitement L-DOPA sera proposé pour soulager l’akinésie. Les dyskinésies seront aussi scorées pour adapter le traitement L-Dopa.
Choix des espèces
Dans le cadre de cette étude, l’utilisation du modèle animal et plus particulièrement le primate non-humain (espèce Macacca Mulatta) reste indispensable. C’est le modèle animal de choix pour étudier les comportements moteurs impactés par la maladie de Parkinson. De plus, le PNH, du fait de sa proximité avec l’Homme à la fois sur le plan anatomique cérébrale et comportemental, permet de facilement transposer les résultats à l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de plus de 4 ans car on peut considérer que le développement du système nerveux central a atteint sa pleine maturité à cet âge. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte.
Rôles des macrophages périvasculaires dans la physiopathologie des événements hémorragiques dans un modèle d’hyperglycémie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ischémie cérébrale provoquée, une injection dans le cerveau, la pose d'un cathéter, des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés à la queue, une hyperglycémie étant induite par injections de streptozotocine, pour étudier le rôle de certaines cellules dans les hémorragies cérébrales après un AVC. Le porteur mentionne un déficit moteur ou cognitif possible et un test comportemental dont il ne précise pas la nature. Les retombées pour les patients sont renvoyées à un horizon lointain, et le porteur affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information.
Objectifs
Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Une hyperglycémie est présente chez environ 28 à 40 % des patients souffrant d'un AVC. Le plus souvent, cette hyperglycémie est la cause d'un diabète pré-existant chez le patient. Or, l'hyperglycémie augmente le risque de HT ce qui est associé à une aggravation de l'issue de l'AVC et une augmentation de la mortalité. En effet, l'hyperglycémie potentialise l'inflammation, et entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et donc une augmentation des HT. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié et d'autant plus dans des conditions avec comorbidité. Ce projet vise donc à caractériser le rôle des PVM dans la physiopathologie des HT en présence d'un facteur de comorbidité qu'est l'hyperglycémie. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT et pourraient être affectés par l'hyperglycémie. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs rôles.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques, et notamment dans un contexte de comorbidité, permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prises en charge des patients victimes d'un AVC.
Procédures
#Procédure 1 et 2 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale et pose d'un cathéter veineux (40min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et à J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16, J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17 , J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min). #Procédure 3 et 4 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle de transformation hémorragiques (35min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (11 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16 , J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17, J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min).
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont du stress lié à la contention (test fonctionnel, prélèvements sanguins), l'induction et le maintient de l'anesthésie (imagerie IRM, procédures chirurgicales). Des douleurs eventuelles liées à la chirugie (pose de cathéter, injection intracérébroventriculaire, ischémie thromboembolique), un déficit moteur ou cognitif (ischémie thromboembolique). De plus le modèle d'hyperglycémie via injection multiple de streptozotocine peut entrainer de la glucosurie, de la polyurie, de la polydipsie.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA (activateur tissulaire du plasminogène) au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés, la littérature et un test de puissance statistique. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisé.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Une habituation aux gestes et dispositifs de contention sera réalisée au préalable afin de réduire le stress des animaux lors de ces manipulations. Le réveil des animaux post-chirurgie se fera au calme, dans une enceinte chauffée ventillée individuelle avant leur retour dans la cage. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale et placées dans une armoire chauffée ventilée. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture sera mis en place. Du fait des effets indésirables induit par l'hyperglycémie, une attention particulière sera portée sur l'hydratation (turgescence cutanée) et l'hygiène de la cage des animaux avec des changements de biberons et de cages plus fréquement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’humain. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’humain et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT dans le cadre d'une hyperglycémie. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Thérapie génique innovante pour la gestion de la spasticité après lésion médullaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une section complète de la moelle épinière, chez le nouveau-né comme chez l'adulte, pour induire une spasticité, puis des injections que le porteur pratique sans analgésie au motif que l'animal "ne ressent plus rien" sous la lésion. Il décrit chez les adultes des troubles urinaires persistants imposant une vidange manuelle de la vessie, un risque d'infection et de mutilation, et chez les nouveau-nés un risque de cannibalisme maternel envers les petits blessés. Le porteur affirme que le modèle murin lésé reste "indispensable" faute d'exploration fonctionnelle directe possible chez l'humain.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.
Procédures
Une lésion de la moelle épinière sera réalisée sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min sur nouveau-né, 30min chez animal adulte) suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Le mode d'injection intrathécale juste au-dessus de la surface de la moelle épinière est envisagé en alternative de l'injection en intramusculaire chez l'animal adulte (durée de l'intervention 10min sous anesthésie générale). Une implantation d'électrodes sera faite sur les souris adultes sous anesthésie gazeuse (durée de l'intervention 30min). Une fois lésés, les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable aussi bien chez la souris nouveau née que chez la souris adulte. Chez les jeunes souris cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance (noté P6), soit 2 jours consécutifs à P6/P7, à P13/P14 et à P20/P21. Ches les souris adultes les injections se feront juste avant les expérimentations. Des enregistrements électromyographiques (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) et des vidéos de l'animal pour observer son comportement seront faits.
Impact sur les animaux
Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris, tant néonatale qu'adulte. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. En revanche, chez les souris adultes, ces symptômes apparaissent après plusieurs semaines. Bien que les souris opérées pendant leur période néonatale retrouvent spontanément une récupération satisfaisante de la vessie, celles opérées à l'âge adulte montrent des troubles de la vessie plus persistants, nécessitant une vidange manuelle jusqu’à la restauration complète de la fonction urinaire (généralement trois semaines après la lésion). Une autre conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Chez les souris adultes des risques d'infections urinaires sont à prévoir ainsi qu'un risque de mutilation. L'isolement des animaux adultes opérés qui est nécessaire le temps de la cicatrisation du site d'incision, peut induire du stress. Les manipulations et les changements de lieux, des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.
