Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Création de lignées de poissons zèbre génétiquement modifiées pour la recherche en neuroscience
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
44 200 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à terme, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de créer des lignées génétiquement modifiées, huit par an sur cinq ans, vendues comme prestation à des laboratoires publics ou privés, chaque poisson étant identifié à trois mois par une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie. Le porteur reconnaît que les modifications génétiques peuvent provoquer des phénotypes dommageables comme une scoliose ou des troubles de la reproduction. Les individus non modifiés sont tués, dix par lignée étant gardés pour l'entretien puis tués à dix-huit mois, et le recours au poisson est justifié par la part de gènes partagés avec l'humain et l'usage d'un "organisme entier".
Objectifs
Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous l’avons choisi pour créer des lignées génétiquement modifiées afin de fournir ces dernières à des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Ces lignées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. L’objectif est de créer 8 lignées par an durant les 5 ans à venir.
Bénéfices attendus
Notre plateforme a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant le modèle poisson zèbre pour comprendre certaines maladies humaines et progresser dans leur traitement.
Procédures
Les poissons doivent être identifiés génétiquement à l’âge de 3 mois. Pour cela ils sont isolés et anesthésiés successivement afin de minimiser la souffrance de l’animal lors du prélèvement de tissu de la nageoire caudale qui est réalisé par la suite. Un seul prélèvement est réalisé par individu, ne durant qu’une minute. Une fois la biopsie terminée, le poisson est remis à l’eau dans un bac de réveil. Il ne sera réhabilité dans un aquarium d’élevage qu’après rétablissement complet de l’anesthésie. Cette biopsie ne doit entrainer aucune séquelle sur la nage ou l’alimentation du poisson. Il est nécessaire de maintenir l’animal isolé jusqu’à l’obtention des résultats d’analyse (maximum 2 semaines). Il est possible qu’un phénotype dommageable apparaissent sur l’ensemble des animaux suite aux modifications génétiques.
Impact sur les animaux
Les poissons vont être pêchés à l’épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Le risque lié à l’anesthésie est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Un traumatisme peut faire suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale, qui est une petite plaie de quelques millimètres. Il s’en suit ensuite un processus cicatriciel qui prend 2 semaines durant lequel le poisson est isolé. Il est possible que les modifications génétiques entraînent des phénotypes dommageables, par exemple une scoliose ou un problème lors de la reproduction.
Devenir
Au cours du projet, les animaux produits qui ne sont pas génétiquement modifiés seront euthanasiés. Nous conserverons 10 individus par lignée produite qui permettront d’obtenir et de garantir le maintien de la lignée nouvelle lignée. Enfin, ces animaux seront également euthanasiés à l’âge de 18 mois après confirmation de l’implantation de la lignée dans le laboratoire demandeur. Les animaux ne seront pas conservés au-delà afin d’éviter qu’ils ne développent des anomalies qui s’intensifient avec le vieillissement des animaux ou qu’ils ne deviennent le réservoir d'infection.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement larvaire et l’imagerie. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
Aux vues de la physiologie du poisson-zèbre et de notre expérience sur la création de lignées génétiquement modifiées au cours des dernières années, nous estimons que le minimum requis de lignée à créer est de 8 par an sur les 5 ans à venir. Nous allons générer 850 individus fondateurs (F0) et 255 individus de la génération suivante (F1) soit 8 lignées x (850 F0 + 255 F1) x 5 ans = 44200 poissons zèbres. Afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaire à la création de ces lignées, nous essayerons d’insérer un rapporteur fluorescent lorsque cela sera possible. Ce qui nous permettra de sélectionner et de garder que les poissons génétiquement modifiés diminuer le nombre de poissons à élever par 4 d’après nos précédentes études soit élever 11 050 poissons zèbre.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Ainsi les paramètres environnementaux comme la qualité de l’eau, la température et le cycle lumineux seront à surveiller. La température de l’air devra être comprise entre 25 degrés Celsius et 27 degrés Celsius et le cycle lumineux de 14-10 avec aube et crépuscule. Le poisson zèbre est une espèce grégaire, ils seront donc placés en groupe de 5 à 20 congénères adultes maximum dans les aquariums d'élevage. Seul les poissons à génotyper seront isolés et maintenus dans le système afin de garantir un environnement contrôlé. Cela leur permettra de maintenir un contact visuel avec leurs congénères. Ils seront surveillés quotidiennement et un affichage assurera la traçabilité et le respect de la durée de l’isolement. Pour préserver l'ensemble des poissons hébergés, une limite d'âge de 18 mois sera appliquée pour éviter que les animaux vieillissants puissent être le réservoir d'infection. En effet, la durée de vie moyenne d’un poisson zèbre est de 24 mois. De la nourriture vivante sera fournie 2 fois par jour afin que les animaux puissent exercer un comportement de chasseur pour se nourrir. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour cela nous utiliserons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels. Cela permettra d’évaluer quels poissons doivent être euthanasiés ou non. Si nous observons des problèmes physiques nous ferons une évaluation pour en définir la gravité et mettre en place des solutions adaptées pour garantir le bien-être des animaux. Si cela s’avère une demande d’autorisation sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser ce modèle pour créer des lignées génétiquement modifiées. De plus, il atteint l’âge de la maturité sexuelle à 3 mois et les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus attrayante. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. Ils seront donc utilisés pour générer une lignée afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses recherches sur le modèle. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à partir de 3 mois et nous ne les utiliserons pas au-delà de 18 mois. Le prélèvement pour génotypage se fait aux alentours de 3 mois, lorsqu’ils ont atteint une taille suffisante. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle.
Etude des conséquences de l’inactivation et de la surexpression de gènes impliqués dans des maladies neurodeveloppementales
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
15 946 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie au cours de laquelle l'utérus est exposé et chaque embryon transpercé par un capillaire de verre avant l'application d'un courant électrique, technique d'électroporation in utero destinée à modifier l'expression de gènes dans le cerveau en développement. Les femelles sont tuées pour collecter embryons et nouveau-nés, ces derniers subissant une injection dans le cerveau ou une perfusion intracardiaque terminale, tous étant tués pour prélever les cerveaux. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Notre recherche est orientée vers l’étude de la physiopathologie des maladies neuro-développementales d’origine génétique. Un grand nombre de gènes y ont été reliés. Notre objectif est de comprendre les rôles de ces gènes dans les cellules du système nerveux central et les mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies. Chez certains patients avec des maladies du développement cortical, il existe des mutations dans des gènes qui montrent une forte probabilité d’être la cause de la maladie. Ces pathologies sont associées aussi bien à des défauts de prolifération, de migration et de différenciation neuronale. Comprendre les mécanismes par lesquels la mutation entraine la pathologie est essentiel pour faciliter le diganostic d’autres maladies et envisager un traitement. Pour comprendre ce qu’il se passe dans les neurones, nous allons adopter une approche génétique visant à modifier l’expression ou la fonction des molécules étudiées. Nous utiliserons l’électroporation in utero chez la souris. Cette technique permet l’introduction de matériel génétique contrôle et muté dans les cellules progénitrices de la zone ventriculaire du cerveau en développement, permettant donc l’étude de la structure, de la fonction et du développement du système nerveux central. Elle offre l’avantage d’un contrôle spatio-temporel de la délivrance d’ADN, permet des études de perte et de gain de fonction et est simple, rapide et efficace. On pourra ainsi étudier l’effet d’un gène : # sur la prolifération : électroporation au stade embryonnaire (un seul stade par gène selon le pic d’expression du gène étudié) et analyse du devenir des cellules modifiées 1 ou 2 jours plus tard. Dans ce cadre, les mères recevront une ou deux injection(s) nous permettant des analyses de données plus fines# sur la migration des neurones : électroporation au stade embryonnaire et analyse du devenir des cellules modifiées 3 ou 4 jours après # sur la différenciation et la connectivité neuronale en introduisant le gène d’intérêt au stade embryonnaire et en analysant 2, 4, 8 ou 21 jours après la naissance .