Devenir
Les animaux participant à la procédure 1 (21 souris) seront euthanasiés à la fin de celle-ci, car ils ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences. Quant aux animaux participant aux procédures 2, 3 et 4 (658 souris), ils seront également euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 679 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. À l'exception de la procédure 1, où les animaux seront euthanasiés à la fin, les tissus seront prélevés à la fin des autres procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.
Raffinement
Souris nouveau-nées - Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant des points limites. Souris adultes - Chez les individus adultes,une injectiond'analgésique sera administrée deux fois dans les 24 heures suivant la lésion de la moelle épinière ou l'implantation des électrodes d'enregistrement. Deux fois par jour, leur vessie sera vidée manuellement jusqu'à la récupération de la fonction urinaire. Leur température et leur hydratation seront également vérifiées, et tout signe clinique de douleur sera surveillé. Une semaine après la lésion, les animaux seront logés par deux par cage, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès illimité à la nourriture et à l'eau. De la même manière, l'hébergement sera enrichi à l'aide de rondin de bois et tunnel et de matériel de nidification. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est plus rapide (5 à 6 jours) que chez l'adulte (4 semaines). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale. Un autre groupe d’animaux sera étudié à l’âge adulte (procédure 4), afin de valider l'efficacité de cette thérapie génique sur un système mature, mais également pour se rapprocher le plus possible des essais cliniques chez l'homme.
Bases neuronales de l’adaptation comportementale en contexte social et non-social chez le macaque rhésus (EU 1/3)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
8 macaques rhésus vont être utilisés, dans des procédures classées modérées, avec une réutilisation prévue ou un placement en retraite envisagé selon l'avis vétérinaire. Chaque animal subit deux chirurgies implantatoires, dont une craniotomie de six heures, puis des enregistrements d'électrophysiologie et une stimulation transcrânienne par ultrasons, tête fixée dans une chaise de contention. Le porteur mentionne un protocole de contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif et un risque de brûlure superficielle de la peau lié aux ultrasons. Il affirme que les primates non humains sont le "seul choix possible" de modèle, cette recherche fondamentale sur le cortex préfrontal étant présentée comme impossible chez l'humain.
Objectifs
L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.
Devenir
La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.
Remplacement
Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.
Réduction
Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.
Raffinement
Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.
Choix des espèces
Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)
Etude de l’inflammation via la caractérisation en IRM moléculaire des molécules d’adhésion cellulaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Une inflammation cérébrale leur est induite par injection intracérébrale d'une protéine bactérienne, et un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivis de la pose d'un cathéter et d'une imagerie moléculaire, avant mise à mort pour immunohistochimie. Le porteur indique que l'AVC peut entraîner un affaiblissement transitoire de la patte avant et que la pose du cathéter provoque une douleur modérée. Il affirme que la biodistribution des particules d'imagerie doit être étudiée dans un organisme complet et que l'expérience ne peut être totalement remplacée par des études in vitro.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Notre étude sera basée sur l’expression de molécules d’adhésions qui sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires au sein du parenchyme cérébral. Il a été montré dans la littérature que l’inflammation post-AVC jouait un rôle dans la physiopathologie de la maladie, c’est pourquoi il nous apparait pertinent de caractériser l’expression de ces molécules d’adhésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication des molécules d'intérêts lors d'une inflammation
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Nous allons injecter une protéine bactérienne inactive dans une région du cerveau spécifique afin d’induire une inflammation du cerveau (durée : inférieure à 30min). Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) Induction du modèle d'AVC par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (durée : 1h30) Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) Imagerie moléculaire avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. De plus, l’injection de LPS en intra-striatale peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le LPS est un PAMP, motif moléculaire associé à un agent pathogène, qui active la voie NF-κB par l'intermédiaire du TLR4 et induit l'expression de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IL-1β. Enfin, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée. Des analgésiques sont prévus afin de limiter et minimiser autant que possible la gêne occasionnée. Concernant les souris ayant eu un AVC, il est possible de voir apparaitre un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l’AVC.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses en immunohistochimie
Remplacement
Avant toute étude in vivo nos particules ont été testées in vitro afin de vérifier leur bon fonctionnement et spécificité. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux en ne leur injectant pas de particules inefficaces. Les expériences in vivo ne peuvent être totalement remplacée par des études in vitro car nous avons besoin de mettre en évidence l’affinité de nos particules pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires dans un organisme complet. En effet ; l’étude de leur bio-distribution in vivo est un point essentiel à notre projet de recherche. Après les expérience d’imagerie, les animaux sont perfusé afin de récupérer les tissus. Des études de microscopie sont réalisées par la suite sur ces tissus afin de confirmer nos observations réalisées in vivo. Cela nous permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cage standards répondant aux normes européennes actuelles (directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des molécules d’adhésion cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude de syndromes neuro-développementaux rares.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
9 550 poissons zèbres vont être utilisés, classés en gravité légère, dans un projet de création et de maintien de lignées génétiquement altérées. Chaque animal subit à quatre mois une amputation d'un morceau de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, geste que le porteur présente comme le plus invasif du projet. Les géniteurs et génitrices retenus sont conservés jusqu'à dix-huit mois, tandis que les autres, porteurs de modifications génétiques et jugés non nécessaires, sont mis à mort. Le porteur affirme que seul un organisme vivant complexe permet d'étudier ces syndromes neuro-développementaux et met en avant la transparence des embryons et les pontes nombreuses pour justifier le choix de l'espèce.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de permettre l'étude d’un ensemble de maladies génétiques rares du neuro-développement caractérisés par une microcéphalie et un nanisme. Actuellement, la prise en charge clinique des patients est strictement symptomatique; aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Ces syndromes sont dus à des mutations dans un gène spécifique identifié. Le projet de recherche vise à comprendre les mécanismes qui mènent à ces syndromes et pourquoi des mutations distinctes de ce gène conduisent à des pathologies différentes. Afin de mener ces études à bien, le poisson-zèbre a été choisi comme modèle car il permet de reproduire et ainsi de comprendre ces maladies. Le projet proposé ici vise à établir et maintenir des lignées de poissons-zèbre présentant deux mutations emblématiques de ce gène, ainsi qu’une invalidation fonctionnelle totale de ce gène. Ces lignées permettront de mettre en évidence les particularités propres à chaque type de mutation expliquant la variabilité́ des symptômes observés chez les patients, et ce, tout particulièrement sur le développement cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre comment les mutations d'un gène sont impliquées dans la survenue de syndromes présentant des pathologies plus ou moins sévères. A court terme, l’établissement de ces lignées permettra d’établir un modèle de référence de la maladie pour l’étude de ces syndromes. A moyen terme, l’analyse de l’expression des gènes dans les premiers stades de développement du poisson-zèbre aidera à mieux comprendre quels sont les gènes impliqués dans la survenue de retard de croissance et de microcéphalies et de mettre en lumière pourquoi ces symptômes sont plus prégnants pour certaines mutations que pour d’autres. A long terme, ces résultats pourront permettre un éclairage sur les mécanismes cellulaires les plus affectés dans ces syndromes. Ces lignées pourront s’avérer être d’une grande aide dans le test de molécules à visée thérapeutique visant à soulager les patients et à améliorer leur vie.
Procédures
La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Aussi, un génotypage des individus s’avère obligatoire. La procédure nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Le choix d’un prélèvement de la nageoire caudale tient au fait que celle-ci se régénère très rapidement. Ce prélèvement sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Afin de limiter la douleur liée au prélèvement, celui-ci sera effectué sous anesthésie générale brève de l’animal et à l’aide d’un scalpel dont la lame sera préalablement stérilisée à l’alcool et changée à chaque série de prélèvement. Après le prélèvement, le poisson sera immédiatement transféré dans un bac individuel contenant de l’eau sans anesthésique pour permettre son réveil. Le poisson sera surveillé pendant 10mn pour vérifier son état général. Classiquement, cette technique ne génère pas de mortalité.
Impact sur les animaux
La transmission des syndromes, par le biais de mutations est de type « autosomique récessive » indiquant que les parents sont porteurs sains et asymptomatiques. L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs des modifications génétiques, sains et asymptomatiques. De même, il est attendu que la génération de ces lignées poissons-zèbres porteurs des modifications génétiques d’intérêt conduise à des individus sains, libre de se mouvoir et ne présentant aucun signe de mal être. Néanmoins un suivi régulier des poissons-zèbre sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être. Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale afin de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Il s’agit là du geste le plus invasif qu’auront à subir les poissons zèbres dans ce projet.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux, non nécessaires à la conduite de ce projet et porteurs de modifications génétiques, qui ne peuvent pas être replacés.
Remplacement
L’étude du développement neuronal à partir de cellules souches issues de patients et d’un modèle animal, le poisson-zèbre, permet de comprendre les mécanismes de ces maladies. Seul un organisme vivant complexe comme l’animal permet de récapituler l’ensemble des phénomènes physiologiques et de les étudier avec pour objectif une possible application à l’Homme. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages, notamment la transparence optique des embryons ce qui permet le suivi, en temps réel, du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans les syndromes étudiés). De précédentes études ont déjà démontré la pertinence du poisson-zèbre comme modèle d’étude car la perte temporaire de la fonction du gène d’intérêt provoque chez cet animal un éventail de symptômes/syndromes spécifiques des maladies humaines, dont une microcéphalie. L’apparition de l’ensemble de ces symptômes/syndromes peut être bloqué par la réexpression de la forme « saine » du gène humain chez le poisson mais pas par les formes « malades », qui portent les mutations identifiées chez l’Homme. Pour poursuivre la caractérisation de ces maladies, l’établissement des lignées poisson-zèbre présentant des mutations stables du gène d’intérêt permettra de disposer de modèles physiologiquement pertinents.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons de la génération F0 à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au maximum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres hétérozygotes nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres hétérozygotes nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus. Dans le cas de figure où la génération de poissons-zèbre avec une invalidation totale du gène d’intérêt se révélait trop difficile à obtenir, les autres lignées de poissons-zèbre ne seront pas générés.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum 2 par 2 le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous hétérozygotes et ne présenteront pas de phénotype dommageable (le syndrome étudié étant récessif). Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. L’observation de blessures sur l’animal ou d’anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac…) conduira à la mise à mort de l’animal afin de limiter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et à l'échelle d’un organisme complexe entier. De plus, ce modèle présente de nombreux avantages avec notamment une fertilisation externe et des pontes supérieures à 100 œufs, permettant ainsi de limiter le nombre de génitrices nécessaires au projet et ainsi de les préserver, tout en obtenant une puissance statistique optimale avec peu de croisements. Enfin, la transparence optique des embryons permet le suivi en temps réel du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans le syndrome étudié). Lors de la création des lignées de poissons-zèbres, les animaux subiront un unique prélèvement de nageoire caudale, à l’âge de 4 mois. Ce prélèvement s’effectue à ce stade car les poissons-zèbres sont suffisamment développés et la quantité de tissu prélevé suffisante pour le génotypage. La cicatrisation et la régénération de la nageoire s’opèrent de manière optimale à ce stade de développement. Par la suite, ces mêmes poissons-zèbres seront les géniteurs et génitrices du projet (à partir de l’âge de 5 à 6 mois).