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de comprendre la fonction de protéines ou d'autres molécules impliqués dans le neurodéveloppement et les mécanismes par lesquels leur déplétion ou surexpression conduit à des troubles du neurodéveloppement. Ce projet aura des retombées pour les patients. En effet, notre collaboration avec des cliniciens nous permet de tester par cette approche des variants retrouvés chez des patients présentant des maladies du développement du cerveau. Comprendre les mécanismes peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon, pour une durée de 1 à 10 secondes pour chaque embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes ( en moyenne 25 minutes pour un chirurgien expérimenté). Un courant électrique sera appliqué sur la paroi utérine, en 5 pulses de 50 ms espacés de 1 seconde (temps total entre 5 et 6 secondes par embryon). Elles seront par la suite placées dans des cages isolées. Certaines recevront une ou deux injections (5 secondes) 1-2 jours après la chirurgie. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin au stade embryonnaire (entre 1 et 10 secondes). Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique (environ 5 secondes) puis d’un anesthésique (environ 5 secondes) avant de subir une chirurgie de perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes donc rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates, aiguille très fine, cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Elles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait privées de congénères pendant quelques jours de convalescence. Certaines recevront une ou deux injections sous cutanées 1-2 jours après la chirurgie, pouvant entrainer un stress et d'autre(s) rupture(s) le la barrière cutanée. Les souriceaux vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin aux stades embryonnaires ainsi que l'application d'un courant électrique sur leur tête. Certains nouveaux nés vont subir une injection d’analgésique puis d’un anesthésique (pouvant entrainer du stress) avant de subir une chirurgie terminale de perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles sont mises à mort pour collecter les embryons ou dès collecte des nouveaux nés. Les embryons ou nouveaux nés sont mis à mort pour collecter les cerveaux.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cortical qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les effets de l’altération de gènes sur le développement embryonnaire cortical.
Réduction
Nous garderons à l’esprit notre responsabilité de diminuer au maximum le nombre d’animaux expérimentés tout en atteignant la significativité statistique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, aucune nouvelle expérience ne sera effectuée avant qu’une analyse complète des précédentes ne soit réalisée. Les experiences (prolifération, migration, maturation) seront choisies en fonction de la nature du gène étudié, son profil d’expression et du phénotype observé chez les patients. Aussi toutes les expériences ne seront pas systèmatiquement éffectuées. Seules celles relevantes seront faites. En ce qui concerne les études post-natales, et afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés et d’éviter le cannibalisme des souris, nous avons adapté nos croisements pour obtenir des souris moins agressives et meilleures nourrices. La bonne maitrise de la technique chirurgicale acquise par l’équipe tout au long de ces dernières années permet d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons (40-80%) ce qui limite fortement le nombre de femelles gestantes manipulées. Nous prévoyons aussi dans cette étude 10 femelles gestantes pour la formation de nouveaux expérimentateurs afin de nous assurer de leur succès et d’un bon taux de survie.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien être de nos animaux. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Avant le début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'analgésique 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la deshydratation. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie. Un anti-inflammatoire non-stéroïdien, est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relais de l’analgésique pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections postchirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les animaux sont euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La technique d’électroporation dans le cerveau a été mise au point chez la souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par animal rend cette méthode efficace. Les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets des mutations dans des gènes impliqués dans les maladies neuro-développementales chez l’homme. 1) Etude de la prolifération : Femelles adultes gestantes de 13 jours ou 14, stades auxquels la proliferation des progeniteurs est à son maximum. Le choix du stade se fera en fonction du profil d’expression deu gène d’intérêt (un seul stade sera retenu pour les expériences, celui avec le pic d’expression de la protéine d’intérêt) : l’électroporation du matériel génétique d’intérêt en même temps qu’un marqueur fluorescent permettra de suivre la prolifération de ces cellules. Analyse à 14 ou 15 jours de gestation, stade d’étude de la prolifération cellulaire. 2) Etude de la migration cellulaire : Femelles adultes gestantes de 13,5, 14,5 ou 15,5 jours, stades auxquels les neurones migrent le long de la glie pour atteindre leur localisation finale. L’electroporation à ces trois stades permettra de visulaiser la migration de types neuronaux diffèrents (nés à chacun de ces stades). Analyse à 18,5 jours de gestation pour les visualiser grâce à un marqueur fluorescent électroporé en même temps que le matériel génétique à étudier. 3) Etude de la maturation neuronale et connectivité : femelles adultes gestantes de 15,5 jours (stade auquel les neurones callosaux sont générés). L’electroporation des embryons à ce stade permettra d’intégrer le gène à étudier uniquement dans ces neurones et de suivre leur développement grâce à un marqueur fluorescent. Etant donné que les étapes majeures de la formation du corps calleux sont la croissance des axones, le passage dans l’autre hémisphère et la phase terminale de l’invasion par les axones du cortex contralatéral à 2, 4 et à 8 jours après la naissance respectivement et le branchement des axones à 21 jours post-natals, nous prévoyons 4 stades afin d’évaluer ces différentes étapes.
Développement post-natal de la souche KI-L178A : Impact physiopathologique du blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 tuées sans réveil et le reste dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré. Issues d'une lignée génétiquement modifiée bloquant l'interaction entre le tPA et un récepteur cérébral, elles sont caractérisées du stade nouveau-né à l'âge adulte par des tests sensorimoteurs, cognitifs et émotionnels, une partie subissant la pose d'un cathéter et un amincissement du crâne pour l'imagerie du couplage neurovasculaire. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels, l'objet restant de comprendre le rôle physiologique de cette interaction. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" des procédures et l'impossibilité de les remplacer.
Objectifs
L'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques. Le tPA est connu pour interagir avec différents récepteurs et que l'interaction entre le tPA et un récepteur d'intérêt (tPA/NMDAR) était impliquée dans certains processus physiologiques et pathologiques (AVC, processus inflammatoires). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec ce récepteur d'intérêt. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions physiologiques au cours du développement (des stades post-nataux jusqu’au stade adulte) et évaluer l’impact du blocage de cette interaction sur l’unité neurovasculaire, par l’étude du couplage neurovasculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’interaction entre le tPA et notre récepteur d'intérêt dans des processus physiologiques.
Procédures
1-Prélevements : La totalité des animaux seront mise à mort pour prélèvement des organes (n=240, durée de la procédure : 15 minutes). 2/3- Comportements : La totalité des animaux seront soumis (selon les groupes établis) à l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; n=240, durée de la procédure : 30minutes/tests). 4-Couplage Neurovasculaire : Chaque animal fera l'objet d’une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (n=120, durée de la procédure : 15 minutes). Puis le modèle de couplage neurovasculaire sera réalisé (n=120, durée de la procédure : 1 heure). Après un amincissement du crâne, un train de stimulation des vibrisses sera effectué sous imagerie (fUS ou Doppler/Speckle).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : 5 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’évaluation du couplage neurovasculaire, les souris seront sous anesthésie générale (isoflurane 2% O2/N2O 30/70 puis médétomidine à 0,1 mg/kg) et sous anesthésie locale (Xylocaine 5%, nébuliseur). Les yeux des souris seront couverts (vitamine A en gel et gel oculaire) afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Les procédure 1 et 2 concernent une évaluation développementale de l’influence du blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR chez les animaux, à savoir des stades P0, P3, P5, P15, P30 et P60. Concernant les autres procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires.
Test d’une nouvelle génération de vecteurs pour la Sclérose Latérale Amyotrophique liée aux mutations SOD1 chez un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 460, modéré pour 130 et sévère pour 130. Issues d'une lignée transgénique qui développe une sclérose latérale amyotrophique, elles perdent du poids vers 90 jours puis se paralysent jusqu'à la mort vers 130 jours, une partie étant suivie jusqu'à ce point limite. Elles reçoivent une injection dans la moelle épinière et une injection dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins et des tests moteurs répétés, pour tester des vecteurs de thérapie génique visant à réduire la protéine SOD1 toxique. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que le modèle murin est "indispensable".