Modulation cholinergique des neurones épineux moyens du striatum afin d’améliorer les stéréotypies dans un modèle des troubles du spectre de l’autisme chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
332 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Elles portent une mutation reproduisant des comportements répétitifs proches de l'autisme et subissent des tests comportementaux d'exploration, des injections, et pour une partie une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de trente à quarante minutes sous anesthésie. Le projet teste si des traitements augmentant une substance du striatum réduisent ces stéréotypies. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne peuvent remplacer l'organisme entier et que des souris vivantes sont nécessaires, les tests comportementaux étant décrits comme sans stress ni souffrance.
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’Homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester des traitements qui augmentent les niveaux de cette substance sont capables d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.
Bénéfices attendus
Des mutations dans plusieurs gènes sont impliquées dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation d’un de ces gènes. Si ces traitements se révèlent efficaces dans cette phase préclinique, ils pourraient être testés en phase clinique afin d’améliorer les comportements stéréotypés chez des patients atteints des TSA. D’ailleurs, un des traitements testés dans ce projet est actuellement utilisé en clinique pour le traitement de certaines formes de TSA et pour la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Ce projet comprend 3 types d’intervention : Intervention 1 : Tests comportementaux sur l’ensemble des animaux qui ne comportent pas de souffrances ou stress, afin de détecter des comportements stéréotypés spontanés typiques des modèles murins des TSA. Un test par souris, durée max 30 minutes. Intervention 2 : Injections systémiques i.p. et s.c. sur animal vigile afin d’induire une anesthésie générale et d’administrer les traitements post-opératoires (analgésiques e anti-inflammatoires) et pharmacologiques. Pour les traitements pharmacologiques d’une partie des animaux : deux injections par souris (1 pour l’habituation et 1 pour le traitement), éventuellement des injections quotidiennes sur 5-7 jours si le traitement unique est inefficace. Durée des injections : quelques secondes. Intervention 3 : Injections intracérébrales par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane) pour une partie des animaux. Une chirurgie (bilatérale) par souris. Durée de la chirurgie : 30-40 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des traitements prévus sur les stéréotypies. Ces tests sont basés sur des comportements spontanés d’exploration et ne comportent pas de stress ni de souffrance des animaux. Une partie des animaux subira des injections i.p. de solution saline ou de produits chimiques qui sont non toxiques et non douloureux ; les injections pourraient engendrer du stress de contention et de la douleur aiguë. Une partie des animaux subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale profonde (classée modérée), pouvant engendrer douleur post-opératoire et stress. Cette chirurgie ne comporte pas de lésions ou d’autres interventions qui peuvent affecter le bien-être animal après l’opération.
Devenir
A la fin des procédures, les souris ne seront pas utilisées pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité des traitements visant à améliorer les stéréotypies.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Ce projet, d'une durée de 5 ans, nécessitera l'utilisation de 332 souris mâles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 12 à 14 par groupe en fonction du type d’expérience). Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cependant, ce nombre prévu pourra être réduit en fonction des résultats obtenus dans les tests comportementaux. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie du trouble de l’autisme et permettre à terme de développer une approche thérapeutique pour cette maladie.
Raffinement
La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 30-40 min) et minimiser la souffrance. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie générale profonde gazeuse. Les principaux paramètres vitaux sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré 30 minutes avant la chirurgie. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré à la fin de l'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal, puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Après le réveil de l’anesthésie, les animaux sont surveillés afin de détecter des signes éventuels de souffrance ou de stress, qui seront pris en charge le cas échéant. Personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Des grilles d’évaluation adaptées sont mises en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. L’analyse comportementale sera réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale, les souris seront hébergées de deux à quatre par cage avec eau et nourriture à volonté, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires, ainsi que le bien-être des animaux, sont strictement contrôlés. Ils auront à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi qu’un environnement enrichi par des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC. Afin de diminuer l’inconfort/stress générés par ce type d’expérimentation comportementale, les souris auront une période d’habituation d’une semaine aux salles d’expérimentions où elles seront manipulées par l’expérimentateur en charge de l’étude.
Choix des espèces
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des stéréotypies, afin de tester si des traitements qui peuvent restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA peuvent améliorer ces comportements. L’âge des souris utilisées sera de 12 à 14 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux adultes capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.
Etude du système endocannabinoïde dans le syndrôme de Sanfilippo.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 72 dans des procédures sans réveil et 324 classées légères. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant deux semaines, pouvant provoquer stress et douleur, avant d'être disséqué pour prélever le cerveau. Le projet, mené sur des souris génétiquement modifiées reproduisant le syndrome de Sanfilippo, étudie le rôle d'une enzyme dans la neuro-inflammation associée à cette maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace un "animal entier" vivant et présente les pistes thérapeutiques comme un objectif du projet.
Objectifs
Les maladies de surcharge lysosomale (MSL) constituent un groupe hétérogène d’environ 70 maladies caractérisées par un dysfonctionnement du lysosome. Ces maladies sont individuellement rares mais touchent globalement plus d’un cas pour 4000 naissances. La maladie de Sanfilippo (MPSIIIB), une maladie des MSL, est caractérisée par une accumulation des Oligosaccharides d’Héparane Sulfate (HSO) dans les tissus y compris dans le système nerveux central (SNC). Cette accumulation progressive induit une série de conséquences pathologiques incluant une neurodégénérescence, une neuro-inflammation et un stress oxydant. La neuro-inflammation très précoce est en grande partie à l’origine des premiers symptômes de la pathologie. Il a été montré, dans des modèles murins de MPSIII, que l’utilisation d’anti-inflammatoires tels que l’aspirine ou la prednisolone permettait de réduire la neuro-inflammation, améliorer les symptômes et entraîner une normalisation de certains marqueurs de la neuropathologie. Les limites de l’utilisation de ce type de molécules sont en grande partie dues à des doses d’efficacité excessives et à un mauvais passage de la barrière hématoencéphalique (BHE). Par conséquent, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques anti-inflammatoires. Parmi ces nouvelles cibles, des études très récentes soulignent l’intérêt d’une manipulation du système endocannabinoïde (ECS) dans la prise en charge des MSL. Le rôle anti-inflammatoire de l’ECS est aujourd’hui clairement démontré et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies neurodégénérescentes. Nous avons récemment découvert au laboratoire une nouvelle enzyme impliquée dans l'ECS et présente dans le SNC. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de cette enzyme dans les évènements clés de la neuro-inflammation associée au syndrôme de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettront de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du syndrome de Sanfilippo et notamment pour le traitement de la neuro-inflammation associée.