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie qui se traduit par la perte des motoneurones (cellules de la moelle épinière) et conduit à la paralysie puis au décès des patients dans un délai de 5 ans après le diagnostic. La maladie se présente sous forme sporadique (90% des cas) ou héréditaire (10%). 20% de la forme héréditaire sont dus à une mutation dans le gène SOD1 et sont à l'origine d'une accumulation de la protéine correspondante dans les cellules, entrainant toxicité et mort cellulaire. C’est sur cette forme de la pathologie que notre projet est focalisé. A l'heure actuelle il n’existe pas de traitements efficace chez l’Homme. L’étude sera réalisée sur une souche de souris transgéniques qui est le modèle le plus communément utilisé dans l’étude de cette maladie car les animaux développent les même symptômes que les patients. Ces animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort à 130 jours environ. Ayant démontré l’efficacité d'une thérapie génique dans la SLA, nous avons maintenant pour but d’optimiser cette thérapie génique en testant l'efficacité d'une nouvelle génération de vecteurs, afin de diminuer la dose de vecteur à injecter (ce qui permettrait de réduire les effets secondaires tels qu’une réaction immunitaire, une toxicité…) tout en gardant l’efficacité du premier produit testé.
Bénéfices attendus
Ce projet mené à terme nous permettra de constater l'efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur l'augmentation de la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes, avec pour objectif à long terme, de proposer un traitement dans le cadre de thérapies géniques dans la Sclérose Latérle Amyotrophique chez l'homme. Il n’existe actuellement aucun traitement dans cette maladie
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 4 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 2 sur souris anesthésiée et 2 sur souris vigiles ; une unique injection intramoelle à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 15 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire à J50, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 20 jours de J40 jusqu’au point limite. 1 minute suffit pour réaliser ce geste et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, neuroscore et test de coordination motrice) une fois par semaine de J50 jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le neuroscore et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le griptest, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le rotarod a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entrainera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les différentes procédures réalisées chez l’animal (intramoelle, injection intracérébroventriculaire) sont à même d’entraîner une douleur post-opératoire. Le prélèvement caudal ainsi que les prélèvements sanguins peuvent également être une source de stress et de douleur de courte durée. Les différents tests fonctionnels réalisés chez la souris (pesée, neuroscore, test de force musculaire, test de coordination motrice et neuroscore) peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode justifiée pour chaque procédure afin de prélever tous les organes nécessaires à la réalisation des analyses biochimiques et histologiques prévues dans notre étude. Ces prélèvements sont réalisés post-mortem et nécessite donc l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la Sclérole Latérale Amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer notre approche de thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de notre traitement sur la réduction des niveaux de SOD1 toxique et par conséquent sur la survie, l'amélioration des signes moteurs et le retard de l’apparition des symptômes.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé, les groupes seront constitués du nombre minimal nécessaire à une interprétation statistique viable. Si possible, les études seront réalisées sur des animaux du même sexe, afin, encore une fois, d'utilisé un nombre minimal d'animaux. Les animaux ne répondant pas aux exigences pour l’étude (porteur ou non de la maladie) seront systématiquement proposés pour d’autres études déjà validées. De plus sur chaque animal utilisé un maximum d’échantillons biologiques sera prélevé pour parer à toute nouvelle analyse à effectuer. Ce qui nous donne : 45 femelles SOD impliqué pour la procédure 2, 35 femelles B6SJL pour la procédure 3, 50 femelles SOD pour la procédure 4 et 65 mâles et 65 femelles SOD pour la procédure 5. Pour la procédure 1, il y aura également 16 mâles reproducteurs ainsi que 380 animaux non inclus en protocole mais nécessaire pour générer les souris en protocole ainsi que 64 souris supplémentaires pour garantir le bon nombre de souris au phénotype attendu, ce qui nous donne un nombre total de 720 souris.
Raffinement
Les animaux seront regroupés par groupe de 6 animaux du même sexe au maximum. Si des bagarres entre mâles sont observées, ceux-ci seront séparés immédiatement. Dans chaque cage un enrichissement sera apporté sous forme de papier craft pour la confection des nids, voir avec des abris en carton si besoin. Lors des injections, un anesthésiant adéquat sera utilisé et la qualité de l'anesthésie testée avant de procéder aux expérimentations et une analgésie adapté apporté si nécessaire. Enfin chaque animal sera suivi quotidiennement de sa naissance à sa mort et un contrôle du poids réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie et autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive. De plus pour minimiser le stress des animaux, ceux-ci seront manipulés tout au long de l’expérimentation par un nombre limité de personne pour créer une habituation souris/manipulateur. De plus, les souris seront hébergées dans une salle réservée à notre équipe, ce qui limitera les venues dans la pièce et donc, le stress des animaux. Il est à noter qu’un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Quelque soit la procédure, en cas de douleur aigue, les animaux seront immédiatement euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus communément utilisés pour les projets de thérapie génique pour le traitement de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) sont des lignées murines. Dans notre projet nous utiliserons le modèle murin transgénique pour la SLA. Ce modèle reproduit les principaux symptômes de la SLA et est par conséquent adapté pour évaluer l’efficacité de nos traitements sur la forme génétique de la maladie. Les animaux présentent des symptômes à partir de 90 jours (perte de poids) due à une accumulation de la protéine SOD1 entrainant une paralysie progressive à partir de 115 jours et la mort des animaux à 130 jours. Les animaux seront injectés à l’âge de 50 jours. Ce stade correspond à des animaux adultes pré-symptomatiques pour lesquels l’accumulation de la protéine toxique SOD est déjà commencée. Ce stade est idéal pour mimer un traitement puisque la pathologie est déjà présente et décelable (biochimie) mais les conséquences ne sont pas encore irréversibles.
Cartographie fonctionnelle et spatiale du tPA endogène au cerveau, en conditions normales ou ischémiques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 10 tuées sans réveil. Une lignée génétiquement modifiée rend le tPA cérébral fluorescent, et une partie des souris subit un accident vasculaire cérébral provoqué au laboratoire, suivi d'une imagerie à trois, six, douze et vingt-quatre heures avant le prélèvement du cerveau. Le porteur signale une possible perte de poids, des douleurs post-opératoires, une détresse et des déficits fonctionnels, l'objet étant de cartographier l'origine cellulaire de cette protéase. Il affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours à la souris et l'absence de méthode de remplacement.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase clé du système fibrinolytique sanguin. Par ses propriétés, le tPA est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est aussi un élément clef dans le système nerveux central (SNC), mais l’élucidation des sources cellulaires de tPA est limitée par un manque d’outils de détection fiable. Cette question est pourtant majeure, pour comprendre comment le tPA favorise ou limite les fonctions et la survie neuronale. L’objectif de cette première étude est de mieux comprendre l’origine cellulaire et les fonctions du tPA dans le SNC par des approches ex vivo/in vivo en se basant sur un nouvel outil original d’étude : une souris génétiquement modifiée, qui d’une part exprime le tPA (associé à une protéine fluorescente) pour le rendre détectable, et d’autre part permet de déléter spécifiquement celui-ci dans les cellules du SNC sans altérer son expression dans les autres compartiments. Cette lignée de souris sera utilisée pour des études histologiques et fonctionnelles, en conditions physiologiques ou dans un modèle d’AVC ischémique développé au laboratoire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles pour comprendre le rôle complexe d’un acteur clef de la physiopathologie cérébrale. Cette meilleure compréhension permettra d’identifier des cibles thérapeutiques pour la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique.