Procédures
Les animaux utilisés pour cette étude seront soumis à 1 injection en intra-péritonéal tous les 3 jours pendant 2 semaines (soit maximum 5 injections). Après la mise à mort, les cerveaux seront prélevés.
Impact sur les animaux
Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection tous les 3 jours durant 2 semaines en intra-péritonéal pouvant provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséqués afin de collecter les cerveaux pour les différentes analyses.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la neuro-inflammation lors de pathologies neurodégénérescentes. Cette étude nécessite la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Pour cela, il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées. Le nombre de 6 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.
Raffinement
Pour cette étude et dans le but d'éviter et d'atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant toute la durée d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de la première injection des molécules en intra-péritonéal, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Toutes les lignées murines utilisées sont déjà disponibles au laboratoire et sont adaptées pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo ainsi que pour développer des thérapies pour les maladies de surcharge lysosomale. Pour les 2 procédures, les animaux seront utilisés à 1, 2 et 4 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire ainsi que la bibliographie.
Neurostimulation pour restaurer la mémoire dans un modèle primate de la maladie d’Alzheimer – 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées modérées malgré leur lourdeur. Une pathologie de type Alzheimer et des déficits cognitifs leur sont induits, et chaque animal subit trois neurochirurgies de six à huit heures pour injection intracérébrale et implantation d'électrodes, des IRM et scanners sous anesthésie, des injections de scopolamine, des ponctions lombaires tous les six mois et des tâches en chaise de contention. Le porteur mentionne des restrictions alimentaires ou hydriques, un risque d'infection lié aux électrodes percutanées, puis une euthanasie pour analyse histologique du cerveau. Il affirme que le cortex préfrontal dorsolatéral "n'existe que chez le primate" et conclut au caractère "indispensable" du modèle primate.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans l’objectif général de développer de nouvelles approches de neurostimulation pour les déficits mnésiques, observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer. Malgré leur incidence très élevée, il n’existe actuellement pas de traitement pharmacologique adéquat, et la neurostimulation représente une approche alternative qui a déjà fait l’objet de plusieurs études préliminaires. Cependant, les approches testées chez l’humain actuellement produisent des effets variables et insuffisants, et qui ne sont pas statistiquement significatifs. Ces protocoles sont relativement simples car ils ne ciblent qu’une seule aire cérébrale et ce, de manière continue au cours du temps. Nous faisons l’hypothèse qu’une intervention ciblant plusieurs aires cérébrales et modulée au cours du temps mènera à une amélioration plus robuste des performances mnésiques dans un phénotype similaire à celui de la maladie d’Alzheimer. Pour tester cette hypothèse, nous allons implanter chez le primate non-humain des technologies d’électrodes intracrâniennes similaires à celles utilisées chez l’humain, et que nous avons déjà testées dans des modèles imprimés en 3D et chez le cochon. Ces électrodes seront implantées dans des aires critiques pour la mémoire de travail et la mémoire épisodique, dont certaines sont spécifiques aux primates (cortex préfrontal dorsolatéral). Nous allons induire chez 10 macaques cynomolgus une physiopathologie similaire à la maladie d’Alzheimer, ainsi que des déficits cognitifs temporaires, et étudier l’impact de nouvelles méthodes de neurostimulation (ciblant plusieurs aires et adaptées en temps réel en fonction de l’état cérébral) sur cette physiopathologie et sur les performances cognitives de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : (1) d'élucider les mécanismes physiologiques sous-tendant l'apprentissage et la mémoire chez le primate dans des états sains et pathologiques, notamment dans un nouveau modèle physiopathologique de la maladie d’Alzheimer ; (2) de développer une nouvelle catégorie d'interfaces cerveau-machine bidirectionnelles permettant d'enregistrer l'activité neuronale et de la stimuler en temps réel dans plusieurs aires cérébrales différentes, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour les troubles mnésiques et la maladie d'Alzheimer, qui ne connaît aucun traitement à l'heure actuelle. Le développement et l’amélioration de ces technologies de neurostimulation est en effet en plein essor, en raison de leur potentiel thérapeutique pour plusieurs maladies neurologiques, incluant non seulement la maladie d’Alzheimer, mais également la maladie de Parkinson, la dépression, les troubles obsessionnels compulsifs, etc. Les applications cliniques sur la maladie d’Alzheimer se limitent actuellement à la stimulation d’une aire unique, avec des protocoles relativement simples, et mènent à des effets très limités et variables. Ce projet va au-delà des protocoles utilisés cliniquement car il stimule plusieurs aires simultanément afin de restaurer leur activité naturelle, et les protocoles de stimulation dépendent de l’état du cerveau grâce à des algorithmes dits en boucle fermée. Un tel développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tâches comportementales en chaise et en comportement libre avec enregistrements électrophysiologiques et neurostimulation (séances quotidiennes de 1-2h pendant toute la durée du projet), à des imagerie par résonance magnétique sous anesthésie (environ 5 séances de 2-3h maximum), à des tomodensitométries sous anesthésie (2 séances de 30 minutes), à 3 procédures neurochirurgicales de 6-8 heures environ (1 pour l'injection intracérébrale de protéines, et 2 pour l'implantation d'électrodes intracérébrales), à des injections intramusculaires de scopolamine (5-10 séances estimées, avec un effet durant 4h maximum), à des ponctions lombaires (réalisées tous les 6 mois à partir de l'implantation et pendant la durée du projet), et à une euthanasie.