Procédures
Procédure 1 : Prélèvement sous anesthésie (sans réveil). Procédure 2 : - Chirurgie sous anesthésie ; évaluation des lésions cérébrales et des transformations hémorragiques par imagerie cérébrale : J+3h, J+6h, J+12h, J+24h. - Prélèvement sous anesthésie (sans réveil)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : une perte de poids/arrêt de la prise alimentaire et de boisson, des douleurs post-opératoires, des signes de détresse, du stress, des déficits fonctionnels.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser autant que possible le nombre minimal d’animaux adéquat, afin de correspondre au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés pour les résultats de l’étude comprendront des tests non-paramétriques (Test de Kruskal-Wallis, suivi du test post-hoc de Dunn’s) ou un t-test si la distribution des échantillons suit une loi normale (Shapiro-Wilk).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de l’interaction neurone-microglie et son lien avec la fonction motrice dans un modèle murin inflammatoire de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalite auto-immune leur est induite par injection pour reproduire une sclérose en plaques, provoquant troubles de la marche, faiblesse musculaire et perte de poids, avant une série de tests moteurs sur couloir filmé, grille d'agrippement et tapis roulant. Le porteur veut mesurer si un entraînement physique modéré module le dialogue entre neurones et microglie et favorise la rémyélinisation, les applications pour les patients restant formulées au conditionnel. Il indique travailler d'abord sur des modèles in vitro et ex vivo, mais conclut que le modèle murin est "ultimement nécessaire".
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, démyélinisante et dégénérative du système nerveux central et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation dans lesquelles l’organisation des fibres myélinisées est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules microgliales, cellules immunes du système nerveux central sont activées précocément lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Dans ce projet nous souhaitons étudier le lien potentiel entre les interactions microglie-neurones et l’évolution du déficit moteur dans un modèle murin de sclérose en plaques. Nous voulons de plus évaluer comment un entrainement physique d’intensité modérée durant la phase de réparation pourrait influencer les interactions microglie-neurones et ainsi moduler la rémyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des interactions neurones-microglie dans la sclérose en plaques. La mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité physique sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurone-microglie pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.
Procédures
Les animaux sont entrainés à effectuer des tests comportementaux non invasifs durant une semaine (sessions de maximum 10 min/jour par animal). Ensuite, nous immunisons les souris pour induire l’encéphalite expérimentale auto-immune, le model murin inflammatoire de sclérose en plaques. Le jour de l’induction deux types d’injections sont nécessaires, en injection sous-cutanées et par voie intrapéritonéale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Les animaux ayant déclenché la maladie seront amenés à effectuer de nouveaux les tests comportementaux non invasifs auxquels ils étaient préalablement entrainés. Durant ces tests, les animaux seront amenés à marcher dans des couloirs équipés d’une caméra ou de capteurs mesurant automatiquement les caractéristiques de la marche, agripper une grille avec les quatre pattes pour mesurer la force musculaire ou marcher sur un tapis roulant. Tous les tests ont une durée courte (maximum 10 min/session) avec des intervalles de repos de minimum 2 heures par souris et n’entrainent pas de stress émotionnel ou physique pour les animaux. Les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.
Impact sur les animaux
Nous étudions un modèle murin de démyélinisation inflammatoire, l’encéphalite auto-immune expérimentale, fréquemment utilisé pour étudier la sclérose en plaques. Après immunisation, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement sur 3-5 jours suivis d’une récupération partielle ou complète. Aucun autre effet délétère n’est attendu chez les animaux en rapport avec les tests fonctionnels et l’activité physique mais une fatigue et un stress léger sont possibles. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation des souris et la douleur des injections sous-cutanées étant très courte (2 à 3 minutes), le risque de défaillance cardio-respiratoire est infime.
Devenir
Des prélévements et analyses sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo. Les modèles murins in vivo sont ultimement nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux, effecteurs de l’immunité circulante et apports métaboliques par le réseau sanguin, qui sont des composantes importantes de cette pathologie.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 150, après des expériences pilotes, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul de puissance après utilisation initiale de 8 à 10 animaux par condition, selon l’expérience considérée. Des tests paramétriques, des tests de corrélation et de régression linéaire seront utilisés pour l’analyse statistique des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, dans un environnement à température et d’hygrométrie contrôlées, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs, sous la supervision de la structure bien être animal du vétérinaire désigné. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft), cachette (maisonnette, dôme) et/ou bâtonnet à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites définis en accord avec le vétérinaire ainsi qu’un suivi quotidien par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animale. Afin de minimiser le stress et la douleur liée à l’induction de l’encéphalite autoimmune experimentale, les animaux sont préalablement anesthésiés par anesthésie gazeuse, qui est rapidement réversible (durée totale d'anesthésie et du geste 10 minutes/animal). Concernant les tests comportementaux, les animaux ont des phases d’habituation et de repos adaptés aux différents tests effectués.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. Le modèle d’encéphalite autoimmune expérimentale chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques, permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Des animaux adultes C57BL6, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’encéphalite autoimmune expérimentale seront utilisés pour cette étude. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’encéphalite autoimmune expérimentale et faire les tests comportementaux envisagés. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs bien les conditions d’initiation de la sclérose en plaques chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Etude de la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes de souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
92 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. Elles reçoivent une injection intraveineuse d'une protéase fluorescente, le tPA recombinant, avant un prélèvement de liquide cérébro-spinal, un prélèvement de sang intra-cardiaque et l'extraction du cerveau, une partie servant d'abord à un apprentissage de la pose de cathéter. L'objet est de comprendre si les plexus choroïdes participent à la maturation du BDNF, les retombées pour les patients victimes d'accident vasculaire cérébral ou de sclérose en plaques restant renvoyées à un horizon thérapeutique lointain. Le porteur affirme le "caractère de stricte nécessité" du recours aux souris et l'impossibilité d'un remplacement.
Objectifs
Les plexus choroïdes, structures cérébrales dont le principal rôle est de produire le liquide cérébro-spinal (LCS), sont aussi capables de sécréter de nombreux facteurs neurotrophiques dont le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF). Le BDNF existe sous sa forme précurseur (pro-BDNF) ou, après protéolyse, mature (mBDNF). Malgré leur localisation parfois commune, le mBDNF et le pro-BDNF se distinguent parfois dans leurs (dys)fonctions neurologiques. Différentes protéases semblent capables de réaliser la maturation du pro-BDNF en mBDNF, notamment l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le tPA est une protéase synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour favoriser la fibrinolyse, grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Il est également sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires du système nerveux, tels que les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Par ses propriétés fibrinolytiques, le tPA recombinant (rtPA) est le seul traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. En plus de participer à la maturation du BDNF, l’ARNm (acide ribonucléique messager) du tPA est parfois retrouvé dans les mêmes régions cérébrales que celui du BDNF. De plus, le tPA et le BDNF sont présents dans les mêmes vésicules au niveau des neurones, co-transportés et co-libérés par les dendrites neuronales. Le tPA a précédemment été identifié dans les plexus choroïdes, suggérant également une synthèse endogène de cette protéase dans ces structures. De plus, le tPA vasculaire peut être transporté par des vésicules à travers les plexus choroïdes. Ainsi l’objectif de cette étude est de determiner si les plexus choroïdes peuvent être une zone de maturation et de libération de BDNF et si le tPA (endogène ou exogène) est un acteur de la maturation et/ou de la sécrétion de BDNF dans le LCS par des approches in vivo chez des souris entièrement déficientes en tPA (tPANull) et des souris contrôles (tPAWT).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va permettre d’acquérir des données fondamentales sur la maturation du BDNF dans les plexus choroïdes et sa modulation potentielle par le tPA à des fins thérapeutiques. En effet, une meilleure compréhension de la maturation du BDNF nous aidera d’une part à évaluer le potentiel effet du tPA vasculaire, et d’autre part, à envisager d’améliorer les performances de patients dans des conditions pathologiques, par le couple pro/m-BDNF.