Impact sur les animaux
Ce projet peut avoir les effets indésirables suivants sur les animaux : (1) stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tâche comportementale, (2) douleurs suite à des procédures neurochirurgicales et à l'injection intramusculaire de substances (scopolamine, anesthésiants), (3) potentielles infections liées à la présence d'un système percutané d'électrodes intracérébrales, (4) nuisances liés à la potentielle restriction alimentaire ou hydrique, (5) nuisances liées à l'imagerie, (6) nuisances liées aux transports entre établissements utilisateurs
Devenir
Les animaux seront eutahanasiés et une analyse histologique du cerveau sera effectuée.
Remplacement
Ce projet vise à étudier les effets de la neurostimulation intracrânienne sur la mémoire lors d’une tâche cognitive. Ceci ne peut être réalisé in vitro. Par ailleurs, les modèles informatiques actuels ne permettent pas de remplacer l’expérimentation animale car les processus mnésiques ne sont pas suffisamment bien compris. Néanmoins, nos travaux de recherche incluent déjà une partie modélisation afin de guider la sélection de certains paramètres de stimulation. Dans le futur, de tels modèles permettraient de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, l’expérimentation humaine n’est pas encore possible à ce stade car les méthodes utilisées sont invasives, impliquent une craniotomie, et nécessitent donc une preuve de concept pré-clinique. En termes de modèle pré-clinique, notre développement technologique doit se faire sur le gros animal, car les implants utilisés cliniquement (électrodes cérébrales profondes et électrodes sous-durales) et leur technique d’implantation chirurgicale (neuronavigation par IRM) ne peuvent pas être utilisés sur des petits modèles animaux tels que le rongeur. Par ailleurs, nous avons auparavant développé des approches méthodologiques et chirurgicales sur des modèles alternatifs, à savoir des modèles de cerveau imprimés en 3D et des modèles porcins. Pour passer à la phase comportementale, c’est-à-dire tester les effets de ces stimulations sur les processus de mémoire et la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, il est nécessaire d’utiliser un modèle de gros animal avec une homologie cérébrale similaire à l’être humain. Un modèle primate s’avère dès lors indispensable, notamment en raison du fait que le cortex préfrontal dorsolatéral, une aire fortement impliquée dans la mémoire de travail et la mémoire épisodique, n’existe que chez le primate.
Réduction
Chaque animal sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, les mêmes animaux seront réutilisés pour plusieurs interventions (effets de la stimulation dans l'état sain et dans différents états pathologiques, i.e. après injection de scopolamine et dévelopement de la tauopathie). Un nombre de 5 animaux est le minimum pour effectuer des tests statistiques de comparaison entre plusieurs états. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur primates non-humains se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Par ailleurs, ces animaux seront divisés en deux groupes d'âge. Au total, nous planifions donc d'utiliser un maximum de 10 animaux. Enfin, certains des animaux utilisés dans ce projet seront des animaux réutilisés de projets précédents.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce. Les hébergements seront enrichis par des approches standards (jouets pour animaux, nourriture variée, fonds sonore) ainsi que l’utilisation d’un système d’écran tactile pour primates permettant de délivrer des récompenses alimentaires lors de l’exécution de tâches de pointage ou de mémorisation. L’habituation aux interactions avec l’humain et aux diverses procédures expérimentales se fera progressivement et par renforcement positif, à un rythme adapté à chaque animal et qui s’étendra sur une durée de plusieurs mois. Nous utiliserons des méthodes chirurgicales aseptiques ainsi qu’une anesthésie gazeuse suivant au plus près les standards cliniques. Les procédures chirurgicales seront menées par un neurochirurgien, à l’aide d’un système de neuronavigation fondé sur des imageries non-invasives du cerveau par IRM et de la morphologie crânienne par tomodensitométrie, permettant d’atteindre une précision d’implantation submillimétrique. Nous effectuerons un suivi post-opératoire accru, plusieurs fois par jour, qui sera consigné par le personnel en charge de l’animalerie sur une feuille de suivi post-opératoire suivant une échelle d'évaluation du bien-être adaptée au primate, basée sur des critères tels que la posture, l’activité motrice, les interactions sociales, la nutrition, l’hydratation, etc. Le suivi post-opératoire inclura également des antalgiques pour contrôler la douleur, des antibiotiques pour réduire le risque d’infection, et si nécessaire des corticoïdes afin de contrôler de possibles augmentations de pression intracrânienne. Les cicatrices seront inspectées quotidiennement et désinfectées à la bétadine. Les transports entre différents établissements s’effectueront dans une cage dédiée placée sur un chariot protégé des regards extérieurs par une housse, l’animal étant sédaté, maintenu au chaud sous une couverture, et bordé d’une bouillotte. Les éventuelles restrictions alimentaires ou hydriques seront introduites ou arrêtées de manière progressive, maintenues au niveau minimal efficace, et feront l’objet d’une surveillance et d’une réévaluation régulières. Ces procédures seront régulièrement mises à jour lors des réunions du comité SBEA. Enfin, les procédures seront arrêtées en cas d'atteinte d'un des points limites.
Choix des espèces
Au niveau scientifique, ce projet vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau cérébral à grande échelle constitué notamment de l’hippocampe, du cortex entorhinal et du cortex préfrontal. Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs, chez lesquels la définition du cortex préfrontal fait même débat. De plus, l’entraînement à des tâches cognitives suffisamment élaborées pour avoir un équivalent chez l’humain requiert l’usage de primates. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui pourrait par la suite être appliquées à l’humain, ce qui nécessite un modèle anatomique suffisamment proche. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte (i.e. de plus de 5 ans environ). Le premier groupe contiendra des animaux entre 5 et 15 ans environ (âge adule moyen). Le deuxième groupe utilisera des animaux plus âgés (15-30 ans) dans le but d’observer des déficits de mémoire liés au vieillissement cognitif et de les compenser par la neurostimulation.
Étude des effets de dérivés de la coronaridine sur l’anxiété et la depression chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées à sévères. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées sur quatorze jours, puis subissent des tests comportementaux dont un test de nage forcée avec immersion dans l'eau et un test de suspension par la queue, classés sévères, pour évaluer deux dérivés de l'ibogaïne sur l'anxiété et la dépression. Le porteur décrit l'immersion comme pouvant provoquer une angoisse considérable et une brève hypothermie, effets qu'il présente comme ceux que l'étude cherche à mesurer. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale appropriée et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Notre projet de recherche consiste à d’étudier les effets comportementaux de la catharanthine et du 8-methoxycoronaridine. Nous cherchons à évaluer les propriétés anxiolytiques et antidépressives de la catharanthine, un métabolite de l'ibogaine, ainsi que du 18-méthoxycoronaridine (18-MC), un dérivé de synthèse, lorsqu'ils sont administrés de manière chronique à des souris. Les benzodiazépines, couramment utilisées pour traiter l'anxiété, présentent des inconvénients importants lorsqu'elles sont utilisées sur le long terme, notamment des effets indésirables potentiellement graves, une tolérance pharmacologique, un risque de dépendance psychologique et physique, ainsi que des effets sur la vigilance et les fonctions cognitives. Dans le but de rechercher une alternative thérapeutique offrant un meilleur rapport bénéfice/risque, nous souhaitons examiner les effets à long terme de la catharanthine et du 18-MC sur les troubles anxieux et dépressifs chez les souris. Plusieurs études suggèrent que les transmissions sérotoninergiques jouent un rôle dans la modulation de l'anxiété et de la dépression. Pour approfondir notre compréhension des voies sérotoninergiques, nous avons l'intention d'évaluer comment différents sous-types de récepteurs sérotoninergiques interviennent dans la régulation des troubles anxieux et dépressifs sous l'influence de la catharanthine et du 18-MC. Nous accorderons une attention particulière au bien-être des animaux participant à cette étude. Cela implique de fournir des conditions d'hébergement appropriées, de suivre quotidiennement l'état des animaux, d'employer des méthodes visant à minimiser la douleur, la souffrance et le stress des sujets, ainsi que d'établir des critères pertinents et précoces pour évaluer leur bien-être tout au long de l'expérience. Cette approche s'inscrit dans le respect des normes éthiques et du traitement des animaux dans le cadre de la recherche scientifique.
Bénéfices attendus
Le traitement actuellement disponible pour l'anxiété est associé à des effets indésirables notables, notamment le risque de dépendance, qui peut se développer même avec des doses thérapeutiques. En outre, ces traitements sont susceptibles d'entraîner des perturbations des fonctions cognitives, telles que la mémoire, les capacités psychomotrices et la vigilance, ce qui limite leur utilisation chez les patients qui doivent effectuer des tâches nécessitant une attention particulière, comme l'utilisation d'équipements dangereux ou la conduite. Il est donc essentiel de rechercher des approches thérapeutiques alternatives, notamment celles qui ciblent les sous-types de récepteurs de la sérotonine ou du GABA, afin d'acquérir une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents à l'anxiété et à la dépression. Actuellement, divers antidépresseurs sont disponibles sur le marché. Cependant, malgré leur efficacité établie, ces traitements présentent plusieurs limitations, telles qu'une durée d'action prolongée, un phénomène de résistance observé chez environ 30 % des patients, ainsi que des effets secondaires invalidants. En outre, ces principes actifs ne sont pas toujours en mesure de cibler toutes les composantes de la dépression. Cela stimule la recherche en psychiatrie en vue de développer de nouvelles molécules qui offriraient un spectre d'action plus large, ce qui est essentiel pour améliorer le profil thérapeutique dans le domaine de la santé publique.
Procédures
-Évaluation de l'activité locomotrice: 110 animaux, une injection i.p (30 secondes) , une séance de mesure de l'activité locomotrice (durée du test: 60 min). -Évaluation de l'anxiété: 70 animaux, une injection i.p (30 secondes) + séance de mesure de comportement de type anxieux (durée du test: 6 min) . -Évaluation de la dépression sur deux tests complémentaires: 120 (60+60) animaux: une injection i.p. (30 secondes) pendant 14 jours (en alternant les lieux d'injection) + séance de mesure du comportement type dépressif (durée du test: 6 min).