Procédures
L'unique procédure réalisée, consistera en une injection intraveineuse de tPA recombinant couplé à un fluorochrome chez des souris entièrement déficientes en tPA et des souris contrôles, pour suivre son passage du compartiment vasculaire vers le parenchyme cérébral et détecter sa présence en immunohistochimie à différents temps. De même, du LCS et du sang seront prélevés pour réaliser diverses études protéiques et transcriptomiques. - Souris Swiss : phase d’apprentissage (Pose d’un cathéter veineux et prélèvement intra-cisternal de LCS). - Souris contrôles : injection I.V saline ou rtPA. - Souris déficiente : injection I.V saline ou rtPA. Mise à mort des souris de la phase d’apprentissage, immédiatement après le prélèvement intra-cisternal. Mise à mort des souris contrôles/déficientes à différents temps post injection : +10 minutes, à +30 minutes et à +60 minutes. Pour chaque animal : un prélèvement de LCS sera effectué, puis un prélèvement de sang en intra-cardiaque et enfin le cerveau sera extrait.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour cette procédure sans réveil : du stress lié à la manipulation des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (AVC, SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, la procédure expérimentale décrite dans ce projet a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards aux normes. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront également placés dans un environnement enrichi : coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront pesés tous les jours et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques suivant l’approche chirurgicale. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant l’ensemble des procédures, les souris seront sous anesthésie générale (et sous anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir leur déshydratation.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien connues et maitrisées dans notre équipe. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend donc cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Concernant l’ensemble des procédures, les souris utilisées seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature.
Examens IRM sur modèles rongeurs en provenance d’établissements utilisateurs extérieurs
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
600 rongeurs, 400 souris et 200 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut subir jusqu'à six examens d'IRM sous anesthésie gazeuse de quatre heures, parfois avec injection d'un produit de contraste au gadolinium, le porteur signalant un risque de non-réveil après la narcose. Il s'agit d'un service de plateforme mutualisant un appareil d'imagerie pour des équipes extérieures, chaque animal étant ensuite réintégré au protocole autorisé dont il relève, où les procédures se poursuivent. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ou in silico ne permet d'étudier le cerveau entier et présente l'IRM répétée comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du petit animal est une technique non invasive et non destructive des tissus in vivo. Elle permet l'étude longitudinale et tri-dimensionnelle notamment du cerveau normal et pathologique. Les divers types de contrastes et de modalités structurelles, fonctionnelles et spectroscopiques font de l'IRM une technique de choix pour la recherche en neurosciences expérimentales. Les applications de l'IRM expérimentale sont notamment le phénotypage d'une cohorte d'animaux, le suivi longitudinal de la progression d'une maladie ou d'un traitement thérapeutique, la validation de nouveaux biomarqueurs d'imagerie. Une IRM à très haut champ magnétique ainsi que des antennes dédiées à l’imagerie du cerveau de souris et de rat sont des déquipements de pointe qui peuvent apporter des informations déterminantes dans des projets scientifiques variés impliquant le petit animal via l’utilisation d’un large spectre de protocoles d’imagerie standards mais aussi avancés et innovants. Ce projet a pour but de faciliter la mise en place de collaborations avec des équipes externes pour réaliser des études d’imagerie IRM sur des modèles rongeurs de diverses pathologies ou des modèles de rongeurs sains afin d’investiguer des questions plus fondamentales sur le fonctionnement cérébral. Pour atteindre cet objectif, des expériences sur animaux anesthésiés doivent être menées.
Bénéfices attendus
Ce projet présente des bénéfices scientifiques à long terme aussi bien pour la plateforme que pour les équipes utilisatrices. Du point de vue scientifique, il permet d’intégrer de nouvelles données d’imagerie pour répondre à une question scientifique précise (expliquée dans les projets scientifiques autorisés par le ministère de l’étude concernée) et aider à la compréhension de pathologie humaine sur les modèles animaux en vue d’un traitement thérapeutique ou de l’aide au diagnostic. D’autre part, dans le cas d’étude longitudinale l’imagerie par résonance magnétique (IRM) présente un grand intérêt en réduisant le nombre d’animaux.
Procédures
Les animaux, 600 au total incluant 400 souris et 200 rats, seront soumis à des examens d'imagerie par résonance magnétique (IRM) sous anesthésie gazeuse avec ou sans injection intraveineuse dans la veine de la queue d’un agent de contraste à base de gadolinium selon le besoin de l’étude. La procédure IRM dure 4h maximum (de l’induction de l’anesthésie au réveil de l’animal). Les examens pourront être répétés au maximum 6 fois sur le même animal avec un délai de 72h minimum de récupération.
Impact sur les animaux
Différents risques sont identifiés : (i) Risques liés à l’anesthésie: stress thermique (hypothermie), difficultés cardio-respiratoires, non récupération de la vigilance suite à la narcose ; (ii) Risques liés à l’injection intraveineuse de produit de contraste : douleur au point d’injection , hématome, saignement possible très localement ; (iii) Risques liés au transport (stress) lors du changement d’établissement utilisateur.
Devenir
A l’issue des examens IRM (imagerie par résonance magnétique), les animaux seront réintégrés dans leur hébergement d’origine pour réaliser les procédures décrites dans le projet scientifique global autorisé par le ministère de l’étude concernée. Les examens IRM ne couvrent qu'une étape dans le cadre du projet scientifique global. Il s'agit ici d'une utilisation continue des animaux et non d'une réutilisation car les animaux ne peuvent être remplacés par d'autres. Ils sont inclus dans un projet scientifique global autorisé par le ministère et subissent une suite de procédures (avant et après les examens IRM) décrites dans le projet global.
Remplacement
Il n’existe pas d'alternatives (études in vitro, in silico ou sur animaux invertébrés) qui permettent d’étudier des mécanismes cellulaires, moléculaires, métaboliques complexes à l’échelle global du cerveau. Le rongeur est une des espèces les plus appropriées pour les études d'imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un contexte neurologique, d’autant plus que l’IRM permet l’étude longitudinale des paramètres d’intérêt de façon non invasive.
Réduction
600 animaux au total sont inclus dans le projet dont 400 souris et 200 rats. Le nombre d’animaux est réduit au maximum. Des études pilotes et tests statistiques ont préalablement étaient réalisés pour estimer le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante pour chaque étude. Les tests statistiques seront dépendants des différentes études qui auront une phase d’imagerie dans leurs protocoles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans leur établissement utilisateur avec les mesures de raffinement et conditions d’hébergement décrites dans projet initial autorisé par le ministère. Les animaux sont transportés de leur lieu d’hébergement initial vers le laboratoire au calme dans une cage adaptée avec de la nourriture, de l’eau à dispositions des animaux ainsi que l’enrichissement mis en place dans leur hébergement d’origine. L’arrivée se fait au niveau du quai de livraison où l’expérimentateur réalisant les IRM (imagerie par résonance magnétique) amène les animaux dans la pièce de préparation à l’aide d’un chariot en empruntant un monte charge. Les animaux sont laissés dans leur cage pendant 30 min à 1h dans la pièce de préparation, et une vérification de l’état des animaux (état du poil, comportement dans la cage, position des oreilles et du museau) est réalisée à la fois par l’expérimentateur réalisant les IRM et une personne responsable des animaux de l’établissement extérieur. La tête des animaux est maintenue immobile par un système de contention (barres d’oreille et mors à dent) intégré au berceau. Un anesthésique local est appliqué au niveau des points d'appui des barres d'oreilles, un gel ophtalmique est appliqué pour limiter la déshydratation oculaire. De la vaseline sera également appliquée avant d’introduire la sonde rectale. Tout au long de l’examen IRM (4h maximum), la profondeur de narcose et la température interne de l'animal sont contrôlées. La procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal sorti pour vérification en cas de souffrance/angoisse chez les animaux pendant l’IRM, repérée par : une respiration anormale (trop rapide ou trop basse malgré l'ajustement d'anesthésique) ou une température anormale (trop élevée ou trop basse malgré l'ajustement de la consigne de température du bain marie ou de la modification de l’anesthésie). Nous accorderons également une grande importance à la période de réveil (chambre thermostatée, stimulation régulière de l’animal). Une personne référente des animaux à imager sera présente de façon à guider l’expérimentateur qui réalise l’IRM et à contrôler au mieux l’anesthésie de l’induction au réveil complet de l’animal.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les principales espèces utilisées sur notre plateforme, leur taille permet de les utiliser dans ce type de machine pour acquérir des séquences capables de donner des détails anatomiques et fonctionnels qui contribue à répondre aux questions scientifiques posées. De plus, les rongeurs permettent l’étude de comportements complexes et de nombreux modèles de rongeurs génétiquement modifiés sont développés pour mimer des pathologies humaines. En raison de sa taille, le rat possède un cerveau plus facile à imager (plus gros). Il est donc plus facile d’obtenir un meilleur signal chez le rat, notamment dans des zones cérébrales de petite taille. Cependant, de nombreuses pathologies cérébrales sont préférentiellement induites et étudiées chez la souris que nous pouvons imagées plus aisément avec des antennes adaptées. Le stade de développement sera décrit dans le projet initial autorisé par le ministère de l’étude concernée. L’âge minimum requis pour passer un examen par imagerie par résonance magnétique (IRM) est fixé à 3 semaines (rats et souris confondus), en raison des contraintes de berceau IRM que nous possédons à la plateforme IRM et de l’anesthésie gazeuse qui sera optimale sur des animaux sevrés qui ont acquis une capacité respiratoire suffisante. De même pour la récupération, elle sera plus facile si on travaille sur des animaux qui sont sevrés.
Interaction entre les neurones sensoriels et le système immunitaire pendant l’infection par le virus herpès
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 2 479 individus en gravité modérée. Leur peau est abrasée puis infectée par le virus de l'herpès, avec des injections cutanées répétées et une molécule les rendant insensibles à la chaleur, pour étudier le rôle des neurones sensoriels dans la réponse immunitaire. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne pourra être administré sans compromettre les résultats, alors que les procédures peuvent provoquer des douleurs modérées. Il affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Objectifs
Les neurones sensoriels permettent à un organisme de détecter le danger grâce à une sensibilité aux stimuli mécaniques, thermiques et chimiques. Ces neurones sensoriels sont impliqués dans la perception de la douleur à ces différents stimuli. Il est de plus en plus évident que les neurones sensoriels et le système immunitaire interagissent pour réguler la douleur, l'inflammation et les défenses de l'hôte contre les pathogènes. Lors d’’une infection, des molécules inflammatoires activent les neurones dont les terminaisons nerveuses sont présentes dans les tissus, permettant ainsi la transmission de signaux au cerveau et la sensation de douleur. Ces neurones libèrent également des neuropeptides au niveau de la lésion, qui peuvent en retour moduler les cellules immunitaires présentes localement. Les neurones sensoriels innervant la peau sont hétérogènes : certains sont impliqués dans la détection de la chaleur et d’autres dans la détection du toucher. Ces différences sont dues à l’expression de différents marqueurs qui nous permettent de modifier génétiquement des animaux afin qu’ils ne soient plus capables de détecter ces sensations. Ainsi, l’objectif de notre projet de recherche est de comprendre comment les neurones sensoriels de la peau régulent l’inflammation et la réponse immunitaire au cours d’une infection par le virus herpès.
Bénéfices attendus
L'influence des neurones sensoriels sur la régulation de la réponse immunitaire inflammatoire lors d'une infection virale par le virus herpès reste inexplorée. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes sous tendant cette régulation permettrait d'identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur l'inhibition ou l'activation locale des neurones sensoriels dans le cas d'infections virales, ou pour aller plus loin, lors de pathologies inflammatoires très invalidantes, telles que la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
L’infection cutanée par le virus herpès nécessite une légère altération de la peau, celle-ci étant réalisée par une légère abrasion de la couche superficielle de la peau pendant 20 secondes réalisée sous anesthésie générale (par injection intrapéritonéale d’un anesthésiant). Les animaux subiront également des injections intradermiques quotidiennes de traitements immunomodulateurs afin d'évaluer leurs rôles potentiels dans la régulation de la réponse immunitaire et donc dans la résolution de l'infection. Pour évaluer le rôle des neurones sensoriels qui détectent la chaleur, les animaux seront injectés en sous-cutanée avec une molécule spécifique qui rend les animaux insensibles à la chaleur. Les injections intrapéritonéales (ip), intradermiques (id) et sous-cutanées (sc) n’excédant pas 10 secondes. Les ip seront réalisées 1 seule fois par animal, les id seront réalisées quotidiennement pendant 4 jours et les sc 3 fois pendant 3 jours. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les animaux seront infectés par le virus herpès après une légère abrasion de la peau. L’infection va déclencher une réponse immunitaire inflammatoire et une plaie cutanée se développera à partir du point d’infection. En revanche, cette plaie se résout spontanément chez une souris sauvage, ainsi que chez les souris qui n’ont plus de neurones sensoriels. Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs modérées chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d'explorer l'effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne pourra être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Après l'infection, un pansement sera appliqué au niveau du flanc des souris pendant 2 jours. Cela peut induire des difficultés pour se mouvoir. Le suivi de la taille des plaies cutanées ainsi que les procédures incluant des injections cutanées peuvent induire du stress chez l’animal liées aux contentions. Les injections de molécules immunomodulatrices sont connues pour induire des démangeaisons légères sans induire d'auto-blessure de l'animal. Les tests comportementaux peuvent induire une douleur légère si le génotype de l'animal fait qu'il développe une hypersensibilité accrue suite à l'infection par le virus herpès.
Devenir
Mise à mort des animaux à la fin des procédures expérimentales pour récupérer les organes d'intérêts (peau et ganglions).
Remplacement
Nous proposons que les neurones sensoriels régulent l'évolution de la réponse immunitaire locale au niveau de la peau au cours de l'infection par le virus herpès. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier le développement de l'activation simultanée du système immunitaire et du système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions qui innervent la peau infectée. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l'interaction neurone/cellule immunitaire ou des molécules produites par ces neurones sensoriels après infection, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maitrisées au laboratoire, telles que la culture cellulaire de neurones et de cellules immunitaires.
Réduction
Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d'infection par abrasion du flanc est un modèle très bien décrit et maitrisé au sein du laboratoire permettant à l'infection de se développer dans quasiment 100% des souris infectées. Nos données obtenues dans un projet précédent nous ont permis de déterminer le nombre de souris nécessaires par expérience, en limitant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Pour une différence clinique et statistiquement significative, nous avons estimé que la taille d’un groupe était de 11 souris pour les infections par le virus herpès en considérant des moyennes de taille de lésion de 2,5 mm2 pour les souris contrôles, une différence significative de 1,5 mm2 et un écart-type commun de 1,2 mm2. Ainsi, des lots de 11 souris seront constitués pour chaque condition testée afin de répondre aux exigences de test statistique de rang non paramétrique. Pour chaque groupe d'animaux utilisés, tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, taille de la plaie, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate et ganglions) afin d'éviter de répéter inutilement les expériences inutiles. Pour minimiser l'impact du microbiote intestinal sur le développement de l'infection et donc la variabilité de nos expériences, nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec les souris provenant de la même portée mais non génétiquement modifiées.
Raffinement
Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Eau et nourriture seront fournies ad libitum et les animaux seront libres de leur déplacement. Pour réduire la souffrance : une surveillance quotidienne sera réalisée. Les points d’observation seront réalisés quotidiennement suivant l’infection et consisteront en une vérification du poids, de la vivacité et de l'état du pelage des animaux. Au besoin et au moindre signe de dégradation de l'état général, d'autres points d'observation intermédiaires seront assurés. Une souris qui aura perdu 20% de son poids initial sera systématiquement mise à mort. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées. Des souris d'âge minimum de 7-8 semaines seront utilisées afin d'avoir un système immunitaire et sensoriel mature.
Etude préclinique de la récupération fonctionnelle et de la plasticité cérébrale après accident vasculaire cérébral ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, dont 960 individus en gravité sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine ou occlusion au chlorure de fer, suivi d'examens IRM et de tests moteurs, cognitifs et émotionnels répétés sur soixante jours. Le porteur décrit un affaiblissement de la patte, des douleurs post-opératoires et une mise à mort si la perte de poids dépasse 15 % ou si le score de douleur est trop élevé. Il rappelle que les traitements neuroprotecteurs efficaces chez l'animal ont échoué chez l'humain, tout en affirmant que les méthodes sans animaux n'apportent pas le même niveau d'information.