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables anticipés chez les animaux, il convient de mentionner les réactions liées aux injections chroniques. Dans le but de minimiser le stress provoqué par l'introduction de l'aiguille, nous opterons pour l'utilisation d'aiguilles les plus fines possibles et d'alterner les lieux d'injection (entre côté droit et gauche). De plus, une période d'isolement d'une heure précédant l'expérimentation sera instaurée. Cette période permettra à l'animal d'explorer librement son environnement, contribuant ainsi progressivement à atténuer le stress associé à la séparation temporaire d'avec ses congénères. Cette étape s'avère essentielle avant la réalisation des tests comportementaux, car le stress induit, perceptible dès les premières secondes et minutes, pourrait interférer avec les effets anxiolytiques recherchés. Dans le cadre de l’évaluation du comportement de type dépressif, les animaux peuvent momentanément éprouver du stress et de l'anxiété en raison de leur position inconfortable. Au contact de l’eau, les animaux peuvent ressentir une angoisse considérable au moment de leur immersion dans l'eau, ainsi qu'une brève hypothermie, bien que nous nous efforcions de minimiser ces effets au maximum. Quant à l’évaluation du comportement de type anxieux, il implique que les animaux soient placés dans un dispositif potentiellement stressant tout en ayant la possibilité de se s’y soustraire en se mettant dans un emplacement considéré comme protecteur. Il est important de noter que ces effets sont précisément ceux que nous cherchons à mettre en évidence et à quantifier afin d'évaluer la capacité de l'administration de la catharanthine et du 18-MC à atténuer ces réactions. Chacun de ces tests a une durée limitée à 6 minutes, après quoi les animaux seront immédiatement retournés dans leur cage habituelle, mettant ainsi fin au stress et à l'angoisse induits par les épreuves. En ce qui concerne les effets indésirables liés aux agents pharmacologiques utilisés, il convient de noter qu'aucun effet indésirable notable n'est a priori anticipé pour la catharanthine et le 18-MC, à l'exception des effets anxiolytiques et antidépresseurs qui sont spécifiquement recherchés dans le cadre de notre étude.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation d'un modèle animal intégré, et notre choix s'est porté sur la souris, une espèce largement reconnue pour son utilisation dans l'étude des effets chroniques des anxiolytiques et des antidépresseurs. Dans le cadre de notre projet, il n'existe pas d'alternatives non animales appropriées disponibles. Les données issues des travaux cliniques et des investigations fondamentales actuellement disponibles reposent principalement sur des expérimentations animales. Cette préférence découle en grande partie de la complexité et de la difficulté intrinsèques des études du système nerveux central chez l'homme. Les procédures expérimentales envisagées dans ce projet, qui englobent des tests comportementaux d'évaluation de l'anxiété et de la dépression, requièrent impérativement l'utilisation d'animaux vivants et ne sont pas susceptibles d'être substituées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. De plus, les mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus anxieux et dépressifs ne peuvent être entièrement élucidés par le biais d'études cliniques. Par conséquent, l'emploi d'un modèle animal approprié demeure essentiel pour l'exploration du comportement lié à l'anxiété et à la dépression dans le contexte de cette recherche.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux, en se basant sur les résultats de nos travaux antérieurs et sur ceux des publications dans le domaine, permettant d’évaluer une puissance de résultats suffisante avec le minimum d’animaux, le nombre d’animaux par groupe nécessaires à cette étude est estimé à 10 animaux par groupe. De plus, pour réduire le nombre total d’animaux, une partie des animaux (110 souris) ayant subi le test de l’activité locomotrice seront réutilisés dans le test de labyrinthe (70 souris) dans le test suspension des animaux par la queue (20 souris) et dans le test de labyrinthe en "O" (20 souris) .
Raffinement
Une observation méticuleuse des animaux sera entreprise dans le cadre de cette étude. Les animaux seront logés dans des cages conformes aux réglementations, au sein d'un environnement contrôlé, et ils bénéficieront d'un environnement enrichi pendant leur période d'hébergement. L'enrichissement de l'environnement, qui consiste en l'ajout d'éléments simples tels qu'un cylindre en carton, vise à augmenter la complexité de l'environnement captif, ce qui, en retour, améliore le bien-être des animaux en favorisant leur activité et en réduisant les comportements stéréotypés ou anormaux. Une surveillance attentive des animaux sera menée, notamment en ce qui concerne leur état général, leur prise de nourriture, leur consommation d'eau et leur comportement général, ainsi que leur poids corporel. Les animaux qui subiront une injection quotidienne dans le traitement chronique, à 24h d'intervalle, nous alternerons de côté les injections et nous examinerons attentivement les lieus d'injection pour rechercher une éventuelle inflammation. Avant le début de l'expérimentation, une période d'acclimatation sera mise en place pour permettre aux souris de s'habituer à l'environnement du test. Cette période implique que les animaux soient placés dans la salle d'expérimentation en présence de l'expérimentateur pendant une heure, ce qui facilite leur adaptation aux manipulations à venir. L'évaluation du comportement de type anxieux et dépressif se fera dans une arène éclairée par une ampoule fournissant une intensité lumineuse de 30 lux. Pour les autres évaluations, l'éclairage sera doux et équivalent à celui utilisé dans leur environnement de cage habituel. Après le contact avec l'eau, des mesures seront prises pour prévenir l'hypothermie potentielle des animaux. Ces mesures comprendront le transfert immédiat et délicat des animaux dans une cage de séchage transitoire équipée d'une lampe chauffante au-dessus et d'un coussin chauffant en dessous. La température dans la cage sera maintenue en dessous de 30°C, et un espace plus frais sera aménagé dans la cage pour permettre aux souris de se déplacer vers un endroit plus frais si elles le souhaitent. Une surveillance étroite et continue des souris sera maintenue pendant leur rétablissement dans cette cage.
Choix des espèces
Le choix des souris albinos SWISS (SN-SWISS-M) s'est fait sur la base des données de la littérature. Ce sont des souris polyvalentes utilisées dans tous les domaines de la recherche biomédicale. Les procédures envisagées dans ce projet ont déjà été validées chez la souris albinos SWISS. Par ailleurs, elles sont moins sujettes au stress et donc plus susceptibles d’avoir des comportements et traits physiologiques normaux. Les expérimentations seront réalisées sur des animaux ayant acquis une maturité complète des structures cérébrales. Nous avons opté pour les sujets au stade adulte pesant en moyenne 30 grammes.