Objectifs
A l’échelle mondiale, l’accident vasculaire cérébral (AVC) est l’une des causes majeures de décès, d’invalidité et de perte socioéconomique. Face à ce fardeau, le seul traitement pharmacologique approuvé consiste en l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Néanmoins, il existe des critères d’éligibilité stricts qui excluent une grande majorité des patients. Il est donc indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. Lors d’un AVC ischémique (i.e. dû à une occlusion vasculaire), le débit sanguin cérébral (DSC) diminue drastiquement et les tissus cérébraux alentours sont altérés de manière plus ou moins définitive. Selon différents facteurs tels que la durée et l’ampleur de la diminution du DSC, l’étendue de la lésion cérébrale et sa localisation, les handicaps résiduels post-AVC peuvent être de différentes natures (moteurs, cognitifs et/ou émotionnels) et extrêmement invalidants. Plusieurs agents thérapeutiques ont été développés et ont montré un bénéfice en termes de neuroprotection chez l’animal. Cependant, la transposition des effets neuroprotecteurs des modèles animaux à l’Homme reste un échec. En effet, alors que la récupération fonctionnelle est au cœur des préoccupations humaines, les études précliniques se sont principalement concentrées sur l’évaluation du volume de lésion cérébrale pour évaluer l’efficacité d’un traitement. Par ailleurs, l’’étude comportementale après un AVC chez les modèles expérimentaux est encore peu utilisée, incomplète voire inadaptée. En effet, la majorité des études ayant travaillé sur les déficits fonctionnels n’ont examiné que les déficits à court terme et particulièrement les déficits moteurs. L’objectif de ce projet consiste donc à caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la plasticité cérébrale et les déficits fonctionnels chroniques de l’accident vasculaire cérébral ischémique, afin de mettre au point de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces troubles.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de plasticité cérébrale et de récupération fonctionnelle après un AVC ischémique. Elle permettra également de proposer des pistes pour caractériser de nouvelles stratégies thérapeutiques en combinaison ou non avec le tPA, afin d’améliorer de manière optimale la récupération des patients.
Procédures
Chaque animal fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux pour l'injection de traitements (15 minutes). 1 - Le modèle d'ischémie par injection de thrombine sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) (50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 2 - Le modèle d'ischémie par occlusion au chlorure de fer sera réalisé (1.5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par IRM (30 minutes) 24h après l'intervention chirurgicale. L'évolution du tractus de fibres (plasticité cérébrale) sera évaluée par IRM de manière longitudinale (24h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC ; 50 minutes). La récupération fonctionnelle sera également évaluée de manière longitudinale (48h, 7 jours, 30 jours et 60 jours post-AVC) à travers l'étude de différentes fonctions (sensorimotrices, cognitives et émotionnelles ; 10 jours). 3 - La totalité des animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleurs quelques heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée lors de l’AVC) qui disparait dans la première semaine après l’AVC. Une perte de poids, des douleurs post-opératoires ou un stress pourraient être observés les jours suivants. Lors des tests comportementaux, les animaux peuvent être soumis à un stress dû à la manipulation, l’isolement (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes prélevés post mortem permettront de réaliser des analyses protéomiques et transcriptomiques.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne permettent pas de mimer parfaitement la pathologie en raison de multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. De plus, les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information pour évaluer une récupération fonctionnelle et cognitive de manière longitudinale. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale, la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale. La physiologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé grâce à nos expériences antérieures et selon les données disponibles dans la littérature. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses, le bruit et la lumière selon le cycle. La température en salle d’expérimentation sera contrôlée et adaptée au bien-être des animaux. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs, soigneusement nettoyés et désinfectés. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés jusqu’à leur réveil. Pour optimiser le réveil de l’animal, la cage de réveil sera disposée de manière à avoir une partie sur un tapis chauffant, laissant le choix à l’animal de la température dans la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront mis à mort si une perte de poids de plus de 15 % est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose (petites maisons), des carrés de cotons et des paillettes seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront mis en place jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la récupération fonctionnelle et la plasticité cérébrale suite à un AVC ischémique. Les souris C57BL/6 utilisées dans cette étude seront âgées de 8 semaines car cela correspond au stade de développement jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l’étude des AVC.
Rôle de l’homéostasie chlorure spinale dans l’hypersensibilité nociceptive induite par une séparation maternelle néonatale
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
176 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée, pour étudier l'hypersensibilité à la douleur induite par une séparation maternelle précoce. La moitié des nouveau-nés est séparée de leur mère, puis soumise à des tests de douleur et à des injections dans la moelle épinière, l'autre moitié subit une chirurgie sans réveil avec ablation d'une vertèbre pour enregistrer la moelle jusqu'à huit heures. Le porteur indique aussi que toutes les mères sont mises à mort après le sevrage, au motif que la séparation altère leur système nerveux. Il affirme que la nociception est un processus intégré, impossible à étudier sans sujets vivants dotés d'un cortex développé.
Objectifs
Pendant très longtemps, la douleur du nouveau-né a été ignorée et négligée lors de sa prise en charge. Ce n’est qu’au début des années 90 que ce problème a commencé à être pris en compte en clinique humaine et de nombreux progrès restent à faire. Les nouveaux nés ressentent non seulement la douleur mais sont extrêmement sensibles aux stimulations aversives. Ceci est d’autant plus vrai pour les enfants nés prématurés dont la prévalence mondiale était de 9.6 % en 2005. La prématurité conduit ces enfants à développer parfois des troubles moteurs et comportementaux et une hypersensibilité douloureuse pouvant perdurer à l’âge adulte. La séparation maternelle néonatale (SMN) est un modèle reflétant la prématurité humaine et des études ont montré que les animaux exposés à la SMN présentent des déficit de comportements et une hypersensibilité douloureuse. Des études récentes suggèrent également un déréglement de l'expression de certaines molécules pouvant ainsi contribuer aux altérations comportementales observées suite à la SMN. Dans ce contexte, nous chercherons à évaluer le rôle de certaines de ces molécules exprimées par les neurones de la moelle épinière impliqués dans la transmission de l'information douloureuse. L’objectif du projet sera d’étudier l’effet du bumétanide (BTD), qui pourrait rétablir a) les seuils de douleur chez l’animal SMN adulte et b) la transmission de la douleur par des neurones dans la moelle épinière d'animaux SMN.
Bénéfices attendus
Le modèle de séparation maternelle a permis de décrypter nombre des mécanismes d’altération du système nerveux qui sont retrouvés chez les enfants prématurés humains. Dans ce cadre, l’étude permettra de mieux comprendre les voies et mécanismes impliqués dans la douleur qui sont altérés lors d’un stress néonatal non douloureux, et plus particulièrement une séparation précoce avec la mère. Ce projet vise aussi à caractériser l’action potentiellement bénéfique du bumétanide sur le comportement modifié des animaux séparés et sur les modifications moléculaires observées dans ce modèle.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis au protocole de séparation maternelle néonatale, tandis que l'autre moitié des nouveau-nés resteront avec leur mère. Des tests d'évaluation de la douleur (durée 10min/animal), n'induisant pas de stress accru chez les animaux seront effectués une fois chacun du jour 30 au jour 60 postnatal pour la moitié des animaux. Ceux-ci recevront un total de 4 injections sous anesthésie générale 30 minutes avant chaque test comportemental. Une chirurgie durant 45 minutes sera effectuée sur l'autre groupe d'animaux puis des enregistrements de la moelle épinière seront effectués. Ces enregistrements dureront 8 heures maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de séparation maternelle néonatale chez le rat est un modèle de stress psycho-social et a donc des conséquences sur le comportement des animaux. Après sevrage, la mère ne réintègrera pas le processus de reproduction mais sera euthanasiée puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. Les nuisances possibles liées à l'injection intrathécale seront le stress lié à l’anesthésie ainsi qu'une inflammation ou infection potentielle du site d’injection. Les tests comportementaux induisent un changement d’environnement pour les animaux et donc un stress.
Devenir
Toutes les mères de cette étude seront mises à mort après sevrage de leurs petits (P21) puisque la séparation altère le fonctionnement de son système nerveux, induisant potentiellement une anxiété accrue au niveau comportemental. En fin d’expérience, tous les animaux seront aussi mis à mort. Pour la moitié des animaux, la chirurgie subie est sans réveil puisqu'une vertèbre est ôtée lors de celle-ci et que leur moelle épinière est manipulée. Les animaux y prenant part seront mis à mort par excès d'anesthésie.
Remplacement
La nociception étant un processus intégré, ce projet nécessite l’étude d’un système intégré et mature. De plus, l’étude vise à caractériser les propriétés et le mode d’action d’une molécule d’intérêt dans notre modèle, et il est donc impossible de se passer de sujets vivants dotés d’un cortex développé. Il n’existe pas encore de modèles alternatifs in silico ou in vitro capable de restaurer les réseaux neuronaux impliqués dans les comportements observés.
Réduction
Chaque groupe de rats requiert 2 portées différentes (comportant chacune minimum 10 animaux) pour une bonne analyse statistique et confirmation des tests comportementaux. L’intégralité des animaux de chaque portée sera analysée à chaque fois, permettant également de préciser les différences mâles-femelles si elles sont observées. Les résultats obtenus sont alors statistiquement robustes et exploitables.
Raffinement
Durant la SMN, les ratons sont placés sous lampes chauffantes afin d’éviter toute hypothermie. Leur prise de poids sera contrôlée 2 fois par semaine. Les animaux sont hébergés en cages collectives afin de préserver les interactions sociales avec leurs congénères et ont constamment à disposition de la frisure pour un nid, un bâton à ronger et un tunnel. Les animaux sont suivis quotidiennement par les zootechniciens de l’animalerie et par les expérimentateurs afin d’être alertés dès les premiers signes de dégradation du bien être animal en portant une attention particulière à tout changement de l’état général ainsi qu’à l’état comportemental. Si des changements sont observés, le vétérinaire sera contacté pour décider de la procédure. Pour l’appréciation de la perte de poids, si lors d’une pesée hebdomadaire, il est observé qu’un animal ne prend pas de poids ou en perd par rapport à la pesée précédente, des aliments humides seront mis à disposition dans les cages pour faciliter la prise alimentaire. Si l’un de ces changements persiste plus de trois jours et est observé par un zootechnicien ou l’expérimentateur, le vétérinaire sera contacté et l’animal sera retiré de l’étude. Les injections seront effectuée sous anesthésie générale profonde (isoflurane 3%) pour limiter le stress des animaux. Les tests comportementaux sont realisés après une semaine d’habituation (manipulation par l'expérimentateur 5 minutes par animal chaque jour) afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Le rat est un standart en tant que modèle expérimental pour ce type d’expérience impliquant des processus intégrés. Nos précédentes études étant réalisées sur le rat, nous conserverons ce modèle bien caractérisé sur le plan comportemental. Le modèle de SMN a déjà été bien caractérisé chez cette espèce, permettant de confirmer la robustesse des résultats obtenus. De plus, ce modèle chez le rat nous permet de modéliser l’état de développement d’un fœtus lors du 3ème trimestre de gestation, puisqu’à la naissance le système nerveux du rat est au même niveau de maturation que celui du fœtus au début du 3ème trimestre de gestation. Les évènements de maturation ayant lieu lors du 3ème trimestre de gestation chez l’Homme, correspondent à ceux qui ont lieu lors des 2 à 3 premières semaines de vie postnatales chez le rat. Le protocole de SMN intervient au stade nouveau-né, entre le jour 2 et le jour 12 postnatal. Cependant, les conséquences de ce stress seront observées à l’âge adulte (45 jours postnatal).
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant le récepteur GPR103 à peptide RFamide sur les effets négatifs de la prise chronique de morphine et les symptômes anxio-dépressifs dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère à modérée, dont 672 individus en gravité modérée. Elles reçoivent de la morphine de façon répétée pour induire une hypersensibilité à la douleur et une dépendance, puis subissent des dizaines de tests douloureux et un sevrage déclenché par la naloxone. Le porteur décrit ce sevrage, avec tremblements, sauts, claquements de dents et diarrhées, comme désagréable et précise qu'il ne peut pas être atténué puisqu'il fait partie des objectifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'observer ces comportements et retient un fond génétique de souris qu'il juge "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs malgré leurs nombreux effets indésirables dont la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur également appelée hyperalgésie, caractérisée par une exacerbation de la sensibilité à un stimulus nociceptif ce qui sous-entend des points communs entre l’hyperalgésie induite par les opiacés et le développement de l’hyperalgésie induite par les douleurs chroniques. Des résultats récents indiquent que le récepteur à neuropeptides RFamide GPR103 est impliqué dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques et anti-hyperalgésiques sur des cibles peu ou pas caractérisées jusqu'à présent.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet permettront de valider l’efficacité de nouveaux antagonistes du récepteur GPR103 contre l’hyperalgésie induite par les opiacés mais également les troubles anxio-dépressifs. Ce projet permettra de valider de nouveaux antagonistes du récepteur GPR103 dans le but d'un éventuel développement clinique.
Procédures
Un premier lot d’animaux subira des 23 injections (sur animal vigil) d’une minute environ pendant 11 jours. Ces animaux subiront au total 66 tests nociceptifs d’une durée de 1 min environ espacés sur une période de 4 semaines. Au premier jour de l’expérience ainsi qu’au 10 jours, le délai entre chaque test est de 30 min et les animaux subissent 8 tests. Les autres jours, les animaux subissent 1 seul test toutes les 24h. Un second lot d'animaux subira une injection d'une durée de 1 min réalisée sur animal vigile puis une semaine après, une autre injection d'une durée de 1 min réalisée sue animal vigile et un test de 10 min. Un troisième lot d'animaux subira une injection d'une durée de 1 min réalisée sur animal vigile puis un test d'une durée de 300 sec pour mesurer les comportements dépressifs, puis une semaine après, une autre injection d'une durée de 1min réalisée sue animal vigile et un test de 6 min.
Impact sur les animaux
L’administration chronique de morphine induit un effet analgésique mais également un développement progressif d’une hypersensibilité à la douleur. Ces administrations répétées de morphine induisent également un état de dépendance physique que l’on observe uniquement lors de la précipitation du sevrage par administration de naloxone. Ce syndrome comportemental de sevrage est désagréable et transitoire, les animaux présentent alors pendant une vingtaine de minutes des tremblements, des sauts, des claquements de dents et des diarrhées et une perte de poids. Cet état de sevrage ne peut être atténué puisque c’est l’un des objectifs de notre étude. Il peut y avoir dans de rares cas un développement d’infection lors d’administration répétés. Les tests comportementaux inclus dans ce projet induisent soit une douleur sur laquelle l'animal garde le contrôle: le retrait de la queue de l'animal met fin au test, soit mettent les animaux dans des situations légèrement anxiogènes. L’administration des antagonistes devraient réduire les symptômes de douleur et/ou d’anxiété dépression et ne devraient pas induire de symptôme indésirable.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus cérébraux.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la modulation de la douleur et des effets anxiolitiques ou antidépresseurs des molécules nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec 12 animaux/groupe.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi avec de la frisure pour faire un nid et des battons en bois à rogner, et observés quotidiennement par l’expérimentateur (afin de repérer immédiatement tout signes de bagarre et/ou de blessure), ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les animaux subiront une période de 2 semaines d’habituation aux locaux avant le début du protocole expérimental. Les souris sont habituées à l’expérimentateur (par une période de manipulation de 3 jours) et à l’expérimentation (habituation aux dispositifs et à la contention pour les injections) afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis afin de soustraire l'animal à la souffrance. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets des antagonistes du récepteur RFamide GPR103 sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou sur les symptômes anxieux ou dépressifs. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris C57BL6/N, fond génétique le plus courament utilisé dans la littérature pour le modèle d'hyperalgésie induite par les opiacés utilisé. De plus, nos résultats préliminaires ont été obtenus sur ce fond génétique. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 7 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 9 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.